Methodenartikel

Perfusion der Rattenleber und Isolierung primärer Hepatozyten: ein altes Verfahren, das für die hochmoderne 3D-Organoidkultur entscheidend ist

3.1K Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/66857

⸱

22. November 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Italian Liver Foundation, 2Department of Life Sciences, University of Trieste

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt eine optimierte zweistufige Kollagenase-Leberperfusionstechnik in einem Rattenmodell vor und zeigt die Verwendung von isolierten Hepatozyten für die in vitro Langzeitkultur von 3D-Organoiden.

Zusammenfassung

Primäre Hepatozyten sind ein häufig verwendetes Werkzeug für In-vitro-Studien im Zusammenhang mit der Leber. Die Erhaltung dieser Zellen war jedoch schon immer eine Herausforderung, da sie in Kultur schnell an Morphologie, Lebensfähigkeit und Funktionalität verloren haben. Ein neuerer Ansatz zur Langzeitkultur ist die Erzeugung von dreidimensionalen (3D) Organoiden, einem In-vitro-Werkzeug , das Gewebe in einer Schale rekapitulieren kann, basierend auf der wunderbaren Fähigkeit der Leber, sich selbst zu regenerieren. Veröffentlichte Protokolle wurden entwickelt, um langfristig funktionsfähige 3D-Organoide aus primären adulten Hepatozyten (Hep-Orgs) zu gewinnen. Das hochmoderne 3D-Organoid-Werkzeug erfordert die Fähigkeit, Zellen aus adultem Gewebe zu isolieren, und dieser erste Schritt ist entscheidend für ein qualitativ hochwertiges Endergebnis. Die in den 1970er Jahren eingeführte zweistufige Kollagenase-Perfusion ist nach wie vor ein gültiges Verfahren, um einzelne Hepatozyten zu gewinnen. Ziel des vorliegenden Artikels ist es, alle entscheidenden Schritte des chirurgischen Eingriffs zu beschreiben und dadurch das Verfahren zur Isolierung primärer Hepatozyten im Rattenmodell zu optimieren. Darüber hinaus wird ein besonderes Augenmerk auf die PREPARE-Leitlinien gelegt, um die Wahrscheinlichkeit erfolgreicher Verfahren zu erhöhen und qualitativ hochwertige Ergebnisse zu gewährleisten. Ein detailliertes Protokoll ermöglicht es den Forschern, die nachgelagerte Arbeit zur Etablierung von 3D-Organoiden aus primären adulten Rattenhepatozyten zu beschleunigen und zu optimieren. Im Vergleich zu 2D-Hepatozyten waren Hep-Orgs an Tag 15 noch lebensfähig und in aktiver Proliferation, was ein langfristiges Potenzial zeigt.

Einleitung

Primäre Hepatozyten sind ein wichtiges und weit verbreitetes Werkzeug für in vitro Leberstudien. Ihre Erweiterung und Pflege war jedoch in der Vergangenheit eine Herausforderung, da sie nach einigen Tagen in der Kultur an Morphologie und Funktionalität verlieren1. Die 2D-Kultur ist insbesondere für Hepatozyten eine limitierende Bedingung, die eine polygonale Form und polarisierte Struktur mit differenzierten apikalen und basolateralen Membranen aufweisen. Tatsächlich beeinträchtigt die Adhäsion der Hepatozyten an der Platte ihre normale Aktivität, da sie zu einem flachen Zytoskelett mit begrenzter Interaktion zwischen den Zellen und zwischen den Zellen und der extrazellulären Matrix (EZM) führt, wodurch die Polarisation und die beteiligten Signalwege reduziertwerden 2.

Um die Einschränkungen dieser Methode zu umgehen, verwendeten Dunn und Kollegen3 zunächst die Kollagen-Doppelschicht. Diese Kulturmethode, die als "Sandwichkultur-Methode" bekannt ist, basiert auf der Aussaat von primären Hepatozyten zwischen den beiden Schichten der Matrix. Diese Methode hat viele Vorteile, darunter die Langzeitkultur, die Beibehaltung der polygonalen Morphologie und transkriptionelle Aktivitäten, die mit denen frisch isolierter Hepatozyten vergleichbar sind4. Ein ähnliches, auf dem gleichen Prinzip beruhendes Verfahren, bei dem die Unterlage aus Matrigel und die Überlagerung aus Kollagen besteht, hat das Vorhandensein eines gut etablierten Kanalikularnetzwerks nachgewiesen5.

Trotz der Zuverlässigkeit der Sandwich-Kulturmethode für das Hepatozytenwachstum wird in der vorliegenden Arbeit eine 3D-Organoidkultur aufgebaut, ein In-vitro-Werkzeug zur Rekapitulation von Geweben in einer Schale und eine potenzielle Brücke zur personalisierten Medizin gebildet, die die Generierung krankheitsspezifischer biologischer Erkenntnisse, die Identifizierung molekularer Ziele, die Etablierung von Medikamenten, die Einrichtung von Biobanken und die Eröffnung neuer Horizonte für innovative Technologien wie Organ-on-Chipermöglicht 6. Primäre Hepatozyten wurden in hemisphärische Matrixtröpfchen eingebettet, die als "Domes" bekannt sind, um ein robustes Wachstum von Organoiden in den Domes zu ermöglichen und den Fluss der löslichen Faktoren, einschließlich des Hepatozyten-Wachstumsfaktors (HGF) und des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF), aus dem Kulturmedium zu gewährleisten. Diese Wachstumsfaktoren aktivieren direkt Signalwege, um das Überleben der Hepatozyten zu sichern7. Leber-Organoide werden in der Regel aus Stamm-/Vorläuferzellen gewonnen, die aus embryonalen Stadien oder adulten Ratten, Mäusen, menschlicher (und auch Hunde- und Katzen-) Leber isoliert wurden8. Auch wenn die 3D-Konformation die Differenzierung von Stammzellen zu adulten Hepatozyten verbessert, fehlt diesem Werkzeug immer noch die Reife des ursprünglichen Primärgewebes9. Um dieses Problem zu überwinden, veröffentlichten 2018 zwei verschiedene Gruppen 9,10 gleichzeitig ein Protokoll zur Gewinnung einer Langzeitkultur von 3D-Leberorganoiden aus adulten primären Maus-Hepatozyten (als Hep-Orgs bezeichnet). Ihre Protokolle rekapitulieren die proliferative Schadensreaktion der Leberregeneration, indem Hepatozyten mit einem hohen Gehalt an entzündlichen Zytokinen wachsen, wie sie nach einer partiellen Hepatektomie auftreten. In der Tat zeigen die oben genannten Studien, dass Hepatozyten nach einer Verletzung12 oder wenn die Cholangiozytenproliferation unterdrückt wird13, in einen duktalen Zustand wechseln können. Ihre bipotente Kapazität ermöglicht die zelluläre Plastizität, was für komplexe Strukturen wie Organoide wichtig ist. Daher überwinden diese Protokolle das Problem der Unfähigkeit, primäre Hepatozyten in vitro zu expandieren.

