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AC-DC Elektropenetrographie zur Untersuchung des Sondierungs- und Verschluckungsverhaltens von Culex tarsalis Mücken an menschlichen Händen

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DOI:

10.3791/66877

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29. November 2024

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1Department of Entomology, Kansas State University, 2Department of Pathobiology, Auburn University, 3National Bio and Agro-Defense Facility, USDA Agricultural Research Service

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Es werden Verfahren zur Untersuchung des Sondierungs- und Verschluckungsverhaltens von Culex tarsalis-Mücken an menschlichen Händen mittels AC-DC-Elektropenetrographie beschrieben.

Zusammenfassung

Mücken übertragen Krankheitserreger, die sich negativ auf die Gesundheit von Mensch und Tier auswirken. Ein besseres Verständnis ihrer Biologie bei der Blutaufnahme und ihrer Wechselwirkungen mit Wirten und Krankheitserregern könnte genutzt werden, um neue Angriffspunkte für die Kontrolle von durch Stechmücken übertragenen Krankheiten zu entwickeln. Leider ist das Sondierungsverhalten (d.h. das Stechen) von Mücken nur unzureichend verstanden, da es im Wirtsgewebe stattfindet. Hier wird ein nicht-invasives Verfahren zur Verwendung der AC-DC-Elektropenetrographie (EPG) zur indirekten Visualisierung und Quantifizierung des Fressverhaltens von Mücken beschrieben, indem Änderungen der elektrischen Signale aufgezeichnet werden, die beim Sondieren und Verschlucken an menschlichen Händen erzeugt werden. Dünne Golddrähte werden mit leitfähigem Silberkleber an den Mücken befestigt und mit dem EPG-Instrument verbunden. Der menschliche Wirt hält eine Substratspannungssonde in der Hand. Die Sondierung des Wirts durch die verdrahtete Mücke vervollständigt den Stromkreis, und elektrische Signale werden auf einem Computer als "Wellenformen" aufgezeichnet, die dann gemessen und zur Analyse aufgezählt werden können. Diese Methodik wurde verwendet, um das Sondierungs- und Verschluckungsverhalten von Aedes aegypti- und Culex tarsalis-Mücken zu charakterisieren und kann auf andere Mückenarten angewendet werden. EPG kann verwendet werden, um die Auswirkungen von Krankheitserregern, Insektiziden und anderen Faktoren auf das Fressverhalten von Mücken zu untersuchen.

Einleitung

Mücken verursachen weltweit Leid und wirtschaftliche Verluste aufgrund ihrer Rolle als Krankheitsüberträger und lästige Schädlinge1. Anopheles-Mücken übertragen Malaria, die jährlich weltweit schätzungsweise 219 Millionen Fälle, mehr als 400.000 Todesfälle verursacht2 und 12 Milliarden US-Dollar an direkten Kosten3. Aedes-Mücken sind die bemerkenswertesten Überträger von Bedeutung für die öffentliche Gesundheit, da sie fast weltweit vorkommen und Erreger von Chikungunya, Dengue-Fieber, lymphatischer Filariose, Rifttalfieber, Gelbfieber und Zika übertragen, die Menschenleben fordern, die Gesundheitssysteme überfordern und zu chronischem Leiden, lebenslanger Morbidität und Behinderung führen4,5. Darüber hinaus übertragen Culex-Mücken Erreger der Pferdeenzephalitis, der Japanischen Enzephalitis, der lymphatischen Filariose, der St.-Louis-Enzephalitis und des West-Nil-Fiebers, die sich sowohl auf die Gesundheit von Mensch als auch Tier auswirken3,4.

Die Vektorkontrolle mit insektizidbasierten Ansätzen ist die weltweit führende Methode zur Kontrolle vektorübertragener Krankheiten6,7. Die Anzahl der Insektizide, die zur Mückenbekämpfung zur Verfügung stehen, ist jedoch begrenzt. Darüber hinaus entwickelt sich die Insektizidresistenz bei vielen Arten, insbesondere bei Aedes-Mücken, was sich auf unsere Fähigkeit auswirkt, durch Vektoren übertragene Krankheiten zu bekämpfen, und den Bedarf an neuen Bekämpfungsstrategien erhöht6,8. Ein besseres Verständnis der Biologie der Mücke, der Interaktionen zwischen Mücke, Wirt und Krankheitserreger und der Prozesse, die die Übertragung von Krankheitserregern regulieren, kann die Entwicklung neuer Werkzeuge zur Vektorkontrolle erleichtern6.

Sondierungs- und Aufnahmeverhalten in Wirtsgeweben können die Übertragung von Krankheitserregern und die Krankheitspathologie beeinflussen9,10,11,12. Zum Beispiel wurden mehr Mikrofilarien aufgenommen, wenn Aedes aegypti direkt aus den Kapillaren fütterte, anstatt Blut außerhalb der geplatzten Gefäße zu sammeln13. Daher kann die Grundlagen- und angewandte Forschung zu diesem Thema dazu beitragen, Strategien zur Mückenbekämpfung und andere Gegenmaßnahmen zur Übertragung von Krankheitserregern zu entwickeln, zu verfeinern und zu bewerten. Es bestehen jedoch erhebliche Wissenslücken in den Details von kryptischen Blutfütterungsverhaltensweisen, die unter der Hautoberfläche des Wirts stattfinden, da diese Verhaltensweisen oft invasive Verfahren an lebenden Tiermodellen erfordern oder transparente künstliche Substrate oder flüssige Nahrungen verwenden9,11,14,15. Nicht-invasive Elektropenetrographie-Techniken (EPG; auch elektrischer Penetrationsgraph genannt) wurden verwendet, um das Fressverhalten von pflanzenfressenden Insekten im Zusammenhang mit der Übertragung von Pflanzenpathogenen, der Resistenz von Wirtspflanzen und den Wirkungsweisen von Insektiziden zu untersuchen, da sie es Forschern ermöglichen, Bewegungen und Verhaltensweisen von Mundwerkzeugen, die im Wirtsgewebe auftreten, indirekt zu beobachten, aufzuzeichnen und zu quantifizieren10,12.

Seit den 1950er Jahren werden elektronische Penetrationsüberwachungstechniken auf blutsaugende Arthropoden, einschließlich Mücken, angewendet16,17,18,19,20. EPG wurde jedoch nie allgemein für blutsaugende Arthropoden übernommen, da die biologischen Aktivitäten, die den Wellenformen entsprechen, nie verifiziert werden konnten21. Darüber hinaus führten das Design und die Elektronik früher Instrumente zu einer Überbetonung einiger elektrischer Signale, zu hohen Rausch-Signal-Verhältnissen, geringer Auflösung und Verzerrung der Wellenformen sowie zu Irritationen bei Wirbeltierwirten12,22. Ein neueres Instrument, der AC-DC EPG Monitor23, verfügt über variable Einstellungen und eine verbesserte Signalverarbeitung, wodurch er besser geeignet ist, blutsaugende Arthropoden aufzuzeichnen und die biologische Herkunft der Wellenformen in experimentellen Korrelationsstudien zu entschlüsseln10,12.

Für EPG wird ein elektrisches Signal über eine Substratspannungssonde (d.h. Referenzelektrode) an den Host angelegt. Der Gliederfüßer wird an einer Aufzeichnungselektrode befestigt und auf dem Wirt platziert. Wenn der Gliederfüßer seine Mundwerkzeuge (d. h. Stilette) in den Wirt einführt, wird das elektrische Signal zur Signalverarbeitung an den AC-DC EPG-Monitor weitergeleitet. Die elektrischen Signale werden dann auf einem Computer als "Wellenformen" angezeigt, die bestimmten Verhaltensweisen wie Mundwerkzeugbewegungen, Verschlucken, Speichelfluss und Aufnehmen/Impfen von Krankheitserregern entsprechen10,12. Sequenzielle und nicht-sequentielle Antwortvariablen, die sich auf die Dauer und Anzahl der Wellenformen beziehen24,25 auf verschiedenen hierarchischen Ebenen (Familien, Typen und Subtypen) können dann basierend auf der Häufigkeit und Dauer der Wellenformen berechnet werden, um Einblicke in das Fressverhalten zu erhalten, das innerhalb und zwischen den Arten und als Reaktion auf biotische und abiotische Faktoren auftritt, wie z. B. Wirte, Krankheitserreger, Pestizide und Umweltbedingungen10,12.

