Das DREAM-Implantat: ein leichtes, modulares und kostengünstiges Implantatsystem für die chronische Elektrophysiologie bei kopffesten und sich frei verhaltenden Mäusen

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein leichtes, kostengünstiges Sondenimplantatsystem für die chronische Elektrophysiologie bei Nagetieren vor, das für Benutzerfreundlichkeit, Sondenwiederherstellung, experimentelle Vielseitigkeit und Kompatibilität mit dem Verhalten optimiert ist.

Zusammenfassung

Chronische elektrophysiologische Ableitungen bei Nagetieren haben unser Verständnis der neuronalen Dynamik und ihrer Verhaltensrelevanz deutlich verbessert. Die derzeitigen Methoden zur chronischen Implantation von Sonden stellen jedoch hohe Kompromisse zwischen Kosten, Benutzerfreundlichkeit, Größe, Anpassungsfähigkeit und Langzeitstabilität dar.

Dieses Protokoll führt ein neuartiges chronisches Sondenimplantatsystem für Mäuse namens DREAM (Dynamic, Recoverable, Economical, Adaptable, and Modular) ein, das entwickelt wurde, um die Kompromisse zu überwinden, die mit den derzeit verfügbaren Optionen verbunden sind. Das System bietet eine leichte, modulare und kostengünstige Lösung mit standardisierten Hardwareelementen, die in einfachen Schritten kombiniert und implantiert und sicher für die Wiederherstellung und mehrfache Wiederverwendung von Sonden explantiert werden können, wodurch die experimentellen Kosten erheblich gesenkt werden.

Das DREAM-Implantatsystem integriert drei Hardware-Module: (1) ein Mikrolaufwerk, das alle Standard-Siliziumsonden aufnehmen kann und es den Experimentatoren ermöglicht, die Aufzeichnungstiefe über einen Verfahrweg von bis zu 7 mm einzustellen; (2) ein dreidimensionales (3D)-druckbares Open-Source-Design für einen tragbaren Faradayschen Käfig, der mit Kupfergitter für elektrische Abschirmung, Aufprallschutz und Steckerplatzierung überzogen ist, und (3) ein miniaturisiertes Kopffixierungssystem für verbesserten Tierschutz und Benutzerfreundlichkeit. Das entsprechende Operationsprotokoll wurde im Hinblick auf Schnelligkeit (Gesamtdauer: 2 h), Sondensicherheit und Tierschutz optimiert.

Die Implantate hatten nur minimale Auswirkungen auf das Verhaltensrepertoire der Tiere, waren leicht in frei beweglichen und kopffixierten Kontexten anwendbar und lieferten klar identifizierbare Spike-Wellenformen und gesunde neuronale Reaktionen für Wochen der Datenerfassung nach der Implantation. Infektionen und andere chirurgische Komplikationen waren äußerst selten.

Als solches ist das DREAM-Implantatsystem eine vielseitige, kostengünstige Lösung für die chronische Elektrophysiologie bei Mäusen, die das Wohlbefinden der Tiere verbessert und ethologisch fundiertere Experimente ermöglicht. Sein Design vereinfacht experimentelle Verfahren für verschiedene Forschungsanforderungen und verbessert den Zugang zur chronischen Elektrophysiologie bei Nagetieren für eine Vielzahl von Forschungslabors.

Einleitung

Die Elektrophysiologie mit chronisch implantierten Siliziumsonden hat sich aufgrund ihrer genetischen und experimentellen Nachvollziehbarkeit als leistungsfähige Technik zur Untersuchung der neuronalen Aktivität und Konnektivität bei sich verhaltenden Tieren, insbesondere bei Mäusen, erwiesen¹. Insbesondere laminare Siliziumsonden haben sich als unschätzbares Werkzeug erwiesen, um funktionelle Beziehungen innerhalb kortikaler Säulen^{zu identifizieren 2} und um die Dynamik großer neuronaler Populationen auf eine Weise mit dem Verhalten in Beziehung zu setzen, die zuvor unmöglich war³.

Zwei komplementäre Ansätze sind die aktuellen Goldstandards für die Aufzeichnung neuronaler Aktivität in vivo: die Zwei-Photonen-Mikroskopie ^4,5 und die extrazelluläre Elektrophysiologie⁶. Die Wahl der Aufzeichnungsmethode schränkt die Art der Messwerte ein, die erhalten werden können: Die Zwei-Photonen-Mikroskopie eignet sich besonders gut für Längsschnittstudien von individuell identifizierbaren Neuronen in großen Populationen über die Zeit, leidet jedoch unter hohen Gerätekosten und ist auf oberflächliche Schichten der Hirnrinde in intakten Gehirnen beschränkt. Darüber hinaus schränkt die typische zeitliche Auflösung von ~30 Hz die Fähigkeit ein, die laufende neuronale Dynamik zu erfassen ^7,8.

Im Gegensatz dazu bieten elektrophysiologische Aufzeichnungen eine hohe zeitliche Auflösung (bis zu 40 kHz), um die neuronale Aktivität Moment für Moment zu verfolgen, können sowohl bei Spezies als auch in kortikalen Tiefen breit angewendet werden und sind im Vergleich zur Zwei-Photonen-Mikroskopie relativ kostengünstig aufgebaut. Die Identifizierung einzelner Neuronen sowie die longitudinale Verfolgung von neuronalen Populationen sind jedoch nur schwer zu erreichen. Dies gilt insbesondere für Drahtelektroden, z. B. Tetroden, und für akute Elektrodeneinführungen. Abgesehen davon, dass sie nicht in der Lage sind, Neuronen über Aufzeichnungssitzungen hinweg zu verfolgen⁹, verursachen wiederholte akute Insertionen ein lokales Trauma¹⁰ , das eine Immunantwort^{auslöst 11}, was die Wahrscheinlichkeit von Infektionen und Gliose erhöht. Dies verringert letztlich die Stabilität der aufgezeichneten neuronalen Aktivität und die Lebenserwartung der Versuchstiere, so dass der Umfang von Längsschnittstudien mit akuten elektrophysiologischen Aufzeichnungen auf wenige Tage begrenzt^{ist 12}.

Chronische Messungen von Siliziumsonden mit hoher Dichte zielen darauf ab, einige der besten Eigenschaften der akuten Elektrophysiologie und der Zwei-Photonen-Bildgebung zu kombinieren. Sie können die Dynamik der neuronalen Population über Sitzungen hinweg verfolgen, wobei die Fähigkeit, einzelne Neuronen zu identifizieren, im Vergleich zur Zwei-Photonen-Bildgebung nur etwas geringer ist¹³. Diese Aufzeichnungen bieten eine hohe Flexibilität bei der räumlichen Platzierung und präzisen zeitlichen Auflösung der aufgezeichneten Signale sowie eine verbesserte Langlebigkeit und ein verbessertes Wohlbefinden der Versuchstiere im Vergleich zu akuten Aufzeichnungen¹⁴. Darüber hinaus ist bei der chronischen Elektrophysiologie im Gegensatz zu akuten Aufzeichnungen nur ein einziges Implantationsereignis erforderlich, wodurch das Risiko von Infektionen und Gewebeschäden effektiv reduziert und der Stress für die Tiere minimiert^{wird 15}. Zusammengenommen machen diese Vorteile die chronische Elektrophysiologie zu einem leistungsfähigen Werkzeug zur Untersuchung der Organisation und Funktion des Nervensystems.

Die häufig verwendeten chronischen Implantationstechniken für Mäuse hindern die Forscher jedoch dazu, erhebliche Kompromisse zwischen der Kompatibilität mit Verhaltensaufzeichnungen, dem Implantatgewicht, der Replizierbarkeit von Implantaten, den finanziellen Kosten und der allgemeinen Benutzerfreundlichkeit einzugehen. Viele Implantatprotokolle sind nicht darauf ausgelegt, die Wiederverwendung von Sonden¹⁶ zu erleichtern, was die effektiven Kosten einzelner Experimente stark erhöht und es somit für einige Laboratorien finanziell schwierig macht, chronische Elektrophysiologie einzusetzen. Sie erfordern oft auch umfangreiche interne Prototyping- und Designarbeiten, für die möglicherweise nicht das Fachwissen und die Ressourcen vorhanden sind.

Andererseits bieten integrierte Implantatsysteme¹⁷ eine breiter zugängliche Lösung für die chronische Elektrophysiologie bei Nagetieren. Diese Systeme sind so konzipiert, dass sie ein Mikrolaufwerk integrieren, das die Sonde mit dem Rest des Implantats hält, um die Handhabung des Implantats und chirurgische Eingriffe zu vereinfachen. Einmal implantiert, können solche Systeme jedoch kopflastig sein und die Fähigkeit des Experimentators einschränken, ein Experiment flexibel an unterschiedliche Zielkoordinaten anzupassen. Oft schließt ihr Gewicht Implantate bei kleineren Tieren aus, beeinträchtigt möglicherweise die Bewegung der Tiere und führt zu Stress¹⁸. Dies kann sich unverhältnismäßig stark auf die Forschung an jugendlichen und weiblichen Kohorten auswirken, da diese Gruppen eher von Gewichtseinschränkungen betroffen sind.

Darüber hinaus ermöglichen nicht alle integrierten Systeme eine Anpassung der Elektrodenpositionen nach der Implantation. Dies ist relevant, da Gliosen oder Narbenbildung durch das Einführen der Sonde¹⁹, insbesondere in den ersten 48 h nach der Implantation²⁰, die Qualität der aufgezeichneten neuronalen Aktivität verringern können. Durch Mikroanpassungen der Einstecktiefe der Sonde können diese negativen Auswirkungen auf die Signalintegrität begrenzt werden. Daher können Mikropositioniermechanismen, allgemein als Mikroantriebe bezeichnet, auch bei Sonden mit einer großen Anzahl von Elektroden über ihre Länge verteilt sein.

Um solche Kompromisse zu überwinden, stellen wir ein neuartiges chronisches Elektrophysiologie-Implantatsystem für Mäuse vor, das die Einschränkungen früherer Designs überwindet, indem es eine leichte, kostengünstige und modulare Lösung bietet. Das DREAM-Implantatsystem ist so konzipiert, dass es weniger als 10 % (~2,1 g) des typischen Körpergewichts einer Maus wiegt, was das Wohlergehen der Tiere und minimale Auswirkungen auf das Verhalten gewährleistet. Die Validierung des DREAM-Implantatdesigns zeigt minimale Auswirkungen auf Verhaltenskennzahlen wie die Fortbewegung, die bei Nagetieren erheblich beeinträchtigt werden kann, wenn der Schädel belastet wird. Dies kann experimentellen Paradigmen zugute kommen, die sowohl frei bewegliche als auch kopffixierte Tiere verwenden, indem sie das Wohlbefinden der Tiere steigern und ethologisch fundiertere Experimente ermöglichen.

Das System verfügt über einen Mikroantrieb zur flexiblen Einstellung der Aufzeichnungstiefe von bis zu 7 mm und kann an verschiedene Arten von Sonden und Aufzeichnungsgeräten angepasst werden, wodurch den Forschern ein kostengünstiges und vielseitiges Werkzeug für verschiedene experimentelle Anwendungen zur Verfügung steht. Das System wird routinemäßig mit einem Metall-Mikroantrieb²¹ kombiniert, der im Vergleich zu anderen Systemen eine konsistente Sondenrückgewinnung bietet (erwartete durchschnittliche Wiederfindungsrate: ca. drei zuverlässige Wiederverwendungen pro Sonde) und die Kosten für einzelne Experimente drastisch reduziert.

Das Design verfügt über einen 3D-gedruckten Faradayschen Schutzkäfig, der einen kostengünstigen und dennoch robusten Schutz vor elektrophysiologischem Rauschen, mechanischen Einwirkungen und infektiösen Materialien ermöglicht und stabile und rauschfreie Aufnahmen mit minimalen Infektionsraten ermöglicht. Dieser implantierbare Käfig besteht aus der sogenannten "Krone", die zum Aufprallschutz und zur Strukturierung der leitfähigen Metallnetzbeschichtung des Faradayschen Käfigs entwickelt wurde, und dem Kronenring, der als Halterung für einen implantierbaren Verstärker und/oder Sondenanschluss dient (siehe Abbildung 1).