Das hochmoderne 3D-Organoid-Werkzeug erfordert die Fähigkeit, Zellen aus adultem Gewebe zu isolieren, und dieser erste Schritt ist entscheidend für ein qualitativ hochwertiges Endergebnis. Während die 3D-Organoid-Präparation als eine neue und sich entwickelnde Technik angesehen werden kann (da die Organoid-Definition erst vor zehn Jahren von Lancaster14 und Huch15 geprägt wurde), ist die zweistufige Kollagenase-Perfusion ein altes Verfahren, das von Seglen in den 1970er Jahren eingeführt wurde16. Konzentriert man sich auf die neuesten Veröffentlichungen auf diesem Gebiet, so können die Protokolle von Ng17 und Shen18 als Goldstandard für die Durchführung des Verfahrens bei Ratten angesehen werden, während die Protokolle von Cabral19 und Charni-Natan20 für Mäuse angesehen werden. Es ist nicht ungewöhnlich, dass sich Forscher auf die Auswahl der besten extrazellulären Matrix (EZM) und Wachstumsfaktoren für die Entwicklung von 3D-Organoiden konzentrieren, aber auf Fehler stoßen, wie z. B. unsachgemäße chirurgische Eingriffe, geringe Lebensfähigkeit und Ausbeute der Hepatozyten oder ein hohes Maß an bakterieller Kontamination. Diese Probleme verlängern die nachgelagerten Versuche und erhöhen die Anzahl der Tiere, die für die folgenden Versuche benötigt werden. Umgekehrt ermöglicht die hohe Anzahl der gewonnenen lebensfähigen Hepatozyten, wenn die Operations- und Isolierungsverfahren gut abgestimmt sind, die Herstellung einer großen Anzahl von Organoiden, wodurch der Einsatz von Tieren eingeschränkt wird. Das vorliegende Protokoll befasst sich hauptsächlich mit diesen Fragen unter Verwendung kommerzieller Lösungen und durch die Optimierung einer präzisen Pfortaderkanülierung, die optimale Perfusions- und Verdauungsschritte mit der Leber in situ gewährleistet.

Um die Qualität, Reproduzierbarkeit und Übersetzbarkeit unserer Tierversuche zu verbessern, haben wir die PREPARE-Richtlinien sorgfältig berücksichtigt: Planning Research and Experimental Procedures on Animals: Recommendations for Excellence21. Diese Reporting-Richtlinien versuchen, die Erfolgswahrscheinlichkeit durch Planung zu erhöhen und stellen einen wichtigen Schritt bei der Umsetzung der 3R von Russel und Burch (Replacement, Reduction, and Refinement) dar. Der PREPARE-Leitfaden deckt 15 Hauptthemen ab, die je nach Forschungsprojekt bearbeitet werden sollten. Wir beschreiben die Themen, auf die wir uns bei der Planung und Vorbereitung des Projekts konzentriert haben.

Die vorliegende Arbeit zielt darauf ab, in einem umfassenden, detaillierten und konsequenten Protokoll die entscheidenden Schritte der Operation im Rattenmodell zu beschreiben, um den Forschern eine Beschleunigung und Optimierung der nachgelagerten Arbeit zu ermöglichen. Als wir uns diesen Protokollen zum ersten Mal näherten, stießen wir auf Probleme mit bakterieller Kontamination, geringer Leberverdauungseffizienz, geringer primärer Hepatozytenausbeute und geringer Lebensfähigkeit der Hepatozyten, die den Erfolg der Technik leicht beeinträchtigen können. Dieses Protokoll zeigte, wie kritische Merkmale angesprochen und gelöst werden können, und optimierte das Verfahren für die Isolierung primärer Hepatozyten von Ratten. Die Perfusion der Rattenleber und die anschließende Isolierung von primären adulten Hepatozyten sind die wichtigsten vorbereitenden Schritte für verschiedene Anwendungen. Insbesondere eignet sich dieses Protokoll für alle Verfahren, die eine gute Ausbeute an hochwertigen und lebensfähigen adulten Hepatozyten erfordern. Die Ergebnisse des Protokolls sind geeignet, um In-vitro-Modelle zur Untersuchung der Leberphysiologie und -pathologie zu etablieren.

Protokoll

Alle Verfahren und die Unterbringung der Tiere wurden gemäß den Richtlinien des italienischen Rechts und der Richtlinie der Europäischen Gemeinschaft durchgeführt. Das Versuchsprotokoll wurde vom lokalen Tierschutzausschuss und vom italienischen Gesundheitsministerium (Genehmigung Nr. 321/2022-PR) gemäß Art. 31 des Dekrets 26/2014 genehmigt.

1. Vorbereitung auf den Tiereingriff

HINWEIS: Bitte beziehen Sie sich auf Tabelle 1 für die Zusammensetzung des Mediums und des Puffers und auf die Materialtabelle für kommerzielle Details.

  1. Erwärmen Sie das Wasserbad auf 42 °C und legen Sie dann den Perfusionspuffer und 1x PBS für ca. 20 min in das Wasserbad.
    HINWEIS: Aufgrund der Enzymempfindlichkeit wird der Verdauungspuffer erst erwärmt, wenn das Perfusionsverfahren erfolgreich gestartet wurde. Halten Sie die Lösungen während des Perfusionsvorgangs im Wasserbad.
  2. Lege Williams komplettes Medium und PBS + 3% KGV auf Eis.
  3. Bereiten Sie die Peristaltikpumpe vor und verbinden Sie den Schlauch mit der Glasflasche und der Blasenfalle, die beide mit Perfusionspuffer gefüllt sind.
  4. Füllen Sie den Schlauch beim Ansaugen der Pumpe mit warmem Perfusionspuffer, um Luft zu entfernen und Ethanolreste zu waschen (niedrige Pumpendrehzahl). Dieser Schritt ist auch wichtig, um den korrekten Betrieb der Pumpe und mögliche Schlauchleckagen zu überprüfen.

2. Vorbereitung für die Isolierung von Hepatozyten

  1. Während des tierischen Eingriffs sind folgende Instrumente dem UV-Licht auszusetzen: Petrischale 100 mm, Zellsieb 100 μm, Schaber Größe M, große Pinzette, Becherglas für Eis, Schale für Eis.