Bisher wurde der AC-DC EPG-Monitor verwendet, um das Sondierungs- und Verschluckungsverhalten von Ae. aegypti26 und Culex tarsalis27 Stechmücken zu charakterisieren, die sich von menschlichen Händen ernähren, und von Dermacentor variabilis und Amblyomma americanum-Zecken, die sich von Rinderkälbern ernähren28. Darüber hinaus wurde kürzlich ein Mausmodell für EPG29 entwickelt, um Erregerstudien mit diesem Instrument zu erleichtern. Menschliche Hände sind ideal für die anfängliche Charakterisierung von Mückenwellenformen, da menschliche Wirte berichten können, wann sie die Mückensondierung sowie andere Verhaltensweisen spüren, was die Korrelation von Wellenformen mit Verhaltensweisen erleichtert (Tabelle 1). Darüber hinaus könnte ein besseres Verständnis der Plastizität des Fressverhaltens bei Stechmücken in verschiedenen menschlichen Populationen zur Entwicklung spezialisierterer Managementmaßnahmen für Stechmücken und die von ihnen übertragenen Krankheitserreger beitragen.

Tabelle 1: Beschreibung der Wellenformenfamilien, die zur Klassifizierung von elektrischen Signalen verwendet werden, die von Culex tarsalis an menschlichen Händen unter Verwendung von AC-DC EPG aufgezeichnet wurden. Die Sondierungsphase und die biologischen Aktivitäten, die jeder Wellenformfamilie entsprechen. Weitere Informationen finden Sie unter Cooper et al.27. Abkürzung: AC = Wechselstrom, DC = Gleichstrom, EPG = Elektropenetrograph. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Um die Verwendung von EPG zur Untersuchung der Mückenbiologie und der Wirt-Vektor-Interaktionen zu erleichtern, wird hier eine Methodik zur Quantifizierung des Fressverhaltens von Cx. tarsalis-Mücken an menschlichen Händen mit dem AC-DC EPG-Monitor vorgestellt. Diese Protokolle bauen auf den grundlegenden AC-DC EPG-Verfahren auf, die in den Online-Ressourcen30 beschrieben sind, und setzen voraus, dass die Benutzer über grundlegende Kenntnisse von AC-DC EPG und der zugehörigen Software verfügen31. Die skizzierten Verfahren können für andere Mücken- und Wirtsarten modifiziert werden und bieten eine Grundlage, um die hypothesengetriebene Erforschung des Fressverhaltens von Mücken zu erleichtern.

Tabelle 2: Definitionen der gängigen AC-DC EPG-Terminologie. Die Definitionen basieren auf den Definitionen in den Online-Ressourcen30,31 und in der wissenschaftlichen Literatur32. Abkürzung: AC = Wechselstrom, DC = Gleichstrom, EPG = Elektropenetrograph. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Protokoll

Dieses Protokoll (IRB-10729) wurde von der Institutional Review Board (IRB) für Humorforschung der Kansas State University27 genehmigt und ist ausschließlich für den Einsatz mit pathogenfreien Mücken vorgesehen. Menschliche Probanden gaben ihre informierte Einwilligung zur Teilnahme an der Studie und zur Veröffentlichung ihrer Daten. Bevor Arbeiten mit Tieren, Menschen oder biohazardstoffen begonnen werden, muss sichergestellt werden, dass alle Verfahren von den zuständigen institutionellen Regulierungsausschüssen oder Aufsichtspersonen geprüft und genehmigt wurden. Weitere Einzelheiten zu sämtlichen in diesem Protokoll verwendeten Geräten und Materialien finden Sie in der Tabelle der Materialien.

1. Erste Vorbereitung und Einrichtung

  1. Richten Sie den AC-DC-EPG-Monitor (Abbildung 1A), den Faraday-Käfig (Abbildung 1B,C) und die Software wie zuvor beschrieben30,31 unter Verwendung der nachfolgend beschriebenen Modifikationen ein (Schritte 1.1.1–1.1.5). Weitere Schritt-für-Schritt-Anleitungen zur Einrichtung und Nutzung der Geräte und Software finden Sie in den Online-Ressourcen30. Speichern Sie die gewünschte Konfiguration als Standard in der Hardwareverwaltungs- und Wellenform-Analyse-Software. Eine Liste gängiger AC-DC-EPG-Fachbegriffe und ihrer Definitionen finden Sie in Tabelle 2.
    1. Verbinden Sie einen Kopfverstärker (Head Amp) und eine Substrat-Spannungsprobe mit Kanal 1 der Steuerbox.
      HINWEIS: Es wird die Aufnahme über einen einzelnen Kanal dargestellt, obwohl der AC-DC-Monitor gleichzeitig vier Insekten und Wirte erfassen kann.
    2. Stellen Sie sicher, dass Kanal 1 an der Steuerbox eingeschaltet ist und die entsprechenden Pre-1- und Post-1-Kanäle an der Schaltinterface-Box aktiviert sind.
      HINWEIS: Nicht verwendete Kanäle müssen ausgeschaltet bleiben.
    3. Aktivieren Sie mithilfe der Hardwareverwaltungssoftware die Kanäle 1 und 3 auf der DI-710 A/D-Platine (aber keine anderen), um die vor- und nachrektifizierten Signale aufzuzeichnen.
    4. Konfigurieren Sie die Hardwareverwaltungssoftware so, dass die vor- und nachrektifizierten Wellenformen angezeigt bzw. überlagert werden (z. B. 1 = 1 für das Vorsignal und 2 = 3 für das Nachsignal).
    5. Stellen Sie die Abtastrate in der Hardwareverwaltungssoftware auf 100 Abtastwerte pro Sekunde pro Kanal ein (d. h. S/s/CHAN: 100).
  2. Stellen Sie Insektenstifte her26,27,29,30:
    1. Heizen Sie das Lötkolben auf die empfohlene Temperatur für den spezifischen Kolophoniumkern-Lötdraht vor.
    2. Entfernen Sie mit einem Abisolierwerkzeug die Kunststoffummantelung etwa 6 cm vom Ende einer 20 AWG Kupferdrahtspule, ohne dabei das innenliegende Kupferdrahtbündel zu durchtrennen oder zu beschädigen (Abbildung 2A). Schneiden Sie anschließend das freigelegte Kupferdrahtbündel ab und lösen Sie es in einzelne Litzen auf (Abbildung 2B).
    3. Wickeln Sie mit einer Spitzzange eine einzelne Litze des Kupferdrahts um den Schaft eines geeigneten Zylinderstifts unterhalb des Kopfes (d. h. der flachen Oberseite), sodass der größte Teil des Kupferdrahts über den Stiftkopf hinausragt. Biegen Sie das Drahtende über den Kopf des Stifts, um den Draht zu fixieren (Abbildung 2C).
      HINWEIS: Testen Sie verschiedene Zylinderstifte, um solche auszuwählen, die fest in der Buchse des Kopfverstärkers sitzen (wenn dieser ausgeschaltet, vom Netz getrennt und auf 106 Ohm (Ω) eingestellt ist).
    4. Spannen Sie den Schaft des Zylinderstifts in eine Hilfshand-Löthilfe, sodass der Kupferdraht nach oben zeigt. Tragen Sie dann eine kleine Menge (~0,2 cm Kugel) wasserlöslichen Flussmittel an die Verbindungsstelle zwischen Zylinderstift und Kupferdraht auf (Abbildung 2D).
      ACHTUNG: Flussmittel ist giftig und muss sorgfältig gehandhabt werden.
    5. Wickeln Sie etwa 10 cm Lötdraht ab und richten Sie ihn gerade. Halten Sie das heiße Lötkolben einige Sekunden lang an den Kopf des Stifts, bis das Flussmittel schmilzt und das Metall heiß ist. Drücken Sie dann die Spitze des Lötdrahts neben das Lötkolben an den Stiftkopf, bis das Lot schmilzt und die Verbindungsstelle vollständig bedeckt, wodurch Stift und Draht zu einem Insektenstift verschmelzen.
    6. Reinigen Sie während des Abkühlens des Insektenstifts die Spitze des Lötkolbens mit Stahlwolle und einem feuchten Schwamm.
    7. Entfernen Sie den abgekühlten Insektenstift aus der Hilfshand. Spülen Sie den Insektenstift zur Entfernung von Flussmittelrückständen mit 70 %igem Ethanol und anschließend mit Wasser ab. Kürzen Sie den Kupferdraht auf die gewünschte Länge (~3 cm, Abbildung 2E).
    8. Wiederholen Sie die Schritte 1.2.3–1.2.7, bis 20–30 Insektenstifte hergestellt sind.
  3. Bauen Sie einen Insektenaspirator zusammen26,27:
    1. Führen Sie die Spitze einer Glas-Pasteurpipette durch eine Flamme und drehen Sie die Pipette leicht. Wiederholen Sie dies, bis das Ende der Pipette die geeignete Größe hat, um eng um den Hinterleib des Insekts zu passen.
    2. Bedecken Sie das breite Ende der modifizierten Pasteurpipette mit Mückennetz und stecken Sie sie direkt in den Silikonschlauch, der mit einem Laboraspirator verbunden ist. Sichern Sie die Verbindung mit Isolierband, um einen Insektenaspirator zu bilden (Abbildung 2H).
      HINWEIS: Die Pasteurpipette und das Netz können in ein kurzes Stück Kunststoffschlauch mit Schnellkupplung eingesetzt werden, um den Wechsel zwischen verschiedenen Größen zu erleichtern (Abbildung 2H).