Schließlich sind die Kopfplatten, die im modularen Implantatsystem enthalten sind, so konzipiert, dass sie mit einem neuartigen, effizienten Kopffixationssystem kompatibel sind, ohne dem Implantat zusätzliches Volumen hinzuzufügen. Im Gegensatz zu anderen bestehenden Systemen müssen keine kleinen Schrauben in der Nähe des Implantats festgezogen werden, was die Fixierung von Mäusen im Versuchsaufbau beschleunigt und die Beziehung zwischen Versuchsleiter und Tier sowie die Verhaltensadhärenz verbessert. Gleichzeitig dient die Kopfplatte als Basis, auf der die anderen Module des chronischen Elektrophysiologie-Systems DREAM aufgebaut werden.

Designdateien für das DREAM-Implantat werden als Open-Source-Hardware auf https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/ veröffentlicht. In den folgenden Abschnitten werden das Design und die Herstellung des DREAM-Implantatsystems beschrieben, seine erfolgreiche Implementierung in einem Mausmodell demonstriert und seine Anwendungsmöglichkeiten und Vorteile gegenüber bestehenden Systemen diskutiert.

Protokoll

Alle experimentellen Verfahren wurden nach den institutionellen Richtlinien der Max-Planck-Gesellschaft durchgeführt und von der Beratenden Ethikkommission nach §15 Tierschutzgesetz, Regierungspräsidium Hessen, Projektgenehmigungskennzeichen: F149-2000 genehmigt.

Abbildung 1: Implantatdesign. (A) 3D-Rendering des Implantats, das auf einen Mausschädel gelegt wird, wobei eine Silikonsonde mit einem Sondenanschluss verbunden ist. Die zentrale Öffnung der Kopfplatte beträgt ca. 10 mm für die Skala. Die Höhe des Antriebs beträgt ca. 17 mm. Das Kupfergeflecht, das die Außenseite der Faradayschen Krone bildet, sowie die Erdungs-/Ref-Drähte sind nicht zu sehen. (B) Wie (A) mit einem Anschluss an eine Verstärkerplatine anstelle eines Sondenanschlusses. (C) Explosionszeichnung des Implantats, die seine Bestandteile zeigt. (D) Darstellung eines abgewinkelten Abstandshalters, der unter einem Mikrolaufwerk implantiert werden kann, wodurch das Mikrolaufwerk konsistent in einem vordefinierten Winkel (hier: 20°) implantiert werden kann. (E) Rendering des integrierten Kopffixationsmechanismus, der eine implantierte Kopfplatte mit Faradayscher Krone mit der umgebenden Kopffixationsklemme und der Schwalbenschwanzverbindung zum Aufbau zeigt. (F) Bild eines Mauskopfes, der mit dem integrierten Kopffixationsmechanismus des Implantats auf einem Laufband fixiert ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

HINWEIS: In den Abschnitten 1 und 2 werden die präoperativen Vorbereitungen erörtert

1. Vorbereitung der Silikonsonde

1. Im Falle einer Wiederverwendung der Sonde reinigen Sie die Silikonsonde gemäß den Empfehlungen des Sondenlieferanten. Weichen Sie die Sonde 5-10 Minuten lang in enzymatischem Reiniger (siehe Materialtabelle) ein und spülen Sie sie dann in demineralisiertem Wasser ab. Tun Sie dies so schnell wie möglich nach der Explantation. Weichen Sie die Sonde einen Tag vor der (Re-)Implantation mindestens 30 Minuten lang in 70%igem Ethanol zur Desinfektion ein.
2. Messen Sie die Kanalimpedanzen, um sicherzustellen, dass sie innerhalb der Spezifikationen für das aufgezeichnete Signal liegen. Befolgen Sie das Protokoll zum Testen des Geräuschpegels aus dem Neuropixels-Benutzerhandbuch²², messen Sie die Impedanz über die gewünschte Aufzeichnungssoftware (z. B. https://open-ephys.github.io/gui-docs/User-Manual/Plugins/Acquisition-Board.html#impedance-testing) und befolgen Sie die Impedanzen des Zielkanals vom Hersteller der Silikonsonde oder aus dem Datenblatt. Wenn die Impedanzen zu hoch sind, erwägen Sie, die Elektrodenstellen²³ neu zu beschichten.
3. Löten Sie eine 0,05-Zoll-Lötbuchse (siehe Materialtabelle) an das Massekabel (GND) der Sonde. Verbinden Sie die Buchse während der Operation mit dem GND-Pin (nächster Schritt).
   HINWEIS: In diesem Protokoll wird kein separater Referenz-Pin (REF) verwendet, da GND und REF auf dem verwendeten Kopftisch kurzgeschlossen werden. Daher wird im weiteren Verlauf des Protokolls nur der GND-Pin erwähnt. Wenn ein separater REF verwendet wird, wiederholen Sie den folgenden Schritt für den REF-Pin.
4. Um den GND-Pin vorzubereiten, stecken Sie die Pin-Seite einer 0,05"-Lötschwanzbuchse (siehe Materialtabelle) wiederholt in die GND 0,05"-Lötschwanzbuchse, bis das Einstecken weitgehend mühelos ist. Die Verwendung von vergoldeten Stiften kann den Bedarf an diesem Glättungsschritt reduzieren. Dadurch wird sichergestellt, dass der GND-Stift und die Buchse während der Operation einfach angeschlossen werden können, ohne dass übermäßiger Druck ausgeübt werden muss, wodurch das Risiko von Verletzungen des Tieres und einer Sondenbeschädigung verringert wird.
5. Wenn ein implantierbarer Vorverstärker für die Silikonsonde verwendet wird, bereiten Sie ihn für die chronische Implantation nach den Verfahren des Lieferanten vor. Befestigen Sie dann den Verstärker/Stecker am Ring des Faradayschen Käfigs, indem Sie ihn mit Silikongips auf den Bereich des Faradayschen Rings kleben, der für die Aufnahme des Verstärkers vorgesehen ist (siehe Abbildung 1).
   HINWEIS: Die Vorbereitung des implantierbaren Vorverstärkers für die Silikonsonde für die chronische Implantation gemäß den Verfahren des Lieferanten kann die Beschichtung mit Silikon oder Epoxidharz umfassen, um eine Beschädigung der Elektronik durch Feuchtigkeit zu vermeiden, sowie das wiederholte Einstecken des Verstärkersteckers, um die Steckkraft beim Verbinden des Verstärkers mit dem Aufnahmesystem während der Aufnahme zu reduzieren. Dies ist besonders nützlich für Omnetics-Benutzer.

2. Vorbereitung des Mikroantriebs und der Kopfbedeckung

1. Drehen Sie die Schraube am Microdrive-Gehäuse so, dass das Microdrive-Shuttle fast vollständig nach oben eingefahren wird.
2. Optional können Sie einen abgewinkelten Abstandshalter (siehe Abbildung 1D) mit Cyanacrylatkleber oder Zahnzement an der Unterseite des Mikrolaufwerks befestigen, der verwendet werden kann, um einen bestimmten Grad der Neigung zu ermöglichen, z. B. bei der Aufnahme durch kortikale Schichten in einem Bereich innerhalb des zentralen Sulcus oder in tiefen Strukturen, die einen nicht senkrechten Zugang erfordern können (für abgewinkelte Abstandshalter, siehe Materialtabelle).
3. Legen Sie das Mikrolaufwerk horizontal auf den Mikrolaufwerkshalter (Ergänzende Abbildung 1).
4. Legen Sie ein kleines Stück Klebekitt (siehe Materialtabelle) in einem Abstand über dem Mikrolaufwerk auf den Mikrolaufwerkhalter, in dem der Kopftischstecker platziert wird. Dieser Abstand hängt von der Länge des Flexkabels ab, das die Silikonsonde mit dem Kopftischstecker verbindet.
5. Geben Sie einen winzigen Tropfen Silikonpflaster (siehe Materialtabelle) auf das Schiffchen.
6. Nehmen Sie die Silikonsonde mit Hilfe einer stumpfen Pinzette mit weicher Spitze aus der Verpackung. Stellen Sie diese her, indem Sie Standard-Spitzzangen mit einem Schrumpfschlauch von 3 mm Durchmesser beschichten (siehe Materialtabelle). Platzieren Sie die Sonde mit dem Flexkabel zuerst auf dem Shuttle des Microdrives, so dass die Unterkante des Flexkabels leicht über die Unterkante des Microdrive-Shuttles hinausragt.
7. Ziehen Sie das Flexkabel vorsichtig zur Oberseite des Mikrolaufwerks, bis die Unterkante des Flexkabels auf die Unterkante des Microdrive-Shuttles trifft. Achten Sie bei diesem Schritt darauf, das Flexkabel gegen die linke Kante des Microdrive-Shuttles zu drücken, sodass es am Ende genau senkrecht auf dem Microdrive platziert ist. Achten Sie an dieser Stelle darauf, dass die Schäfte der Silikonsonde nicht (oder nur minimal) über die Unterkante des Mikrolaufwerks hinausragen (abhängig von der genauen Länge der Sondenschäfte und der Tiefe des Zielhirnbereichs).
8. Platzieren Sie den Kopftischstecker der Sonde auf dem Klebekitt oben an der Halterung, um die Sonde vor dem Herunterfallen zu schützen.
9. Tragen Sie mit einer 27-G-Spritzennadel einen kleinen Tropfen Cyanacrylatkleber (siehe Materialtabelle) zwischen dem Flexkabel und dem Shuttle auf, um die Sonde an Ort und Stelle zu halten. Stellen Sie sicher, dass der Kleber nicht auf das Mikrolaufwerk oder entlang des Flexkabels über das Shuttle hinaus läuft (dies ist sehr wichtig)
10. Sobald das Flexkabel in Position geklebt ist, befestigen Sie den Verstärker mit Silikongips am Kronenring (siehe Materialtabelle). Befestigen Sie dann das Flexkabel am Verstärker und bedecken Sie den Anschluss und das Kabel mit einer dünnen Schicht Silikonpflaster.
11. Nach 5 Minuten, wenn der Gips ausgehärtet ist, bewahren Sie das Mikrolaufwerk und die Sonde bis zur weiteren Verwendung sicher auf.
12. Schneiden Sie Stücke aus Kupfernetz (siehe Materialtabelle) in eine offene Donut-Form (siehe Schnittmuster in der ergänzenden Abbildung 2), um den Faradayschen Käfig abzudecken.
13. Befestigen Sie den Kupfergitterausschnitt mit kleinen Tropfen Epoxidharz am Faradayschen Käfig (siehe Materialtabelle). Für diesen Schritt kann man Epoxidharz auch durch Zahnzement ersetzen.
    HINWEIS: Der Faradaysche Käfig enthält Platz für einen Sondenanschluss oder einen Verstärker. Dieser Raum ist in der Designdatei durch ein X gekennzeichnet und enthält eine Stützbasis für den Verstärker/Anschluss sowie einen größeren Abstand zwischen den beiden benachbarten Speichen des Käfigs. Um ausreichend Platz um den Verstärker/Anschluss zu schaffen, befestigen Sie eine kleine Menge an zusätzlichem Netz zwischen den beiden benachbarten Speichen, wodurch ein Vorsprung entsteht. Dadurch wird sichergestellt, dass der Verstärker/Anschluss später in dieser "Tasche" positioniert werden kann, ohne den Faradayschen Käfig zu berühren. Um eine sichere Haftung mit minimalem Verzug zu gewährleisten, verwenden Sie den Kronenring, der direkt auf die Krone aufgesetzt wird, um die Form zu erhalten und die dünnen Speichen der Krone zu stützen. Des Weiteren können Sie mit lötenhelfenden Händen die Krone und das Netz während des Trocknens sichern. Wenn Sie Schwierigkeiten haben, die Form der Krone während des Eingriffs beizubehalten, versuchen Sie, nur zwei der Kronenarme gleichzeitig mit Epoxidharz zu versehen, um ein Verziehen zu vermeiden.
14. Wenn eine separate Erdung des Faradayschen Käfigs gewünscht wird, löten Sie einen kleinen Stift auf einen 30-mm-Erdungsdraht (siehe Materialtabelle) und kleben Sie den Draht dann mit leitfähigem Epoxidharz an den Kupfergitterausschnitt.
    HINWEIS: Dieser Schritt wird im Labor nicht eingehalten.
15. Bewahren Sie die vorbereiteten Teile zu diesem Zeitpunkt sicher auf und führen Sie die Operation zu einem späteren Zeitpunkt durch.
    HINWEIS: In den Abschnitten 3-6 wird die Implantation des Mikroantriebs und der Kopfbedeckung erläutert.

