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Split-Luciferase-Reassemblierungs-Assay zur Messung von Kontakten zwischen endoplasmatischem Retikulum und Mitochondrien in lebenden Zellen

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DOI:

10.3791/66862

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11. Oktober 2024

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Biomedical Science Education, College of Medicine, Charles R. Drew University of Medicine and Science

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir haben einen Split-Luciferase-Reassemblierungs-Assay etabliert, um die Kontakte zwischen endoplasmatischem Retikulum und Mitochondrien in lebenden Zellen zu überwachen. Mit diesem Assay beschreiben wir ein Protokoll zur quantitativen Messung des Ausmaßes dieser Interorganellenkopplungen in HEK293T Zellen unter den Bedingungen einer chemischen Behandlung.

Zusammenfassung

Die Kontaktstellen des endoplasmatischen Retikulums (ER)-Mitochondrien spielen eine entscheidende Rolle für die Zellgesundheit und Homöostase, wie z. B. die Regulation der Ca2+ - und Lipidhomöostase, die mitochondriale Dynamik, die Biogenese von Autophagosomen und Mitophagosomen sowie die Apoptose. Das Versagen der Aufrechterhaltung einer normalen ER-mitochondrialen Kopplung ist an vielen neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer, Parkinson, amyotropher Lateralsklerose und hereditärer spastischer Querschnittslähmung beteiligt. Es ist von erheblicher Bedeutung zu untersuchen, wie die Dysregulation von ER-mitochondrialen Kontakten zum Zelltod führen könnte und ob die Reparatur dieser Kontakte auf das normale Niveau neurodegenerative Zustände verbessern könnte. Daher könnten verbesserte Assays, die das Niveau dieser Kontakte messen, dazu beitragen, die pathogenen Mechanismen dieser Krankheiten zu beleuchten. Letztendlich wird die Etablierung einfacher und zuverlässiger Assays die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien erleichtern. Hier beschreiben wir einen Split-Luciferase-Assay zur quantitativen Messung des Ausmaßes von ER-Mitochondrien-Kontakten in lebenden Zellen. Dieser Assay kann verwendet werden, um die pathophysiologische Rolle dieser Kontakte zu untersuchen und ihre Modulatoren im Hochdurchsatz-Screening zu identifizieren.

Einleitung

Die Wechselwirkungen zwischen dem ER und den Mitochondrien sind entscheidend für die zelluläre Homöostase und das Überleben 1,2,3,4. Frühere Erkenntnisse deuten darauf hin, dass jede Art von Störung oder Dysregulation in den Kontaktstellen der ER-Mitochondrien zu verschiedenen neurodegenerativen, metabolischen und kardiovaskulären Erkrankungen sowie zu Krebs beitragenkann 5,6,7,8,9,10. Zum Beispiel kann eine abnormale Erhöhung der Ca2+-Aufnahme in die Mitochondrien zum Zelltod führen, indem sie die Übergangsporen der Mitochondrien-Permeabilität öffnet, was in einigen Modellen der Alzheimer-Krankheit häufig zu beobachten ist 5,11. In ähnlicher Weise können reduzierte ER-Mitochondrien-Kontakte zu einer Abnahme der ATP-Produktion und einer Beeinträchtigung der Ca2+-Aufnahme führen, wie in Modellen der amyotrophen Lateralsklerosebeobachtet 5,11,12. Da immer mehr Studien im Bereich der ER-Mitochondrien-Kontakte durchgeführt werden, werden weitere krankheitsbezogene Proteine und Gene entdeckt, die diese Kontakte beeinflussen könnten. Trotz des derzeitigen Wissens und der Beweise, die die Rolle der Kontaktstellen zwischen ER und Mitochondrien belegen, ist noch viel Arbeit erforderlich, um aufzuklären, wie diese Kontakte zum Verlust der Zellfunktion und letztendlich zum Zelltod führen könnten.

Es wurden verschiedene Methoden entwickelt, um die Nähe der beiden Membranen, die strukturelle Morphologie und den Abstand zwischen den beiden Organellenkontaktstellen zu bewerten 3,4,13. Die Ansätze zur Überwachung der ER-Mitochondrien-Kopplung umfassen die auf Fluoreszenzmarkern basierende Bildgebung14,15, die FRET-Reporter-basierte Bildgebung16 und die auf Split-Fluoreszenzsonden basierende Bildgebung17,18, die Epifluoreszenz und konfokale Mikroskopie verwenden. Die hochauflösende und atomare Auflösungsmikroskopie ist ebenfalls ein leistungsfähiges Werkzeug für die genaue Visualisierung von Kontakten zwischen Organellen, obwohl ihr Einsatz in der Kontaktstellenanalyse noch begrenzt ist, da sie hochspezialisierte Mikroskope und technisches Know-how erfordert19. Darüber hinaus werden die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), die Rasterelektronenmikroskopie (REM) und andere EM-Techniken wie Elektronentomographie (ET) und Kryo-Elektronenmikroskopie häufig eingesetzt, da sie eine hochauflösende ultrastrukturelle Abbildung der Kontaktstellen ermöglichen, die mit anderen experimentellen Ansätzen oft nicht zu erforschen sind 20,21,22. Bei diesen EM-basierten Methoden handelt es sich jedoch um eine Technik mit sehr geringem Durchsatz, die auch durch chemische Fixierungsverfahren beeinträchtigt werden kann. In jüngerer Zeit wurden auf Proximity-Labeling basierende Methoden verwendet, um Kontaktstellen zu detektieren und neue Proteine an Kontaktstellen zu identifizieren. Zum Beispiel wurde der Proximity-Ligation-Assay (PLA) verwendet, um die Organellennähe zu quantifizieren23,24, während eine überarbeitete Version des Ascorbatperoxidase-Assays (APEX) zur Identifizierung neuer Proteine an der Kontaktstelleverwendet wurde 25,26. Es ist wichtig zu erkennen, dass alle diese oben beschriebenen Methoden Stärken und intrinsische Grenzen bei der Erkennung der Kontakte zwischen den Organellen haben. Daher ist die Kombination verschiedener Techniken erforderlich, um eine gründliche Interpretation der Kontaktstellen der Organellen zu erhalten.