Aufbau eines Elektrophysiologie-Labors für EEG-Aufnahmen; umfasst Verstärker, Computer, Faraday-Käfig und Sensoren.
Abbildung 1: Der AC-DC-EPG-Monitor-Aufbau zur Aufnahme an menschlichen Händen. (A) Komponenten des EPG, einschließlich (1) Steuerbox, (2) Schaltinterfacebox, (3) Netzteil, (4) DI-710 A/D-Board, (5) Computer, (6) Spannungsregler, und (B) Faraday-Käfig mit (C) einem digitalen Mikroskop (7) auf einem Schwanenhalsstativ, (8) Luftpolsterfolie und Luftkissen, (9) Substrat-Spannungsprobe und (10) Kopfverstärker auf einem Labortisch. Abkürzungen: AC = Wechselstrom, DC = Gleichstrom, EPG = Elektropenetrograph. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Montageprozess des Katheters mit Schlauch, Draht und Werkzeugen; Diagramm des experimentellen Aufbaus für den Fluidtransfer.
Abbildung 2: Ableitelektroden zum Verdrahten von Mücken und ein Insektenaspirator zum Handhaben der Mücken während des Verdrahtens. (A) 20 AWG Kupferdraht, bei dem 6 cm der Kunststoffummantelung entfernt wurden, um das innenliegende Bündel aus Kupferdrähten freizulegen. (B) Einzelne Litzen des Kupferdrahtbündels. (C) Eine Litze des Kupferdrahts, die um den Kopf einer Messing-Türstiftspange gewickelt ist, wobei das Drahtende über den Stiftkopf zurückgebogen wurde. (D) Ein wenig Flussmittel an der Verbindungsstelle zwischen der Messing-Türstiftspange und dem Kupferdraht, die mit einer „Helfende Hände“-Löthilfe gehalten wird, vorbereitend zum Löten. (E) Ein fertiggestellter Insektenstummel, bestehend aus einem an einen Kupferdraht angelöteten Messingnagel. (F) Eine Ableitelektrode, bestehend aus einem Golddraht, der um die Spitze des Kupferdrahts eines Insektenstummels gewickelt ist und mit Silberleim fixiert wurde. (G) Eine Vergrößerung der Goldschleife an der Spitze der Ableitelektrode. (H) Ein zusammengesetzter (oben) und zerlegter (unten) Insektenaspirator, hergestellt aus modifizierten Pasteur-Pipetten, Mückennetz, Kunststoffschläuchen, Isolierband und männlichen Schnellkupplungen, neben dem Laboraspiratorrohr, das mit der weiblichen Schnellkupplung ausgestattet ist (oben rechts). Maßstäbe = 1 cm (A–F), 200 µm (G). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

2. Verdrahtung von Mücken

  1. Bereiten Sie die Mücken und den Silberleim am Nachmittag/Abend vor dem EPG-Versuch vor:
    1. Züchten und pflegen Cx. tarsalis KNWR-Stamm-Mücken entsprechend früherer Beschreibung kennzeichnen27.
    2. Schnell erwachsene weibliche Mücken, 5–17 Tage nach der Schlüpfung, für 8–12 Stunden hungern, um die Probierquoten zu erhöhen, jedoch Zugang zu Wasser gewähren, um Mortalität zu vermeiden.
    3. Frischen Silberkleber herstellen26,27,28,29,30:
      1. Fügen Sie 510 mg 4- hinzu8 µm Silberflocken in ein 20-mL-Becherglas geben. Die Waage tarieren und 1.100 mg ungiftigen Bastelkleber dem Becherglas mit den Silberflocken hinzufügen.
      2. Nullen Sie die Waage ab, geben Sie 510 mg von 8-10 µm Silberflocken in das Becherglas auf den Kleber geben und dann hinzufügen 1,000 µL von Wasser mit einer Pipette.
      3. Fügen Sie vorsichtig einen Rührstab zum Becher hinzu und stellen Sie diesen auf das Rührgerät. Beginnen Sie mit langsamen Rühren, erhöhen Sie nach und nach die Geschwindigkeit auf die Einstellung „schnell“ und rühren Sie 4 Minuten lang. Stellen Sie sicher, dass alle Bestandteile eingearbeitet sind.
      4. Verwenden Sie eine Transferpipette (mit abgeschnittenem Spitzenende), um den Silberkleber in 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen.
      5. Verschließen Sie die Öffnungen der Silberkleber-Röhrchen mit Parafilm und lagern Sie sie bei Raumtemperatur bis zur Verwendung.
        HINWEIS: Silberkleber hat bis zu 2 Tage lang die richtige Konsistenz, es wird jedoch empfohlen, den Kleber am Abend vor der Verwendung frisch herzustellen.30.
  2. Aufbereitung der Ableitelektroden26,27,29,30:
    1. Den Silberkleber vor Gebrauch kräftig vortexen.
    2. Wickeln Sie einen Schaumstoffblock mit frischer Frischhaltefolie ein, um die vorbereiteten Insektenstummel und verdrahteten Mücken darin zu verstauen.
      HINWEIS: Der Schaumstoff muss groß genug sein, um den mit Drähten fixierten Mücken Platz zum Stehen auf der Oberfläche zu bieten, ohne sich gegenseitig zu berühren, aber klein genug, um in eine Aufbewahrungsbox zu passen. VORSICHT: Ausscheidungströpfchen, die nach der Blutmahlzeit freigesetzt werden, können Krankheitserreger enthalten. Entsorgen Sie die Plastikfolie/den Schaumstoffblock nach Gebrauch entsprechend den Sicherheitsvorschriften.
    3. Entfernen Sie Verfärbungen (und alten Silberkleber, falls Insektenstummel wiederverwendet werden) von der Spitze des Kupferdrahts, indem Sie die oberen 1 cm des Kupferdrahts mit einem Rasiermesser abschaben, bis alle Seiten glänzend sind. Bereiten Sie für jeden Moskito einen Insektenstummel sowie einige zusätzliche Exemplare vor.
    4. Schneiden Sie Golddraht mit einem Durchmesser von 0,025 mm in Stücke von 4–5 cm Länge. Halten Sie den Draht stets mit selbstschließenden Pinzetten, die mit Klebeband abgedeckt sind, um Beschädigungen zu vermeiden.
      HINWEIS: Golddraht ist vor schwarzem Hintergrund deutlich besser sichtbar.
    5. Legen Sie das Ende des Golddrahts an die saubere Spitze des Kupferdrahts des Insektenstumpfs und wickeln Sie den Golddraht vorsichtig dreimal um den Kupferdraht.
    6. Verwenden Sie eine Präpariernadel, um Silberleim aufzutragen, um den Golddraht an seiner Position zu fixieren. Stellen Sie sicher, dass kein Zipfel oder loses Ende vorhanden ist. Platzieren Sie den Insektenstummel in den Schaumstoff, bis der Leim getrocknet ist.
    7. Streichen Sie vorsichtig über den an der Insektenhalterung befestigten Golddraht, um ihn zu glätten und zu einem langen, sanften Bogen zu formen (Abbildung 2F). Schneiden Sie den Draht auf die gewünschte Länge (~2,5–3 cm) zu.
    8. Unter einem Stereomikroskop arbeiten und mit feinen Pinzetten eine Goldschleife an der Spitze des Golddrahts bilden sowie die Schleife in einem Winkel biegen 90° Winkel, wie unten beschrieben (Schritte 2.2.8.1–2.2.8.4); Abbildung 2E, F). Stellen Sie sicher, dass die Goldschleife vollständig geschlossen ist. Legen Sie den Insektenstummel zurück in den Schaumstoffblock.
      1. Halten Sie den Insektenstummel mit der nicht-dominanten Hand am Messingnagel fest, wobei die Spitze des Golddrahts die Mikroskopbühne berührt. Greifen Sie mit der dominanten Hand das äußerste Ende des Golddrahts mit einer feinen Pinzette.
      2. Mit der feinen Pinzette das Ende des Golddrahts über den Kupferdraht des Insektenhalters führen, und zwar in der Nähe der Stelle, an der der Golddraht angeklebt ist. Die Spitze der feinen Pinzette und des Golddrahts auf die Mikroskopbühne aufsetzen.
      3. Ziehen Sie vorsichtig am Insektenstummel, bis der Golddraht eine kleine Goldschlaufe um die Spitze der feinen Pinzette bildet (ziehen Sie nicht zu fest). Lassen Sie den Golddraht los und entfernen Sie die Pinzette vorsichtig.
      4. Während der Insektenstummel weiterhin in der nicht-dominanten Hand gehalten wird, greifen Sie mit der feinen Pinzette die goldene Schlaufe so, dass die Pinzette im rechten Winkel zum Drahtansatz steht und die Spitze der Pinzette die Mitte der goldenen Schlaufe überbrückt, wodurch beide Seiten der Schlaufe erfasst werden. Ziehen Sie vorsichtig am Insektenstummel, während Sie die Pinzette leicht vom Insektenstummel weg drehen, bis die Schlaufe an einem Winkel von 90° Winkel zum Hals des Drahtes (Abbildung 2G).
  3. Befestigen Sie die Aufnahmeelektroden an den Mücken26,27,29,30 (am Morgen des EPG):
    1. Betäuben Sie nüchterne Mücken mit CO2 Gas, bis sich alle Bewegungen stoppen. Legen Sie die Mücken auf den Rücken auf das Betäubungskissen, sodass ihre Abdomen dem Forscher zugewandt sind.
    2. Platzieren Sie ein etwa 2 cm langes Stück Laborband unter einem Auflichtmikroskop mit der klebrigen Seite nach unten. Geben Sie einen Tropfen von 0,5 cm (~ 10 µL) Silberkleber auf das Klebeband.
    3. Aspirieren Sie den Bauch einer betäubten Mücke mit dem modifizierten Pasteur-Pipettensauger, wobei der Saugvorgang nur so lange erfolgen sollte, bis der Bauch an seiner Position fixiert ist. Halten Sie die Mücke mithilfe des Saugers unter dem Stereomikroskop über den Silberleim.
      HINWEIS: Die Flügel können sich innerhalb oder außerhalb der Spitze der modifizierten Pasteurpipette befinden, doch wenn sie innerhalb liegen, wird verhindert, dass die Mücke herausfällt. Vermeiden Sie es, die Flügel zu verbiegen oder zu beschädigen.
    4. Arbeiten Sie schnell, tauchen Sie eine Minutiennadel in den Silberkleber und tragen Sie eine dünne Schicht auf das Pronotum der Mücke auf (d. h. die dorsale Fläche des Thorax). Setzen Sie, falls möglich, unmittelbar mit dem nächsten Schritt fort (oder betäuben Sie die Mücke erneut, falls erforderlich).
      HINWEIS: Es wird empfohlen, die Schuppen am Pronotum durch Hin-und-her-Bewegen des Pinsels zu entfernen, um eine ausreichende Eindringtiefe des Klebers in die Poren der Kutikula sicherzustellen. Vermeiden Sie es, Kleber auf andere Körperteile der Mücke zu bekommen.
    5. Tauchen Sie die Goldöse an der Spitze der Ableitelektrode kurz in den Silberleim und platzieren Sie sie auf dem Silberleimfleck am Pronotum der Mücke. Bewegen Sie die Öse vor und zurück, um sicherzustellen, dass sie bündig am Pronotum anliegt. Halten Sie den Draht fest, bis der Leim getrocknet ist (~20–25 s).
    6. Ersetzen Sie den Insektenstummel im Schaumstoff unter einem Winkel, der es der verkabelten Mücke ermöglicht, bequem zu stehen, wenn sie aufwacht. Fahren Sie mit der Verkabelung der nächsten Mücke fort.
      HINWEIS: Es empfiehlt sich, Notizen zur Qualität jeder Verdrahtungsarbeit zu machen.
    7. Sobald die gewünschte Anzahl von Mücken verdrahtet ist, wird der Schaumstoffblock in eine Aufbewahrungsbox gegeben. Die Mücken werden bis zur Verwendung unter normalen Zuchtbedingungen gehalten.