3. Erstes Verfahren an den Tieren und Anästhesie

  1. Betäuben Sie die erwachsene Ratte (250-350 g Körpergewicht; 10-12 Wochen alt) durch intraperitoneale Injektion einer Anästhesiemischung (Endkonzentration für Xylazin: 22,5 mg/kg; für Ketamin: 112,5 mg/kg; ca. Endvolumen: 0,8-1,0 ml).
  2. Überwachen Sie die Narkosetiefe, indem Sie die Zehen zusammenkneifen, bis die Ratte nicht mehr auf schädliche Reize reagiert. In der Regel dauert es 5 Minuten. Die Anästhesiedosis sorgt für eine tiefe, chirurgische Anästhesie, die das Risiko von Leiden oder Belastungen während des Eingriffs minimiert
    HINWEIS: Die Ausblutung ist die sekundäre Methode der Ratten-Euthanasie, die in diesem Versuch verwendet wird, und stellt sicher, dass das Tier effektiv eingeschläfert wurde.
  3. Rasieren Sie den Bauch und reinigen Sie ihn mit 70% Ethanol, um die bakterielle Kontamination während der Operation zu reduzieren.
    HINWEIS: Da es sich um eine Operation handelt, bei der nicht überlebt wird, wird keine vollständige Asepsis aufrechterhalten.
  4. Legen Sie die Ratte in die Mitte des Seziertabletts und befestigen Sie die Gliedmaßen mit Nadeln.
  5. Machen Sie einen U-förmigen Schnitt durch die Haut und den Muskel von der Mitte des Unterbauchs bis zum Brustkorb, klemmen Sie die Haut ein und falten Sie sie zum Kopf hoch, wodurch der Darm freigelegt wird.
  6. Bewegen Sie den Darm vorsichtig auf die linke Seite des Tieres, aus der Bauchhöhle, und legen Sie die Leberpfortader und die Hohlvene frei.
  7. Führen Sie mit einer Zange einen Baumwollfaden unter die Pfortader und bereiten Sie 2 Knoten vor, die 1 cm voneinander entfernt sind und die Vene selbst umgeben.
    HINWEIS: Ein schwarzer Faden ist leichter zu visualisieren.
  8. Injizieren Sie 100-150 IE Heparin gelöst in 1x PBS (Gesamtvolumen 300 μL) in die Hohlvene, um eine Blutgerinnung zu verhindern.

4. Kanülierung und Leberperfusion

  1. Schalten Sie die Pumpe mit einer niedrigen Drehzahl ein (weniger als 1 ml/min Durchfluss).
  2. Führen Sie den 18 G Angiokath in die Pfortader auf Höhe des Fadens in einem flachen Winkel relativ zur Vene ein.
  3. Entfernen Sie die innere Nadel manuell, um die Kanüle in der Vene zu belassen. Im nächsten Schritt fließt Blut, das den Pfropfen füllt und eingeschlossene Luftblasen vermeidet.
  4. Während der Perfusionspuffer in den Schlauch fließt, verbinden Sie die Kanüle durch Drücken der C-Taste mit einem Luer-Lock-Anschluss mit dem Auslassende.
  5. Binden Sie an dieser Stelle die Knoten, einen um den Katheter in der Vene und einen um den Katheter, bevor Sie in die Vene eintreten, um den Schlauch in der richtigen Position zu stabilisieren.
  6. Schneide die Hohlvene auf, damit das Blut austreten kann. Stellen Sie sicher, dass die Leber in 2-3 s schnell (Sekunden) anschwillt und bleicht. Dies bestätigt, dass der Perfusionspuffer korrekt durch die Leber fließt.
    HINWEIS: Wenn einige Lappen rot bleiben, wird der Angiokatheter zu tief platziert. Wenn nur rote Flecken vorhanden sind, kann ein leichtes Klopfen auf die Leber die Durchblutung an den spezifischen Stellen unterstützen. Gießen Sie etwas 1x PBS über den offenen Bauch, um das Blut zu bewegen und auf Undichtigkeiten zu prüfen.
  7. Erhöhen Sie den Pumpenfluss langsam auf 10 ml/min und halten Sie ihn mindestens 10 Minuten lang, um die Reinigung der Leber vom Blut zu ermöglichen.
  8. Während der Perfusion üben Sie mit einem Wattestäbchen für 10 s Intervalle Druck auf die Hohlvene aus: Achten Sie darauf, dass die Leber beim Einklemmen anschwillt und sich beim Lösen entspannt. Wiederholen Sie den Druck regelmäßig (5-10 Mal) und prüfen Sie, ob die Leber anschwillt und sich entspannt.
    HINWEIS: Dieser Schritt dient als wichtiger Prüfpunkt für die sichtbare Validierung der Perfusion. Es war unerlässlich, um eine hohe Vitalität der Hepatozyten zu gewährleisten und die Endausbeute zu maximieren. Durch die aktive Überprüfung dieses Prozesses kann der Puffer effektiv alle Teile des Lebergefäßsystems erreichen, was eine passive Blutreinigung allein nicht erreichen würde.

5. Verdauung der Leber

  1. Wechseln Sie nach der Perfusion zum vorgewärmten Aufschlusspuffer, ohne den Durchfluss zu unterbrechen und Luftblasen im Schlauch zu vermeiden.
    HINWEIS: Eine vorübergehende Reduzierung des Durchflusses kann helfen, diesen Durchgang durchzuführen. Der Aufschlusspuffer enthält Phenolrot, was die Visualisierung des Wechsels vom Perfusionspuffer zum Aufschlusspuffer erleichtert.
  2. Erhöhen Sie die Pumpendrehzahl auf 20 mL/min und drücken Sie regelmäßig mit dem Tupfer, um die Leber zu anschwellen und zu entspannen.
  3. Nach diesem Schritt (der etwa 15 Minuten dauert) sorgen Sie dafür, dass die Leber zunehmend matschig wird. An diesem Punkt kann die Nadel entfernt werden und die Pumpe stoppt.
  4. Da die Leberkapsel nach der Verdauung brüchig ist, präparieren Sie die Leber vorsichtig und vorsichtig: Fassen Sie das zentrale Bindegewebe zwischen den Lappen mit einer Pinzette. Schneiden Sie alle Verbindungen zu anderen Organen ab und heben Sie die Leber an.
  5. Waschen Sie die Leber und tauchen Sie sie einige Sekunden lang in die vorgekühlte PBS + 3%ige P/S-Lösung. Geben Sie es dann in die vorgekühlte Tube von William's Complete Medium.
    HINWEIS: Blutung und Tod sorgen für die Durchblutung über die Hohlvene. Die Bestätigung für den Tod des Tieres kommt durch den Pneumothorax, der in dem Moment induziert wird, in dem die Leber explantiert und das Zwerchfell vollständig präpariert wird und bei der Untersuchung Atmung und Herzschlag nicht mehr funktionsfähig sind.

