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Mitochondriale Transformation bei Baker

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DOI:

10.3791/66856

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7. Juni 2024

 ,  , 
1Departamento de Genética Molecular, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In dieser Arbeit wird erklärt, wie Hefe-Mitochondrien mit einer biolistischen Methode transformiert werden können. Wir zeigen auch, wie die Transformanten ausgewählt und gereinigt werden und wie die gewünschte Mutation an der Zielposition innerhalb des mitochondrialen Genoms eingeführt wird.

Zusammenfassung

Die Backhefe Saccharomyces cerevisiae wird seit Jahrzehnten häufig zum Verständnis der mitochondrialen Biologie verwendet. Dieses Modell hat Erkenntnisse über essentielle, konservierte mitochondriale Signalwege zwischen Eukaryoten und Pilz- oder Hefe-spezifischen Signalwegen geliefert. Eine der vielen Fähigkeiten von S. cerevisiae ist die Fähigkeit, das mitochondriale Genom zu manipulieren, was bisher nur bei S. cerevisiae und der einzelligen Alge Chlamydomonas reinhardtii möglich ist. Die biolistische Transformation der Hefe-Mitochondrien ermöglicht es uns, ortsgerichtete Mutationen einzuführen, Genumlagerungen vorzunehmen und Reporter einzuführen. Diese Ansätze werden hauptsächlich verwendet, um die Mechanismen von zwei hochgradig koordinierten Prozessen in Mitochondrien zu verstehen: die Translation durch Mitoribosomen und die Assemblierung von respiratorischen Komplexen und ATP-Synthase. Die mitochondriale Transformation kann jedoch möglicherweise zur Untersuchung anderer Signalwege verwendet werden. In der vorliegenden Arbeit zeigen wir, wie Hefemitochondrien durch Hochgeschwindigkeits-Mikroprojektilbeschuss transformiert, das beabsichtigte Transformanten ausgewählt und gereinigt und die gewünschte Mutation in das mitochondriale Genom eingeführt werden kann.

Einleitung

Die Hefe Saccharomyces cerevisiae ist ein weithin anerkanntes Modell zur Untersuchung der mitochondrialen Biogenese. Da es sich bei der Hefe um einen anaeroben, fakultativen Organismus handelt, ist es möglich, die Ursachen und Folgen der Einführung von Mutationen, die die Atmung beeinträchtigen, umfassend zu untersuchen. Darüber hinaus verfügt dieser Organismus über freundliche genetische und biochemische Werkzeuge, um mitochondriale Signalwege zu untersuchen. Eine der leistungsfähigsten Ressourcen zur Erforschung der Mechanismen des Zusammenbaus von Atemwegskomplexen und der mitochondrialen Proteinsynthese ist jedoch die Fähigkeit, Mitochondrien zu transformieren und das Genom der Organelle zu modifizieren. Früher war es hilfreich, in die mitochondriale DNA (mtDNA) Punktmutationen oder kleine Deletionen/Insertionen 1,2,3,4,5 einzuführen, die Gene 6,7 zu löschen, Genumlagerungen 7,8 vorzunehmen, Epitope zu mitochondrialen Proteinen hinzuzufügen 9,10, Gene vom Zellkern in die Mitochondrien zu verlagern11,12 und führen Reportergene wie BarStar13, GFP14,15, Luciferase16 und das am weitesten verbreitete ARG8m 17,18 ein. Mitochondriale Genommodifikationen haben es uns ermöglicht, Mechanismen zu analysieren und zu identifizieren, die sonst schwer zu verstehen gewesen wären. Zum Beispiel war das ARG8 m-Reportergen, das am COX1-Locus in der mitochondrialen DNA eingefügt wurde, entscheidend für das Verständnis, dass Mss51 eine doppelte Rolle bei der Cox1-Biogenese spielt. Zum einen ist es ein translationaler Aktivator der COX1-mRNA und zum anderen ein Assemblierungschaperon für das neu hergestellte Cox1-Protein 7,19. In dieser Arbeit wird eine detaillierte Methode zur Transformation von S. cerevisiae Mitochondrien vorgestellt. Obwohl das mitochondriale Transformationsprotokoll bereits früher veröffentlicht wurde 16,20,21,22,23, ist eine visuelle Annäherung durch ein Video unerlässlich, um die verschiedenen Stadien und Details der Methode gründlich zu verstehen. Die Methode besteht aus verschiedenen Schritten und gliedert sich in vier allgemeine Stufen:

Diagramm des Gen-Editing-Prozesss; Wolframpartikel, DNA-Beschichtung, Integrationsschritte des mitochondrialen Genoms.
Abbildung 1: Überblick über den Ablauf der mitochondrialen Transformation durch Hochgeschwindigkeits-Mikroprojektilbeschuss: 1) Die Wolframpartikel werden sterilisiert und vor der DNA-Beschichtung vorbereitet. 2) Zwei verschiedene Plasmide werden auf der Oberfläche der WPs ausgefällt. Eines ist ein bakterielles Plasmid, das das Konstrukt enthält, das zur mitochondrialen Matrix geleitet wird. Der andere ist ein Expressionsvektor für Kernhefe, der einen Auxotrophiemarker trägt. 3) Ein Rezeptorhefestamm ohne mitochondriale DNA (rho0) wird auf einer fermentativen Kohlenstoffquelle wie Galaktose oder Raffinose gezüchtet, die keine Glukoseunterdrückung der mitochondrialen Genexpression ausübt34,35. Die Kultur wird auf Petrischalen verteilt, die das Bombardementmedium enthalten. 4) Mit Plasmiden beschichtete WPs werden durch Hochgeschwindigkeits-Mikroprojektilbeschuss auf den Rezeptorstamm geschossen. 5) Positive synthetische Rho-Kolonien, die das mitochondriale Plasmid enthalten, werden durch Paarung mit einem Testerstamm ausgewählt. 6) Das mitochondriale Konstrukt wird an der gewünschten Stelle in das mitochondriale Genom integriert, indem der synthetische Rho-Stamm (Donor) mit dem Akzeptorstamm durch einen Prozess gepaart wird, der als Zytoduktion bekannt ist. 7) Der positive Rezeptor, der haploide Stamm, der das mitochondriale Konstrukt trägt, wird selektiert und in verschiedenen Medien gereinigt. Abkürzungen: WPs = Wolframpartikel; mtDNA = mitochondriale DNA. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Transformation von Zellen mit dem DNA-Konstrukt, das sich in das mitochondriale Genom integrieren soll (Abbildung 1, Schritte 1-4)
Obwohl es möglich ist, eine Hefe, die ein vollständiges mitochondriales Genom (rho+) enthält, direkt zu transformieren, ist die Transformation 10-20x effizienter, wenn den Zellen mitochondriale DNA (rho0)24 fehlt. Wolframpartikel (WPs) werden mit zwei verschiedenen Plasmiden beschichtet, die co-transformiert werden. Der erste ist ein Hefe-2-μ-Expressionsvektor, der einen Auxotrophiemarker trägt, wie z. B. LEU2 oder URA3 (z. B. YEp351 bzw. YEp352). Wenn die biolistische Einführung von DNA in die Hefezellen erfolgreich ist, wachsen die Transformanten auf dem Auxotrophiemedium (d.h. einem Medium, dem Leucin oder Uracil fehlt). Dieses Plasmid ist hilfreich bei der ersten Selektion der Zellen, die das Kernplasmid erworben haben; Andernfalls würde die Anzahl der resultierenden Kolonien die Platte sättigen. Das zweite Plasmid ist ein bakterielles Plasmid (wie z.B. pBluescript oder ähnliches), das den mitochondrialen Aufbau enthält, der in das mitochondriale Genom integriert werden soll. Das Konstrukt muss mindestens 100 nt von 5' und 3' flankierenden mitochondrialen Sequenzen für die Rekombination mit der mitochondrialen Region von Interesse enthalten. Unserer Erfahrung nach ist es wahrscheinlicher, dass größere flankierende Sequenzen erfolgreich mit dem Ziellocus im mitochondrialen Genom rekombinieren.