3. Chirurgie: Vorbereitung der Sonde und des Arbeitsbereichs

1. Sterilisieren Sie chirurgische Instrumente und platzieren Sie sie nach einem zugelassenen Verfahren im chirurgischen Arbeitsbereich.
   HINWEIS: Dies kann die Verwendung eines Bead-Sterilisators, das Autoklavieren von Instrumenten oder das Spülen mit 30 % Peroxid oder 90 % Ethanol umfassen, je nach genehmigtem Versuchsprotokoll.
2. Stellen Sie die Keramikschale, die zur Herstellung des Zahnzementes verwendet wurde, in eine Kühlbox, einen Kühlschrank oder einen Gefrierschrank und befolgen Sie dabei die Anweisungen im Zahnzement-Set (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie die abgekühlte Keramikschale während des Zementmischens, um die Zeit zu verlängern, in der der Zement formbar ist. Verwenden Sie eine gekühlte Schale, wenn längere Zementierschritte erforderlich sind.
3. Wenn eine histologische Überprüfung der Sondenplatzierung am Ende des Experiments gewünscht wird, verlängern Sie die Silikonsonde direkt vor der Operation, indem Sie die Schraube am Mikroantrieb gegen den Uhrzeigersinn drehen und einen lipophilen Farbstoff (siehe Materialtabelle) auf die Sonde auftragen, indem Sie ihn in einen kleinen Tropfen des Farbstoffs tauchen. Bereiten Sie den lipophilen Farbstoff aus einer handelsüblichen Dimethylsulfoxid (DMSO) oder Ethanol (EtOH) verdünnten Stammlösung (siehe Materialtabelle) her, indem Sie ihn in einem geeigneten Puffer wie PBS in einer Konzentration von 1-5 μM verdünnen.

4. Operation: Vorbereitung des Tieres

1. Befolgen Sie ein genehmigtes Anästhesieprotokoll für eine 2-4-stündige Nagetieroperation unter aseptischen Bedingungen. Dies kann Vollnarkose und Lokalanästhesie, Analgesie, Auftragen von Augensalben und Injektionen von Kochsalzlösung umfassen. Verwenden Sie hier eine injizierbare Anästhesie (Ketamin 100 [mg/kg]/Medetomidin 0,5 [mg/kg]) zusammen mit einer lokalen Analgesiecreme und Augensalbe (siehe Materialtabelle) und legen Sie das Tier auf ein Heizkissen, um die Körpertemperatur zu regulieren.
2. Wenn das Tier vollständig betäubt ist, bringen Sie es in einen separaten, unsterilen Rasierbereich.
   1. Stellen Sie sicher, dass das Tier ausreichend erwärmt wird. Legen Sie es zum Beispiel auf ein Heizkissen. Entferne die Haare auf der Oberseite des Schädels. Tun Sie dies mit einem Elektrorasierer oder einer Enthaarungscreme (siehe Materialtabelle) oder indem Sie den Oberkopf wiederholt mit einem Skalpell rasieren, das mit 70 % Ethanol bedeckt ist.
   2. Entfernen Sie vorsichtig lose Haare, um sicherzustellen, dass sie später nicht mit freiliegendem Gewebe in Berührung kommen. Um Haare zu entfernen, verwenden Sie z. B. mit 70%igem Ethanol benetzte Taschentücher und/oder eine Quetschballpumpe. Wenn Sie Enthaarungscreme verwenden, achten Sie darauf, dass diese mit Wattestäbchen und Kochsalzlösung gründlich entfernt wird.
3. Desinfizieren Sie den rasierten Bereich mehrmals mit einem Desinfektionsmittel auf Jodbasis (siehe Materialtabelle) und Alkohol mit Wattestäbchen, indem Sie von der Mitte des Kopfes zu den Seiten vordringen, um alle verbleibenden losen Haare von der Schnittstelle wegzubürsten.
4. Desinfizieren Sie das Fell am und um den Kopf mit Betadine. Dies gewährleistet einen sterilen Arbeitsbereich und schützt chirurgische Instrumente und Materialien vor dem Kontakt mit unsterilem Fell.
5. Platzieren Sie das Tier mit Ohrstangen und Nasenhalter in einem stereotaktischen Rahmen (siehe Materialtabelle).
6. Schneiden Sie mit einer kleinen chirurgischen Schere (siehe Materialtabelle) eine mandelförmige Öffnung in die Haut auf der Oberseite des Schädels, die nur von der hinteren Seite der Lambda-Naht bis zwischen den Augen reicht.
7. Entfernen Sie die Unterhautmembran und das Periost, indem Sie noch nass abschneiden, und kratzen Sie dann den Schädel mit einer Skalpellklinge ab, um weiches Membrangewebe auf der Schädeloberfläche zu entfernen, das die Haftung des Zahnzementes behindern könnte.
8. Optional: Nachdem der Schädel von Membrangewebe befreit wurde, tragen Sie kurz eine dünne Schicht 0,5%iges Peroxid auf und waschen Sie diese mit einem wasserbasierten Joddesinfektionsmittel (z. B. Betadin) ab, bevor Sie die Schädeloberfläche aufrauen, um die Haftung des Primers auf dem Schädel zu verbessern.
9. Aufrauen Sie die Oberfläche des Schädels vorsichtig auf, indem Sie mit der Spitze des Skalpells auf den Kopf gestelltes Kreuzmuster kratzen. Dies hilft dabei, dass Zahnzement später am Schädel haftet.
   HINWEIS: Kratzen Sie nicht zu stark auf den Nähten, da dies dazu führen kann, dass die Nähte reißen und intrakranielle Flüssigkeit austritt, was die Haftung des Zahnzementes beeinträchtigt.
10. Wechseln Sie zwischen Skalpellklinge und sterilen Wattestäbchen, um die Nackenmuskeln, die an den Seiten der Lambda-Naht befestigt sind, sanft zu kratzen/wegzuschieben, bis die Muskeln an den "Rand" des Schädels auf dem Kleinhirn zurückgeschoben wurden. Dies trägt dazu bei, das Muskelrauschen in neuronalen Aufzeichnungen zu minimieren.
11. Füllen Sie eine 1-ml-Spritze mit einer 27-g-Nadel (siehe Materialtabelle) mit kleinen Mengen chirurgischem Cyanacrylatkleber (siehe Materialtabelle). Kleben Sie dann die Haut mit der Spritze an die Schädelränder, um winzige Tropfen Sekundenkleber darauf zu schmieren. Kleben Sie das Gewebe so flach wie möglich auf den Schädel, um Platz für Implantate zu schaffen. Dieses Verfahren stellt sicher, dass Haut und Muskeln nicht in direkten Kontakt mit Teilen des Implantats kommen, was Muskelgeräusche bei Aufnahmen vermeidet und die Haftung des Zahnzementes verbessert.
12. Tragen Sie Zahnzementgrundierung auf den Schädel auf, um die Haftung zu erhöhen, und härten Sie ihn mit UV-Licht aus (siehe Materialtabelle). Dies verbessert die Adhäsion von Zahnzement und verhindert, dass Schädelnähte undicht werden und die Schädel-Zement-Verbindung mit der Zeit geschwächt wird.
13. Finden Sie den Zielort für die Sondenimplantation relativ zu Bregma oder Lambda und skizzieren Sie die Kraniotomie um ihn herum mit einem chirurgischen Marker. Platzieren Sie die Kopfplatte so auf dem Schädel, dass die Kraniotomie darin liegt, mit Platz für den Mikroantrieb an einer Seite der Kraniotomie, sowie für 1-2 Erdungsstifte.
14. Implantieren Sie die Kopfplatte mit Zahnzement. Mischen Sie Zahnzement in der dafür vorgesehenen gekühlten Keramikschale (siehe Schritt 3.2). Stellen Sie sicher, dass die Kopfplatte an allen Seiten am Schädel haftet und eine wasserdichte "Vertiefung" bildet.
15. Bohren Sie mit einem Dentalbohrer (Größe US 1/2 HP) ein kleines Bohrloch in der Breite der in Schritt 1.4 vorbereiteten Stifte über die Hirnareale, die als GND/REF verwendet werden sollen. Wenn eine Erdung des Faradayschen Käfigs gewünscht ist, bohren Sie ein weiteres kleines Fräsloch in der Nähe der Kante des Faradayschen Käfigs für den Faraday-GND-Stift.
    HINWEIS: Platzieren Sie die GND/REF-Stifte in ausreichendem Abstand zum Rand des Käfigs, damit der Stift selbst später darin platziert werden kann, ohne den Faradayschen Käfig zu berühren.
16. Reinigen Sie die Kraniotomie, indem Sie mit einer Spritze vorsichtig sterile Kochsalzlösung darauf träufeln und mit nicht verschüttenden Tüchern entfernen (siehe Materialtabelle). Wiederholen Sie den Vorgang, bis das gesamte Blut und loses Gewebe entfernt ist.
17. Bereiten Sie eine 0,7%ige Agarlösung (siehe Materialtabelle) in Kochsalzlösung vor, kühlen Sie sie etwas ab und führen Sie sie mit einer 27-G-Nadel auf einer 1-ml-Spritze in die Kraniotomie ein.
18. Führen Sie vorsichtig einen GND-Stift (siehe Schritt 1.3) in jede Kraniotomie ein, die im vorherigen Schritt gebohrt wurde. Der/die Stift(e) wird von allen Seiten mit Agar umgeben (siehe Schritt 4.17). Tragen Sie Zement um die Stifte auf, um sie zu sichern und eine elektrische Isolierung zu gewährleisten.
19. Reinigen Sie die Keramikschale und stellen Sie sie wieder in den Kühl-/Gefrierschrank.
20. Bohren Sie mit einem Zahnbohrer den Umriss eines größeren Kraniotomies (kreisförmig oder quadratisch), indem Sie sich in gleichmäßigen Bewegungen um den Rand bewegen. Stellen Sie sicher, dass die Kraniotomie 1 mm x 1 mm bis 2 mm x 2 mm beträgt, um kleine Anpassungen an der Platzierung der Sonde zu ermöglichen, um Blutgefäße zu vermeiden, ohne zu viel von der Hirnrinde freizulegen. Vermeiden Sie nach Möglichkeit das Platzieren von Kraniotomien über Nähten. Bohren Sie in Runden von 20-30 s und kühlen Sie den Schädel zwischen den Bohrrunden mit Kochsalzlösung ab.
    HINWEIS: Wenn Sie mit dem Bohren beginnen, ist es sinnvoll, die Vorderkante des Mikrolaufwerks mit einem Marker zu markieren, um sicherzustellen, dass beim Bohren eine gerade Kante parallel zur Vorderkante des Mikrolaufwerks gebildet werden kann. Dies verbessert die Chancen, Zement in der Kraniotomie zu vermeiden, wenn das Mikrolaufwerk an Ort und Stelle fixiert wird, sowie die Adhäsion, verhindert einen Überhang des Mikrolaufwerks über dem Kraniotomie und ermöglicht eine größere seitliche Manövrierfähigkeit beim Platzieren des Mikrolaufwerks in Bezug auf die endgültige Position der Aufnahmestelle.
21. Testen Sie nach einigen ersten Bohrrunden die Widerstandsfähigkeit des ausgebohrten Teils des Knochens, indem Sie mit einer feinen Pinzette (Größe 5 oder feiner; siehe Materialtabelle) vorsichtig darauf drücken.
    1. Testen Sie zwischen den Bohrrunden weiter, bis der Knochen unter der Pinzette zu "hüpfen" beginnt, wenn er gedrückt wird. Wenn dies der Fall ist, geben Sie einen Tropfen Kochsalzlösung auf die Kraniotomie, um den Knochen weicher zu machen, und entfernen Sie dann mit der Pinzette vorsichtig das ausgebohrte Knochenstück.
    2. Wenn der Knochen nicht schonend entfernt werden kann, bohren Sie noch einmal und konzentrieren Sie sich dabei auf die Stellen, an denen der Knochen noch stärker befestigt ist. Versuchen Sie im Allgemeinen, den Schädel mit leichtem Druck von der Pinzette zu entfernen, bevor er vollständig durchbohrt wurde, da dies in der Regel Gewebeschäden minimiert.
       HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Oberfläche der Dura regelmäßig angefeuchtet wird, sowohl während des Bohrens, um die Temperaturen zu senken, als auch nach der Entfernung des Knochenlappens. Dies verbessert die Chancen auf ein einfaches Einführen der Sonde, indem verhindert wird, dass die Dura austrocknet und schwieriger zu durchdringen ist. Wenn sich die Dura als zu schwer zu durchdringen erweist oder stumpfe oder mehrschäftige Sonden verwendet werden, wird eine Durotomie durchgeführt, indem die Dura mit einer 27-G-Nadel angehoben und ein kleiner Schnitt unter Eintauchen in Kochsalzlösung durchgeführt wird, um zu verhindern, dass die Dura an der Gehirnoberfläche kleben bleibt.
22. Decken Sie die Kraniotomie mit einem hämostatischen Schwamm (siehe Materialtabelle) ab, der in kühler, steriler Kochsalzlösung getränkt ist, um die Dura und das Gehirn zu schützen.