Zuvor haben wir den Split-Renilla-Luciferase 8-Reassemblierungsassay (split-R luc-Assay) etabliert, um den Grad der ER-Mitochondrien-Membrankontakte zu überwachen (Abbildung 1A)24,26,27. Kurz gesagt, jede gespaltene Hälfte der Renilla-Luciferase ist mit einer ER- oder Mitochondrien-Targeting-Sequenz konjugiert. Wenn sie zusammen transfiziert werden, wird jede gespaltene Hälfte des Enzyms entweder in der ER- oder in der Mitochondrienmembran exprimiert. Wenn das ER und die Mitochondrien in unmittelbarer Nähe zueinander positioniert sind, kommen die gespaltenen Hälften zusammen und rekonstituieren das gesamte Enzym mit Luciferase-Aktivität. Für das split-R luc-Konstrukthaben wir Renilla luciferase 8 (Rluc8) in pBAD/Myc-His27 als initiale Vorlage verwendet. Die Spaltstelle (zwischen den Aminosäuren 91 und 92) wurde auf der Grundlage früherer Berichtebestimmt 27. Für die N-terminale Hälfte des Rluc8 wurden DNA-Sequenzen für die Aminosäuren 1-91 des Rluc8 mit dem 3'-Ende des FLAG-Tags und die mitochondriale AKAP1-Targeting-Sequenz der Maus im pcDNA3.1 TOPO-Vektor mittels PCR27 fusioniert. Für die C-terminale Hälfte, die auf das ER abzielt, wurden DNA-Sequenzen, die für die Aminosäuren 92-311 kodieren, mit dem 5'-Ende des myc-Tags und der UBC6-ER-Lokalisationssequenz der Hefe fusioniert. Hier haben wir das Split-R-luc-Plasmid-Konstruktso verbessert, dass gespaltene Hälften der Renilla-Luziferase in einem einzigen Vektor (pCAG) unter demselben Promotor exprimiert und anschließend in zwei Fragmente gespalten werden, wenn T2A, eine selbstspaltende Peptid-2A-Sequenz aus dem Thosea asigna-Virus, zwischen den beiden gespaltenen Hälften eingefügt wird (Abbildung 1B). Die Plasmid-DNA-Karte und die Sequenzen sind in der ergänzenden Datei 1 und der ergänzenden Abbildung S1 enthalten. Mit diesem System haben wir die Auswirkungen von drei Chemikalien (die GTPasen hemmen, die an der Aktinpolymerisation beteiligt sind) auf ER-Mitochondrien-Kontakte gemessen. Dieser split-R luc-Assayist ein einfaches, aber robustes Assay-System für das Hochdurchsatz-Screening von Interorganellen-Kontaktmodulatoren24.

Protokoll

1. Zellerhaltung und Aussaat (Tag 1)

  1. Bewahren Sie HEK293T Zellen in Zellkulturmedien auf, die Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) (in 100 mm Kulturschalen) in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 enthalten.
  2. Bevor Sie beginnen, überprüfen Sie die Konfluenz der Platte, indem Sie sie unter dem Mikroskop betrachten. Wenn die Zellen eine Konfluenz von etwa 80-90 % erreichen, bereiten Sie die Aussaat der Zellen in einer 6-Well-Kulturplatte vor, indem Sie das Medium entfernen und mit 10 ml Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) waschen.
  3. Nehmen Sie das DPBS aus der Kulturschale und behandeln Sie die Zellen mit 1 ml 0,05 % Trypsin-EDTA-Phenolrot. 3 Minuten inkubieren, dann die Platte aus dem Inkubator nehmen und 9 ml Nährmedium (DMEM mit 10 % FBS) hinzufügen, um die Trypsinreaktion zu stoppen. Pipettieren Sie langsam auf und ab, um sicherzustellen, dass alle Zellen, die noch an der Platte haften, entfernt werden. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 50-ml-Röhrchen.
  4. Bei 300 × g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Entfernen Sie das Medium und resuspendieren Sie die Zellpellets mit 1 ml frischem Medium (DMEM + 10 % FBS).
  5. Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer.
    1. Sorgen Sie für eine gleichmäßige Verteilung der Zellen, indem Sie das Röhrchen vorsichtig schwenken. Nehmen Sie sofort 10 μl der Zellsuspension heraus und geben Sie sie in ein 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie 90 μl Medium in dasselbe Röhrchen.
    2. Nachdem Sie die Zellen und Medien vorsichtig gemischt haben, nehmen Sie die Zellsuspension und tragen Sie 10 μl auf jede der Kammern des Hämozytometers auf, indem Sie vorsichtig unter das Deckglas pipettieren.
    3. Fokussieren Sie mit einem 10-fach-Objektiv die Gitterlinien des Hämozytometers unter einem Mikroskop. Zählen Sie nach dem Fokussieren die Anzahl der Zellen in einem Satz von 16 Quadraten (4 x 4 Quadrate) mit einem Handzählzähler. Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle vier Sätze à 16 Quadrate gezählt sind.
    4. Berechnen Sie die Gesamtzahl der Zellen/ml, indem Sie die durchschnittliche Zellzahl (aus jedem der 16 Eckquadrate) nehmen und diese mit 105 multiplizieren.
      HINWEIS: Anstatt ein Hämozytometer zur Zellzählung zu verwenden, kann ein automatisierter Zellzähler gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet werden.
  6. Sobald die Zellzählung abgeschlossen ist, bereiten Sie die Platte der Zellen in einer 6-Well-Platte bei 7,5 × 105 Zellen/Well-Dichte mit 2 ml Medien/Well vor. Geben Sie in ein 50-ml-Röhrchen das erforderliche Zellvolumen zusammen mit 13 mL Medium. Geben Sie 2 ml der verdünnten Zellsuspension in jede der 6 Vertiefungen.
    1. Berechnen Sie vor dem Plattieren die Anzahl der Zellen, die für 7,5 × 105 Zellen/Well erforderlich sind, unter Verwendung von C1V1 = C2V2 , wobei C1 die anfängliche Zellzahl (Zellzahl/ml) ist, V1 das Volumen ist, das aus der anfänglichen Zellsuspension benötigt wird, C2 die gewünschte Zielzelldichte (Zellzahl/ml) ist. und V2 ist das endgültige Volumen, das für die Zellaussaat benötigt wird.
  7. Nach der Abgabe klopfen Sie vorsichtig von allen Seiten auf die Platte, um die Zellen zu verteilen, und stellen Sie sie dann über Nacht in einen befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5% CO2 .