Ein konkretes Beispiel ist in Abbildung 225 dargestellt. In diesem Beispiel bestand das Ziel darin, die Region des mitochondrialen COX1-Gens zu löschen, die für die letzten 15 Aminosäuren des entsprechenden Proteins (Cox1ΔC15) kodiert (Abbildung 2A). Das bakterielle Plasmid, das die COX1ΔC15-Mutation trug, enthielt 395 nt bzw. 990 nt der 5'- bzw. 3'-untranslatierten Regionen des Gens. Das Plasmid wurde von pBluescript (pXPM61) abgeleitet und zusammen mit dem 2-μ-Plasmid YEp352 auf der Oberfläche von WPs kopräzipitiert (Abbildung 2B). Die WPs wurden dann durch Mikroprojektilbeschuss in den ausgewählten Empfängerstamm eingebracht (Abbildung 2C). Dieser Stamm mit der Bezeichnung NAB6926 ist ein MATa, rho0-Stamm mit den Allelen kar1-1 und ade2 (die Bedeutung dieser Eigenschaften wird weiter unten diskutiert). Die Zellen wurden auf Bombardementmedien plattiert, denen Uracil fehlte, um diejenigen auszuwählen, die das 2-μ Plasmid erhielten (Abbildung 2C). Die Zellen wurden 5-7 Nächte lang bei 30 °C gezüchtet.

Selektion der Zellen, die das bakterielle Plasmid mit dem mitochondrialen Konstrukt und das nukleäre 2 μ Plasmid mit dem Auxotrophiemarker erworben haben (Abbildung 1, Schritt 5)
Die positiven Kolonien erhalten viele Kopien des bakteriellen Plasmids in ihren Mitochondrien22. Da die transformierten Zellen ursprünglich rho0 sind, unterstützen keine mitochondrialen Sequenzen die Translation des im Plasmid vorhandenen mitochondrialen Konstrukts; Daher wird das transformierte mitochondriale Gen nicht exprimiert. Es ist notwendig, die Transformanten mit einem Testerstamm zu paaren, um die Hefekolonien nachzuweisen, die das mitochondriale Plasmid erworben haben. Das mitochondriale Genom des Testerstamms enthält eine nicht-funktionelle mutierte Version des interessierenden Gens. Nach der Paarung verschmelzen die Mitochondrien, und die mitochondriale Sequenz, die in dem transformierten Plasmid enthalten ist, rekombiniert mit dem mutierten mitochondrialen Gen aus dem Testerstamm; Folglich wird die Wiederherstellung des WT-Gens die Funktion wiederherstellen. Das resultierende Diploid hat einen nachweisbaren positiven Phänotyp (in der Regel die Fähigkeit, in Atemmedien oder einem Medium ohne Arginin zu wachsen). Die positiven Zellen, die das bakterielle Plasmid in den Mitochondrien tragen, werden als "synthetische Rho-Zellen " bezeichnet. Im spezifischen Beispiel von Abbildung 2D wurden synthetische Rho-Zellen mit dem COX1ΔC15-Konstrukt (XPM199 genannt) auf einem Medium ohne Uracil repliziert (dies ist die Master-Platte, von der positive Kolonien gereinigt wurden). Sie wurden auch auf einem Rasen des Testerstamms L4527 repliziert, der die nicht-funktionelle Mutation cox1D369N enthält. Nach zweiwöchiger Paarung rekombinierte sich das mitochondriale Genom von L45 und XPM199, was zu einem funktionsfähigen COX1-Gen führte; Daher gewannen die Diploiden die Fähigkeit zurück, auf Atemwegsmedien zu wachsen. Von der Masterplatte wählten wir die positiven Kolonien aus. Sie wurden auf Platten gestreift, denen Uracil fehlte, und die selektiven Tests wurden wiederholt, um reine synthetische Rhozellen zu erhalten (Abbildung 2E). Es ist wichtig zu beachten, dass die Testplatte nur zur Identifizierung von synthetischen Rho-Kolonien dient und Mutanten aus diesen Platten nicht gewonnen werden können.

Integration des Konstrukts in das mitochondriale Genom des beabsichtigten Stammes
Dieser Schritt wird durch einen Prozess erreicht, der als Zytoduktionbezeichnet wird 28,29 (Abbildung 1, Schritt 6). Bei diesem Ansatz wird der synthetische Rho-Stamm (Donorstamm) mit dem beabsichtigten Akzeptorstamm des entgegengesetzten Paarungstyps verpaart. Eine wesentliche Voraussetzung ist, dass mindestens einer der beiden Paarungsstämme die kar1-1-Mutation trägt, um die Kernfusionzu behindern 30. Daher entsteht bei der Paarung der beiden Zellen eine zweikernige Zygote (Abbildung 3). Das mitochondriale Netzwerk aus den Elternzellen (Donor und Akzeptor) verschmilzt und die mitochondrialen DNA-Moleküle rekombinieren. Die zweikernigen Zygoten werden inkubiert/zurückgewonnen, um eine Knospung zu ermöglichen, die haploide Zellen produziert. Diese Haploide tragen den Kernhintergrund einer der Elternzellen. In ähnlicher Weise können Haploide die mitochondriale DNA entweder von der Elternzelle oder von der rekombinierten mitochondrialen DNA von Interesse tragen. Die kar1-1-Mutation ist jedoch nicht zu 100 % wirksam, und während der Paarung werden einige echte Diploide gebildet28,29. Der synthetische Rho-Stamm (Donor, XPM199) trug im Beispiel das kar1-1-Allel. Als selektiven Marker besaß es das ade2-Allel, was es zu einem auxotrophen Marker für Adenin machte (Abbildung 4). Der Akzeptorstamm war XPM10, ein rho+-Stamm mit dem cox1Δ::ARG8m-Konstrukt, wobei der Reporter ARG8m die COX1-Codons im mitochondrialen Genomersetzte 7. Die Mischung beider Zellkulturen wurde als Tropfen auf eine YPD-Platte gegeben, um die Paarung zu ermöglichen. Nach 3-5 Stunden wurden die Zellen unter einem Lichtmikroskop beobachtet, um die Bildung von shmoos (Abbildung 3B) zu erkennen, einer Zellform, die mit der Paarung assoziiert ist. Nach der Inkubations-/Erholungszeit wurden die zweikernigen Zygoten auf ein Medium ohne Adenin plattiert, um das Wachstum der Spenderzellen zu verhindern.