5. Chirurgie: Sondenimplantation

1. Befestigen Sie den benutzerdefinierten Mikrolaufwerkshalter (siehe Materialtabelle) am Arm des stereotaktischen Geräts. Wenn das Mikrolaufwerk nach der Sondenvorbereitung aus dem Mikrolaufwerkshalter entfernt wurde, setzen Sie das Mikrolaufwerk mit der angeschlossenen Silikonsonde in den Mikrolaufwerkshalter ein. Winkeln Sie den Stereosteuerarm nach Bedarf an, um den gewünschten Zielbereich des Gehirns zu erreichen. Platzieren Sie den Kronenring mit dem angebrachten Verstärker auf den drei vertikalen Stiften auf der Rückseite des Mikrolaufwerkshalters (siehe Ergänzende Abbildung 1).
2. Senken Sie das Mikrolaufwerk auf ~0,5 mm um den Kraniotomie ab und verbinden Sie dann mit einer Pinzette den/die an der Sonde befestigte(n) GND/REF-Stift(e) mit dem/den entsprechenden GND/REF-Stift(en), der/die am Schädel implantiert ist (siehe Schritte 4.14-4.15). In der ergänzenden Abbildung 3 und der ergänzenden Abbildung 4 finden Sie Beispiele für die Platzierung von Antrieb, Kraniotomie und GND/REF-Stiften.
3. Sobald sie angebracht sind, können Sie den/die Stift(e) optional mit einem Tropfen leitfähigem Silberepoxidharz (siehe Materialtabelle) sichern, um eine robustere Verbindung zu gewährleisten. Sobald das Silberepoxidharz ausgehärtet ist, bedecken Sie die verbundenen Stifte mit einer kleinen Menge Zahnzement (siehe Materialtabelle), um sicherzustellen, dass die Verbindung über lange Zeiträume stabil bleibt und keine elektrische Verbindung mit dem umgebenden Gewebe und/oder den Implantatelementen besteht.
4. Entfernen Sie den hämostatischen Schwamm aus der Kraniotomie (siehe Schritt 4.22).
5. Positionieren Sie den stereotaktischen Arm mit dem Mikroantrieb über der Kraniotomie.
   HINWEIS: Wenn die Sonde zurückgezogen wird, stellen Sie sicher, dass das Mikrolaufwerk so platziert ist, dass die Sonde auf einem Teil der Kraniotomie aufsetzt, der keine großen Blutgefäße enthält.
6. Senken Sie den Mikroantrieb bei Bedarf ab, indem Sie die Position und den Winkel anpassen, bis der Sondenschaft die Dura- oder Gehirnoberfläche (siehe Schritt 4.21) im Zielbereich berührt.
7. Mischen Sie Zahnzement in der dafür vorgesehenen Keramikschale (siehe Schritt 3.2) und zementieren Sie die Basis des Mikroantriebs an Ort und Stelle, wobei Sie sich auf die drei Seiten der Mikroantriebsbasis konzentrieren, die nicht zur Elektrode zeigen. Stellen Sie sicher, dass der Zement das Mikrolaufwerk über der abnehmbaren "Basis" nicht berührt (siehe Abbildung 1D).
   1. Stellen Sie sicher, dass der Raum zwischen Basis und Schädel vollständig mit Zahnzement bedeckt ist. Reinigen Sie die Keramikschale und stellen Sie sie wieder in den Kühl-/Gefrierschrank. Warten Sie, bis der Zement ausgehärtet ist, ca. 10-15 Minuten.
      HINWEIS: Zwischen der Basis des Mikrolaufwerks und dem Schädel bleibt eine kleine Lücke, und der Zement wird in seiner flüssigsten Form verwendet, um sie zu füllen. Sobald der Zement etwas eingedickt ist, wird der Zement zwischen den Wänden der Microdrive-Basis und dem Schädel aufgebaut. Es werden immer sehr kleine Mengen Zement verwendet, da der Fluss des Stoffes unvorhersehbar sein kann und größere Mengen in unerwünschte Bereiche fließen können. Kleine Mengen eines in Kochsalzlösung getauchten hämostatischen Schwamms können verwendet werden, um Teile der Kraniotomie abzudecken. Sollte versehentlich Zement auf den Kraniotomie fließen, entfernen Sie den Zement mit einer Pinzette, sobald er eine filmartige Konsistenz annimmt.
8. Senken Sie die Silikonsonde auf das Gehirn ab und überwachen Sie die Sondenposition sorgfältig durch ein Mikroskop. Wenn die Sondenschäfte das Gehirn berühren, senken Sie die Sonde schnell um ~250 μm ab (eine volle Umdrehung der Schraube entspricht 282 μm), um sicherzustellen, dass die Sonde den Widerstand der Dura/Kortikaloberfläche durchbricht.
   1. Überprüfen Sie dies visuell. Wenn die Sonde nicht in die Rinde eingebrochen ist, warten Sie 5 Minuten und versuchen Sie dann, mit der Schaftspitze durch die Dura zu ätzen, indem Sie die Sonde wiederholt um einige Dutzend Mikrometer anheben und senken, während die Dura/Rinde unter Spannung von der Sondenspitze steht.
9. Sobald die Sonde die Oberfläche des Kortex durchbrochen hat, senken Sie sie allmählich in einem langsameren Tempo (100-200 μm /min) ab, bis entweder die Zielkoordinaten erreicht sind oder sich die Sonde um mehr als 1000 μm bewegt hat. Wenn das Ziel erfordert, dass sich die Sonde um mehr als 1000 μm bewegt, wird die Sonde in Schritten von maximal 1000 μm/Sitzung über die folgenden Aufnahmesitzungen vorgeschoben, bis die Zielkoordinaten erreicht sind.
   HINWEIS: Überspringen Sie diesen Schritt, wenn die Überwachung neuronaler Signale beim Absenken der Siliziumsonde bevorzugt wird. Die Schritte dazu sind in Abschnitt 7 beschrieben.
10. Bereiten Sie das Silikonelastomer gemäß den Anweisungen vor (siehe Materialtabelle) und geben Sie einen kleinen Tropfen mit einer 1-ml-Spritze in die Kraniotomie ab (siehe Materialtabelle).
11. Nach dem Trocknen das Silikonelastomer mit einer 50/50-Mischung aus Knochenwachs und Mineralöl bedecken. Dieser Schritt schützt die Sonde zusätzlich und verhindert die Ansammlung von Schmutz und trockenem Plasma über der Kraniotomie, wodurch die Extraktion einfacher und sicherer wird. Seien Sie vorsichtig, da das Arbeiten um die Sonde herum im abgesenkten Zustand zu Brüchen führen kann.

6. Operation: Implantation eines Faradayschen Käfigs

1. Wenn der Zahnzement vollständig erstarrt ist, lösen Sie den Mikroantriebshalter, indem Sie die seitliche Schraube lösen, mit der der Antrieb mit einem Inbusschlüssel befestigt ist (siehe Ergänzende Abbildung 1). Ziehen Sie den Halter vorsichtig um ~1 cm zurück, so dass das Mikrolaufwerk freistehend ist, der Sondenverstärker/-stecker jedoch am Implantathalter fixiert bleibt, ohne das Flexkabel zu dehnen.
2. Platzieren Sie die vorgefertigte Krone und das Faraday-Netz um die Kopfplatte, indem Sie den Käfig an der Öffnung dehnen und horizontal über den Mikroantrieb und das Flex-Kabel schieben, und befestigen Sie ihn dann mit Zahnzement auf der Kopfplatte.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, alle Räume zwischen dem Faradayschen Käfig und dem Schädel mit Zahnzement zu verschließen, um das Implantat vor Verunreinigungen zu schützen.
3. Setzen Sie den Faradayschen Kronenring (siehe Materialtabelle) mit Sondenanschluss/Kopftisch über die Krone und richten Sie die integrierte Halterung für den Sondenverstärker/-anschluss an dem Bereich aus, der durch ein eingedrücktes "X" auf der Faradayschen Krone markiert ist (siehe Schritt 2.13).
4. Befestigen Sie den Ring mit einem kleinen Tropfen Cyanacrylatkleber oder Zahnzement an jeder Speichenringverbindung am Faradayschen Käfig.
5. Sobald der Faraday-Ring mit integriertem Tastkopfverstärker/-stecker befestigt ist, ziehen Sie den stereotaktischen Arm mit dem Mikrolaufwerkshalter vollständig ein. In der ergänzenden Abbildung 3 finden Sie eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für den Zusammenbau dieser Komponenten.

7. Aufzeichnung von Tests nach der Operation

1. Verbinden Sie den Sondenverstärker/-anschluss mit der Aufnahmehardware und starten Sie eine Aufnahme.
2. Wenn die Sonde während des ersten Einführens noch nicht ihren Zielort erreicht hat (siehe Schritt 5.9), drehen Sie die Mikroantriebsschraube langsam gegen den Uhrzeigersinn, um die Sonde abzusenken und gleichzeitig neuronale Signale zu überwachen.
   HINWEIS: Die Signale sollten sich ändern, a) wenn die Elektroden die Schicht aus Silikonelastomer über der Kraniotomie berühren und b) wenn die Elektroden beginnen, sich in das Gehirn zu bewegen (siehe Schritt 7.2). Hochfrequente neuronale Aktivität wird von Elektroden registriert, die vollständig in das Gehirn eingeführt werden, während Elektroden, die mit dem Liquor auf der Gehirnoberfläche in Kontakt stehen, typischerweise ein tiefpassgefiltertes neuronales Populationssignal ohne Spitzenaktivität zeigen (ähnlich einer EEG-Spur), und die Aufzeichnung von Stellen in der Luft registriert ein erhöhtes elektrisches Rauschen. Es ist möglich, die Einstecktiefe der Sonde zusätzlich zu überprüfen, indem die Impedanz einzelner Kanäle nach der Testaufzeichnung gemessen wird. Kanäle, die mit Luft in Berührung kommen, sollten eine hohe Impedanz (was auf einen offenen Stromkreis hinweist) und Impedanzen aufweisen, wie sie vor der Operation für die Kanäle gemessen wurden, die den Liquor berühren oder sich bereits im Gehirn befinden. Die Siliziumsonde wird um einen maximalen Gesamtabstand von ca. 1000 μm pro Sitzung mit einer maximalen Geschwindigkeit von ca. 75 μm/min vorgeschoben (siehe Schritt 5.5).
3. Wenn neuronale lokale Feldpotentiale über die Sonde sichtbar sind und/oder die Sonde um maximal 1000 μm vorgeschoben wird, beenden Sie die Testaufzeichnung und trennen Sie den Kopftischstecker.