2. Polyethylenimin (PEI)-vermittelte Zelltransfektion und Zellaussaat nach der Transfektion (Tag 2)

  1. Nehmen Sie die 6-Well-Platte aus dem Inkubator und saugen Sie das vorhandene Nährmedium aus jeder Vertiefung ab. Fügen Sie 2 ml frisches Medium pro Vertiefung hinzu.
  2. Transfizieren Sie die Zellen mit Split-Rluc-Plasmid-DNA (pCAG-MitoR, luc N-T2A-R luc CER-IRES-mCherry), gelöst in TE-Puffer (pH 8,0).
    1. Mischen Sie für jede Vertiefung die DNA (750 ng) und das PEI (Verhältnis von DNA/PEI = 1:3) in 200 μl DMEM in einem 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Die DNA/PEI auf Stufe 8 ca. 2 s lang schnell vortexen, um sicherzustellen, dass sie sich gut miteinander vermischen und einen Komplex bilden. Danach in einer Mini-Zentrifuge kurz herunterschleudern (<3 s).
    2. Lassen Sie die DNA/PEI-Mischung 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren und geben Sie dann die Mischung (durch Tropfen) auf die Oberfläche des Nährmediums in der 6-Well-Platte mit den Zellen. Klopfen Sie vorsichtig auf die Platte (um die Mischung gleichmäßig zu verteilen) und inkubieren Sie sie in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2 für 6 h.
  3. Bereiten Sie während der Inkubation eine mit Poly-D-Lysin (PDL) beschichtete 96-Well-Platte vor, indem Sie zunächst 70 μl PDL (50 μg/ml in DPBS) in jede Vertiefung geben und in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2 für mindestens 1 h inkubieren. Entfernen Sie die PDL-Lösung und waschen Sie dann jede Vertiefung 2x mit 100 μL DPBS. Stellen Sie am Ende der zweiten Wäsche sicher, dass alle verbleibenden DPBS entfernt sind.
  4. 6 Stunden nach der Transfektion bereiten Sie die Aussaat der transfizierten Zellen in einer PDL-beschichteten 96-Well-Platte vor.
    1. Nehmen Sie die 6-Well-Platte mit den transfizierten Zellen aus dem Inkubator, saugen Sie das Medium ab und waschen Sie jede Vertiefung mit 2 ml DPBS. Nach dem Entfernen des DPBS 350 μL 0,05 % Trypsin-EDTA-Phenolrot zugeben und 1-2 min inkubieren. Um die Trypsinreaktion zu stoppen, geben Sie 1,7 ml Medium in jede Vertiefung.
    2. Nachdem Sie die Zellen zusammen mit dem Medium in ein 50-ml-Röhrchen überführt haben, drehen Sie das Röhrchen 5 Minuten lang bei 300 × g in einer Tischzentrifuge. Aspirieren Sie das Medium und resuspendieren Sie das Zellpellet mit 1 mL frischem Medium. Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer (wie in Schritt 1.5 beschrieben).
  5. Die Zellen werden in eine PDL-beschichtete 96-Well-Platte mit einer Dichte von 4 × 104 Zellen/Well in 100 μl Kulturmedium ausgesät. Fügen Sie dazu in einem 50-ml-Röhrchen das erforderliche Zellvolumen (zur Berechnung siehe unten) zusammen mit dem entsprechenden Medienvolumen (12 mL Gesamtvolumen) hinzu. Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 μl der verdünnten Zellsuspension in jede der 96 Vertiefungen. Inkubieren Sie die Zellen für 18 h in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5% CO2.
    1. Berechnen Sie die Anzahl der Zellen, die für 4 × 104 Zellen/Vertiefung erforderlich sind, unter Verwendung von C1V1 = C2V2 , wobei C1 die anfängliche Zellzahl (Zellzahl/ml), V1 das benötigte Volumen aus der anfänglichen Zellsuspension, C2 die gewünschte Zielzelldichte (Zellzahl/ml) und V2 das endgültige Volumen ist, das für die Zellaussaat benötigt wird.