3. EPG-Setup und Vorbereitung (am Morgen vor der EPG)

  1. Schalten Sie den AC-DC-EPG-Monitor mindestens 30 Minuten vor der Aufnahme ein (durch Umlegen des Schalters an der Stromversorgung), um die Geräteabgleichung und eventuelle Fehlersuche zu ermöglichen.
    ANMERKUNG: Die auf der Steuerbox und der Schaltinterface-Box verwendeten Kanäle können eingeschaltet bleiben.
  2. Schalten Sie den Computer ein und öffnen Sie die Hardware-Verwaltungssoftware.
    ANMERKUNG: Wenn die Signale nicht als flache, dünne Linien erscheinen, ist eine Fehlersuche erforderlich (siehe Diskussionsabschnitt).
  3. Führen Sie den Berührungstest27,30 durch, um die Gerätefunktionalität zu überprüfen:
    1. Bleiben Sie geerdet (d. h., berühren Sie den Faradayschen Käfig mit bloßer Haut), drehen Sie den Regler am Kopfverstärker auf 106 Ω und stecken Sie den Schaft eines Insektenstummels in die Buchse.
      ​ANMERKUNG: Die Durchführung des Berührungstests auf einem höheren Eingangswiderstand (Ri) kann den Kopfverstärker beschädigen.
    2. Bleiben Sie geerdet, schalten Sie den Kopfverstärker ein und greifen Sie dreimal fest den Kupferdraht des Insektenstummels zwischen Zeigefinger und Daumen. Wenn der EPG korrekt funktioniert, erscheinen drei große Peaks sowohl im Vor- als auch im Nachsignal auf dem Bildschirm. Andernfalls ist eine Fehlersuche erforderlich (siehe Diskussionsabschnitt).
  4. Stellen Sie die Geräteeinstellungen auf 150 mV Wechselstrom (AC) mit einem Ri von 107 Ω, einer Hardware-Verstärkung von 20–40x, einem negativen Offset, einer nativen Basislinie und einer Software-Verstärkung von 8–16x27,30 ein, wie unten beschrieben (Schritte 3.4.1–3.4.3).
    1. Stellen Sie Spannung, Stromart, Hardware-Verstärkung (Bereich, Verstärkung und Multiplikator), Offset und Basislinie (Nullpunkt) mithilfe der Schalter und Regler an Kanal 1 der Steuerbox ein.
      ANMERKUNG: Die geeignete Hardware-Verstärkung hängt von der Qualität der Verdrahtung und der Silberleimverbindung ab; daher ist eine Variation der optimalen Verstärkungseinstellungen von Mücke zu Mücke sowie von Tag zu Tag zu erwarten. Die Hardware-Verstärkung muss möglicherweise während der Aufnahme angepasst werden, falls die Signale aussteuern (definiert in Tabelle 2 und dargestellt in Abbildung 3A,C) oder zu schwach sind, um sichtbar zu sein. Alle Änderungen an der Hardware-Verstärkung wirken sich dauerhaft auf die Aufnahme aus (dargestellt in Abbildung 3A,C).
    2. Stellen Sie den Ri-Wert mithilfe des Reglers am Kopfverstärker ein.
    3. Stellen Sie die Software-Verstärkung in der Hardware-Verwaltungssoftware ein und passen Sie sie an (z. B. wählen Sie das Vorsignal oder Nachsignal aus und klicken Sie mit der linken Maustaste, um die Software-Verstärkung zu erhöhen, oder mit der rechten Maustaste, um sie zu verringern).
      ANMERKUNG: Änderungen der Verstärkung in der Software wirken sich NICHT dauerhaft auf die Aufnahme aus.
  5. Richten Sie eine neue Aufnahme in der Hardware-Verwaltungssoftware ein, beginnen Sie jedoch erst mit der Aufnahme im Schritt 4.3 im nächsten Abschnitt.