Auswahl des haploiden Stammes, der das mitochondriale Genom von Interesse trägt (Abbildung 1, Schritt 7)
Nach der Zytoduktion liegt eine Mischung aus Donor-, Akzeptor- und diploiden Zellen vor. Daher müssen die Zellen nach der Inkubation/Wiederherstellung der zweikernigen Zygoten in verschiedenen selektiven Medien gezüchtet werden, um die interessierenden Haploide zu identifizieren und zu reinigen. Die Selektionsmedien hängen von den Genotypen des Donors, den Akzeptorstämmen und dem beabsichtigten mitochondrialen Aufbau ab. Im Allgemeinen ist die Begründung für die Wahl des selektiven Mediums jedoch: i) Nach der Inkubation/Wiederherstellung wird das Zytoduktionsgemisch auf einem selektiven Medium gezüchtet, bei dem der Spenderstamm nicht wachsen kann. Im konkreten Beispiel in Abbildung 4A,B trägt der Donor (synthetischer Rho-Stamm) das nicht-funktionelle ade2-Allel. Daher muss die Zytoduktionsmischung auf einer mittleren Platte ohne Adenin inkubiert werden. Dies ist die Masterplatte. ii) Sobald die Kolonien gewachsen sind, wird die Master-Platte erneut auf einem Medium ohne Adenin repliziert (um eine neue Master-Platte zu erzeugen, von der aus die positiven Kolonien von Interesse gereinigt werden) und anschließend auf einem Medium, in dem nur Diploide wachsen können. Dies ist notwendig, um eine weitere versehentliche Reinigung der diploiden Kolonien zu vermeiden. Im Fall des Beispiels aus Abbildung 4C können nur Diploide auf Medien wachsen, denen Leucin fehlt. iii) Die Master-Platte wird auch auf Medien repliziert, auf denen nur die Akzeptor-Haploide wachsen, die die mitochondriale DNA von Interesse eingebaut haben. Im Beispiel von Abbildung 4C wachsen Haploide auf Atemwegsmedien, die Ethanol/Glycerin als Kohlenstoffquelle enthalten, da das Cox1ΔC15-Protein funktionsfähig ist. Der resultierende rho+-Stamm mit der interessierenden mtDNA wurde XPM20925 genannt. Die in Abbildung 2 und Abbildung 4 verwendeten Dehnungen sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Prozess der Editierung von Hefe-Genen, Diagramm mit mtDNA und COX1ΔC15, URA3-Plasmid, synthetischer rho⁻-Stamm.
Abbildung 2: Diagramm, das ein spezifisches Beispiel für die mitochondriale Transformation und Selektion positiver Rho-Zellen beschreibt. (A) Die beabsichtigte Modifikation des mitochondrialen Genoms war eine Deletion der Region, die für die letzten 15 Aminosäuren der Cox1-Untereinheit (Cox1ΔC15) kodiert. (B) WPs wurden mit zwei Plasmiden beschichtet, um Hefezellen zu transformieren. Eines davon war das 2-μ-Plasmid Yep352, das in den Zellkern gerichtet und exprimiert wurde. Das andere war das Plasmid pXPM61, das das COX1ΔC15-Allel plus 395 nt bzw. 990 nt der COX1 5'- bzw. 3'-UTRs enthält. (C) Die WPs wurden in Zellen des Stammes NAB69 eingeführt, dem mitochondriale DNA fehlt (rho0-Stamm). Transformantenkolonien, die aus den Bombardementplatten gewonnen wurden, wurden auf einem Medium repliziert, dem Uracil, der auxotrophe Marker des Kernplasmids YEp352, fehlte. (D) Zur Selektion der positiven Rho-Kolonien wurde die -URA-Platte auf einem Medium repliziert, dem Uracil fehlte. Dies war die Masterplatte, von der die positiven Kolonien entnommen und isoliert wurden. Es wurde auch auf Platten mit Rich Media (YPD) und einem Rasen eines Testerstammes repliziert. Während der Paarung wurde die synthetische rhomitochondriale DNA mit der mitochondrialen DNA des Testerstamms L4527 rekombiniert, der eine Mutation im COX1-Gen (D369N) trägt. Die Diploide, die auf Atemmedien wuchsen, enthielten die transformierte DNA. Die entsprechenden Kolonien wurden von der Master-Platte entnommen, um sie zu restaurieren und zu reinigen. Um die positiven Kolonien in der Masterplatte bei allen Replikationen zu identifizieren, wurden an den Rändern der Platten (grüne Linien) Markierungen mit einem Permanentmarker angebracht. (E) Die ausgewählten positiven Kolonien wurden auf einem Medium ohne Uracil regeneriert. Das war die neue Masterplatte. Wie in D wurden zwei weitere Testrunden durchgeführt, um die synthetischen Rhokolonien zu reinigen. Abkürzungen: WPs = Wolframpartikel; mtDNA = mitochondriale DNA; -URA/Sorb = Mangel an Uracil/ Sorbitol enthaltend; WT = Wildtyp. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Fusionsprozess der Hefezellen; Diagramm und Mikroskopbild; Rho+-Überweisung; Paarungsstadien; Zellbiologie.
Abbildung 3: Diagramm, das den Ablauf der Zytoduktion beschreibt. (A) Allgemeiner Überblick darüber, wie sich Zellen während der Zytoduktion paaren. Während der Zytoduktion verschmelzen die Mitochondrien der Donor- und Akzeptorstämme, so dass die mitochondriale DNA beider Stämme rekombiniert. Da die Kernfusion aufgrund der kar1-1-Mutation 30 reduziert ist, bilden sich zweikernige Zygoten. Nach einiger Inkubations-/Erholungszeit werden die binukleären Zygotenknospen und haploiden Akzeptoren ausgewählt, die die beabsichtigte mitochondriale Mutation enthalten. (B) Die Paarung des synthetischen Rho-Stammes (Donor) und des Akzeptorstamms durch Zytoduktion ermöglicht die Bildung von shmoos (rote Pfeile), einer charakteristischen Form der Paarungshefe. Das Bild wurde unter einem Lichtmikroskop mit einem 100-fachen Objektiv aufgenommen. Maßstabsleiste = 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diagramm der genetischen Kreuzung von Hefe, das den Spender XPM199 und den Akzeptor XPM10 zeigt, wobei die ADE-Master-Plattierung und der rekombinante Wachstumsprozess für die DNA-Integration hervorgehoben sind.
Abbildung 4: Diagramm, das ein spezifisches Beispiel für eine Zytoduktion zur Integration der Mutation COX1ΔC15 in das mitochondriale Genom beschreibt. (A) Flüssigkulturen des synthetischen Rho-Stammes (Donor, XPM199) und des interessierenden Stammes (Akzeptor, XPM10) wurden gemischt, um sich zu paaren. Nach der Shmoo-Bildung wurde die Mischung 2-4 Stunden lang in einer Flüssigkultur zurückgewonnen. Als nächstes wurde die Zytoduktionsmischung auf einer Platte mit einem Medium ohne Adenin verteilt, um das Wachstum der Spenderzellen zu verhindern. (B) Schematische Darstellung der Rekombinationsereignisse der mitochondrialen DNA aus dem Donor (XPM199) und dem Akzeptor (XPM10) während der Zytoduktion. (C) Die Master-Platte wurde auf verschiedenen selektiven Medien repliziert, um diejenigen Haploide zu identifizieren und zu reinigen, die das beabsichtigte mitochondriale Gen in die DNA der Organelle integriert haben (XPM209)25. Abkürzungen: -ADE = fehlendes Adenin; -LEU = fehlendes Leucin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Protokoll

HINWEIS: Wir empfehlen, für jedes Konstrukt sechs Transformationen durchzuführen, da die Effizienz der mitochondrialen Transformation in der Regel gering ist. Die Zusammensetzung der verschiedenen Wachstumsmedien ist in Tabelle 2 dargestellt.

1. Vorbereitung von Wolframpartikeln

  1. Wiegen Sie 30 mg 0,7 μm Wolframpartikel (WPs, Microcarrier) in einem Mikroröhrchen. Fügen Sie 1,5 ml 70%iges Ethanol (EtOH) zum Sterilisieren hinzu. Die WPs vernetzen und 10 min bei Raumtemperatur ruhen lassen.
  2. Zentrifugieren Sie bei 13.200 x g für 15 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie die WPs, indem Sie den Partikeln 1,5 ml steriles Wasser hinzufügen, sie vortexen und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 13.200 × g zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand.
  3. Fügen Sie 500 μl steriles 50%iges Glycerin hinzu (die Endkonzentration beträgt 60 μg WPs/μl).
    HINWEIS: WPs können mindestens 6 Monate bei -20 °C gelagert werden. Entnehmen Sie aus diesem Vorrat die benötigte Menge für sechs Transformationen (100 μL).