3. Chemische Behandlung und Luciferase-Assay in lebenden Zellen (Tag 3)

  1. Bereiten Sie in einem 1,7-ml-Mikrofuruge-Röhrchen die drei frischen Lösungen von 50 μM Rhosin (50 mM Stamm in DMSO), 25 μM Ehop-016 (25 mM Stamm in DMSO) und 50 μM ZCL278 (50 mM Stamm in DMSO) vor, indem Sie jede Stammlösung (50 mM Rhosin, 25 mM Ehop-016 und 50 mL ZCL278; alle in DMSO) 1:1.000 in der erforderlichen Menge (50 μl/Vertiefung × Anzahl der Vertiefungen) Kulturmedien verdünnen. Zu jeder Lösung wird lebendes Zellsubstrat (50 mM Stamm in DMSO) für Renilla-Luciferase gegeben, verdünnt im Verhältnis 1:2.000 auf eine Endkonzentration von 25 μM. Um 0,5-, 5- und 50-μM-ZCL278-Lösungen herzustellen, führen Sie serielle Verdünnungen mit dem anfänglichen 50 μM ZCL278 in Nährmedien durch.
    HINWEIS: Wenn die chemische Inkubationszeit weniger als 1-1,5 h betragen soll, können die Zellen 1-1,5 h lang mit lebendem Zellsubstrat (für Renilla-Luciferase) vorinkubiert werden, bevor sie mit jeder Chemikalie behandelt werden. Wir fügen Chemikalien und lebendes Zellsubstrat gleichzeitig hinzu, um das Protokoll für das Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening zu optimieren.
  2. Entfernen Sie das Medium aus jeder Vertiefung der 96-Well-Platte, die die transfizierten Zellen enthält, und geben Sie 50 μl einer Mischung aus Chemikalie und Substrat in jede Vertiefung.
  3. Nachdem Sie die Zellen 1 h, 2 h oder 5 h inkubiert haben, nehmen Sie die Kulturplatte aus dem Inkubator, legen Sie sie auf den Lumineszenzplatten-Reader und messen Sie die Lumineszenz.
    1. Stellen Sie vor dem Start sicher, dass der Plattenleser eingeschaltet ist. Greifen Sie auf die Microplate Reader-Software zu und erstellen Sie eine neue Datei, indem Sie auf Neue Sitzung klicken. Stellen Sie die Temperatur des Plattenlesers auf 37 °C ein, indem Sie auf Inkubator klicken, die Temperaturoption aktivieren und 37 °C eingeben. Wählen Sie unter Plattenlayout die Option Unbekannt aus, und geben Sie die zu messenden Vertiefungen durch Klicken und Ziehen an.
    2. Klicken Sie unter Protokoll auf Lumineszenz und behalten Sie die Standardeinstellungen bei. Wenn Sie mit der Einrichtung fertig sind, legen Sie die Platte mit abgenommenem Deckel in den Plattenleser ein und wählen Sie Platte rein ausführen. Klicken Sie auf Start und das Fenster zum Speichern der Datei wird angezeigt. Speichern Sie die Datei auf Ihrem Desktop, indem Sie sie umbenennen und auf Speichern klicken.
      HINWEIS: Die Lumineszenz wird nach Zugabe des Lebendzellsubstrats noch >24 h erzeugt.
  4. Sobald die Ablesung abgeschlossen ist, nehmen Sie die Platte aus dem Plattenlesegerät, und klicken Sie dann auf Platte einführen , um das Lesegerät wieder einzusetzen. Sobald die Platte fertig ist, stellen Sie sie bis zum nächsten Messwert wieder in den befeuchteten Inkubator (37 °C, 5 % CO2).
  5. Wenn Sie fertig sind, übertragen Sie die Lumineszenzdaten in ein Grafikprogramm, um die relative Lumineszenzeinheit (RLU) (y-Achse) für jede Variable (z. B. Chemikalien oder Konzentrationen) (x-Achse) darzustellen und die Daten zu analysieren.

4. Validierung des Split-R luc-Assaysmit anderen Methoden.

  1. Führen Sie andere Assays durch, wie z. B. Proximity-Ligation-Assay (PLA), Transmissionselektronenmikroskopie und Überwachung der mitochondrialen Kalziumaufnahme, um die Ergebnisse des Split-R-luc-Assayszu validieren, wie zuvor beschrieben24.

Ergebnisse

Wir haben das oben beschriebene Protokoll verwendet, um das Niveau der ER-Mitochondrien-Kontakte nach Zugabe von drei Verbindungen zu messen, von denen bekannt ist, dass sie spezifische GTPasen hemmen. CDC42, RHO und RAC sind GTPasen, die bei Aktivierung die Aktinpolymerisation28 fördern und durch ZCL278, Rhosin bzw. Ehop-016 gehemmt werden24. HEK293T Zellen, die mit split-Rluc transfiziert wurden, wurden mit DMSO (Kontrolle), ZCL278 (50 μM), Rhosin (50 μM) oder Ehop-016 (25 μM) behandelt und für 1 h, 2 h und 5 h inkubiert. Mit einem Plattenleser haben wir die Split-Rluc-Aktivität zu definierten Zeitpunkten gemessen (Abbildung 2).