6. Reinigung der Hepatozyten

  1. Unter der biologischen Haube die Leber in die Petrischale 100 mm mit den 15 mL kaltem Williams vollständigem Medium über eine Schale voller Eis geben.
  2. Drücken Sie mit dem Schaber kräftig auf das Organ, um die Zellen im Medium freizusetzen.
    HINWEIS: Wenn die Verdauungsphase korrekt durchgeführt wird, sollte die Zellfreisetzung leicht sein und nicht viel Druck auf die Leber erfordern. Schneiden Sie die Leber nicht in Stücke; Lassen Sie es intakt. Wenn die Leber in das Medium eingetaucht wird, wird die Zellfreisetzung verbessert.
  3. Sammeln Sie die mediumhaltigen Zellen und filtern Sie sie mit dem 100 μm Filter, während Sie sie in ein steriles konisches Röhrchen überführen. Die Filtration ermöglicht die Entfernung von Bindegewebe und unverdauten Gewebefragmenten.
  4. Gießen Sie etwa 15 ml kaltes William's Complete Medium über die zerdrückte Leber in der Petrischale, um mehr Zellen freizusetzen. Wiederholen Sie die Schritte 6.2 und 6.3.
  5. Nummer 6.4 mindestens einmal wiederholen, bis alle Zellen freigesetzt sind. Teilen Sie das Medium bei Bedarf in konische Röhrchen auf und verwenden Sie mehrere 100 μm Filter.
    HINWEIS: Nach der Freisetzung der Hepatozyten und vor dem Filtern sollte das Medium aufgrund des Vorhandenseins der Hepatozyten undurchsichtig aussehen. Die verbleibende Leber sollte faserig aussehen und wird verworfen.
  6. Das filtrierte Medium, das Leberzellen enthält, wird 3 min lang bei 4 °C bei 4 °C mit einer Bremse mit niedriger Drehzahl zentrifugiert.
    HINWEIS: Hepatozyten sind dichter als andere Leberzellen. Aufgrund der geringen Zentrifugationskraft befinden sich nur Hepatozyten im Pellet, während andere Zellen im Überstand verbleiben.
  7. Entsorgen Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören. Geben Sie vorsichtig etwa 40 mL eiskaltes Williams vollständiges Medium in das Röhrchen und pipettieren Sie langsam 2 bis 3 Mal auf und ab, um das Zellpellet wieder zu suspendieren.
    HINWEIS: Das Zellpellet muss vorsichtig resuspendiert werden, um eine Beschädigung der Zellen zu vermeiden.
  8. Bei 50 x g für 3 min bei 4 °C zentrifugieren.
    HINWEIS: Zählen Sie bei den ersten Versuchen die lebensfähigen Zellen nach der zweiten Zentrifugation mit einem 1:10-Trypanblau-Assay, bevor Sie mit den nächsten Schritten fortfahren. Auf diese Weise kann vermieden werden, dass Medien und Zeit verschwendet werden, wenn alle Zellen tot sind.
  9. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 25 ml eiskaltem Williams vollständigem Medium.
  10. Geben Sie 25 ml 90%ige Dichtegradientenlösung in das Röhrchen und mischen Sie es vorsichtig.
    HINWEIS: Eine Dichtegradientenlösung trennt lebensfähige Hepatozyten von toten Hepatozyten und Zelltrümmern basierend auf ihrer Dichte.
  11. Zentrifugieren Sie bei 200 x g für 10 min bei 4 °C. Auf dem Boden des Röhrchens muss ein sichtbares Pellet erhalten werden, das den lebensfähigen Hepatozyten entspricht, und auf der Oberseite des Gradienten muss eine klare Schicht aus abgestorbenen Hepatozyten erhalten werden.
    HINWEIS: Wenn überhaupt kein Pellet vorhanden ist, versuchen Sie, die Lösung durch Schwenken erneut zu mischen und die Zentrifugation zu wiederholen.
  12. Aspirieren Sie die abgestorbene Zellschicht von der Oberseite des Gradienten und belassen Sie 1-2 mL des Mediums mit dem Pellet.
  13. Resuspendieren Sie das Pellet in 30-40 ml Williams vollständigem Medium.
    HINWEIS: Verwenden Sie für den gesamten Eingriff nur serologische 25-ml-Pipetten. Pipetten mit kleinerem Durchgang können die Lebensfähigkeit der Hepatozyten verringern. Alle Schritte sollten auf Eis durchgeführt werden, um +4 °C zu halten.
  14. Bei 200 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren, dann den Überstand aspirieren.

7. Hepatozytenkultur und RNA-Entnahme

  1. Fügen Sie eine angemessene Menge Medium für die Zellzählung hinzu. Zählen Sie die Zellviabilität mit 1:10 Trypanblau.
  2. 2D-Hepatozytenkultur
    1. Plattenzellen in einer Konzentration von 500.000 Zellen/Vertiefung einer 6-Well-Schale auf einer kollagenbeschichteten Zellplatte mit vorgewärmtem Williams vollständigem Medium.
    2. Stellen Sie die Zellkultur in einen befeuchteten Inkubator mit 95 % Luft, 5 % CO2 bei 37 °C.
    3. Wechseln Sie nach 4 h das Medium auf das neue vorgewärmte William's Complete Medium.
    4. Bewahren Sie die Zellen im Inkubator auf. Wechseln Sie das Medium täglich.
    5. Sammeln Sie primäre Hepatozyten in einem Reagenz für die RNA-Extraktion vor der Plattierung (Tag 0) und an den Tagen 1 bis 3 der Kultur.
    6. Extrahieren Sie die RNA gemäß dem Protokoll des Herstellers und transkribieren Sie sie in cDNA für die Bewertung von Lebermarkergenen mittels RT-qPCR. Die Liste der Grundierungen ist in Tabelle 2 dargestellt.
  3. Für die 3D-Langzeit-Hepatozytenkultur:
    1. Resuspendieren Sie die Zellen in der kalten, reinen Matrix in einer Konzentration von 1.000-10.000 Zellen in 20 μL.
      HINWEIS: Versuchen Sie, die Bildung von Matrixblasen zu vermeiden.
    2. Mit vorgekühlten Pipettenspitzen werden die mit der Matrix enthaltenen Zelltröpfchen in eine vorgewärmte Zellkulturplatte gefüllt.
    3. Drehen Sie die Platte auf den Kopf und lassen Sie sie 20-30 min im Zellkultur-Inkubator.
    4. Drehen Sie es auf und fügen Sie das vorgewärmte 3D-Langzeit-Hepatozytenmedium und das spezifische Kulturmedium gemäß Pengs Arbeithinzu 22. Bewahren Sie die Zellen im Inkubator auf.
    5. Wechseln Sie das 3D-Langzeit-Hepatozytenmedium alle 2-3 Tage.
    6. Spätestens nach 14 Tagen Kultur werden die Hep-Orgs von der Matrix getrennt und lebensfähige Hep-Orgs werden mittels Trypanblau und EdU-Proliferationsassay bewertet und gemäß Pengs Arbeit passageiert.