2. WPs DNA-Beschichtung

  1. 5 μg des 2 μ Plasmids und 15 μg des bakteriellen Plasmids, das die mitochondriale Sequenz enthält, werden in ein Mikroröhrchen auf Eis gegeben.
    HINWEIS: Das Endvolumen darf 50 μl nicht überschreiten, um eine weitere Verdünnung der für die DNA-Beschichtung benötigten Reagenzien zu vermeiden.
  2. 100 μl der WP-Suspension zugeben und 5 s lang (6 mg WP) vortexen.
  3. Fügen Sie 4 μl 1 M Spermidin hinzu. Kurz Wirbel.
  4. 100 μL eiskalte 2,5 M CaCl2 zugeben, kurz vortexen. 10 Minuten auf Eis inkubieren; Alle 3 Min. die Mischung kurz aufwirbeln.
    HINWEIS: Die CaCl2-Lösung ist filtersterilisiert und darf nicht autoklaviert werden.
  5. Die WP werden 30 s lang bei 13.200 × g bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand verworfen. Waschen Sie die Partikel, indem Sie sie vorsichtig in 200 μl 100 % EtOH bei -20 °C resuspendieren.
  6. Die WP werden 30 s lang bei 13.200 × g bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand verworfen. Wiederholen Sie den Waschvorgang.
  7. Resuspendieren Sie die WPs in 60-70 μl Raumtemperatur 100 % EtOH mit einer Pipettenspitze; Nicht wirbeln.
    HINWEIS: Um die Qualität der Plasmide zu gewährleisten, sollte die DNA-Beschichtung am selben Tag wie die biolistische Transformation durchgeführt werden.

3. Biolistische Materialaufbereitung

  1. Vor dem Beschuss werden sechs Makroträgerhalter (Abbildung 5) in einem Autoklaven sterilisiert und gründlich getrocknet. Alternativ können Sie sie in EtOH einweichen und mit Hilfe einer Pinzette mit einer Flamme sterilisieren. Lege sie auf eine sterile Glasplatte.
  2. Bei der DNA-Präzipitation (10 min Inkubation auf Eis in Schritt 2.4) werden mit Hilfe einer sterilen Pinzette jeweils sechs Makrocarrier (oder fliegende Scheiben) in einen der sechs Makrocarrier-Halter eingeführt.
    HINWEIS: Sterilisieren Sie die Makrocarrier nicht.
  3. Mischen Sie die DNA-beschichteten WPs mit der Pipette. Geben Sie 10 μL der WPs auf jede Makroträgeroberfläche und verteilen Sie sie mit der Pipettenspitze über die gesamte Oberfläche. Geben Sie bei Bedarf einige zusätzliche Mikroliter 100 % EtOH auf die Makroträgeroberfläche, um eine gleichmäßige Verteilung der WPs zu erzielen. Lassen Sie die Suspension ~20 min bei Raumtemperatur trocknen.

4. Vorbereitung der Hefezellen und Bombardementplatten

  1. Inokulieren Sie den rho 0-Rezeptorstamm auf 2 ml YPR-Medium (Tabelle 2). Anbau für eine Nacht bei 30 °C in einem rotierenden Rad.
  2. 300 μl der Kultur in 30 ml frischem YPR-Medium verdünnen. Grow bei 30 °C und 200 U/min auf einem Rotationsschüttler für zwei Nächte, bis die Kultur gesättigt ist.
  3. Die Hefezellen bei 600 × g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Den Überstand verwerfen und die Hefezellen in 600 μl YPD-Medium resuspendieren (Tabelle 2).
  4. Mit einem sterilen Glasgriff 100 μl der Hefezellsuspension auf eine feste Bombardement-Medium-Platte verteilen.
    HINWEIS: Dem Bombardement-Medium darf die Auswahlmarkierung des 2-μ Plasmids fehlen, das für die Transformation verwendet wird.
  5. Wiederholen Sie Schritt 4.4 für die anderen fünf Platten.
  6. Vor dem Beschuss 1-3 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren, um sicherzustellen, dass das flüssige Medium vollständig von der Oberfläche der Platte absorbiert wird.

5. Erzeugung eines synthetischen Rho-Stammes durch biolistische Transformation

HINWEIS: Bevor Sie beginnen, lesen Sie unbedingt die Bedienungsanleitung für das biolistische Gerät. Wir werden das Protokoll der referenzierten Geräte beschreiben (Materialtabelle und Abbildung 5).

  1. Reinigen Sie die Kammer des biolistischen Partikelabgabesystems mit 70% Ethanol, um eine Kontamination zu vermeiden, und lassen Sie es mindestens 10 Minuten stehen. Wischen Sie die Oberfläche kurz vor dem Bombardement mit einem sauberen Papiertuch ab.
  2. Öffnen Sie die Ventile des Heliumtanks, um einen Wert von etwa 2.000 psi einzustellen.
  3. Schalten Sie das Gerät ein und schalten Sie die Vakuumquelle ein.
  4. Legen Sie den Makroträger mit einer Pinzette nach unten auf den Makroträgerhalter.
    HINWEIS: Verwenden Sie nicht das mit dem Gerät gelieferte Stoppsieb.
  5. Schrauben Sie den Deckel des Makroträgers auf den Makroträger. Alle Teile zusammen bilden das Microcarrier-Startsystem (Abbildung 5).
  6. Platzieren Sie das Microcarrier-Startsystem in der Vakuumkammer auf der fünften Ebene von unten.
  7. Platzieren Sie eine der Platten mit dem Rasen rho0 auf der zweiten Ebene vom Boden der Kammer aus. Stellen Sie sicher, dass die Platte nach oben zeigt und ohne Deckel ist.
  8. Legen Sie mit einer sterilen Pinzette eine Berstscheibe auf die Haltekappe. Schrauben Sie die Haltekappe auf das Beschleunigungsrohr; Stellen Sie sicher, dass die Haltekappe fest sitzt.
    HINWEIS: Behandeln Sie die gerissenen Bandscheiben nicht mit Isopropanol, wie in der Bedienungsanleitung empfohlen, da wir beobachtet haben, dass die Umwandlungseffizienz abnimmt.
  9. Schließen Sie die Tür der Vakuumkammer.
  10. Bringen Sie den VAC/VENT/ HOLD-Schalter in die VAC-Position . Wenn ein Vakuum von 25-28 inHg erreicht ist, stellen Sie den VAC/VENT/HOLD-Schalter in die Position HOLD .
    HINWEIS: Beachten Sie, dass das erreichbare Vakuum je nach Meereshöhe variieren kann. Wir hatten Erfolg, 25 inHg zu erreichen.
  11. Drücke den FIRE-Schalter , um die WPs abzuschießen. Warte, bis der Druck im Beschleunigungsrohr 1.300 psi erreicht, dann bricht die Berstscheibe und macht ein Knallgeräusch.
  12. Unmittelbar nach dem Bruch der Berstscheibe werden der FIRE-Schalter und das Vakuum freigegeben, indem der VAC/VENT/ HOLD-Schalter in die Position VENT gebracht wird.
  13. Entfernen Sie vorsichtig mit einer sterilen Pinzette alle Rückstände der Berstscheibe, die sich auf der Oberfläche der Platte befinden, und decken Sie die Platte mit ihrem Deckel ab.
  14. Wiederholen Sie den Vorgang für die restlichen fünf Platten und setzen Sie in jeder Runde eine neue Berstscheibe und einen neuen Makroträger ein.
  15. Schließen Sie am Ende das Hauptventil des Heliumtanks.
  16. Schließen Sie die Kammer und bauen Sie ein Vakuum auf, indem Sie den VAC/VENT/ HOLD-Schalter in die VAC-Position bringen. Befreien Sie das System von jeglichem Heliumdruck, indem Sie den FIRE-Schalter einige Male drücken und wieder loslassen. Wiederholen Sie den Vorgang bei geöffneter Tür.
  17. Schalten Sie die Vakuumpumpe und die Bombardement-Ausrüstung aus.
  18. Reinigen Sie das Zuführsystem mit 70 % EtOH. Waschen Sie die Makroträgerstützen mit einer 0,1%igen SDS-Lösung; Mit sterilem destilliertem Wasser und 100% EtOH abspülen.