8. Rückforderung

1. Decken Sie den Faradayschen Käfig mit selbstklebendem Veterinärtuch ab (siehe Materialtabelle).
2. Beenden Sie die Anästhesie und lassen Sie das Tier einige Tage lang genesen, indem Sie den genehmigten Versuchsrichtlinien folgen.
3. Wenn sich die Elektroden an der Siliziumsonde noch nicht an der gewünschten Zielstelle befinden, drehen Sie die Schraube des Mikroantriebs in kleinen Schritten mit maximal vier vollen Umdrehungen (oder ~1000 μm) pro Sitzung. Wiederholen Sie diesen Vorgang bei Bedarf über mehrere Tage, bis das Ziel erreicht ist. Es wird empfohlen, die Sondenbewegung mit gleichzeitigen Aufzeichnungen zu kombinieren, um die elektrophysiologische Aktivität in den durchquerten Bereichen zu bewerten.

9. Verhaltensexperimente und chronische Aufzeichnungen

1. Bei chronischen kopffixierten Aufnahmen während der Aufgabenausführung befestigen Sie die Kopfplatte an der Basis des Faradayschen Käfigs an der Kopffixationsklemme, indem Sie die Klemme manuell öffnen und die implantierte Kopfplatte festklemmen (siehe Abbildung 1C, E, F).
   HINWEIS: Wenn keine Kopffixierung erforderlich ist, kann dieses Implantatsystem auch für frei bewegliche Aufnahmen verwendet werden. Um sich frei zu bewegen, überspringen Sie die Schritte 9.1 und 9.7.
2. Entfernen Sie den selbstklebenden Veterinärwickel vom Implantat.
   HINWEIS: Um die Unannehmlichkeiten für das Tier zu minimieren, wird empfohlen, vor diesem Schritt eine einfache, lohnende Verhaltensaufgabe als Ablenkung zu beginnen, während der Versuchsleiter mit dem Implantat arbeitet.
3. Schließen Sie den Verstärker/Stecker an das Aufnahmegerät an.
4. Führen Sie neuronale Aufzeichnungen durch, während das Tier die Aufgabe ausführt.
   HINWEIS: Wenn das Ziel darin besteht, die Anzahl der aufgezeichneten extrazellulären Einheiten zu maximieren, bewegen Sie das Shuttle um einige Dutzend Mikrometer, wenn die neuronale Ausbeute an einer Stelle abnimmt. Beachten Sie, dass es nach dem Bewegen der Sonde Minuten bis Stunden dauern kann, bis sich das Signal stabilisiert hat. Daher kann es von Vorteil sein, die Sonde am Ende einer Sitzung zu bewegen, damit das Signal bis zum Beginn der nächsten Sitzung wiederhergestellt werden kann.
5. Trennen Sie das Aufzeichnungsgerät und decken Sie das Implantat am Ende der Verhaltensaufzeichnung mit einer neuen Veterinärbandage ab.
6. Öffnen Sie die Kopffixierklemme, um das Tier von der Kopffixierung zu lösen.

10. Wiederherstellung der Sonde

1. Ziehen Sie am Ende der endgültigen Aufnahme die Silikonsonde so weit wie möglich auf das Mikrolaufwerk zurück, indem Sie die Schraube im Uhrzeigersinn drehen. Tun Sie dies, während das Tier kopffixiert ist und sich verhält oder während das Tier in der chirurgischen Einrichtung betäubt ist. Zeichnen Sie den Austritt der Sonde aus dem Gehirn auf, indem Sie gleichzeitig neuronale Signale überwachen und die Signatur von Elektroden überprüfen, die in das Gehirn eingetaucht sind, die Gehirnoberfläche berühren oder mit Luft in Kontakt kommen (siehe Schritt 7.3).
   HINWEIS: Abhängig vom Histologieprotokoll und der Sonde werden elektrolytische Läsionen durchgeführt, bevor die Sonde zurückgezogen wird, um die genaue Position einiger Elektroden auf der Sonde zu bestimmen. Ist eine Überwachung des Sondenaustritts per neuronaler Aufzeichnung nicht notwendig, ist auch ein Zurückziehen der Sonde nach Beendigung des Tieres möglich.
2. Beenden Sie das Tier gemäß den genehmigten Richtlinien (dies schließt die Perfusion des Tieres ein, wenn eine Fixierung des Gehirns für die anschließende Histologie geplant ist).
3. Warten Sie ~ 10 Minuten, nachdem das Tier gestorben ist. Fixieren Sie dann das Tier mit dem Kopf in der Stereotax und stellen Sie sicher, dass sich der Kopf des Tieres während der Explantation nicht bewegen kann, um einen Bruch der Sonde zu verhindern.
4. Tragen Sie einen Tropfen Kochsalzlösung auf den Kraniotomie auf und lassen Sie es einige Minuten einwirken, um getrocknetes biologisches Gewebe auf dem Sondenschaft aufzuweichen und die Wahrscheinlichkeit eines Schaftbruchs zu verringern.
5. Platzieren Sie den stereotaktischen Halter ca. 0,5 cm über dem Mikrolaufwerk. Schneiden Sie dann das obere Ende der Speichen des Faradayschen Käfigs mit einer kleinen chirurgischen Schere ab (siehe Materialtabelle), um den Faradayschen Ring freizugeben, der den Verstärker/Anschluss hält, und übertragen Sie den Ring zurück auf die vertikalen Stifte an der Oberseite des stereotaktischen Halters (siehe Schritt 5.1 und Ergänzende Abbildung 1).
6. Schneiden Sie das Kupfernetz vorsichtig mit der gleichen chirurgischen Schere ab, indem Sie zwischen den Speichen der Faradayschen Krone u-förmige Bereiche aus Netz ausschneiden. Schneiden Sie dann die Kunststoffspeichen der Krone an der Basis ab.
   HINWEIS: Vermeiden Sie es, die gedruckten Kunststoffspeichen beim Schneiden zu verbiegen, da sie brechen und Kunststoffreste in Richtung der Sonde fliegen können.
7. Senken Sie den stereotaktischen Halter ab, bis das Mikrolaufwerk mit der seitlichen Schraube des Halters in der Halterung fixiert werden kann, fixieren Sie das Mikrolaufwerk und lösen Sie dann die T1-Schraube, die das Mikrolaufwerkgehäuse mit der Mikrolaufwerksbasis verbindet.
8. Ziehen Sie den stereotaktischen Arm mit dem Implantathalter langsam ein, um das Mikrolaufwerk von seiner Basis abzuheben. Stellen Sie sicher, dass sich das Mikrolaufwerk in einem senkrechten Winkel (d. h. "vertikal" von der Basis) von der Basis trennt.
   HINWEIS: Wenn sich das Gehäuse und die Basis des Mikrolaufwerks nicht leicht trennen lassen, stellen Sie sicher, dass die Bewegung des stereotaktischen Arms im Vergleich zur Ausrichtung des Mikrolaufwerks nicht in einem Winkel steht. Bei Bedarf werden Halterung und Mikroantrieb wieder zueinander ausgerichtet, indem die Fixierung des Tierkopfes leicht gelockert und entsprechend neu positioniert wird. Die korrekte Ausrichtung ist einer der entscheidenden Aspekte für eine einfache Wiederherstellung des Mikrolaufwerks. Prüfen Sie auch, ob Zahnzementreste vorhanden sind, die den Microdrive und die Microdrive-Basis verbinden (siehe Schritt 5.5). In diesem Fall wird der Zement je nach verwendeter Zementmenge vorsichtig mit einem Skalpell und/oder Zahnbohrer abgekratzt.
9. Heben Sie den stereotaktischen Arm mit der angebrachten Sonde an, um ausreichend Platz darunter zu schaffen.
10. Entfernen Sie das Tier aus der Stereotax und bereiten Sie das Gehirn vor, indem Sie auf Wunsch ein genehmigtes Histologieprotokoll befolgen. Stellen Sie die implantierte Microdrive-Basis wieder her und reinigen Sie sie, indem Sie sie mehrere Stunden lang in Aceton einweichen, um sie später wiederzuverwenden.
11. Platzieren Sie eine saubere Microdrive-Basis auf Klebekitt (siehe Materialtabelle), senken Sie dann das Microdrive auf die Basis und ziehen Sie die Schraube fest. Um einen Bruch zu vermeiden, überwachen Sie die Sondenposition während des gesamten Prozesses unter einem Mikroskop. Dieser Schritt kann zu einem späteren Zeitpunkt abgeschlossen werden, wenn die implantierte Microdrive-Basis zuerst für die Wiederverwendung gereinigt werden muss.
    HINWEIS: Dieses Protokoll erfordert die Verwendung von Klebekitt als Plattform für die Basis, was von entscheidender Bedeutung ist, da es sowohl die Basis sichert als auch ein gewisses Maß an Nachgiebigkeit aufweist, um sicherzustellen, dass die Basis nicht verrutscht und mit der Sonde kollidiert. Die Spachtelmasse sollte zu einer vertikalen "Klippenwand" an der Seite der Mikroantriebsbasis geformt werden, an der die Sonde abgesenkt wird. Dadurch wird sichergestellt, dass die Sonde, wenn sie über die Basis hinaus abgesenkt wird, nicht mit dem darunter liegenden Kitt in Berührung kommt. Der Kitt-"Turm" sollte auch hoch genug sein, dass die Sonde keinen Kontakt mit der Tischoberfläche hat, auf der der Kitt platziert wird, wenn er über die Mikroantriebsbasis abgesenkt wird. Befestigen Sie den Kitt zum Schluss gut an der Oberfläche, um ein Verrutschen oder Herunterfallen zu verhindern. Wenn Sie das Mikrolaufwerk auf die Mikrolaufwerksbasis absenken, die vom Kitt gehalten wird, stellen Sie sicher, dass eine seitliche Profilansicht vom Mikroskop aus angezeigt wird, um den Fortschritt zu überwachen, damit die Sonde beim Absenken weder mit der Basis noch mit dem Kitt kollidiert.
12. Reinigen und sterilisieren Sie die Sonde gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die am häufigsten erhältlichen Sonden 12 Stunden lang in einem enzymatischen Reiniger (siehe Materialtabelle) einweichen, dann in demineralisiertem Wasser abspülen und in Alkohol desinfizieren. Senken Sie dazu die Sonde in ein großes Becherglas, in dem sich der enzymatische Reiniger befindet, während Sie noch an der Mikrolaufwerkhalterung am stereotaktischen Arm befestigt sind.
    HINWEIS: Messen Sie bei Bedarf die Impedanzen der Elektroden an der Sonde nach der Reinigung, um die Potentialdegradation einzelner Elektroden zu überwachen.
13. Bewahren Sie das Mikrolaufwerk mit der gereinigten Sonde bis zum nächsten Experiment sicher auf.