Mit Rhosin (RHO GTPase-Inhibitor) behandelte Zellen zeigten nach 1 h, 2 h und 5 h der Behandlung keine signifikanten Veränderungen der Luciferase-Aktivität im Vergleich zu den mit DMSO behandelten Kontrollzellen (p > 0,9999, p = 0,6956, p > 0,9999) (Abbildung 2). Diese Ergebnisse zeigen, dass Rhosin die Kontakte zwischen ER und Mitochondrien nicht beeinflusst, was darauf hindeutet, dass die Aktivität der RFO-GTPase nicht an der Regulierung der Kontakte zwischen den beiden Organellen beteiligt ist.

Im Gegensatz dazu zeigte der RAC-GTPase-Inhibitor Ehop-016 nach 1 h, 2 h und 5 h der Behandlung eine signifikant geringere Luciferase-Aktivität als DMSO (p = 0,0106, p = 0,0009, p = 0,0024) (Abbildung 2). Diese Daten deuten darauf hin, dass die RAC-GTPase-Aktivität für die Aufrechterhaltung einer normalen ER-Mitochondrien-Interaktion in der Zelle erforderlich ist.

Schließlich zeigte der CDC42-Inhibitor ZCL278 die drastischsten Veränderungen der Luciferase-Aktivität (Abbildung 2). ZCL278-behandelte Zellen zeigten eine signifikante Abnahme der Luziferase-Aktivität im Vergleich zum Kontroll-DMSO und wiesen über alle drei Zeitpunkte hinweg die niedrigsten p-Werte auf, wobei sie durchgehend einen p-< 0,0001 beibehielten. Unsere Daten zeigen eine starke Hemmung der ER-Mitochondrien-Kopplung, wenn die CDC42-GTPase-Aktivität durch ZCL278 blockiert wird, was mit unserem vorherigen Bericht übereinstimmt, in dem der ursprüngliche split-R luc-Assayverwendet wurde, der in Zellen durchgeführt wurde, die mit zwei Vektoren co-transfiziert wurden, die jede Hälfte der Split-Luciferase separat kodieren24.

Angesichts der bemerkenswerten Ergebnisse mit ZCL278, insbesondere im Vergleich zu den anderen GTPase-Inhibitoren, wurde die Aktivität von ZCL278 in verschiedenen Konzentrationen [0,5 μM, 5 μM, 50 μM] gegen eine DMSO-Kontrolle weiter getestet. Die Luziferase-Aktivitäten, die 1 h, 2 h und 5 h nach der Behandlung gemessen wurden, zeigten eine dosisabhängige Reaktion; 0,5 μM ZCL278 zeigten die schwächste Wirkung auf die Luciferase-Aktivität, während 5 μM eine stärkere und 50 μM die stärkste Verringerung der rekonstituierten Enzymaktivität zeigten (Abbildung 3). Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass ZCL278 die Split-R-luc-Aktivitätdosisabhängig herunterreguliert und im Laufe der Zeit höhere Konzentrationen von ZCL278 (CDC42-Inhibitor) im Vergleich zu niedrigeren Konzentrationen immer noch eine signifikante Veränderung im Vergleich zum Kontroll-DMSO zeigen.

Um unseren split-R luc-Assayzu validieren, können etablierte unabhängige Assays wie der Proximity-Ligation-Assay (PLA), die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und die Überwachung der mitochondrialen Kalziumaufnahme durchgeführt werden (Abbildung 4 und Daten nicht gezeigt)24. Isoproterenol, ein β2-adrenerger Rezeptoragonist, der eine der Verbindungen ist, die in unserem Screening für ER-Mitochondrien-Kontaktpromotoren (Abbildung 4A) identifiziert wurden, wurde verwendet, um zu bestätigen, dass die Luciferase-Aktivität des Split-Rluc nach der Behandlung mit Isoproterenol aufgrund erhöhter ER-Mitochondrien-Kontakte erhöht war, was sich in Veränderungen der PLA-Signalintensität sowie der mitochondrialen Kalziumaufnahme zeigte (Abbildung 4B-E).