Ergebnisse

Am Ende der Setup-Verfahren (Schritt 6.13) erhielten wir eine Zellausbeute von bis zu 1 x 108 Zellen pro Isolation aus der Leber von etwa 300 g einer Ratte. Eine Zellviabilität zwischen 78 % und 97 % wurde durch Trypanblau-Zählung festgestellt.

Wie bereits in früheren Studienbeschrieben 1,18,19, verlieren primäre Hepatozyten in Kultur ihre Morphologie, leberspezifische Funktionen, und sterben innerhalb weniger Tage ab.

In der Literatur ist bekannt23,24, dass primäre adulte Hepatozyten schnell die quaderförmig-hexagonale Morphologie verlieren, sich innerhalb weniger Tage in eine "fibroblastenähnliche" Form verwandeln und absterben. Abbildung 1 zeigt die verschiedenen Phasen: 4 h nach dem Plattieren auf einer kollagenbeschichteten Platte haften die Hepatozyten an der Oberfläche, verteilt in einer typischen Monoschicht mit quaderförmiger Morphologie, die Ränder der Zellen sind definiert, die Verbindungen zwischen den Zellen sind linear und die Oberfläche der Zellen sieht glatt aus (Abbildung 1A). An Tag 1 erhalten die primären Hepatozyten ihre typische hexagonale Form und Lipidtröpfchen werden sichtbar (Abbildung 1B). An den Tagen 2-3 nehmen die Lipidtröpfchen zu (Abbildung 1C-1D), während die Zellen an den Tagen 4-5 Aktin-Stressfasern ansammeln (Abbildung 1E-F). Wir untersuchten auch den Prozentsatz lebensfähiger Zellen in der primären 2D-Kultur von Tag 1 bis Tag 5 und verglichen ihn mit der Lebensfähigkeit vor der Beschichtung an Tag 0 (Abbildung 2). Es ist möglich, bereits in den ersten Tagen der Kultur eine drastische Verringerung der Lebensfähigkeit zu beobachten, die an Tag 1 49,5 % (SD 12,7) erreicht, an Tag 2 auf 45,2 % (SD 18,2) und an Tag 3 auf 33,5 % (SD 0,77) sinkt. Der Anteil lebensfähiger Zellen liegt an Tag 4 bereits bei 16,9 % (SD 5,4), während er an Tag 5 9,1 % (SD 0,38) erreicht. Daher ist es offensichtlich, dass der Verlust der Morphologie mit einem schnell fortschreitenden Zelltod von adulten Hepatozyten in 2D-Kultur einhergeht.

Isolierte Hepatozyten zeigten vor der Plattierung (Tag 0) eine hohe mRNA-Expression von hepatischen Markergenen (ABCD3, ALB, KRT18, PCK1, SERPIN, TDO2), die mittels RT-qPCR ausgewertet wurden (Abbildung 3). Alle analysierten Gene zeigen eine kulturzeitabhängige Abnahme der Expression bereits am Tag 1 in der Kultur. Die mRNA-Expressionsniveaus verdeutlichen den Funktions- und Lebensfähigkeitsverlust der primären Hepatozyten im Laufe der Zeit.

Isolierte Hepatozyten wurden in 3D-Matrixtröpfchen plattiert und 3D-Organoid-Zellstrukturen im Laufe der Zeit verfolgt. An Tag 1 der Kultur werden einzelne Hepatozyten in den Matrixtröpfchen suspendiert (Abbildung 4A). Die Zellkonzentration wird absichtlich niedrig gehalten, um den Hepatozyten ausreichend Platz zum Wachsen zu geben. Dies ermöglicht es uns auch, das Wachstum der Organoide visuell zu verfolgen. Primäre Hepatozyten zeigten in den ersten Tagen der Kultur eine zelluläre Teilung (Abbildung 4C). Während an Tag 0 Hep-Orgs mit einer Größe von 30 μm gemessen wurden, verdoppelten sich die Hep-Orgs an Tag 2 fast mit ihren Abmessungen, was das Größenwachstum unterstreicht, das bis Tag 15 anhielt (33,08 μm an Tag 1; 64,86 μm an Tag 2; 45,06 μm an Tag 5; 55,19 μm an Tag 7; 51,93 μm an Tag 10; 62,90 μm an Fay 15). Was die Form der Hep-Orgs betrifft, so erreichten sie, während sie an Tag 1 noch rundförmig waren, an den folgenden Tagen die "Traubenform" (typisch für Leberorganoide).

Hepatozyten, die in einer 3D-Matrix plattiert sind, bleiben in Kultur wochenlang am Leben und zeigen eine Lebensfähigkeit von 23 % ±10 % nach 15 Tagen unter Verwendung des Trypanblau-Assays (Abbildung 4B, erste Reihe). Um die Proliferation von Ratten-Hep-Orgs zu validieren, wurde an Tag 15 ein EdU-Test durchgeführt (Abbildung 4D). Nichtsdestotrotz zeigte die Hoechst-Färbung eine hohe Anzahl von Einzelzellen anstelle von Hep-Orgs, eine proliferative Aktivität von Hepatozyten (grünen Zellen) war vorhanden, auch wenn der EdU-Inkorporation gering war (9% ± 7%) (Abbildung 4B, zweite Reihe).