4. EPG an menschlichen Händen26,27 :

  1. Nach Einholung der informierten Einwilligung (gemäß den Vorgaben der zuständigen IRB der Heiminstitution) lässt man den Probanden neben der Faraday-Käfig sitzen, wobei ein Arm im Käfig ist und er die Substrat-Spannungsprobe hält, die unterhalb des Kopfverstärkers platziert wird.
    ANMERKUNG: Der Arm muss bequem auf einer Luftpolsterfolie oder einem ähnlichen nichtleitenden Untergrund ruhen. Hand und Substrat-Spannungsprobe dürfen während der Aufnahme den Faraday-Käfig oder den Kopfverstärker nicht berühren. Um Schäden zu vermeiden, ist es unbedingt erforderlich, dass der Freiwillige den Kopfverstärker nicht berührt, sobald dieser eingeschaltet ist. Falls der Kopfverstärker versehentlich berührt wird, führt man den oben beschriebenen Berührungstest durch, um seine Funktionsfähigkeit zu überprüfen.
  2. Sobald der Proband in Position ist, dreht man den Kopfverstärker zur Seite. Man nimmt eine verdrahtete Mücke aus der Aufbewahrungsbox und verbindet sie mit dem Gerät, indem man den Messingstift des Insektenstümpfchens in die Buchse am Kopfverstärker einsteckt. Die Mücke hängt dabei lose herunter.
    ANMERKUNG: Eine Sprühflasche mit 70%igem Ethanol sollte griffbereit gehalten werden, um eventuell von der Leitung lösende Mücken zu kontrollieren.
  3. Man startet die Aufnahme mit der Hardware-Verwaltungssoftware. Positioniert man den Kopfverstärker über der Hand, sodass die Mücke bequem stehen und sondieren kann.
  4. Schaltet man den Kopfverstärker ein, während man geerdet ist. Startet man einen 10-Minuten-Timer. Passt man die Handposition des Probanden bei Bedarf an, um den Sondiervorgang zu unterstützen.
    ANMERKUNG: Bei Mücken, die dazu neigen, sofort zu sondieren, sollte der Kopfverstärker eingeschaltet werden, bevor die Mücke auf die Hand positioniert wird. Ein dünner Holzstab oder der Griff eines nichtleitenden Pinsels kann verwendet werden, um den Kupferdraht des Insektenstümpfchens zu biegen und die Position der Mücke weiter anzupassen. Eine Lupe oder ein digitales Mikroskop an einer Schwanenhalshalterung kann helfen, die Mücke während der EPG zu beobachten, insbesondere bei Verhaltenskorrelationsstudien.
  5. Mit der Hardware-Verwaltungssoftware werden zeitgestempelte Beobachtungen (z. B. Ereignismarkierungen) während der Aufnahme bezüglich Reaktionen des Wirts, Verhalten der Mücke, Verstärkungsänderungen usw. durchgeführt. Die Position der Signale auf dem Bildschirm und die Software-Verstärkung werden bei Bedarf angepasst, um beide Signale klar sichtbar auf dem Bildschirm zu halten. Die Hardware-Verstärkung wird angepasst, wenn die Signale überschwingen (Abbildung 3A,C und Tabelle 2) oder wenn die Wellen zu klein erscheinen, wenn die Software-Verstärkung maximal eingestellt ist. Der Offset wird angepasst, wenn eine Gleichrichter-Übersteuerung beobachtet wird (Abbildung 3C,C' und Tabelle 2). Detaillierte Anweisungen zur Durchführung dieser Einstellungen finden sich im Software-Handbuch31 und in Online-Ressourcen30.
    1. Zur Anpassung der Position der Signale auf dem Bildschirm wählt man das pre- oder post-Signal aus (z. B. durch Klicken auf
      1 = 1       oder 2 = 3) und zieht das Signal an die gewünschte Position auf dem Bildschirm (idealerweise nahe der Mitte, aber ohne Überlappung).
    2. Zur Anpassung der Software-Verstärkung verwendet man die in Schritt 3.4.3 beschriebene Hardware-Verwaltungssoftware.
    3. Zur Anpassung der Hardware-Verstärkung beginnt man damit, den Verstärkungsregler für Kanal 1 nach rechts oder links zu drehen, um die Verstärkung zu erhöhen bzw. zu verringern. Falls diese Einstellung nicht ausreicht, um das Überschwingen zu beseitigen (Verstärkung zu hoch; Abbildung 3A,C) oder um die Signaldetails klar darzustellen (Verstärkung zu niedrig), schaltet man die Reichweiten- und Multiplikator-Schalter für Kanal 1, um die Verstärkung weiter anzupassen.
      ANMERKUNG: Es wird empfohlen, Ereignismarkierungen zu verwenden, um festzuhalten, wann die Hardware-Verstärkung angepasst wurde, um die Interpretation der Wellenformdaten zu erleichtern.
    4. Zur Anpassung des Offsets schaltet man den Offset-Schalter für Kanal 1 am Steuerpult auf neg, dann dreht man den Offset-Regler für Kanal 1, bis die Peaks in den pre- und post-Signalen in dieselbe Richtung auf dem Computerbildschirm verlaufen. Falls der Offset-Regler zu weit gedreht wird, kehrt sich das post-Signal erneut um.
  6. Falls die Mücke innerhalb von 10 Minuten (oder einem anderen definierten Zeitpunkt) nicht sondiert, schaltet man den Kopfverstärker aus. Falls die Mücke zum Zeitpunkt des Zeitpunkts gerade sondiert, lässt man sie den Sondiervorgang abschließen, bevor der Kopfverstärker ausgeschaltet wird. Der Proband zieht vorsichtig die Hand zurück, dann entfernt man die Mücke zusammen mit dem angebrachten Insektenstümpfchen. Man stellt die Mücke zurück in die Aufbewahrungsbox.
  7. Man beendet/schließt die Aufnahme mit der Hardware-Verwaltungssoftware. Man fährt mit der EPG an der nächsten Mücke fort (Schritt 4.2).
    ANMERKUNG: Denkt daran, nach jeder Mücke den Dateinamen zu ändern.
  8. Am Ende der Sitzung schaltet man den Kopfverstärker und die Stromquelle aus und schließt die Software.
  9. Man bespricht die Erklärung zur Teilnehmer-Debriefing oder eine ähnliche Erklärung mit dem Freiwilligen gemäß den Vorgaben der genehmigten IRB.
  10. Man entsorgt die Mücken gemäß den Protokollvorgaben. Man entfernt die Plastikfolie vom Schaumstoffblock und entsorgt sie ordnungsgemäß.
  11. Nach Abschluss der gesamten Datenerfassung überprüft, misst und analysiert man die Wellenformen und die Daten wie zuvor beschrieben24,25,26,27,29,30. Online-Ressourcen30 enthalten Schritt-für-Schritt-Anleitungen zur Nutzung der Wellenform-Auswertungssoftware, zur Erstellung von Abbildungen der Wellenformen, zur Messung der Wellenformen, zum Export der Daten zur Analyse, zur Durchführung der statistischen Analyse sowie eine detaillierte Erklärung gängiger Wellenform-Reaktionsvariablen.

Elektrophysiologisches Daten-Diagramm, das transiente Änderungen der Signalamplitude über die Zeit veranschaulicht.
Abbildung 3: Beispiele suboptimaler Aufnahmen aufgrund von Übersteuerung, Verstärkungsänderungen am Steuerpult, unklaren Spannungsänderungen durch minderwertige Verkabelung, Gleichrichter-Übersteuerung und Rauschen. Wellenformen von Culex tarsalis-Mücken, die sich an menschlichen Händen satt gefressen haben, verzerrt durch (A) Übersteuerung (blaue horizontale Pfeil) und anschließende Verstärkungsänderungen am Steuerpult von 100x auf 80x auf 40x auf 60x auf 40x auf 20x (orangefarbene vertikale Pfeile), (B) unklare Spannungsänderungen sowie (C) Gleichrichter-Übersteuerung im Post- (schwarzes) Signal im Vergleich zum Pre- (rotes) Signal (siehe Wellenform J, Vergrößerung in Panel C'), Netzrauschen (11-Hz-Sinuswelle, nur im Pre-Gleichrichtung (rotes) Signal sichtbar, Vergrößerung in Panel C'), Übersteuerung (blaue horizontale Pfeil) und eine Verstärkungsänderung am Steuerpult von 500x auf 200x (orangefarbener vertikaler Pfeil). Die Namen der Wellenformen sind oben an jedem Panel angegeben. Die violetten Pfeile in der unteren rechten Ecke von Panel C zeigen an, wann der Kopfverstärker nach Abschluss der Messung ausgeschaltet wurde, und liefern ein weiteres Beispiel für Gleichrichter-Übersteuerung. Rote horizontale Linien, die dem Pre-Gleichrichtungssignal in Panel C zugeordnet sind, zeigen an, wann Ereignismarkierungen zur Aufzeichnung zeitgestempelter Notizen verwendet wurden. Ri-Werte, angelegte Signale, Zeitmaßstäbe und Softwareverstärkungen betragen (A) 107 Ω, 150 mV DC, 13,2 s/div, 8x; (B) 107 Ω, 150 mV DC, 4,4 s/div, 128x; und (C) 107 Ω, 150 mV AC, 7,4 s/div, 2x; (C') 0,2 s/div, 8x. Abkürzungen: AC = Wechselstrom, DC = Gleichstrom, Ri = Eingangswiderstand, mV = Millivolt, Ω = Ohm, s/div = Sekunden pro Division. Diese Abbildung wurde mit Daten aus Cooper et al.27 erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergebnisse

AC-DC-EPG-Aufnahmen der Blutmahlzeiten von Cx. tarsalis-Mücken an menschlichen Händen (Abbildung 4) ergaben interpretierbare Signalkurven, die für die Analyse und Veröffentlichung geeignet waren27. Interpretierbare Signalkurven enthielten deutliche, voneinander unterscheidbare, sich wiederholende Muster, die in Wellenformfamilien (Tabelle 1 und Abbildung 4), Typen und Untertypen klassifiziert werden konnten, nachdem die Kompression (wie in Tabelle 2 definiert) und die Softwareverstärkung in der Software zur Überprüfung der Signalkurven angepasst worden waren27,31. Alle zuvor bei Ae. aegypti-Mücken beschriebenen Wellenformfamilien (J, K, L, M, N) und Typen (L1, L2, M1, M2), die an menschlichen Händen gefüttert wurden26, wurden auch in den von Cx. tarsalis erzeugten Signalkurven identifiziert, wodurch die Gültigkeit der hier beschriebenen Methoden bestätigt wurde. Zusätzlich wurden drei neue Wellenformtypen (M3, N1, N2) sowie zahlreiche Untertypen von L1, L2, M1 und M2 identifiziert27. Außerdem wurde der Spannungsabfall auf den Ausgangswert, wenn die Mundwerkzeuge vom Wirt zurückgezogen werden, als Wellenformfamilie W bezeichnet27.

Die systematische Variation der Geräteeinstellungen (Stromart und Ri-Stufen) unter Einhaltung der hier beschriebenen Verfahren ermöglichte die Bestimmung der optimalen Einstellungen zur Aufzeichnung des Blutmahlens von Cx. tarsalis an menschlichen Händen, der elektrischen Ursprünge jeder Wellenform, der durchschnittlichen Dauer in Sekunden vollständiger und unvollständiger Probierphasen pro Mücke sowie des statistischen Vergleichs der Wellenformdauer in Sekunden pro Insekt (WDI), der Anzahl der Wellenformereignisse pro Insekt (NWEI) und der Wellenformdauer in Sekunden pro Ereignis und Insekt (WDEI) über die verschiedenen Einstellungen hinweg27. Zudem wurden Mücken während unterschiedlicher Wellenformen unterbrochen und seziert, um festzustellen, welche Wellenform mit der Aufnahme von Blut korreliert27. Eine ähnliche Untersuchung wurde für Ae. aegypti mit vergleichbarer Methodik durchgeführt26.

Aufgrund der empfindlichen und komplexen Natur der EPG-Aufzeichnungen waren nicht alle Aufnahmen so makellos wie die in Abbildung 4 gezeigten. Gelegentlich kam es zu Übersteuerungen (Abbildung 3A,C), Änderungen der Hardware-Verstärkung (Abbildung 3A,C), minderwertigen Verdrahtungen (Abbildung 3B), Falteffekten des Gleichrichters in der Wellenform J (Abbildung 3C,C') und elektrischem Rauschen (Abbildung 3C,C'), wodurch die Wellenformen verzerrt oder überlagert wurden. Dadurch eigneten sie sich weniger für Abbildungen in publizierbarer Qualität, und die Auswertung sowie Analyse wurde erschwert. Daher wird empfohlen, besondere Sorgfalt bereits in der Anfangsphase darauf zu verwenden, die Verdrahtungstechniken zu perfektionieren, die Verstärkungs- und Spannungseinstellungen zu optimieren, den Offset anzupassen und elektrisches Rauschen zu kontrollieren. Interessanterweise trat der Falteffekt des Gleichrichters nur bei der Wellenformfamilie J von Cx. tarsalis auf (Abbildung 3C,C') und trat nach der anfänglichen Offset-Anpassung nicht erneut auf, selbst bei Verwendung anderer Mückenarten (Ae. aegypti und Culex quinquefasciatus) (Daten nicht gezeigt). Darüber hinaus zeigte die Fehlersuche, dass das in Abbildung 3 (Panels C und C') sichtbare unkontrollierte elektrische Rauschen auf eine defekte Faraday-Käfig zurückzuführen war. Die Aufnahmen, die im defekten Faraday-Käfig gemacht wurden, waren dennoch verwendbar, doch die Rauschprobleme wurden behoben, nachdem ein verbesserter Faraday-Käfig gebaut worden war (Abbildung 1B).

Auch wenn alle Vorsichtsmaßnahmen und Optimierungen bereits vorab getroffen wurden, waren gelegentlich geringfügige Unterschiede in der Qualität der Elektrodenanbringung am Mückenkörper sowie andere unbekannte Faktoren dafür verantwortlich, dass das Signal verzerrt wurde und sich das Signal-Rausch-Verhältnis veränderte, sodass während der Aufnahme die Hardware-Verstärkung angepasst werden musste, um sicherzustellen, dass das Signal im sichtbaren Bereich lag und die Auflösung der Peaks in jeder Wellenform ausreichte, um sie identifizieren und charakterisieren zu können. Leider kann die Anpassung der Hardware-Verstärkung während der Aufnahme abrupte Spannungssprünge verursachen (Abbildung 3A, C), wodurch die Wellenformen für die Veröffentlichung ungeeignet werden, aber dennoch (ganz oder teilweise) für Messungen und Analysen verwendet werden können.

Diagramme zum statischen Gleichgewicht mit Kraftanalyse; Graphen zeigen die Gleichungen ΣFx=0, ΣFy=0.
Abbildung 4: Repräsentative Wellenformen einer Culex tarsalis-Probe an einer menschlichen Hand, aufgezeichnet mit einem Ri von 107 Ω und einem angelegten Signal von 250 mV AC. Wellenformnamen auf Familienebene (NP, J, K, L, M, W) sind oben in jedem Panel angegeben. Die unteren Panels zeigen Vergrößerungen ausgewählter Bereiche des Panels A. Eingefügte Panels zeigen Vergrößerungen der angegebenen Bereiche. Zeitmaßstäbe und Verstärkungen der Software betragen (A) 7,0 s/div, 16x; (B) 1,0 s/div, 64x; (B') 0,2 s/div, 64x; (C) 1,0 s/div, 64x; (C') 0,2 s/div, 32x; (D) 1,0 s/div, 64x; (D') 0,2 s/div, 64x. Abkürzungen: AC = Wechselstrom, Ri = Eingangswiderstand, mV = Millivolt, Ω = Ohm, s/div = Sekunden pro Division. Diese Abbildung wurde mit Daten aus Cooper et al.27 erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Diskussion

Bei der Verwendung des AC/DC-EPG ist es entscheidend, ein grundlegendes Verständnis des Hardware- und Softwarebetriebs30 zu haben und die hierin beschriebenen Protokolle sorgfältig zu befolgen, um eine Beschädigung des Geräts zu vermeiden. Vermeiden Sie es vor allem, den Kopfverstärker zu berühren, wenn er eingeschaltet ist, es sei denn, er ist am Faradayschen Käfig geerdet. Es wird empfohlen, so weit wie möglich im Faradayschen Käfig aufzunehmen30. Die Käfigtüren müssen nicht unbedingt geschlossen werden, um interpretierbare Wellenformen zu erhalten, es sei denn, die Aufnahme erfolgt in einer Umgebung mit übermäßigem elektrischem Umgebungsrauschen. Nichts Motorisiertes kann im Faradayschen Käfig sein. Es ist wichtig zu beachten, dass der Faradaysche Käfig selbst ausschließlich über den Kopfverstärker elektrisch geerdet werden muss, damit er ordnungsgemäß funktioniert. Dies wird erreicht, indem der Kopfverstärker an einen Laborständer aus Metall angeschlossen wird, wobei die Farbe an einem Fuß des Ständers abgeschliffen wird, um einen leitenden Weg für die vom Faradayschen Käfig erfasste Elektrizität zu ermöglichen, die zum Laborständer, in das Metallgehäuse des Kopfverstärkers und über das Kabel zum Schaltkasten fließt. durch das Netzteil in eine ordnungsgemäß geerdete Steckdose und durch den Baugrund30 in die Erde. Ein Multimeter kann verwendet werden, um die Qualität der Verbindung zwischen den Komponenten im Inneren des Käfigs zu überprüfen, indem der spezifische Widerstand (der die Umkehrung der Leitfähigkeit ist) zwischen verschiedenen Punkten gemessen wird. Ein drahtloses AM-Radio kann auch im Faradayschen Käfig platziert werden, um zu überprüfen, ob der Schall beim Schließen der Türen deutlich reduziert (oder idealerweise eliminiert) wird, um zu bestätigen, dass der Faradaysche Käfig elektrische Signale in der Luft ausreichend erfasst (E. Backus per. Comm.).