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Abbildung 1: Der Split-RLuc-Reassemblierungs-Assay. (A) Schematische Darstellung des Split-R Luc-Assays. Wo es keine Membrankontakte zwischen den Mitochondrien und dem endoplasmatischen Retikulum gibt, interagieren das Mito-RlucN und das RlucC-ER nicht und es gibt keine Rluc8-Aktivität. Die Wechselwirkung zwischen dem Mito-R lucN und dem RlucC-ER, bei der das ER und die Mitochondrienmembranen in Kontakt kommen, führt jedoch zu einer vollen enzymatischen Aktivität, die durch die Umwandlung des Substrats in Lumineszenz nachgewiesen wird. (B) Schematische Karte des gespaltenen Rluc DNA-Konstrukts (pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry). (C) Diagramm des Arbeitsablaufs für den Split-Rluc-Assay in HEK293T Zellen. Abkürzungen: Mito = Mitochondrien; ER = endoplasmatisches Retikulum; IRES, interne ribosomale Eintrittsstelle; rb_glob pA, Beta-Globin-Polyadenylierungssignal des Kaninchens; T2A, eine selbstspaltende Peptid-2A-Sequenz aus dem Thosea asigna-Virus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Die Split-R-luc-Aktivitätenentsprechen den ER-Mito-Kontakten in den mit GTPase-Inhibitoren behandelten Zellen. (A-C) Rekonstituierte Luciferase-Aktivitäten bei (A) 1 h, (B) 2 h oder (C) 5 h nach Behandlung mit DMSO (Kontrolle), Rhosin [50 μM], Ehop-016 [25 μM] oder ZCL278 [50 μM] (n = 12 für jede Gruppe). Alle Daten wurden mittels unidirektionaler ANOVA mit mehreren Vergleichen analysiert. p-Werte werden als p > 0,05 (ns), p ≤ 0,05 (*), p ≤ 0,01 (**), p ≤ 0,001 (***), p ≤ 0,0001 (****) angegeben. Fehlerbalken zeigen den Mittelwert ± Standardmessfehler an. Abkürzungen: Mito = Mitochondrien; ER = endoplasmatisches Retikulum; RLU = relative Lichteinheit. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Die split-Rluc-Aktivitäten zur Messung des Niveaus der ER-Mito-Kontakte in den mit ZCL278 behandelten Zellen. (A-C) Rekonstituierte Luciferase-Aktivitäten bei (A) 1 h, (B) 2 h oder (C) 5 h nach DMSO (Kontrolle) oder ZCL278 bei [0,5 μM], [5 μM] oder [50 μM] Konzentration (n = 12 für jede Gruppe). Alle Daten wurden mittels unidirektionaler ANOVA mit mehreren Vergleichen analysiert. p-Werte werden als p > 0,05 (ns), p ≤ 0,05 (*), p ≤ 0,01 (**), p ≤ 0,001 (***), p ≤ 0,0001 (****) angegeben. Fehlerbalken zeigen den Mittelwert ± Standardmessfehler an. Abkürzungen: Mito = Mitochondrien; ER = endoplasmatisches Retikulum; RLU = relative Lichteinheit. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Validierung des split-Rluc Assays. (A) Ein Beispiel für die Quantifizierung der Split-R-luc-Aktivitätnach Behandlung HEK293T Zellen mit 11 Arzneimitteln, einschließlich Isoproterenol, das in einem Wirkstoff-Screening auf ER-Mitochondrien-Kontaktpromotoren identifiziert wurde. (B) Ein Beispiel für einen Proximity-Ligationsassay in HeLa-Zellen, die mit DMSO oder Isoproterenol (1 μM) behandelt wurden. Das PLA-Signal (rot) zeigt einen engen Kontakt zwischen ER und Mito an. Sec61-GFP (grün): zur Kennzeichnung von ER; DAPI (blau): Zellkern. (C) Quantifizierung des PLA-Signals in A (n = 4 Experimente mit je 77-97 Zellen; Mann-Whitney-Test). (D) Mitochondriale Kalziumaufnahme als Reaktion auf Histamin (100 μM). Änderung der Fluoreszenzintensität von Mito-R-GECO1 (der Durchschnitt wurde über mehrere HeLa-Zellen gemessen), aufgetragen alle 2,5 s in DMSO- oder Isoproterenol-behandelten Zellen. Der Pfeil zeigt die Histaminzugabe an. (E) Links: Maximaler Peak der mitochondrialen Kalziumaufnahme in A. Unpaariger zweiseitiger t-Test (n = 10, DMOS; 14, Isoproterenol). Rechts: Mitochondriale Kalziumaufnahmerate (wie in A; 7,5 bis 12,5 s). Mann-Whitney-Test (n = 12, DMSO; 11, Isoproterenol). Diese Abbildung wurde von Lim et al.24 modifiziert. Abkürzungen: RLU = relative Lichteinheit; PLA = Proximity-Ligations-Assay. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Zusammenfassung der aktuellen Techniken für ER-Mitochondrien-Kontakte. Liste der Vorteile und Einschränkungen für jede Methode. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Datei 1: Zip-Datei mit DNA-Sequenz (PDF- und GBK-Format) von pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S1: Karte von pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Wir haben einen Split-Renilla-Luciferase-8-Reassemblierungs-Assay (Split-R luc-Assay) verwendet, um den Grad der ER-Mitochondrien-Kopplungen zu quantifizieren. In dieser Studie haben wir das ursprüngliche split-Rluc-Konstrukt24 modifiziert, indem wir einen einzelnen Vektor, pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry, erzeugt haben, der für jede split-Rluc-Komponente (MitoRlucN und RlucCER) und eine selbstspaltende Peptid-2A-Sequenz aus dem Thosea asigna Virus kodiert, um die Expression der gleichen Menge jeder gespaltenen Hälfte der Luciferase sicherzustellen. Als Substrat für die Renilla-Luziferase wurde anstelle von Coelenterazin aus folgenden Gründen ein modifiziertes Lebendzellsubstrat (geschütztes Derivat von Coelenterazin; siehe Materialtabelle) verwendet. Erstens erzeugt dieses geschützte Derivat im Gegensatz zu Coelenterazin, das Autolumineszenz in einer wässrigen Umgebung erzeugt (insbesondere schlechter im Serum), eine sehr geringe Autolumineszenz (oft nicht nachweisbar) in einem Medium, das 10% Serum enthält, daher ist sein Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis höher als das von Coelenterazin erzeugte. Zweitens, anders als bei Coelenterazin, wo die Lumineszenz kurz nach der Zugabe des Substrats am stärksten ist, aber sehr schnell abnimmt, erreicht die von dem modifizierten lebenden Substrat erzeugte Lumineszenz ihren höchsten erreichbaren Punkt etwa 1,5 h nach der Substratzugabe und bleibt länger als 24 h kontinuierlich. Diese Änderungen in der Reaktionskinetik erleichtern die Messung der Lumineszenz in einer Multiwell-Platte, was für das Hochdurchsatz-Screening sehr nützlich ist. Darüber hinaus ermöglicht die durch das geschützte Substrat erzeugte Lumineszenz, die auf lange Sicht konstant bleibt, die Messung eines einzelnen Probensatzes zu mehreren Zeitpunkten, im Gegensatz zur Messung mehrerer Probensätze, die zu verschiedenen Zeitpunkten verwendet werden (ein Punkt pro Probe).