figure-results-1
Abbildung 1: 2D-Kultur der primären Hepatozyten auf kollagenbeschichteten Platten im Laufe der Zeit. Die Bilder wurden bei 20-facher Vergrößerung mit (A) Phasenkontrastmikroskopie 4 Stunden nach der Beschichtung, (B) Tag 1, (C) Tag 2, (D) Tag 3, (E) Tag 4, (F) Tag 5 aufgenommen. In jedem Bild wird ein Maßstabsbalken von 50 μm angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-2
Abbildung 2: Lebensfähige Primärzellen in 2D-Kultur auf kollagenbeschichteten Platten. Die Grafik zeigt den Prozentsatz lebensfähiger Zellen von Tag 1 bis Tag 5 im Vergleich zu lebensfähigen Zellen, die an Tag 0 plattiert wurden und als 100 % angesehen werden. Die Ergebnisse werden als Einzelreplikate, Durchschnitt und SD von 3 verschiedenen Experimenten angegeben (* p-Wert ≤ 0,05; ** p-Wert ≤ 0,005). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-3
Abbildung 3: mRNA-Expression von hepatischen Markern, gemessen mittels RT-qPCR in primären Hepatozyten. Die Ergebnisse wurden auf β-Aktin und/oder GAPDH (Housekeeping-Gene) normalisiert und werden im Verhältnis zu primären Hepatozyten exprimiert, die vor der Plattierung an Tag 0 gesammelt wurden, was als 1 betrachtet wird. Die Ergebnisse werden als Durchschnitt ± SD von mindestens 3 verschiedenen Experimenten angegeben (**+ p-Wert ≤ 0,001). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-4
Abbildung 4: 3D-Hepatozytenkultur in Matrixtröpfchen im Laufe der Zeit. (A) Isolierte Hepatozyten, die in Matrixtröpfchen für Langzeit-Hep-Orgs plattiert sind: Im Bild sind die Matrixtröpfchen auf der Oberfläche der Vertiefung sichtbar (roter Kreis = ein Tröpfchen). (B) Prozentsatz lebensfähiger Zellen durch Trypanblau und proliferativer Zellen durch EdU am Tag 15 vor der Passage. Die Quantifizierung der EdU-positiven Zellen wurde mit der ImageJ2-Software durchgeführt. Die Ergebnisse werden in Prozent als Durchschnitt±SD von mindestens 3 verschiedenen Experimenten angegeben. (C) Phasenkontrastbilder der 3D-Kultur von Ratten-Hep-Orgs an verschiedenen Tagen des Wachstums in der 3D-Kultur: Tag 1, 2, 5, 7, 10, 15. Bildvergrößerung 20X. In jedem Bild wird ein Maßstabsbalken von 50 μm angegeben. (D) EdU-Inkorporationsassay von Hep-Orgs der Ratte an Tag 15. Bildvergrößerung 20X. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Puffer und Medienzusammensetzung. Die Tabelle enthält den Namen und die Komponenten (mit ihrer endgültigen Konzentration) aller Puffer und der Zellmedien, die im Protokoll verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Liste der Rattenprimer. Die Tabelle enthält eine Liste der Primer, die für RT-qPCR-Experimente verwendet wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Diskussion

3D-Organoide sind eine Grenze für die personalisierte Medizin und ermöglichen eine langfristige Hepatozytenkultur. Die Qualität dieser innovativen Technik erfordert eine gute Ausbeute an lebensfähigen primären Hepatozyten und eine gut durchgeführte Leberperfusion und Hepatozytenisolierung. Dieses alte Verfahren ist immer noch weit verbreitet; Es umfasst jedoch verschiedene Schritte, die eine Herausforderung darstellen können. Als wir uns dem Verfahren näherten, stießen wir auf kritische Probleme wie bakterielle Kontamination, geringe Leberverdauungseffizienz, geringe primäre Hepatozytenausbeute und geringe Lebensfähigkeit der Hepatozyten, die den Erfolg der Technik leicht beeinträchtigen können. Ausgehend von den goldenen Standardprotokollen17,18 beleuchten wir hier, wie häufige Probleme überwunden werden können, klären die kritischsten Schritte bei der Isolierung primärer Hepatozyten von Ratten und fassen die verstreuten Tipps zusammen, die den Erfolg der Technik im Rattenmodell leicht beeinflussen können. Obwohl das Verfahren der Leberperfusion eine große Herausforderung darstellt und vom Bediener genaues Fachwissen erfordert, garantiert es qualitativ hochwertige Ergebnisse in Bezug auf Ausbeute, Integrität, Lebensfähigkeit und Funktionalität der primären Hepatozyten. Diese Merkmale sind für die nachfolgenden Phasen unerlässlich.

Bei der Planung des Projekts haben wir die PREPARE-Richtlinien Checkliste21 sorgfältig berücksichtigt. Besonderes Augenmerk wurde auf die bisherige Literatur gelegt, verschiedene frühere Arbeiten verglichen und mit einigen der Autoren in Kontakt getreten (PREPARE Leitfaden-Checkliste _topic A1). Das Organoid-Tool selbst ist ein wichtiges Mittel, um die Anzahl der Tiere zu reduzieren, da die Zellen bis zu 7 Monate in Kultur vermehrt werden können (PREPARE Guidelines Checkliste _topic A3). Durch den Dialog mit dem Personal der Tiereinrichtung wählten wir einen erfahrenen Techniker aus, der bei dem Verfahren Hilfestellung leistete und dazu beitrug, den Einsatz von überschüssigen Versuchstieren zu vermeiden (PREPARE Richtlinien Checkliste _topic B5). Es wurde eine geeignete Peristaltikpumpe beschafft, die für die Leberperfusion erforderlich ist (PREPARE Guidelines Checkliste _topic B6).

Die Veröffentlichungen von Ng17 und Shen18 sind die jüngsten, die das Verfahren bei Ratten beschreiben. Die Hauptfragen, die in diesem Protokoll behandelt werden und von den vorherigen nicht behandelt wurden, betreffen die Verwendung kommerzieller Lösungen und die Optimierung einer präzisen Pfortaderkanülierung, die optimale Perfusions- und Verdauungsschritte gewährleistet, um die Leber in situ zu erhalten. Während die Protokolle von Shen18 und Ng17 hausgemachte Lösungen verwendeten, basiert unser Protokoll auf kommerziellen Perfusions- und Aufschlusslösungen, um die Variabilität bei der Pufferherstellung zu reduzieren. Ein Überschuss an verdauter Enzymkonzentration könnte aggressiv gegenüber Hepatozyten sein und deren Qualität und Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigen25. Die Verwendung kommerzieller Lösungen ist entscheidend, um die Reproduzierbarkeit des Protokolls zu verbessern und die Standardisierung zu gewährleisten. Darüber hinaus kann das von Ng17 durchgeführte Protokoll eine Herausforderung darstellen, da die Leber vor der Verdauungsphase entfernt werden muss. Unser Protokoll basiert auf der Perfusion und Verdauung der Leber, ohne sie zu entfernen, bis beide Phasen durchgeführt wurden, was das Verfahren vereinfacht. In Bezug auf die Zellausbeute und die Zellviabilität sind die Ergebnisse unseres Protokolls vergleichbar mit früheren Arbeiten.