Ergebnisse

Dieses Protokoll stellt ein chronisches Implantationssystem vor, das es Forschern ermöglicht, leichte, kostengünstige und sichere chronische elektrophysiologische Aufzeichnungen bei sich verhaltenden Mäusen zu implementieren (Abbildung 1). Zu den Hauptfaktoren, die die erfolgreiche Anwendung dieses Ansatzes bestimmen, gehören: eine vollständige Zementabdeckung des Schädels, eine minimalinvasive und ordnungsgemäß geschützte Kraniotomie, eine sichere Befestigung des Mikrolaufwerks und der Verkabelung mit dem Schädel sowie die vollständige Kontinuität des schützenden Faraday-Materials. Wenn diese Punkte berücksichtigt werden, können konstant qualitativ hochwertige Aufnahmen erreicht werden. Hier werden repräsentative Ergebnisse zu folgenden Hauptaspekten des Operationserfolgs gezeigt:

1) Beeinträchtigt das Implantat das Verhalten oder das Wohlbefinden der Tiere?
2) Ist die Signalqualität hoch und können die Signale über längere Zeiträume aufrechterhalten werden?
3) Lassen sich Aufzeichnungen gut mit der Aufgabenleistung kombinieren?

Um den Einfluss des Implantats auf das Verhalten der Tiere zu bewerten, analysierten wir die verfolgten Fortbewegungsmuster von fünf implantierten Tieren. Abbildung 2A zeigt ein Beispiel für ein Tier, das sich 10 Minuten vor und 1 Woche nach der Implantation frei in einem Spielkäfig bewegt. Man sieht, dass die Bewegungsmuster unverändert sind. Diese Beobachtung wird durch Abbildung 2B, C bestätigt, die die Verteilungen der Bewegungsgeschwindigkeiten und Kopfrichtungen bei den Tieren zeigt. Sowohl die Laufgeschwindigkeit als auch die Kopfrichtung waren vor und nach der Implantation weitgehend unverändert, und wenn überhaupt, schienen die Laufgeschwindigkeiten nach der Operation leicht erhöht zu sein. Ergänzendes Video 1 zeigt eine kurze Videoaufnahme eines Tieres 6 Tage nach der Implantation. Typische Verhaltensweisen im häuslichen Käfig wie Fortbewegung, Fellpflege, Aufzucht und Nahrungssuche in der häuslichen Umgebung sind alle sichtbar und deuten auf eine erfolgreiche Genesung nach der Operation sowie auf den allgemeinen Gesundheitszustand hin. Die geringe Auswirkungen des Implantats auf das Verhalten sind höchstwahrscheinlich auf sein geringes Gewicht und seine überschaubare Höhe zurückzuführen.

Abbildung 2: Fortbewegung vor und nach der Operation. (A) Beispiel für die Fortbewegung eines Tieres vor (linkes Bild) und nach (rechtes Bild) Implantation. Die x/y-Koordinaten sind in Zentimetern angegeben, die Punkte zeigen die Position des Tieres zu jedem Zeitpunkt über einen Zeitraum von 10 min. (B) Verteilung der Bewegungsgeschwindigkeiten in cm/s für 5 Sitzungen vor und 3 Sitzungen nach der Implantation bei 5 Tieren. (C) Kerndichte für die Wahrscheinlichkeit einer Bewegung in verschiedene Richtungen, für die gleichen Sitzungen, die in (B) analysiert wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Als nächstes wird die Signalqualität im Local Field Potential (LFP) und die Spike-Aktivität an den Aufnahmestandorten bewertet. Hier zeigen wir repräsentative Daten aus kortikalen Aufzeichnungen im primären visuellen Kortex (V1). Zur Validierung wurde die mutmaßliche Einzeleinheitenaktivität aus breitbandigen neuronalen Signalen extrahiert, die in V1 einer wachen Maus mit Kilosort 3 aufgezeichnet wurden (siehe Abbildung 3). Abbildung 3A zeigt die Position der extrahierten Einzeleinheiten auf dem Sondenschaft, Abbildung 3B zeigt die entsprechenden Spike-Wellenformen und Abbildung 3C zeigt die Spike-Reaktionen derselben Neuronen auf ein CSD-Protokoll (Current Source Density). In diesem Paradigma wurden Weitfeldblitze mit einer Dauer von 300 ms bei einer Frequenz von 1 Hz (d.h. 300 ms an, 700 ms aus) in 200 Versuchen präsentiert. Schließlich zeigt Abbildung 3D die Reaktionen der gleichen Einheiten auf ein visuelles rezeptives Feld-Mapping-Protokoll, das aus 2000 Frames zufällig ausgewählter schwarzer und weißer Quadrate auf grauem Hintergrund besteht, die jeweils 16,6 ms lang präsentiert werden. Die Quadrate deckten jeweils einen Sehwinkel von 12 Grad ab und wurden aus einem Feld von 15 x 5 möglichen Positionen ausgewählt, so dass das Mapping-Paradigma einen visuellen Raum von insgesamt -90 bis +90 Grad Azimut und -30 bis +40 Grad Höhe abdeckte. Die Reaktionen der Feuerrate auf jeden Stimulus-Frame wurden extrahiert, indem die maximale Feuerrate über ein 16,6-ms-Fenster mit einer Verzögerung zwischen 40 und 140 ms analysiert wurde, die basierend auf der maximalen Aktivität in jedem Fenster als optimal pro Kanal identifiziert wurde. Diese Art der Aufzeichnung kann verwendet werden, um die Einführtiefe jeder Elektrode anzupassen und die Signalqualität nach der Implantatoperation zu beurteilen.

Abbildung 3: Aufgezeichnete neuronale Signale. (A) Abgeleitete Position einzelner Einheiten, sortiert nach Kilosort 3 Spike-Sortierpaket, entlang der Elektrodenkontakte der Sonde. (B) Spike-Wellenformen für die gleichen Einheiten, die in A über einen Zeitraum von 5 ms angezeigt werden. Dünne Linien: Einzelne Spike-Wellenformen. Dicke Linien: Durchschnittliche Spike-Wellenform. (C) Rasterdiagramm von Spitzen als Reaktion auf ein CSD-Paradigma (Current Source Density), das 300 ms Weitfeldblitze gefolgt von einem 700 ms schwarzen Bildschirm darstellt. Die Antworten werden für die gleichen Einheiten wie in A und B angezeigt. Überlagerte farbige Linien stellen Peristimulus-Zeit-Histogramme (PSTHs) der gleichen Reaktionen dar. Die Zündraten für die PSTHs wurden in 10-ms-Bins berechnet und dann durch die maximale Zündrate über die gesamte PSTH normalisiert. Die Zeit 0 ist um den Weitfeld-Flash-Stimulus zentriert. (D) Geschätzte rezeptive Felder der gleichen Einheiten wie in A-C, gemessen mit einem Sparse Noise Receptive Field Mapping Paradigma. Jedes Diagramm zeigt die durchschnittliche Aktivität der Feuerungsrate über ein Analysefenster von 16,6 ms als Reaktion auf den Beginn (linkes Bild) oder den Versatz (rechtes Bild) von weißen und schwarzen quadratischen Stimuli. Die Stimuli wurden für die Dauer von 16,6 ms präsentiert und zufällig über ein 5 x 15 Quadrat großes Raster verteilt, das sich über einen horizontalen Sehwinkel von 180 Grad und einen vertikalen Sehwinkel von 70 Grad erstreckte. Die Aktivität der Feuerrate wurde über das gesamte rezeptive Feldgitter z-bewertet (siehe Farbbalken). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Aufnahmequalität blieb bei wiederholten Aufnahmen über Wochen bis Monate hoch. Abbildung 4A zeigt LFP-Längsschnittaufnahmen von einem Tier über einen Zeitraum von 15 Wochen. LFPs wurden als Reaktion auf das oben beschriebene CSD-Paradigma aufgezeichnet (siehe Abbildung 3A-C). Abbildung 4A zeigt die durchschnittlichen LFP-Reaktionen 500 ms nach Beginn des Blitzes. In diesem Beispiel haben wir eine lineare Sonde mit 32 Kanälen und einem Zwischenelektrodenabstand von 25 μm verwendet. Beachten Sie, dass an Tag 18 die Sondentiefe angepasst wurde, wodurch die Sonde um 600 μm nach unten verschoben wurde. Sowohl vor als auch nach dieser Anpassung blieben die LFP-Signale über die Aufzeichnungstage hinweg stabil.

In Übereinstimmung damit waren über viele Aufnahmen hinweg Spike-Wellenformen von vermeintlichen Einzeleinheiten erkennbar. Abbildung 4B zeigt repräsentative Beispiel-Spike-Wellenformen aus drei Aufnahmesitzungen über einen Monat hinweg und zeigt, dass die Aktivität einzelner Einheiten im Laufe der Zeit erfolgreich identifiziert werden kann. Abbildung 4C zeigt die Gesamtzahl der mutmaßlichen Einzeleinheiten, die aus chronischen Aufzeichnungen von sechs Tieren über ein Zeitfenster von bis zu 100 Tagen extrahiert wurden. Die Einzeleinheiten wurden nach dem Standardkriterium der Kilosorte 3.0 definiert (siehe Ergänzende Tabelle 1). Wie man sehen kann, betrug die Anzahl der klar definierten Einzeleinheiten in der ersten Woche nach der Implantation typischerweise ~40 und sank dann allmählich in Richtung einer scheinbar stabilen Asymptote von ~20 Einheiten. Da diese Aufzeichnungen mit linearen 32-Kanal-Sonden durchgeführt wurden, entspricht dies einer erwarteten Ausbeute von etwa 1,25 Einzeleinheiten pro Elektrode direkt nach der Implantation, die bei Langzeitaufzeichnungen auf ca. 0,65 Einzeleinheiten pro Elektrode sinkt. Die wiederholte Verbindung mit dem Verstärker/Anschluss des Implantats über Sitzungen hinweg schien weder die Aufnahmequalität noch die Stabilität des Implantats zu beeinträchtigen, da die Faradaysche Krone, die den Verstärker/Anschluss hält, wiederholten Kräften von über 10 Newton standhalten kann, eine Größenordnung, die selbst über den maximalen Steckkräften liegt, die für Standardsteckverbinder erforderlich sind (siehe Ergänzendes Video 2).

Abbildung 4: Stabilität neuronaler Aufzeichnungen über die Zeit. (A) Durchschnittliche LFP-Aktivität als Reaktion auf einen Weitfeld-Flash-CSD-Stimulus, dargestellt über alle 32 Kanäle einer chronisch implantierten Sonde von 3-110 Tagen nach der Implantation. Die rote vertikale Linie zeigt, dass die Sonde an eine neue Stelle abgesenkt wird, da die Kanäle 0-8 bis zum 18. Tag nach der Operation von außerhalb des Gehirns aufgezeichnet werden. (B) Spike-Wellenformen von drei Beispieleinheiten desselben chronischen Implantats, die über einen Zeitraum von vier Wochen wiederholt aufgezeichnet wurden. Dünne Linien: Einzelne Spike-Wellenformen. Dicke überlagerte Linie: Durchschnittliche Spike-Wellenform. (C) Die Anzahl der mutmaßlichen Einzeleinheiten, die von Kilosort 3 über Aufzeichnungstage für 6 Tiere nachgewiesen wurden (siehe eingefügte Legende). Das rote Quadrat zeigt die Tage an, an denen die Sonde bewegt wurde. Die gestrichelte Linie gibt die Anzahl der Elektroden pro Implantat an, die in diesen Aufzeichnungen verwendet werden (32). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Durch die Bereitstellung eines modularen Systems, das sowohl ein Mikrolaufwerk als auch einen tragbaren Faradayschen Käfig und eine Kopfplatte umfasst, die gleichzeitig als Implantatbasis und Vorrichtung zur Kopffixierung dient, ermöglicht dieses Protokoll die Integration der chronischen Elektrophysiologie mit dem kopffixierten Verhalten. Hier werden Beispieldaten von Mäusen gezeigt, die eine virtuelle Umgebung auf einem kugelförmigen Laufband durchqueren. Abbildung 5A zeigt die laufbedingte Spike-Aktivität von 20 Einheiten in einem Beispielversuch. Abbildung 5B zeigt die vielfältigen, aber robusten Beziehungen zwischen Laufgeschwindigkeit und Spike-Aktivität einzelner Spike-sortierter Einheiten sowie einen Populationsdurchschnitt für denselben Effekt in Abbildung 5C, der den gut etablierten Effekt der Bewegungsaktivität auf die neuronale Aktivität bei Nagetieren V1²⁴ bestätigt.