Unter Verwendung dieser aktualisierten Version des split-R luc-Konstruktshaben wir getestet, ob RHO-, RAC- und CDC42-GTPasen an der ER-Mito-Kontaktbildung beteiligt sind. Wir fügten GTPase-Inhibitoren, Rhosin (RHO-Inhibitor), Ehop-016 (RAC-Inhibitor) und ZCL278 (CDC42-Inhibitor), zu HEK293T Zellen hinzu, die Split-R-luc-Komponentenexprimieren. Unsere Assay-Ergebnisse deuten darauf hin, dass ZCL278 der stärkste Inhibitor der ER-Mitochondrien-Kontaktbildung ist und Ehop-016 der nächste signifikante Inhibitor ist, während Rhosin ihre Kontakte nicht beeinflusste. Diese Daten deuten darauf hin, dass eine CDC42-vermittelte Aktinpolymerisation (sowie in geringerem Maße auch eine RAC-vermittelte) erforderlich ist, um ER-Mitochondrien-Kontakte in der Zelle aufrechtzuerhalten, während die RHO-vermittelte Aktinpolymerisation wahrscheinlich nicht wichtig ist.

Um maximale Effizienz zu gewährleisten, gibt es viele kritische Schritte, die für dieses Protokoll berücksichtigt werden müssen. In erster Linie muss die Menge des transfizierten Konstrukts getestet werden, da zu viel DNA eine toxische Wirkung auf die Zellen haben kann. Zweitens, da die Anzahl der Zellen einen erheblichen Einfluss auf die gemessenen Luziferase-Spiegel haben kann, ist es entscheidend, die Zelldichte so nah wie im Protokoll angegeben zu halten, um die ideale und konsistente Konfluenz der Zellen von 80 % zum Zeitpunkt des Assays zu gewährleisten. Es kann zu einer Verringerung der Lumineszenz kommen, wenn die Zellen während der chemischen Expositionszeit die Konfluenz erreichen, da konfluente Zellen im Allgemeinen weniger Protein produzieren. Drittens, um sicherzustellen, dass sich die Zellen während der Zugabe von Chemikalien und Substrat nicht ablösen, verwenden wir eine 96-Well-Platte, die mit Poly-D-Lysin vorbeschichtet ist. Viertens ist es für die in diesem Protokoll verwendeten Verbindungen (einschließlich des Substrats) wichtig, sie bei -20 °C oder niedriger (-70 °C) in Aliquoten zu halten und sie den sofort aufgetauten Zellen zuzusetzen. Aufgrund möglicher Temperaturschwankungen, die die Luciferase-Aktivität beeinträchtigen können, ist es möglicherweise am besten, die innersten Vertiefungen der Platte zu verwenden und die Vertiefungen an der Außenseite der Platte zu ignorieren.

Der split-R luc8-Assaybietet eine einfache und dennoch robuste Methode zur Bestimmung von ER-Mitochondrien-Kontakten, ideal für das Hochdurchsatz-Screening. Es gibt jedoch einige Einschränkungen, die beachtet werden müssen. Für die Zellphysiologie stellt sich das Problem der Veränderungen im Zellverhalten aufgrund der ständigen Überexpression des Konstrukts DNA. Derzeit arbeiten wir an einem Konstrukt mit einem induzierbaren Promotor, um die möglichen Veränderungen in der Zellphysiologie durch ständige Überexpression zu bekämpfen. Des Weiteren sollte beachtet werden, wenn dieser Assay zu einem Screening-Zweck verwendet wird, so sollte beachtet werden, dass falsch positive Ergebnisse aus jeder indirekten Wirkung der Arzneimittel auf i) Expressionsniveaus, ii) Organellen-Targeting-Effizienzen der genannten Proteinfragmente oder iii) enzymatische Aktivitäten der rekonstituierten Luciferasen resultieren können. Aufgrund dieser Einschränkungen muss dieser Assay in Verbindung mit anderen Methoden getestet werden, um die Ergebnisse weiter zu validieren. Tabelle 1 verweist auf verschiedene Methoden zur Prüfung dieser Kontaktstellen mit ihren Vor- und Nachteilen. Wir haben uns andere Methoden zunutze gemacht, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Proximity-Ligationsassays (PLA), die die Nähe zwischen Proteinen nachweisen, und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), die eine klare Visualisierung von Organellenkontakten ermöglicht, in Verbindung mit dem split-R luc-Assay, um zu validieren, dass die resultierenden Veränderungen der RLU tatsächlich auf Veränderungen der ER-Mitochondrien-Kontaktstellen zurückzuführen sind (Abbildung 4 und Lim et al.24). Wir haben auch eine Korrelation zwischen Veränderungen der ER-Mitochondrien-Kontakte und funktionellen Parametern wie Kalziumtransfer und mitochondrialer Spaltung gezeigt (Abbildung 4 und Lim et al.24). Um sicherzustellen, dass die Wirkung der Arzneimittel auf die Split-Rluc-Aktivität nicht auf eine erhöhte Expression des split-R luc-Genszurückzuführen ist, kann ein Transkriptions- oder Translationsinhibitor zusammen mit den Arzneimitteln hinzugefügt werden, wie wir es zuvor getan haben24.