Die Reinigung und Desinfektion der Perfusionsschläuche vor und nach dem Eingriff sowie die Hautdesinfektion vor Beginn der Operation sind sehr wichtig, um die bakterielle Kontamination zu begrenzen. Darüber hinaus ist die vollständige Trocknung der Schläuche nach der Ethanolreinigung und das anschließende Waschen mit dem Medium entscheidend, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhöhen. Tatsächlich würde selbst ein einziger Schuss Ethanol, der in die Leber injiziert wird, während des Eingriffs zum Zelltod führen.

Die Temperatur der injizierten Lösung ist wichtig, aber auch die Empfindlichkeit des Kollagenase-Enzyms gegenüber der Temperatur muss berücksichtigt werden. Aus diesem Grund haben wir den Perfusionspuffer vor Beginn des chirurgischen Eingriffs auf 42 °C vorgewärmt, während wir den Verdauungspuffer erst während des Perfusionsschritts in das Wärmebad gegeben haben. Durch das Hinzufügen einer Blasenfalle zum Schlauch vor dem Katheter wird verhindert, dass austretende Blasen den Katheter erreichen und dass Luft in die Leber gelangt, wenn die Perfusionslösung ausgeht17.

Die Zusammensetzung des Puffers, der Perfusionsdruck und die Durchflussrate sollten innerhalb des entsprechenden Bereichsliegen 17. Wir haben die Erfahrung gemacht, dass niedriger Druck und niedrige Durchflussrate zu einer geringen Ausbeute führen und die Lebensfähigkeit der Zellen negativ beeinflussen, da der Puffer die kleinen Gefäße nicht erreichen konnte. Auf der anderen Seite sollte die Durchflussrate nicht zu hoch sein, um die Glisson-Kapsel intakt zu halten. Da die Integrität der Zelladhäsion Ca2+ 18 erfordert, ist der Perfusionspuffer eine Ca2+-freie Lösung, die EDTA enthält, um die kalziumhaltigen Brücken zwischen den Zellen anzugreifen, so dass er für die Entfernung von Kalzium und das Auswaschen von Blut aus der Leber unerlässlich ist. Die Perfusionszeit von 8-15 min bei einer Flussrate von 10 mL/min ist entscheidend, damit alle Zellen von der EDTA, Ca2+-freien Lösung erreicht werden können. Eine suboptimale Durchblutung kann zu einer verminderten Verdauung führen.

Der Verdauungspuffer enthält Ca2+, da die Kollagenase, die die Kollagenmatrix verdaut, Ca2+ -abhängig ist. Die Flussrate des Verdauungspuffers sollte bei mindestens 20 ml/min gehalten werden und die Zeit hängt von der Kollagenasekapazität ab. Im Falle des spezifischen Aufschlusspuffers, den wir verwenden, müssen wir 15 Minuten perfundieren, um ein Endvolumen von 300 ml Lösung zu erhalten. Wenn die Verdauung unvollständig ist, bleiben die Zell-Zell-Verbindungen erhalten, und der aufeinanderfolgende mechanische Druck schädigt die Zellen, wodurch die Lebensfähigkeit verringert wird. Die langsame Erhöhung der Flussrate trägt dazu bei, die belastende Wirkung der Durchblutung auf die Zellen zu reduzieren. Während der Operation konzentrierten wir uns auf die vorübergehende Klemmung der unteren Hohlvene und die anschließende Leberschwellung: Diese Passage verbesserte sowohl die Verdauungseffizienz als auch die Zellregeneration erheblich. Am Ende der Verdauung sollte die Leber hellbraun und weich aussehen. Wenn die Leberresektion abgeschlossen ist, reduziert das Waschen der isolierten Leber in PBS +3% P/S den Bakterientitel und hilft, eine Kontamination im folgenden Teil des Eingriffs zu vermeiden.

Bei der Isolierung von Hepatozyten unter der biologischen Haube wird durch die Verwendung von serologischen 25-ml-Pipetten die Verringerung der Lebensfähigkeit der Hepatozyten durch Pipetten mit kleinerer Bohrung vermieden. Wir fügten einen optionalen Schritt hinzu, um die Ausbeute an primären Hepatozyten zu erhöhen, d. h. das Gießen von Williams vollständigem Medium über die zertrümmerte Leber, um den Schabeschritt unter der Haube zu wiederholen. Dieser Schritt erfolgt nach der Filterung des zellfreigesetzten Mediums aus der isolierten Leber und hilft, den Petri zu reinigen und mehr Zellen aus der Leberkapsel zu gewinnen. Wenn es notwendig ist, hohen Druck auszuüben, um die Hepatozyten durch die Filter zu bewegen, ist die Lebensfähigkeit der Zellen niedrig19.

Die Unfähigkeit von Hepatozyten, länger als 2 Tage als 2D kultiviert zu werden, veranlasste uns, ein alternatives Langzeitkulturmodell zu finden. Ein geeignetes Modell, um Hepatozyten über einen längeren Zeitraum zu kultivieren, ist adultes Hep-Org. Im Vergleich zu 2D-Hepatozyten zeigten Hep-Orgs, dass sie an Tag 15 noch lebensfähig und in aktiver Proliferation waren, was ein langfristiges Potenzial zeigt.

Die Perfusion der Rattenleber und die anschließende Isolierung von primären adulten Hepatozyten sind die wichtigsten vorbereitenden Schritte für verschiedene Anwendungen. Obwohl die Reproduzierbarkeit eine Einschränkung der Technik sein kann, da das Verfahren viele Schritte und Variablen umfasst, hilft die visuelle Beschreibung des Verfahrens, die Methode mit einer hohen Erfolgsquote zu replizieren. Dieses Protokoll zeigt die kritischen Stadien auf und zeigt, wie diese angegangen werden können, und optimiert das Verfahren für die Isolierung primärer Hepatozyten an Ratten und die Ergebnisse, die für die Etablierung von In-vitro-Modellen wie der Hep-Orgs-Generation geeignet sind, um die Physiologie und Pathologie der Leber zu untersuchen.

Offenlegungen

Alle Autoren haben alle Interessenkonflikte offengelegt.