6. Selektion synthetischer Rho-Kolonien

  1. Die Bombardementplatten 5-7 Nächte bei 30 °C inkubieren.
    HINWEIS: Es ist wichtig, die Platten täglich auf Verschmutzungen zu überprüfen. Bei Bedarf kann der kontaminierte Bereich mit einem sterilen Spachtel ausgeschnitten werden, um eine weitere Kontamination zu vermeiden.
  2. Beimpfen Sie den Testerstamm des entgegengesetzten Paarungstyps über Nacht in 2 mL YPD-Medium (siehe das spezifische Beispiel in Abbildung 2D,E).
  3. Beimpfen Sie 150 μl der Stammkultur des Testers auf einer YPD-Platte. Verteilen Sie den Tester mit einem sterilen Glasgriff gleichmäßig auf der Plattenoberfläche. Lass die Platte mindestens 5 min trocknen.
  4. Stelle Repliken der Bombardementplatten mit Samt-Replizierpads und einem Replikatorstempel her.
    1. Replizieren Sie auf einer Dropout-Mediumplatte, die dem transformierten 2-μ-Plasmid-Auxotrophiemarker entspricht. Das Wachstum dauert eine Inkubation über Nacht bei 30 °C. Danach bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C lagern. Diese Platte ist die Masterplatte.
    2. Replizieren Sie es auf der YPD-Platte, die den Rasen des Testers aus Schritt 6.3 enthält. Zwei Nächte lang bei 30 °C inkubieren. Anschließend repliziert man diese Platte auf dem selektiven Medium, um das Vorhandensein des mitochondrialen Gens von Interesse, beispielsweise eines Atemmediums oder eines Mediums, dem Arginin fehlt, nachzuweisen, und inkubiert über Nacht bei 30 °C. Nur die Zellen, die das synthetische bakterielle Plasmid in den Mitochondrien beherbergt haben, wachsen nach der Paarung mit dem Testerstamm auf dem Selektivmedium.
  5. Identifizieren Sie auf der Masterplatte (Schritt 6.4.1) die entsprechenden Völker, die in Schritt 6.4.2 gewachsen sind.
    HINWEIS: Da die Beschussplatte (und damit die Masterplatte) mit Transformantenkolonien überfüllt ist, kann es schwierig sein, die positiven Kolonien zu identifizieren, die auf der Gegenplatte des Testers beobachtet wurden. Aus diesem Grund ist es sehr empfehlenswert, auf jeder Seite aller Platten mit einem Permanentmarker ein paar kleine Linien zu zeichnen. Zeichnen Sie ähnliche Linien auf den Ring des replizierenden Stempels. Diese Linien sind hilfreich beim Ausrichten und Lokalisieren positiver Kolonien auf der Masterplatte (siehe Beispiel in Abbildung 2D).
  6. Reinigen Sie die positiven Kolonien, indem Sie sie von der Master-Platte auf eine zweite selektive Dropout-Platte streichen, wie in Schritt 6.4.1. Zwei Nächte bei 30 °C inkubieren.
    HINWEIS: Es ist wichtig, dass das Schlieren das Wachstum einzelner Völker ermöglicht, um einen reinen Stamm zu gewährleisten.
  7. Wiederholen Sie den Auswahlprozess (Schritte 6.2-6.5), um das Vorhandensein des bakteriellen Plasmids in den Mitochondrien zu bestätigen.
    HINWEIS: In der Regel kann dieser Vorgang zwei weitere Male wiederholt werden, um stabile synthetische Stämme auszuwählen.
  8. Sobald der synthetische Rho-Stamm die Plasmid-DNA in den Mitochondrien stabil hält, wählen Sie 3-5 verschiedene positive Kolonien aus und inokulieren Sie sie in 2 ml YPD. Verwenden Sie diese Kultur, um einen Kryovialfond herzustellen (durch Mischen von 600 μl Kultur und 600 μl 50 % Glycerin, um sie bei -70 °C zu konservieren) und um die Plasmidsequenz durch Zytoduktion in die gewünschte mtDNA einzufügen (Schritt 6.7).
    ANMERKUNG: Da kein Selektionsdruck besteht, um das transformierte Plasmid in den Mitochondrien aus dem synthetischen Rho-Stamm aufrechtzuerhalten, kann das Plasmid leicht verloren gehen. Daher empfehlen wir, die Zytoduktion so schnell wie möglich durchzuführen.

7. Integration der im synthetischen Rho-Stamm vorhandenen Konstruktion in die Zielstelle im mitochondrialen Genom durch Zytoduktion

  1. Beimpfen Sie zwei Röhrchen mit 3 mL YPD-Medien , eines mit den Spenderzellen (synthetische Rho-Zellen) und eines mit den Akzeptorzellen (Hefezelle, bei der die endgültige Konstruktion erwartet wird). Über Nacht bei 30 °C inkubieren.
  2. Mischen Sie 750 μl des Spenderstamms und 250 μl des Rezeptorstamms in einem sterilen Mikroröhrchen (Verhältnis 3:1).
  3. Zentrifugieren Sie die Mischung 1 Minute lang bei 13.200 × g; Entsorgen Sie den Überstand. Nehmen Sie mit einer 1-ml-Pipettenspitze, bei der das Ende abgeschnitten ist, einen Tropfen des Zellpellets und geben Sie es auf eine YPD-Platte. Bei 30 °C für 2-4 h inkubieren.
    HINWEIS: Um eine Kreuzkontamination zu vermeiden, geben Sie nicht mehr als zwei Zellsuspensionen in eine einzige Platte (siehe Beispiel in Abbildung 4A).
  4. Nehmen Sie eine kleine Menge der Zellmischung, resuspendieren Sie sie in 15 μl sterilem Wasser auf einem Objektträger und legen Sie ein Deckglas auf. Überprüfen Sie unter einem Lichtmikroskop mit einem 40x- oder 100x-Objektiv auf das Vorhandensein von Schmoosen; Diese charakteristische Form zeigt sich, wenn zwei Gegenstücktypen vorhanden sind (Abbildung 3B).
  5. Wenn shmoos vorhanden sind, resuspendieren Sie eine kleine Menge (~0,5 mm3) der Zellmasse in 2 mL YPD-Medium. 2 h bei 30 °C in einem rotierenden Rad inkubieren, damit sich die zweikernigen Zygoten erholen können.
  6. Mischen Sie die Mischung und verdünnen Sie 10 μl der Zellsuspension in 990 μl sterilem Wasser (1:100 Verdünnung). Verwenden Sie Glasperlen oder einen sterilen Glasgriff, um 100 μl der Zellverdünnung auf ein Dropout-Medium zu verteilen, in dem nur der Akzeptorstamm (und sporadische Diploide) wachsen. 2-3 Nächte bei 30 °C inkubieren.
  7. Replizieren Sie die resultierenden Kolonien auf den erforderlichen selektiven Medien, wie in der Einleitung erläutert (Stufe 4; siehe Abbildung 4C für ein spezifisches Beispiel).
  8. Nach der Identifizierung positiver Kolonien werden diese auf demselben selektiven Medium wiederhergestellt, um den haploiden Stamm zu reinigen, der die interessierende mtDNA trägt.
  9. Wählen Sie mindestens zwei positive Kolonien aus und züchten Sie sie über Nacht auf 2 ml YPD-Medium bei 30 °C. Erstellen Sie ein kryogenes Backup, indem Sie 600 μl 50 % Glycerin mit 600 μl der gesättigten YPD-Kultur mischen. Bei -70 °C lagern.
  10. Isolierung der DNA der resultierenden Stämme31,32. Amplifizieren Sie die gewünschte Region durch PCR und Sequenzierung, um das Vorhandensein der mitochondrialen Mutation zu bestätigen.
    HINWEIS: Jede positive Kolonie ist ein technisches Replikat, das unabhängig bestätigt werden muss, um die korrekte Sequenz im mitochondrialen Genom zu gewährleisten.