Für die Anwendung des split-R luc-Systemsin differenzierten Neuronen in Kulturen, in denen die Transfektionsrate niedrig ist, wäre eine Virusinfektion (mit Lentiviren, die split-Rluc-Komponenten exprimieren) ein alternativer Ansatz. Seine Verwendung kann erweitert werden, um ein Screening-System zu schaffen, in dem die Zellen (z. B. humane induzierte pluripotente Stammzellen) so verändert werden, dass sie jede Komponente des split-Rluc, MitoRlucN und RlucCER stabil exprimieren, entweder durch Virusinfektion oder durch CRSPR-vermittelte Geneditierung. Für ein stabiles Expressionssystem muss man sich jedoch darüber im Klaren sein, dass es einen Selektionsdruck für Zellen geben könnte, die das split-Rluc-System besser vertragen, was möglicherweise nicht repräsentativ für den normalen physiologischen Zustand ist. Diese Anpassung oder Selektion könnte zu einer Verzerrung der experimentellen Ergebnisse führen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass split-Rluc trotz einiger der oben genannten Einschränkungen ein schneller, unkomplizierter und leistungsstarker Assay für das Hochdurchsatz-Screening auf kleine Moleküle oder Gene ist, die die Interorganellenkontakte in der Zelle regulieren, wie in unserer früheren Wirkstoffscreening-Studiegezeigt wurde 24.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

Die Autoren danken Dr. Jeffrey Golden (Cedars-Sinai Medical Center) für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Diese Arbeit wurde teilweise vom National Institute of Neurological Disease and Stroke (NINDS, R01NS113516) finanziert.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,7 mL SafeSeal MikrozentrifugenröhrchenSorenson16070
6-Well-Platte TC TreatedUSA ScientificCC7682-7506
10 mL Pipettenspitzen OneTipUSA Scientific1110-3700
10 μ L Pipettenspitzen OneTipUSA Scientific1110-3700
20-200 μ L Abgeschrägte Spitzen OneTipUSA Scientific1111-1210
50 mL Konisches Röhrchen aus PolypropylenFalcon352070
96-Well-Flipper-Mikroröhrchen-RacksThermoFisher Scientific8770-11
96-Well-Platte TC behandelt USA ScientificCC7682-7596
100 mm x 20 mm TC-behandelte SchaleUSA ScientificCC7682-3394
1250 μ L Spitzen OneTipUSA Scientific1112-1720
Zentrifuge 5910  Ri - KühlzentrifugeEppendorf5943000131
Dimethylsulfoxid, wasserfrei, ≥ 99,9%Sigma-Aldrich276855-100ML
DMEM, hoher GlukosegehaltThermoFisher Scientific11965092
DPBS, kein Kalzium, kein MagnesiumThermoFisher Scientific14190144
EHop 016Bio-Techne Tocris6248In DMSO auflösen; lagern bei -70 &Grad; C
EnduRen LebendzellsubstratPromegaE6481Aliquots bei -70 ° C
Eppendorf 2-20 μ L-PipetteEppendorf3123000039
Eppendorf Research plus 100-1000 μ L PipetteEppendorf3123000063
Eppendorf Research Plus 1-10 µ L-PipetteEppendorf3123000020
Eppendorf Research plus 12-KanalEppendorf3125000028
Eppendorf Research plus 200 μ L PipetteEppendorf 
Fötales Rinderserum, qualifiziert, USDA-zugelassene RegionenThermoFisher Scientific10437028
Forma Steri-Cycle CO2  Inkubator, 184 L, Edelstahl poliertThermoFisher Scientific381
HandstrichzählerSigma-AldrichHS6594
HEK 293T ZellenATCCCRL-3216
Hämazytometer - Neubauer Bright Line, DoppelzählkammerLW ScientificCTL-HEMM-GLDR
Invitrogen TE PufferThermoFisher Scientific8019005
MikroskopZeissAxiovert 25 CFL
Mini-ZentrifugeBenchmark ScientificC1012
Multi-Röhrchen-Rack für 50 ml konische, 15 ml konische und MikrozentrifugenröhrchenBoekel Scientific120008
PEI MAX - Transfektionsqualität Lineares Polyethyleniminhydrochlorid (MW 40.000)Polysciences24765-100MG
Pipet-Aid XP USAScientific4440-0101
Poly-D-LysinhydrobromidSigma-AldrichP6407-5MG
RhosinhydrochloridBio-Techne Tocris5003In DMSO auflösen; lagern bei -70 & Grad; C
Trypsin-EDTA (0,05%), PhenolrotThermoFisher Scientific25300054
Varioskan LUX Multimode-Mikroplatten-ReaderThermoFisher ScientificVL0000D0
VortexThermoFisher Scientific2215365Level 8
VWR Vakuum-AspirationssystemVWR75870-734
ZCL 278Bio-Techne Tocris4794In DMSO auflösen; bei -70 Grad lagern; C
3123000055

Referenzen

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