Die richtige und standardisierte Vorbereitung des Silberklebers und die Befestigung der Aufzeichnungselektroden an Insekten sind entscheidend, um brauchbare Aufzeichnungen zu erhalten. Die Kutikula eines Insekts ist ein Isolator und wirkt als Kondensator, wenn der Silberkleber nicht ausreichend in die Poren der Nagelhaut eindringt, um einen Weg zu schaffen, auf dem Elektrizität vom Inneren des Insekts zum Golddraht auf der Oberfläche des Pronotums30 gelangt. Bereiten Sie den Silberkleber vor jeder EPG-Sitzung gleichzeitig vor, arbeiten Sie mit frischem Silberkleber aus der Röhre und ersetzen Sie ihn während des Verdrahtungsvorgangs häufig durch kräftig verwirbelten Silberkleber. Stellen Sie sicher, dass die goldene Schlaufe am Brustkorb anliegt, so dass die gesamte Schlaufe in Kontakt mit der Nagelhaut ist und nicht zur Seite gekippt oder durch eine dicke Schicht Silberkleber und Schuppen getrennt ist, um eine starke elektrische Verbindung herzustellen und ein Ablösen und Entweichen der Mücke vom Draht zu verhindern.

Die hier beschriebenen Protokolle müssen bei der Arbeit mit verschiedenen Mückenarten optimiert werden. Die optimalen EPG-Einstellungen (Ri-Pegel, Spannung, Stromtyp und Hardware-Verstärkung) für die Aufzeichnung auf einem bestimmten Arthropoden müssen experimentell bestimmt werden12,30. Sobald der Versatz jedoch angepasst ist, muss er nicht mehr nachjustiert werden, wenn mit ähnlichen Mücken gearbeitet wird. Optimale Einstellungen wurden für AC-DC EPG mit Ae. aegypti26 und Cx. tarsalis27 ermittelt. Wellenformbibliotheken (definiert in Tabelle 2) für zusätzliche Spezies werden die Einführung von EPG für Stechmücken erleichtern. Es ist auch notwendig, die Anästhesie für die interessierende Mücke zu optimieren, da das Blutsaugverhalten je nach Mückenart und Anästhesiewahl unterschiedlich beeinflusst werden kann. Zum Beispiel benötigen Cx. tarsalis eine Erholungsphase von 4 Stunden nach 15 Minuten Anästhesie mit CO2, während für Ae. aegypti eine Erholungsphase von 15 Minuten nach einer 15-minütigen Anästhesie mit Eis ausreichend ist. Culex tarsalis sind jedoch bei Kälteeinwirkung nur schwer zu besiegen, so dass trotz der langen Erholungsphase überwiegend CO2 verwendet wird.

Obwohl der AC-DC EPG-Monitor nach der Durchsicht von Online-Ressourcen30,31 oder einer Schulung mit einem erfahrenen Benutzer einfach zu bedienen ist, ist eine gewisse Fehlerbehebung erforderlich. Anfänglich wiesen die EPG-Aufzeichnungen des Autors von Mückensonden eine unerwartete 11-Hz-Zeichenwelle im Vorsignal auf, die von Wayadande und Kollegen nicht beobachtet oder berichtet worden war26. Rücksprache mit E. Backus deutete darauf hin, dass der Faradaysche Käfig wahrscheinlich das Problem war, da es störende Erdschleifen gab. Ein neuer Faradayscher Käfig, der aus einem hochleitfähigen Kupferschirm bestand, der mit einem Aluminiumrahmen verbunden war, der mit einer großen Aluminiumbodenplatte verschraubt war, die von Gummifüßen getragen wurde, um ihn von der untenstehenden Tabelle zu isolieren (Abbildung 1B), löste das 11-Hz-Rauschsignal (Abbildung 3C, C'). Darüber hinaus erschienen gelegentlich beim ersten Einschalten des EPG-Netzteils die Vor- und Nachgleichrichtersignale als dicke, unscharfe Linien anstelle von geraden, glatten, dünnen Linien. Dies wurde in der Regel behoben, indem das Instrument ausgeschaltet und alle Kabelverbindungen überprüft wurden. Wenn dies fehlschlug, half es normalerweise, das Instrument für 1-3 Minuten vom Stromnetz zu trennen. Sehr selten werden die Vor- und Nachsignale während des Betriebs dick und unscharf, was dadurch behoben wurde, dass das Instrument ausgeschaltet und an eine andere Steckdose angeschlossen wurde oder ein Spannungsregler und ein Power Conditioner verwendet wurden, um das EPG anzuschließen, bevor es an die Steckdose angeschlossen wurde. Im Idealfall würde eine dedizierte Leitung für den EPG-Monitor das Leitungsrauschen von Kühlschränken und anderen Geräten eliminieren, die an denselben Stromkreis wie der EPG30 angeschlossen sind.

Derzeit gibt es zwei Haupteinschränkungen bei der Verwendung von EPG zur Untersuchung von Mücken. Erstens wurden nur wenige Korrelationsstudien durchgeführt, um zu überprüfen, welches Sondierungsverhalten den Wellenformen entspricht. Es gibt zwar starke Hypothesen darüber, was während jeder Wellenformfamilie (Tabelle 1) und einiger der Wellenformtypen (M1 und M2) passiert, aber nur wenige dieser Hypothesen wurden experimentell bestätigt, mit der Ausnahme, dass die Blutaufnahme mit der Wellenformfamilie Mkorreliert ist 26,27. Am wichtigsten ist, dass Wellenformen identifiziert werden müssen, die dem Speichelfluss entsprechen, da viele Krankheitserreger im Speichel übertragen werden. Die Korrelation von EPG-Wellenformen mit biologischen Aktivitäten in Mücken ist erforderlich, um signifikante Unterschiede in der Wellenformdauer und -anzahl zwischen den Behandlungsgruppen sinnvoll interpretieren zu können. Zweitens können die Sondierungs- und Erfassungsraten während des EPG viel niedriger sein als erwartet27. Das individuelle Anbinden von Mücken an kurze Drähte und das direkte Platzieren auf dem Wirt könnte die Wirtssuche über große Entfernungen und das soziale Fressverhalten verhindern, was sich auf das Sondierungs- und Verschluckungsverhalten auswirken kann. Richtig verdrahtete Insekten können normal laufen und fliegen. Dennoch ziehen Mücken oft an den Drähten und verheddern sich manchmal oder halten sich in unnatürlichen Winkeln, was darauf hindeutet, dass die Verdrahtung ihr Verhalten bis zu einem gewissen Grad beeinflusst. Die Autoren testeten viele Strategien, um die Sondierungsraten während des EPG zu erhöhen, und das Fasten der Mücken über Nacht, die Verwendung älterer Personen, die Exposition gegenüber menschlichem Atem unmittelbar vor dem Aufsetzen auf die Hand und das Auftragen von menschlichem Speichel auf die Hand waren am effektivsten, sowie die Verwendung von Wirten, die ständig feine Anpassungen an der Position ihrer Hand vornahmen, um sicherzustellen, dass sich die Mücke in der idealen Position zum Sondieren befand27.