Ergebnisse

In diesem Abschnitt werden einige repräsentative Ergebnisse aus den verschiedenen Stadien der mitochondrialen Transformation vorgestellt. Abbildung 6 zeigt ein Bombardement-Verfahren. Die synthetischen rho-Zellen trugen ein bakterielles Plasmid mit dem Reportergen ARG8m, das die kodierende Sequenz eines mitochondrialen Gens ersetzen wird (Abbildung 6A). Nach dem Bombardement wurde die Platte auf einem Medium repliziert, dem Uracil (-URA) fehlte; Dies ist die Masterplatte (Abbildung 6B). Die wachsenden Kolonien haben den Hefeexpressionsvektor mit dem URA3-Auxotrophiemarker. Gemäß Protokollabschnitt 6 wurde die Beschussplatte auch auf einem YPD-Medium repliziert, das einen Rasen des Testerstammes enthielt. In diesem Fall beherbergte der Testerstamm ein defektes Allel des ARG8m-Gens im mitochondrialen Genom (ARG8m-1)1. Nach 2 Nächten Inkubation paarten sich der Testrasen und die Transformantenzellen und die Mitochondrien fusionierten. Diese Platte wurde auf einem Medium repliziert, dem Arginin fehlte. Nur die Diploide, die das mitochondriale Plasmid enthielten, konnten auf diesem Selektionsmedium wachsen, da das im synthetischen rho- Stamm vorhandene ARG8m-Gen das defekte ARG8m-1 aus dem mitochondrialen Genom des Testerstamms ersetzte.

Die Anzahl der positiven Kolonien variiert in der Regel zwischen null und 20 pro Platte. Im vorliegenden Beispiel wurden vier positive synthetische Rhokolonien erhalten, die durch Streifen auf einem uracilarmen Medium gereinigt wurden. In der ersten Reinigungsrunde wurden neben den positiven auch viele negative Kolonien erhalten. Nach zwei oder drei Reinigungsrunden ist es jedoch möglich, den reinen positiven synthetischen Stamm zu erhalten. In Abbildung 6C zeigten wir ein paar positive synthetische Rho-Kolonien nach drei Reinigungs- und Testrunden. Die meisten Kolonien von der -URA-Masterplatte sind positiv für die Prüfsonde. Interessanterweise enthalten nicht alle Zellen einer positiven Kolonie das mitochondriale Plasmid, was darauf hindeutet, dass das transformierte Plasmid in einer Population der Kolonie verloren gegangen ist. Dieses Ergebnis ist zu erwarten, da es keinen Selektionsdruck gibt, das mitochondriale Plasmid zu halten, wodurch es instabil wird. Ein synthetischer Rho-Stamm, wie er in Abbildung 6C gezeigt ist, kann jedoch zum nächsten Schritt, der Zytoduktion (Protokollabschnitt 7), überführt und zur Vorbereitung von Brühen für die Lagerung bei -70 °C verwendet werden. Abbildung 6D zeigt auch die dritte Runde der Aufreinigung eines synthetischen Rho-Stammes. Da die Transformanten in diesem Fall jedoch praktisch nicht in der Lage waren, das mitochondriale Plasmid aufrechtzuerhalten, wurden sie verworfen.

Wir haben eine allgemeine Strategie zur Selektion positiver synthetischer Rho-Kolonien beschrieben, die in Abbildung 7A dargestellt ist. In diesem Fall weist das mitochondriale Konstrukt, das in den synthetischen rho-Zellen vorhanden ist, mehrere hundert Nukleotide auf, um mit der mitochondrialen DNA aus dem Testerstamm zu rekombinieren (z. B. rekombiniert das Konstrukt COX1ΔC15 im synthetischen rho- Stamm mit dem mutierten Gen cox1D369N auf der mitochondrialen DNA des Testers (Abbildung 2D); oder das cox1Δ::ARG8m-Konstrukt im synthetischen rho- Stamm mit dem mutierten Gen ARG8m-1 in der mitochondrialen DNA des Testers (Abbildung 6A). Wenn jedoch kein Testerstamm zur Verfügung steht, um die positiven synthetischen Rhozellen von Interesse auszuwählen, gibt es einen indirekten Ansatz, um sie auszuwählen33. In diesem Fall muss das bakterielle Plasmid auch ein Fragment eines mitochondrialen Gens enthalten, wie COX2 oder COX3. Der Testerstamm enthält eine nicht-funktionelle Kopie des mitochondrialen cox2 - oder cox3-Gens . In dem gegebenen Beispiel kann die Sequenz des cox3-Fragments , die in dem bakteriellen Plasmid vorhanden ist, die in den Mitochondrien des Testers vorhandene cox3-Sequenz ergänzen und nach der Rekombination ein funktionelles COX3-Gen bereitstellen. Nach der Kreuzung der synthetischen Rhozellen mit dem Testerstamm können Diploide nur atmen, wenn die synthetischen Rhozellen das bakterielle Plasmid in den Mitochondrien enthalten (Abbildung 7B).

Abbildung 8 veranschaulicht den Zytoduktionsprozess. Die Donor- und Akzeptorstämme weisen Leucin- bzw. Adenin-Auxotrophie auf. Daher wurde die Mischung nach der Zytoduktion auf ein Medium ohne Leucin aufgebracht, um das Wachstum der Spenderzellen zu verhindern. Dies ist die Masterplatte. Zu diesem Zeitpunkt wachsen nur Haploide mit dem nuklearen Hintergrund des Akzeptorstamms und sporadischen Diploiden. Um Diploide auszuschließen, wurde die Master-Platte auf Medien ohne Adenin repliziert, wo nur Diploide wachsen können. In diesem Beispiel ist die resultierende mitochondriale DNA nach der Zytoduktion mutiert, und die beabsichtigten Haploide können auf dem Atmungsmedium von Ethanol/Glycerin nicht wachsen. Daher muss die Master-Platte auf YPD-Platten mit einem Rasen eines Testerstammes repliziert werden. Die Position der positiv atmenden Diploide gibt an, welche Kolonien von der Masterplatte gereinigt werden sollen. Zwei Reinigungsrunden sind notwendig, um den endgültigen, reinen Stamm zu erhalten. Die mitochondriale Integration wird in der Regel durch PCR-Amplifikation der umgebenden Region von Interesse und Sequenzierung bestätigt.

Schließlich können Gene in den spezifischen Locus im mitochondrialen Genom eingefügt werden. Zum Beispiel können Reportergene unter anderem am 3'-Ende der kodierenden Sequenz eines mitochondrialen Gens eingefügt werden oder die kodierende Region des mitochondrialen Gens ersetzen (Abbildung 9A). Gene können jedoch auch an ektopischen Stellen innerhalb nicht-kodierender Regionen des mitochondrialen Genoms eingefügt werden. Die häufig verwendete Stelle befindet sich 295 nt stromaufwärts des Startcodons des COX2-Gens . Die Veränderung in dieser nicht-kodierenden Region ist harmlos13. Um das Gen erfolgreich in der ektopischen Stelle zu exprimieren, muss es von einem mitochondrialen Promotor und Terminator flankiert werden. Die flankierenden COX2-Sequenzen sind am optimalsten, da COX2 das Mitochondrien-Gen mit den kürzesten untranslatierten 5'- und 3'-Sequenzen ist (73 nt der 5'-UTR und 119 nt der 3'-UTR) (Abbildung 9B). Für diese Konstruktion weist das bakterielle Plasmid folgende Eigenschaften auf: Das Template ist ein Plasmid, das die COX2-kodierende Region enthält, mit 1120 nt stromabwärts des Stopp-Codons und 670 nt stromaufwärts des AUG-Startcodons , genannt pXPM5025. Das interessierende Gen ist so konstruiert, dass es von 73 nt des COX2 5'-UTR und 119 nt des COX2 3'-UTR flankiert wird. Danach wurde, wie bereits angedeutet, 295 nt stromaufwärts des COX2 AUG-Startcodons eingefügt, bei dem es sich um eine nichtkodierende Region handelt (Abbildung 9B). Beachten Sie, dass dieses Plasmid und folglich im resultierenden mitochondrialen Genom die COX2 5'- und 3'-UTRs dupliziert werden. Nach dem Beschuss dieses Plasmids werden die synthetischen Rho-Zellen für die Zytoduktion mit einem Rezeptorstamm paart, der eine ausgedehnte Deletion der COX2-Region (cox2-62-Allel ) aufweist)1. Während der Zytoduktion rekombiniert das mitochondriale Plasmid des synthetischen Rho-Stammes mit der mitochondrialen DNA aus dem Akzeptor. Das resultierende mitochondriale Genom hat die ektopische Konstruktion und ein WT-COX2-Gen . Daher können die positiven Kolonien in einem Atemmedium wachsen (Abbildung 9B).