Abbildung 5: Neuronale Reaktionen während des kopffixierten Verhaltens. (A) Rasterdiagramm der Reaktionen einzelner Einheiten über einen Beispielversuch, wobei die Laufgeschwindigkeit (violette Linie) und die durchschnittlichen Feuerraten über alle Einzeleinheiten (hellblaue Linie) überlagert sind. (B) Aktivität einer einzelnen Einheit während verschiedener Fahrgeschwindigkeitskategorien, dargestellt für sechs Beispieleinheiten. (C) Durchschnittliche Spike-Aktivität über alle einzelnen Einheiten in einer Beispielsitzung, dargestellt über die fünf Quinitile der Laufgeschwindigkeitsverteilung. Die Laufgeschwindigkeiten in dieser Sitzung lagen zwischen 0 und 0,88 Metern/Sekunde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Tabelle 1: Tabelle mit den Standardparametern, die von Kilosort 3 bei der Identifizierung einzelner Einheiten in den in Abbildung 3, Abbildung 4 und Abbildung 5 gezeigten Aufzeichnungen verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzendes Video 1: Video, das die Bewegungsaktivität von Tieren nach der Implantation zeigt. Das Video, das nach der 5-tägigen Erholungsphase aufgenommen wurde, ist abgeschlossen und zeigt das normale Bewegungsverhalten sowie die Anpassung an die Größe und das Gewicht des Implantats. Das Tier ist normalerweise zu sehen, wie es einen Spielkäfig erkundet, in dem sich die Umgebung bereichert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzendes Video 2: Ein Video, das zeigt, wie eine Kraft auf die montierte Faraday-Krone ausgeübt wird. Die Kräfte, denen die Faradaysche Krone standhält, sind etwa eine Größenordnung größer als die Verbindungskraft, die für Standardsteckverbinder wie 4-polige polarisierte Nano-Steckverbinder benötigt wird. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 1: Abbildung mit Bildern des Laufwerkshalters. Druckbare Designdateien finden Sie im entsprechenden Github-Repository (https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Schablone für Kupfergewebe. Drucken Sie die Schablone mit der ursprünglichen Skalierung aus und verwenden Sie die Schablone zum Ausschneiden des Kupfernetzes (Schritt 2.12). Verwenden Sie die Maßstabsleiste, um die Skalierung des Drucks zu überprüfen und ggf. anzupassen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Fotoserie, die die Montageschritte des Implantats während der Operation zeigt. In diesem Fall sind zwei Mikrolaufwerke sowie zwei Verstärker verbaut. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 4: Zeichnung eines Mausschädels mit beispielhafter Platzierung von Laufwerken, Kraniotomien (in grün) und GND/REF-Stift (in rot). Die Position der Nadel wird aufgrund der Platzierung im Kleinhirn empfohlen, die die kortikalen Aufzeichnungen wahrscheinlich nicht beeinträchtigt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Dieses Manuskript stellt ein Protokoll für die schnelle, sichere und standardisierte Implantation von Sonden vor, das auch die Bergung und Wiederverwendung der Sonde am Ende des Experiments ermöglicht. Der Ansatz nutzt ein modulares System von Implantatkomponenten, insbesondere ein Mikrolaufwerk, das mit allen gängigen Siliziumsonden und Aufzeichnungssystemen kompatibel ist, eine Kopfplatte, die für kopffeste Verhaltensexperimente verwendet werden kann, und einen tragbaren Faradayschen Käfig zum Schutz des Implantats. Diese Konstellation ermöglicht es dem Anwender, sein Implantat flexibel an unterschiedliche experimentelle Paradigmen anzupassen, wie z.B. kopffixiertes versus frei bewegliches Verhalten oder Implantatminiaturisierung (ohne Faradayscher Käfig) versus erhöhte Langzeitsignalrobustheit (mit Faradayscher Käfig) – ohne dabei auf die Standardisierung des Implantats verzichten zu müssen.

Dieser Ansatz macht chronische elektrophysiologische Aufzeichnungen standardisierter (durch vorgefertigte Elemente, die nicht von Hand montiert werden müssen), kostengünstiger (durch Sondenbergung), weniger zeitaufwändig (durch Vereinfachung von Operationsschritten) und leichter kompatibel mit dem Tierschutz und -verhalten (durch verringerte Implantatgröße und stressfreie Kopffixierung). Als solches zielt dieses Protokoll darauf ab, elektrophysiologische Implantate in sich verhaltenden Nagetieren für ein breiteres Spektrum von Forschern zugänglich zu machen, das über die Pionierlabore auf dem neuesten Stand des Fachgebiets hinausgeht.

Um dieses Ziel zu erreichen, minimiert das hier vorgestellte Protokoll den Kompromiss zwischen mehreren oft gleich entscheidenden Aspekten von Mikroantriebsimplantaten, nämlich Flexibilität, Modularität, einfache Implantation, Stabilität, Gesamtkosten, Kompatibilität mit dem Verhalten und Wiederverwendbarkeit der Sonde. Die derzeit verfügbaren Ansätze zeichnen sich oft durch einige dieser Aspekte aus, gehen jedoch zu hohen Kosten für andere Funktionen. Für Anwendungsfälle, die absolute Implantatstabilität über lange Zeiträume erfordern, kann beispielsweise der beste Implantatansatz darin bestehen, die Sonde direkt auf den Schädel zu zementieren²⁵. Dies verhindert jedoch auch die Wiederverwendung der Sonde sowie die Neupositionierung der Aufnahmestellen bei schlechter Aufnahmequalität und ist mit der standardisierten Implantatinsertion nicht kompatibel. In ähnlicher Weise bietet das AMIE-Laufwerk zwar eine leichte, kostengünstige Lösung für die wiederherstellbare Implantation von Sonden, ist jedoch auf einzelne Sonden beschränkt und in der Platzierung der Zielkoordinaten¹⁷ eingeschränkt. Am anderen Ende des Spektrums stehen einige kommerziell erhältliche Nanoantriebe (siehe Tabelle 1 16,17,21,26,27,28,29,30) extrem klein, können frei auf dem Schädel platziert werden und maximieren die Anzahl der Sonden, die in ein einzelnes Tier implantiert werden können ¹⁶. Sie sind jedoch im Vergleich zu anderen Lösungen teuer, erfordern von den Experimentatoren hohe Fähigkeiten für erfolgreiche Implantatoperationen und verbieten die Wiederverwendung von Sonden. Das von Vöröslakos et ^al.21 entwickelte Mikrolaufwerk, von dem auch eine leichte Version Teil dieses Protokolls ist, opfert die kleine Implantatgröße für eine bessere Benutzerfreundlichkeit, einen niedrigeren Preis und eine bessere Wiederverwendbarkeit der Sonde

Tabelle 1: Vergleich gängiger Strategien für chronische Sondenimplantate bei Nagetieren. Verfügbarkeit: ob das Mikrolaufwerk Open Source ist (damit Forscher es selbst bauen können), kommerziell verfügbar oder beides. Modularität: Integrierte Systeme bestehen aus einer oder wenigen Komponenten, die in einer festen Beziehung zueinander stehen, während modulare Systeme eine freie Platzierung der Sonde/des Mikroantriebs relativ zum Schutz (Kopfband/Faradayscher Käfig) nach der Herstellung des Implantats (z. B. zum Zeitpunkt der Operation) ermöglichen. Die Modularität wurde anhand von veröffentlichten Informationen bzw. Implantationsprotokollen der aufgeführten Implantate ermittelt. Headfix: Ja: Das Implantat verfügt über Mechanismen zur Kopffixierung, die in sein Design integriert sind, X: Das Implantat lässt Platz, um eine zusätzliche Kopfplatte für die Fixierung ohne große Probleme hinzuzufügen, Nein: Das Design des Implantats führt wahrscheinlich zu Platzproblemen oder erfordert erhebliche Designänderungen für die Verwendung mit der Kopffixierung. Sondenplatzierung: Eingeschränkt: Die Sondenposition ist in der Phase des Implantatdesigns begrenzt. Flexibel: Die Sondenposition kann auch während der Operation angepasst werden. Anzahl der Sonden: Die Anzahl der Sonden, die implantiert werden konnten. Beachten Sie, dass die Implantation von >2-Sonden in eine Maus unabhängig vom gewählten Implantatsystem eine erhebliche Herausforderung darstellt. Wiederverwendbarkeit der Sonde: Ja, wenn die Sonden theoretisch wiederverwendet werden können. Gewicht/Größe: Gewicht und Sperrigkeit des Implantats. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Um ein System zu schaffen, das diese unterschiedlichen Anforderungen nahtloser in Einklang bringt, wurde das DREAM-Implantat auf Basis des Vöröslakos-Implantats²¹ entwickelt, jedoch mit einigen grundlegenden Modifikationen. Um das Gesamtgewicht des Implantats zu reduzieren, wird der hier verwendete Mikroantrieb zunächst aus maschinell bearbeitetem Aluminium anstelle von 3D-gedrucktem Edelstahl hergestellt, und die Faraday-Krone ist miniaturisiert, wodurch je nach Wahl des Kopfplattenmaterials eine Gesamtgewichtsreduzierung von 1,2-1,4 g erreicht wird (siehe Tabelle 2). Zweitens wurde die Kopfplatte, die den Mikroantrieb umgibt, so konzipiert, dass sie einen integrierten Kopffixationsmechanismus ermöglicht, der eine schnelle und stressfreie Kopffixierung ermöglicht und gleichzeitig als Basis für den Faradayschen Käfig dient, wodurch der Zugang zu den meisten potenziellen Zielbereichen für neuronale Aufzeichnungen ermöglicht und das Implantat nur minimal belastet wird. Die flache Form des Fixationsmechanismus und das Fehlen von Vorsprüngen sorgen auch für eine minimale Beeinträchtigung des Gesichtsfeldes oder der Fortbewegung der Tiere (siehe Abbildung 2A-C), eine deutliche Verbesserung gegenüber früheren Systemen^31,32. Die Faradaysche Krone und der Faraday-Ring, die auf der Kopfplatte befestigt sind, wurden im Vergleich zu früheren Designs ebenfalls erheblich verändert. Sie erfordern jetzt keine Ad-hoc-Anpassung (z. B. in Bezug auf die Platzierung des Steckers) oder Löten während der gesamten Operation, wodurch potenzielle Ursachen für Implantatschäden und unvorhersehbare Schwankungen in der Implantatqualität beseitigt werden. Stattdessen bietet das DREAM-Implantat mehrere standardisierte Kronenringvarianten, die es ermöglichen, jeden Konnektor in einer von vier vordefinierten Positionen zu platzieren, wodurch die Variabilität und der Aufwand während der Operation minimiert werden. Durch die Optimierung des Implantatsystems für die Sondenwiederherstellung ermöglicht das DREAM-Implantat den Experimentatoren, die Kosten sowie die Vorbereitungszeit pro Implantat drastisch zu senken, da das Mikrolaufwerk und die Sonde in der Regel zusammen geborgen, gereinigt und wiederverwendet werden können.

Einen umfassenderen Überblick über die Kompromisse, die die verschiedenen Implantatsysteme mit sich bringen, finden Sie in Tabelle 1. Während der hier vorgestellte Ansatz im Vergleich zu allen anderen Strategien in der Regel keine maximale Leistung bietet, z. B. in Bezug auf Größe, Stabilität oder Kosten, arbeitet er bei all diesen Parametern im oberen Bereich, was ihn leichter auf eine Vielzahl von Experimenten anwendbar macht.