Danksagungen

Wir danken Dr. Davide Selvestrel und Prof. Giovanni Sorrentino vom SorrentinoLab an der Universität Triest für die Unterstützung bei der Durchführung des EdU-Proliferationstests. Die Arbeiten wurden durch einen Ad-hoc-Zuschuss der Banca d'Italia und interne FIF-Zuschüsse unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
A83-01- ALK5-Inhibitor IVZwillingshelix  T3031
B27Thermofisher Scientific0080085SA
CFX Connect Echtzeit-PCR-Nachweissystem   Bio-Rad
CHIR99021Twin HelixT2310
Click EdU Alexa 488 Imaging KitThermofisher ScientificC10499
Kollagen, Typ I, Lösung aus RattenschwanzMerckC3867-1VL
Dexamethason MerckD4902
EGFMerck  E9644
Fötales Rinderserum (FBS)EurocloneECS0180L
GELTREX LDEV FREE RGF BMEThermofisher ScientificA1413202
Heparin-Natrium 25000 IE/5 mlB. Braun Melsungen AGB01AB01
HGFPeprotech 100-39H 
Insulin-Transferrin-Selen-Lösung 100x ThermofisherScientific 41400045
L-Glutamin LösungEurocloneECB3000D
Leber Digest Medium Thermofisher Wissenschaftlich  17703-034
LeberperfusionsmediumThermofisher Scientific17701038
N2-ErgänzungThermofisher Scientific17502048
N-AcetylcysteinMerckA9165
NicotinamidMerck  N-0636
Nicht-essentielle AminosäurenMerckM7145
NormocinAurogeneant-nr-1
PBS-Puffer 1XPanReac AppliChemA0964,9050
Penicillin-Streptomycin-Lösung 100xEurocloneECB3001D
PercollSanta Cruzsc-296039A
Peristaltische PumpeIsmatec™  MS-4/12 Reglo Digital Pumpe
TNFaPeprotech  300-01A
TRI ReagenzMerckT9424
Schlauch  Ismatec™    ID.2,79mm
Williams' E Medium, ohne GlutaminThermofisher Scientific31415029
Y27632Twin HelixT1725

Referenzen

  1. Heslop, J. A., et al. Mechanistic evaluation of primary human hepatocyte culture using global proteomic analysis reveals a selective dedifferentiation profile. Arch Toxicol. 91 (1), 439-452 (2017).
  2. Ietto, G., et al. Multicellular liver organoids: Generation and importance of diverse specialized cellular components. Cells. 12 (10), 1429(2023).
  3. Dunn, J. C., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Hepatocytes in collagen sandwich: evidence for transcriptional and translational regulation. J Cell Biol. 116 (4), 1043-1053 (1992).
  4. Keemink, J., Oorts, M., Annaert, P. Primary Hepatocytes in sandwich culture. Methods in Mol Biol (Clifton, N.J). 1250, 175-188 (2015).
  5. Kaur, I., et al. Primary hepatocyte isolation and cultures: Technical aspects, challenges and advancements. Bioengineering (Basel, Switzerland). 10 (2), 131(2023).
  6. Thompson, W. L., Takebe, T. Human liver model systems in a dish. Dev Growth Differ. 63 (1), 47-58 (2021).
  7. Takebe, T., Wells, J. M. Organoids by design. Science (New York, N.Y.). 364 (6444), 956-959 (2019).
  8. Nantasanti, S., de Bruin, A., Rothuizen, J., Penning, L. C., Schotanus, B. A. Concise review: organoids are a powerful tool for the study of liver disease and personalized treatment design in humans and animals. Stem Cells Transl Med. 5 (3), 325-330 (2016).
  9. Raju, R., et al. In vitro pluripotent stem cell differentiation to hepatocyte ceases further maturation at an equivalent stage of e15 in mouse embryonic liver development. Stem Cells Dev. 27 (13), 910-921 (2018).
  10. Peng, W. C., et al. Inflammatory cytokine TNFalpha promotes the long-term expansion of primary hepatocytes in 3D culture. Cell. 175 (6), 1607-1619.e15 (2018).
  11. Hu, H., et al. Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3d organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606.e19 (2018).
  12. Michalopoulos, G. K., Bowen, W. C., Mulè, K., Lopez-Talavera, J. C., Mars, W. Hepatocytes undergo phenotypic transformation to biliary epithelium in organoid cultures. Hepatology (Baltimore, Md). 36 (2), 278-283 (2002).
  13. Schaub, J. R., et al. De novo formation of the biliary system by TGFβ-mediated hepatocyte transdifferentiation. Nature. 557 (7704), 247-251 (2018).
  14. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science (New York, N.Y.). 345 (6194), 1247125(2014).
  15. Huch, M., Koo, B. -K. Modeling mouse and human development using organoid cultures. Development (Cambridge, England). 142 (18), 3113-3125 (2015).
  16. Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
  17. Ng, I. C., et al. Isolation of primary rat hepatocytes with multiparameter perfusion control. J Vis Exp. (170), e62289(2021).
  18. Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q. -H., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. J Vis Exp. (64), e3917(2012).
  19. Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. J Vis Exp. (132), e56993(2018).
  20. Charni-Natan, M., Goldstein, I. Protocol for primary mouse hepatocyte isolation. STAR protoc. 1 (2), 100086(2020).
  21. Smith, A. J., Clutton, R. E., Lilley, E., Hansen, K. E. A., Brattelid, T. PREPARE: Guidelines for planning animal research and testing. Lab Anim. 52 (2), 135-141 (2018).
  22. Kluiver, T. A., Kraaier, L. J., Peng, W. C. Long-term expansion of murine primary hepatocyte organoids. Methods in Molecular Biol (Clifton, N.J). 2544, 1-13 (2022).
  23. Shulman, M., Nahmias, Y. Long-term culture and coculture of primary rat and human hepatocytes. Methods in Molecular Biol (Clifton, N.J). 945, 287-302 (2013).
  24. Knobeloch, D., et al. Human hepatocytes: isolation, culture, and quality procedures. Methods in Molecular Biol (Clifton, N.J). 806, 99-120 (2012).
  25. Queral, A. E., DeAngelo, A. B., Garrett, C. T. Effect of different collagenases on the isolation of viable hepatocytes from rat liver. Anal Biochem. 138 (1), 235-237 (1984).

Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

3D OrganoidkulturKollagenase Perfusionhepatische OrganoidePercoll DichtegradientZellviabilit tHepatozytenkulturLeberregenerationTrypanblau F rbung
Perfusion der Rattenleber und Isolierung primärer Hepatozyten: ein altes Verfahren, das für die hochmoderne 3D-Organoidkultur entscheidend ist
Kontakt
Rückmeldung an Ihre Bibliothek

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.