Diagramm des Startsystems von Mikrocarriern, Heliumdruckaufbau, Probenplatte, Beschleunigungsrohr.
Abbildung 5: Schematische Darstellung der Hochgeschwindigkeits-Mikroprojektil-Bombardement-Ausrüstung. Unser Labor verwendet das Biolistic-PDS-1000/He Particle Delivery System (Materialtabelle). Abkürzung: WPs = Wolframpartikel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Hefetransformationsdiagramm und Petrischale-Ergebnisse, die die Funktionalität des ARG-Gens in synthetischer mtDNA zeigen.
Abbildung 6: Beispiel einer Hochgeschwindigkeits-Mikroprojektil-Transformationsplatte. (A,B) Nach dem Beschuss wurden die Platten 5-7 Nächte lang bei 30 °C inkubiert. Wenn eine Verunreinigung wächst (gekennzeichnet durch einen blauen Pfeil), kann sie mit einem sterilen Spatel herausgeschnitten werden. Nach der Replikation der Platten auf dem Selektionsmarkermedium (in diesem Fall -URA) wurde die Masterplatte ebenfalls auf das Vorhandensein des mitochondrialen Plasmids getestet, indem sie mit einem Testerstamm gepaart wurde. In diesem Fall hat der Testerstamm das nicht-funktionelle Allel ARG8m-1 1. Nach 2-wöchiger Paarung und Replikation der Platte auf einem Medium ohne Arginin (-ARG) entstanden vier positive Kolonien (mit roten Pfeilen gekennzeichnet). (C) Die positiven synthetischen Rho-Kolonien wurden gereinigt, indem sie auf -URA-Medium auffrischt wurden, und es wurden Repliktests durchgeführt, wie zuvor beschrieben. Diese Platten stellen die dritte Runde der Reinigung dar. (D) Einige positive synthetische Rho-Kolonien verloren das mitochondriale Konstrukt. Abkürzungen: mtDNA = mitochondriale DNA; -URA = Mangel an Uracil; -ARG = Mangel an Arginin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Prozessdiagramm des bakteriellen Plasmidintegrationsprozesses; Gentransfer in die mtDNA; Gentechnik-Konzept.
Abbildung 7: Diagramm, das zeigt, wie positive synthetische Rhokolonien nach dem Bombardement selektiert werden. (A) Das bakterielle Plasmid enthält eine nicht-funktionelle mutierte Version eines mitochondrialen Gens. Zum Nachweis werden die synthetischen Rho-Kolonien mit einem Testerstamm verpaart, der eine andere nicht-funktionelle Mutation desselben Gens in der mitochondrialen DNA enthält. Nach der Paarung rekombinieren die mutierten mtDNAs, und ein funktionsfähiges Gen kann durch Komplementierung wiederhergestellt werden. Hier wächst der Diploide auf einem selektiven Medium, auf dem weder der synthetische Rho-Stamm noch der Tester wachsen können. (B) In diesem Fall enthält das Plasmid eine zusätzliche Sequenz eines mitochondrialen Gens (d. h. ein Stück COX3). Nach der Transformation wird der synthetische Rho-Stamm nach seiner Fähigkeit ausgewählt, eine COX3-Mutation im Testerstamm zu ergänzen, so dass nur die Diploide auf einem selektiven Medium (d.h. Atemmedium) wachsen können. Diese Methode ist praktisch, wenn kein Teststamm für das interessierende Gen verfügbar ist. Der Nachweis positiver synthetischer Rho-Kolonien ist in diesem Fall indirekt. Abkürzung: mtDNA = mitochondriale DNA. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Petrischale-Experiment; Zytoduktionsprozess; Beobachtung des Hefewachstums; Bewertung des genetischen Transfers.
Abbildung 8: Beispiel für eine Zytoduktion zur Integration eines Konstrukts in den Ziellocus in der mitochondrialen DNA. Nach der Paarung und Genesung wurden die gemischten Zellen und zweikernigen Zygoten auf einem Medium plattiert, das Leucin fehlte. Da der Spenderstamm in diesem Fall das Leu2,3-112-Allel besitzt, verhindert dieses Medium das Wachstum des Spenders. Diese Platte wurde auf demselben Medium (Master-Platte) repliziert, in einem Medium, in dem nur Diploide wachsen können (-ADE) und in einem Medium, in dem der Akzeptor mit der beabsichtigten Mutation wachsen kann (rote Pfeile). In diesem Fall können weder die Spender- noch die Rezeptorzellen auf Atemwegsmedien wachsen. Nur das nach der Verpaarung mit einem Rasen einer Tester-Sorte resultierende Diploid kann auf einem Atemmedium wachsen. Diese atmenden diploiden Kolonien sind ein Leitfaden für die Auswahl und Reinigung der positiven Kolonien von der Masterplatte. Abkürzungen: -LEU = fehlendes Leucin; -ADE = Mangel an Adenin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diagramm des mitochondrialen Gentransfers mit synthetischem Rho-Donor zum mtDNA-Akzeptorprozess.
Abbildung 9: Diagramm, das zeigt, wie das mutierte mitochondriale Konstrukt (das im synthetischen Rho-Stamm vorhanden ist) in den Akzeptorstamm integriert wird. (A) In diesem Beispiel trägt der Akzeptorstamm das ARG8 m-Reportergen, das die Codons des interessierenden Gens ersetzt. Die synthetische rho-DNA enthält eine mutierte Version dieses Gens. Das Plasmid und die mitochondriale DNA rekombinieren durch die 5'- und 3'-Flankenregionen, und der ARG8m-Reporter wird durch die mutierte Sequenz des interessierenden Gens ersetzt. (B) Fremde Gene können ektopisch in bestimmte Regionen des mitochondrialen Genoms eingefügt werden 7,13,36. In diesem Beispiel kann ein Gen an einer Position 295 nt stromaufwärts des COX2-Gens eingeführt werden. Dabei handelt es sich um eine nicht-kodierende Region der mtDNA. Ein fremdes Gen von Interesse wird von 73 nt und 119 nt des COX2 5' UTR bzw. 3' UTR flankiert. Diese Konstruktion wird in ein Plasmid eingefügt, das das COX2-Gen plus 670 nt und 1120 nt der 5'- und 3'-UTR-Regionen enthält. Der synthetische Rho-Stamm (Donor) trägt dieses Konstrukt in den Mitochondrien. In diesem Fall weist der Akzeptorstamm (XPM13)7 eine signifikante Deletion des cox2-Gens (Allel cox2-62)1 auf. Nach der Zytoduktion rekombiniert die mitochondriale DNA des Donors und des Akzeptors. Das COX2-Gen wird wiederhergestellt, und das interessierende Gen wird an der ektopischen Stelle eingefügt (295 nt stromaufwärts des COX2-Gens). Abkürzungen: mtDNA = mitochondriale DNA; nt = Nukleotide. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

HefestammGenotypSCHIRI
NAB69Mata,ade2-101, arg8-delta::hisG, ura3-52, kar1-1 (rho0)1
NB71Matα, ade2-101, ura3-52, leu2-delta, arg8-delta::URA3, kar1-1, (cox3Δ:ARG8m-1)1
XPM10bMatα, lys2, leu2-3,112, arg8::hisG, ura3-52 (rho+ , cox1∆::ARG8m)7
XPM209Matα, lys2, arg8::hisG, ura3-52, leu2-3, 112, (rho+, ΔΣai, COX1ΔC15)26
XPM199Mata,ade2-101, arg8-delta::hisG, ura3-52, kar1-1 (rho-, pXPM61)26
XPM13Matα, lys2, leu2-3,112, arg8::hisG,ura3-52, his3-deltaHindIII (rho+,cox2-62, cox1∆::ARG8m)7
L45Matα, ade1, op1 (rho+, cox1-D369N)28

Tabelle 1: Beispiele für Hefestämme, die bei der biolistischen Transformation und Zytoduktion verwendet werden.