Drei Aspekte des Protokolls sind besonders wichtig, um es an den jeweiligen Anwendungsfall anzupassen: Die Konstellation von Boden und Referenz, die Technik zur Zementierung des Mikroantriebs und die Implantatvalidierung durch neuronale Aufzeichnung. Zunächst ging es bei der Implantation der Masse- und Referenzstifte darum, den Sweet Spot zwischen mechanischer/elektrischer Stabilität und Invasivität zu identifizieren. Während z. B. schwimmende Silberdrähte, die in Agar eingebettet sind, weniger invasiv sind als Knochenschrauben³³, sind sie wahrscheinlich anfälliger dafür, sich im Laufe der Zeit zu lösen. Die Verwendung von Stiften, gekoppelt mit Agar, gewährleistet eine stabile elektrische Verbindung und hat gleichzeitig den Vorteil, dass sie während des Einführens leichter zu kontrollieren ist und Gewebetraumata vermieden werden. Es ist unwahrscheinlich, dass sich am Schädel befestigte Erdungsstifte lösen, und falls sich der Draht vom Stift trennt, ist die Wiederbefestigung aufgrund der größeren Oberfläche und Stabilität des implantierten Stifts in der Regel einfach.

Tabelle 2: Vergleich der Komponentengewichte zwischen dem DREAM-Implantat und dem von Vöröslakos et ^al.21 beschriebenen Implantat. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Zweitens sollte die Zementierung des Mikrolaufwerks in der Regel vor dem Einführen der Sonde in das Gehirn erfolgen. Dadurch wird eine seitliche Bewegung der Sonde im Gehirn verhindert, wenn der Mikroantrieb während des Einführens nicht perfekt in der stereotaktischen Halterung fixiert ist. Um die Platzierung der Sonde zu überprüfen, bevor das Mikrolaufwerk an Ort und Stelle zementiert wird, kann man die Spitze des Sondenschafts kurz absenken, um festzustellen, wo er das Gehirn berühren wird, da die Extrapolation der Aufsetzposition angesichts der Parallaxenverschiebung des Mikroskops schwierig sein kann. Sobald die Position des Mikroantriebs festgelegt ist, kann die Kraniotomie optional mit Silikonelastomer geschützt werden, bevor der Mikroantrieb zementiert wird, um sicherzustellen, dass der Zement nicht versehentlich mit der Kraniotomie in Kontakt kommt. Es wird jedoch nicht empfohlen, die Sonde durch das Silikonelastomer abzusenken, da Silikonelastomerrückstände ins Gehirn gezogen werden und Entzündungen und Gliose verursachen können.

Drittens kann je nach verwendetem Versuchsprotokoll eine Testaufzeichnung direkt nach der Operation sinnvoll sein oder auch nicht. Im Großen und Ganzen ist die neuronale Aktivität, die direkt nach dem Einführen der Sonde aufgezeichnet wird, nicht direkt repräsentativ für die chronisch aufgezeichnete Aktivität, was auf Faktoren wie vorübergehende Hirnschwellungen und Gewebebewegungen um die Sonde zurückzuführen ist, was bedeutet, dass sowohl die Einstichtiefe als auch die Spike-Wellenformen wahrscheinlich nicht direkt stabilisiert werden. Sofortaufnahmen können daher vor allem dazu dienen, die allgemeine Signalqualität und die Integrität des Implantats zu ermitteln. Es wird empfohlen, den beweglichen Microdrive-Schlitten in den folgenden Tagen nach der Operation zu verwenden, sobald sich das Gehirn stabilisiert hat, um die Position fein abzustimmen. Dies trägt auch dazu bei, eine Bewegung der Sonde um mehr als 1000 μm pro Tag zu vermeiden, wodurch Schäden an der Aufzeichnungsstelle minimiert und somit die Langlebigkeit der Aufzeichnungsstelle verbessert wird.

Schließlich können Benutzer das System so anpassen, dass es von mehr als einem Zielort aus aufzeichnet. Da dieses System modular aufgebaut ist, hat der Anwender einen großen Spielraum bei der Montage und Platzierung der Komponenten zueinander (siehe oben sowie Ergänzende Abbildung 3 und Ergänzende Abbildung 4). Dazu gehören Modifikationen, die es ermöglichen würden, ein horizontal verlängertes Shuttle auf dem Mikroantrieb zu montieren, was die Implantation mehrerer Sonden oder großer Sonden mit mehreren Schäften ermöglicht, sowie die Implantation mehrerer einzelner Mikroantriebe (siehe Ergänzende Abbildung 3 und Ergänzende Abbildung 4). Solche Modifikationen erfordern lediglich die Verwendung eines angepassten Kronenrings mit einer erhöhten Anzahl von Befestigungszonen für Steckverbinder/Interface-Boards/Headstages. Die räumlichen Einschränkungen dieses Designs werden jedoch durch das Tiermodell, in diesem Fall die Maus, vorgegeben, was das Stapeln mehrerer Sonden auf ein Mikrolaufwerk in Bezug auf den Platzbedarf attraktiver macht als die Implantation mehrerer Mikrolaufwerke unabhängig voneinander. Die hier verwendeten Mikroantriebe können gestapelte Sonden unterstützen, und daher ist die einzige wirkliche Einschränkung die Anzahl der Kopfstufen oder Anschlüsse, die den vom Tiermodell definierten Platz- und Gewichtsbeschränkungen entsprechen können. Abstandshalter können auch verwendet werden, um die nicht-vertikalen Montage- und Einsteckwege weiter zu erhöhen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll eine kostengünstige, leichte und vor allem einstellbare Implantation einer Sonde ermöglicht, mit dem zusätzlichen Vorteil eines Mikrolaufwerksdesigns, das die Wiederherstellung der Sonde in den Vordergrund stellt. Dies löst die Probleme der unerschwinglichen Kosten von Einwegsonden, der hohen Barriere für chirurgische und Implantationsfähigkeiten sowie der Tatsache, dass kommerzielle Lösungen für chronische Implantationen oft schwer an einzigartige Anwendungsfälle angepasst werden können. Diese Probleme stellen ein Problem für Labore dar, die bereits akute Elektrophysiologie anwenden, und eine Abschreckung für diejenigen, die noch keine elektrophysiologischen Experimente durchführen. Dieses System zielt darauf ab, die breitere Akzeptanz der chronischen Elektrophysiologieforschung über diese Grenzen hinaus zu erleichtern.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,05" Löt-Endfassung	Mill-Max	853-93-100-10-001000
1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Reagenz Tetramethylindocarbocyaninperchlorat ('DiI'; DiIC18(3))	ThermoFisher	D282	Lipophiler Farbstoff, der zur einfacheren histologischen Überprüfung der Sondenposition verwendet wird
Klebekitt (Blu-Tack)	Bostik	308590110	Varianten (z. B. von Pritt) sollten in deinem Schreibwarenladen erhältlich sein
Agar	Sigma Aldrich	A1296	Verwenden Sie Kochsalzlösung für die Leitfähigkeit.
Verstärker (Miniamp-64)	Cambridge Neurotech		Miniatur- und implantierbarer Verstärker und Digitalisator. Alternative implantierbare Digitalisierung oder implantierbarer Omnetics-Steckverbinder ist möglich.
Analgetikum-Creme (EMLA-Creme)	Aspen	39699/0088	Schmerzlindercreme, die gegen operative Schmerzen verwendet wird, enthält Prilocain, Lidocain.
Schräger Abstandshalter	3DNeuro		Schräger Abstandshalter für nicht senkrechte Antriebsmontage... Open Souce, ebenfalls erhältlich bei https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/
Blaulichthärtende LED	B.A. International	818223	Licht aushärten für die Polymerisation des Grundsatzes. 420–480 nm Wellenlänge
Knochenwachs	SMI	Z046	Wachs zum Schutz der Kraniotomie und Probe nach der Operation.
Buprenorphin	Elanco Europe LTD	401513	Injizierbare Buprenorphin-Lösung (0,3 mg/mL)
Kupfergitter	Dexmet	3CU6-050FA	Kupfergitter, das zur elektrischen und physischen Abschirmung von Sonden und Kraniotomie verwendet wird.
Cyanoacrylatkleber (Loctite)	Loctite	1363589	Cyanoacrylat-Gelkleber
Zahnbeton (SuperBond C& B)	Sun Medical	K058E	Zahnklement (SuperBond)
Enthaarungscreme (Veet)	Veet	310000091434	Haarentfernungscreme zur Haarentfernung rund um die Operationsstelle.
Enrofloxacin (Baytril)	Elanco Europe LTD	00879/4117	Injizierbare Enrofloxacin-Lösung (25 mg/mL)
Faradaysche Krone	3DNeuro		3D-gedruckter implantierbarer Schutzkäfig. Open Souce, ebenfalls erhältlich bei https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/
Faradayscher Ring	3DNeuro		3D-gedruckter implantierbarer Schutzring für den Faraday-Käfig. Open Souce, ebenfalls erhältlich bei https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/
Hämostatischer Schwamm	SMI	ZHG101010	Absorbierbarer gelatinehämostatischer Schwamm
Schrumpfschlauchrohr	HellermannTyton	TA32-9/3 BK	Schrumpfschlauch zum Herstellen von weichen Pinzetten
Jod	Braunol	9322507	Wässrige Povidon-Jod-Lösung.
Metamizol (Novalgin)	Sanofi-Aventis Gmbh	4527098	Injizierbares Metamizol (500 mg/mL)
Metamizol (Novalgin)	Sanofi-Aventis Gmbh	1553758	Metamizol-Lösung
Microdrive (R2Drive)	3DNeuro		Bergbarer Metall-Mikroantrieb mit beweglichem Shuttle. Open Souce, auch erhältlich bei https://buzsakilab.github.io/ 3d_print_designs/
Mineralöl	Sigma-Aldrich	M5310-100ML	Öl wird als Lösungsmittel verwendet, um ein Kraniotomie-Schutzgel herzustellen.
Nicht-haarende Feuchttücher (Kimtech)	Kimtech	7552	Feuchttücher, die nicht abfallen,
Grundbuch	Bisco	B-7202P	Universeller Totenschädelkleber verhindert, dass Feuchtigkeit den Zement verschlechtert, und bietet eine solide Basis für den Zementaufbau.
R2Drive-Halter	3DNeuro		Stereotaktische Befestigung zur Montage von R2Drive. Open Souce, auch erhältlich bei https://buzsakilab.github.io/ 3d_print_designs/
Selbsthaftende Folie	3M	VB050	Schutzverband für Implantat nach der Operation
Siliziumsonde (H2)	Cambridge Neurotech		Chronisch implantierbare lineare Siliziumsonde mit 32 Kanälen. Alternative Sondennutzung möglich.
Silikon-Elastomer (Duragel)	Cambridge Neurotech		Silikon-Elastomer
Silikongips (Kwikcast)	WPI	KWIK-CAST
Silberleitfähiges Epoxidharz	MG Chemicals	8331D-14G	Silber-Epoxidharz
Größe 5 Dumont-Zange	FSTools	11251-10	Kleine Pinzetten zum Anheben des Knochenlappens.
Edelstahldraht, mit Teflon beschichtet	Wissenschaftsprodukte GmBH	SS-3T	Erdungsdraht
Stereotax (RWD)	Heckantrieb	68803	Stereotax für chirurgische Eingriffe an Mäusen.
Tergazym	Alconox	1304	Ein möglicher enzymatischer Reiniger zur Reinigungssonde
Zweiteiliges Schnellhärten-Epoxidharz	Gorilla	EP3	Epoxidharz für die dauerhafte Bindung von DREAM-Implantatteilen.
Vannas Spring Scissors runder Griff	FSTools	15403-08	0,075 mm geradespitzte Feder-Rebound-Schere für Tiermedizin.
Veterinärer Cyanoacrylat-Kleber (Vetbond)	3M	70-0068-5256-3	Veterinärer Cyanoacrylat-Kleber