WachstumsmedienKomponenten
YPD2% Glukose, 2% Bactopepton, 1% Hefeextrakt
YPR2% Raffinose, 2% Bactopepton, 1% Hefeextrakt
YPEG*3% Glycerin, 3% Ethanol*1, 2% Bactopepton, 1% Hefeextrakt
Drop-out-Medien2 % Glukose, 6,8 % Hefestickstoffbasis mit (NH4)2SO4, Drop-out-Aminosäuremischung*2
Bombardierung von Medien5 % Glukose, 6,8 % Hefestickstoffbase mit (NH4)2SO4, 1 M Sorbit, Drop-out-Aminosäuremischung*2,3.
*1 Ethanol nach dem Autoklavieren hinzufügen, wenn das Medium warm ist.
*2 Die Menge der Aminosäuremischung kann je nach verfügbarem Lagerbestand oder der vom Hersteller angegebenen Menge variieren.
*3 Für das Beschussmedium die Aminosäuren und Stickstoffbasen je nach Hefestamm nach Bedarf hinzufügen. Stellen Sie sicher, dass die Zusammensetzung spezifisch für die Auxotrophie des 2-μL-Plasmids ist, das für die Auswahl verwendet wird.

Tabelle 2: In diesem Protokoll verwendete Hefewachstumsmedien.

Diskussion

In der vorliegenden Arbeit wurde beschrieben, wie Mitochondrien aus der Hefe S. cerevisiae erfolgreich transformiert werden können. Der Prozess, vom Hochgeschwindigkeits-Mikroprojektilbeschuss bis zur Reinigung des beabsichtigten Hefestammes, dauert ~8-12 Wochen, je nachdem, wie viele Reinigungsrunden des synthetischen Rho- Stammes notwendig sind. Einige der kritischen Schritte der Methode sind wie folgt. Erstens: Je größer die flankierenden Regionen, die um die Mutationsstelle im mitochondrialen Genkonstrukt hinzugefügt werden, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Integration der Zielmutation. Die Mindestgröße der flankierenden Bereiche beträgt ~100 nt; Es wird jedoch dringend empfohlen, mehr als 500 NT auf jeder Seite der Mutation zu verwenden. Zweitens wird bei der Auswahl der synthetischen Rho-Kolonien nach der Transformation empfohlen, nicht mehr als 3-4 Reinigungsrunden durchzuführen; Andernfalls besteht ein hohes Risiko, dass das mitochondriale Konstrukt schließlich verloren geht, da kein Selektionsdruck besteht, das Plasmid in den Mitochondrien zu halten. Drittens, um Schäden am Benutzer oder an der Ausrüstung zu vermeiden, müssen Sie das Handbuch der Bombardement-Maschine sorgfältig lesen, bevor Sie mit dem Vorgang beginnen. Dieses Gerät ist empfindlich und verwendet hohen Druck und Vakuum.

Eine Einschränkung dieses Verfahrens besteht darin, dass bisher nur Hefe und die Grünalge C. reinhardtii Kandidaten sind, um Mitochondrien mit dieser Methode zu transformieren. Es wäre relevant, wenn wir ortsgerichtete Mutationen im mitochondrialen Genom von anderen Organismen einführen könnten. Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass es schwierig ist, viele verschiedene Konstrukte in derselben Sitzung zu transformieren. Es wird empfohlen, für jede Konstruktion sechs Transformationen durchzuführen, von denen jede getestet, ausgewählt und gereinigt werden muss. Dies führt dazu, dass über 50 Platten mit Medien nur zur Gewinnung reiner Rho-Kolonien einer einzigen mitochondrialen Mutation verwendet werden.

Trotz dieser Einschränkungen hat die Fähigkeit, das mitochondriale Genom der Hefe zu manipulieren, wesentlich zum Verständnis vieler Wege der Biogenese von Atmungskomplexen beigetragen. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um Reportergene einzuführen, um die mitochondriale Translationzu überwachen und zu quantifizieren 1,7,36,37, mitochondriale Genezu unterbrechen 38, Assemblierungschaperone von Atmungskomplexen zu identifizieren 39, die Mechanismen der gekoppelten mitochondrialen Translation und Assemblierung besser zu verstehen 7,11,12,36und suchen nach Suppressoren, wenn die Expression eines mutierten mitochondrialen Gensverfolgt wird 40. Obwohl bereits früher über bestimmte Ansätze zur Manipulation des mitochondrialen Genoms bei Säugetieren berichtet wurde41, gibt es für diese Organismen keine weit verbreitete Methode zur Transformation der mitochondrialen DNA.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Diese Veröffentlichung wurde unterstützt von Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), UNAM [IN223623 zu XP-M]. Die UPD ist ein CONAHCYT Fellow (CVU:883299). Wir danken Dr. Ariann Mendoza-Martínez für die technische Hilfe bei den lichtmikroskopischen Bildern. Biorender-Lizenzen: DU26OMVLUU (Abbildung 2); BK26TH9GXH (Abbildung 3); GD26TH80R5 (Abbildung 4); PU26THARYD (Abbildung 7); ML26THAIFG (Abbildung 9).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 mL PipettenspitzenAxygenT-1000-B
1,5 mL MikroröhrchenAxygenMCT-150-C
10 μ L PipettenspitzenAxygenT-10-C
15 mL Röhrchen mit konischem Boden AxygenSCT-25ML-25-S
200 μ L PipettenspitzenAxygenT-200-Y
50 mL konischer Boden   RöhrchenAxygenSCT-50ML-25-S
AfiIINew England BioLabsR0520S
AgaroseSeaKem50004
Analytische WaageOHAUSARA520
AutoklavTOMYES-315
Bacto AgarBD214010
Bacto PeptonBD211677
Biolisitic Macrocarrier Halter BIO-RAD1652322
BunsenbrennerVWR89038-528
CalciumchloridFisher ScientificC79-500
CSM -ADEFormediumDCS0049
CSM -ARGFormediumDCS0059
CSM -LEUFormediumDCS0099
CSM -URAFormedium
KulturglaskolbenKIMAX KIMBLE25615
KulturglasröhrchenPyrex9820
DextroseBD215520
EthanolJT Baker 9000
PinzetteMillipore620006
GlasperlenSigmaZ265926
GlasgriffSigmaS4647
GlycerinJT BAKER2136-01
Heliumtank Grad 5 (99,99 %)--
HSTaq  KitPCR BIO
MikrozentrifugueEppendorf022620100
NdeINew England BioLabsR0111L
OrbitalschüttlerNew Brunswick ScientificNB-G25
PCR-RöhrchenAxygenPCR-02-C
PDS-1000/He TM Biolistisches PartikelabgabesystemBIO-RAD165-2257
Petrischalen (100X10)BD252777
QIAprep Spin MiniprepQiagen27106
RaffinoseFormediumRAF03
Replica PlaterSciencewareZ363391
Berstscheiben 1350 PsiBIO-RAD1652330
SorbitSigmaS7547
SpermidinSigma S0266
T4 DNA-LigaseThermo ScientificEL0011
Gewebekultur-RotatorThermo Scientific88882015
Wolfram-Microcarrier M10BIO-RAD1652266
Vakuumpumpe mit einer Kapazität von 100 l/min-
Samt-PadsBel-ArtH37848-0002
Vortex Scientifc IndustriesSI-0236
Holz-Applikator-StickPROMA1820060
HefeextraktBD212750
Hefe Stickstoffbasis ohne AminosäurenBD291920
DCS0169

Referenzen

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