Trotz dieser Einschränkungen hat AC-DC EPG zahlreiche Vorteile gegenüber anderen Ansätzen zur Untersuchung des Sondierungs- und Verschluckungsverhaltens. Systeme wie das BiteOScope11, das flyPAD15 und die Automated Biomaterial Platform14, die zur Quantifizierung des Sondierungs- und Verschluckungsverhaltens und der Speichelsekretion während der Blutfütterung entwickelt wurden, verwenden transparente künstliche Substrate und flüssige Diäten, denen normale Wirtsgewebssysteme und Wirtshinweise fehlen. Während diese synthetischen Plattformen für viele experimentelle Zwecke nützlich sind, ist ein klarer Vorteil von AC-DC EPG die Möglichkeit, diese Verhaltensweisen und Variablen von Interesse innerhalb natürlicher Wirtssysteme zu untersuchen. Ferner bietet die benutzerdefinierte Anpassungsfähigkeit des AC-DC-EPG-Systems einen zusätzlichen Vorteil gegenüber anderen EPG-Instrumenten22, 33 und EPG-ähnlichen elektronischen Überwachungsgeräten16, 21, die keine einstellbaren Ri-Pegel, Stromarten und Spannungspegel aufweisen, die erforderlich sind, um Wellenformen mit der maximalen Informationsmenge zu erhalten und nachteilige Auswirkungen auf ein breites Spektrum der Wirte und Arthropoden zu minimieren22. 23. Urheberrecht Elektromyographie-Techniken (EMG) werden auch verwendet, um die Bluternährung zu untersuchen. Der elektrische Schaltkreis umfasst jedoch in der Regel nur den Gliederfüßer und es werden nur Muskelpotentiale aufgezeichnet, die der Aufzeichnungselektrode am nächsten liegen, so dass die Wellenformen keine Informationen über detaillierte Aktivitäten an der Wirt-Insekten-Grenzfläche liefern, wie z. B. Zellrupturen, Stilettpositionen und -aktivitäten sowie Strömungspotentiale durch die Mundwerkzeuge28,34. Intravitalmikroskopische Techniken können verwendet werden, um detaillierte Mundwerkzeugbewegungen und -aktivitäten in lebenden Wirtsgeweben direkt sichtbar zu machen, aber diese Techniken beinhalten invasive Verfahren an lebenden Tiermodellen9. Nur der AC-DC EPG-Monitor kann in Echtzeit sehr detaillierte Informationen über Sondierungs-, Verschluckungs- und Speichelverhalten liefern, die in lebenden undurchsichtigen Wirtsgeweben auftreten, ohne dass invasive Verfahren erforderlich sind, und ist für den Einsatz bei einer Vielzahl von Arthropoden anpassbar10,12.

Dies ist die erste detaillierte Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Verkabelung von Mücken, den Bau eines Insektensaugers und die Durchführung von EPG an menschlichen Wirten. Es wird erwartet, dass diese Protokolle die Einführung von AC-DC EPG bei Stechmücken erleichtern werden, die sich von menschlichen Wirten ernähren. Beispiele für zukünftige Forschungsbemühungen unter Verwendung von AC-DC EPG könnten Studien zu grundlegenden Mechanismen der Bluternährung und der Schädigung des Wirtsgewebes10 umfassen, einschließlich der Identifizierung stereotyper Sequenzen von Sondierungsverhaltensweisen vor der Blutaufnahme, der Untersuchung des Blutflusses durch Mundwerkzeuge und des Vergleichs der Plastizität der Nahrungsaufnahme innerhalb und zwischen Arthropodenarten/Entwicklungsstadien26. EPG kann auch verwendet werden, um die Wirkung von Insektiziden, Antifeedants und Repellentien zu quantifizieren12. Die hier vorgestellten Verfahren zur Verwendung von AC-DC EPG zur Untersuchung von Stechmücken an menschlichen Händen werden diese Studien beschleunigen und neue Einblicke in die Biologie der Blutfresser von Mücken ermöglichen.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen. Die Erwähnung von Handelsnamen oder kommerziellen Produkten in dieser Veröffentlichung dient ausschließlich dem Zweck, spezifische Informationen bereitzustellen, und impliziert keine Empfehlung oder Billigung durch das US-Landwirtschaftsministerium. Die Schlussfolgerungen in diesem Bericht sind die der Autoren und geben nicht unbedingt die Ansichten des USDA wieder.

Danksagungen

Wir danken Prof. Astri Wayadande von der Oklahoma State University für ihre Pionierarbeit beim Verdrahtungsverfahren für Mücken, und Dr. Elaine Backus von der USDA-ARS in Parlier, CA, und Mr. Andrew Dowell von EPG Technologies Inc. in Gainesville, FL, für ihre Unterstützung bei der Fehlerbehebung der EPG-Geräte. Wir danken auch Dr. Dustin Swanson und Mr. William Yarnell vom USDA-ARS Insectary in Manhattan, KS, für die Bereitstellung von Moskitos, und Miss Miriam Ruhinda von der Kansas State University in Manhattan, KS für ihre Unterstützung beim Filmen der Verfahrensvideos. Diese Arbeit wurde durch den Zugang zum Integrated Molecular Entomology Core (IEMC) an der Kansas State University ermöglicht. Diese Forschung wurde durch das USDA Research, Education, and Economics Workforce Development Agreement (#58-3022-0-002) und das Hatch Multistate Project (NE1943) unterstützt. Dieses Manuskript ist Beitrag Nr. 24-194-J von der Kansas Agricultural Experiment Station, Kansas State University, Manhattan, KS, USA.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Instrumentierung
AC-DC 4-Kanal-ElektropenetrographEPG Technologies, Inc.Enthält für EPG das Netzteil, die Steuerbox, die Schaltschnittstellenbox, vier Kopfstufenverstärker, vier Substratspannungsson
Kabel Luftkissendenen der menschliche Host während des EPG seine Hand/seinen Arm ablegen
DI-710 Datenerfassungshardware (AD-Platine)DATAQ Instruments Inc.zur Digitalisierung der analogen EPG-Signale, damit sie auf einem Computer visualisiert werden können
Dimmbare LED-Lupenlampe, große 5-fache Freisprechlupe mit Licht und Ständer zum Lesen Hobbys Basteln NähwerkbankAmazon.comzur Verhaltensbeobachtung während des EPG; nur während des EPGs unplugged verwenden, da sonst Geräusche auftreten können
Dino-Lite Edge Digitalmikroskop (250-fache Vergrößerung)Dino-LiteAF4915ZTzur Verhaltensbeobachtung während des EPGs
Dino-Lite Flex-ArmDesktop-Stativ Dino-LiteMS22Bzum Halten und Manipulieren der Kamera
Eisco Steel Retort Base Stand und Rod SetFisherScientific S41740zum Halten des Kopftischverstärkers & Erdung des Faradayschen Käfigs (muss aus Metall sein)
EPG Online WorkshopUF IFAS Erweiterunghttps://ifas-crec-entomology.catalog.instructure.com/courses/epg-workshop-2022AKA, "Online-Ressourcen" zum Erlernen von EPG (Geräteeinrichtung, Datenerfassung und -analyse, Faradaysche Konstruktion, Silberleimvorbereitung, Konstruktion von Insektenstummeln usw.)
Furman P-1800 AR Power Regulator/Power ConditionerAmazon.comzur Reduzierung von Leitungsrauschen
Small Bubble Cushioning WrapAmazon.comzur Verwendung als Barriere zwischen dem Host und dem Faradayschen
Käfig Troemner Talboys Labjaws Regular Clamp HolderFisher Scientific02-217-121zum Halten des Kopfstufenverstärkers & zur Erdung des Faradayschen Käfigs (muss aus Metall bestehen und darf nicht mit Kunststoff überzogen sein)
Windows ComputerBest Buyfür EPG & statistische
AnalysenSoftware
Backus 2.0 Data Analysis SAS Programm UF IFAS Extensionhttps://crec.ifas.ufl.edu/extension/epg/data-analysis/für die statistische Analyse von Signaldaten
Ebert 1.0 File Manipulator and Error Checker SAS ProgrammeUF IFAS Extensionhttps://crec.ifas.ufl.edu/extension/epg/data-analysis/für die Vorbereitung von Dateien für die statistische Analyse von Signaldaten
SAS Version 9.4SAS Institute Inc.für die statistische Analyse von Signaldaten
WinDaq Lite DATAQ Instruments Inc.zum Aufzeichnen und Überprüfen von EPG-Daten. Enthält die WinDaq Hardware Manager Software (AKA, "Hardware Management Software") und die WinDaq Waveform Browser Software (AKA, "Waveform Reviewing Software"). Nur für die Verwendung auf Windows-Computern. 
Faraday Cage
Aluminium-SiebrahmenHome DepotMSCF5167für die Wände des Faradayschen Käfigs
Aluminiumblech, 0,125 (1/8) dick 3003-H14Metals DepotS318für die Basis der Faradayschen
Käfig-Eckstreben, 1"  Home Depot339547für die Wände des Faradayschen Käfigs
Flachkopf-Kreuzschlitzschrauben, #6-32 x 1"Home Depot459999für den Bau von Faradayschen
Unterlegscheiben, #6 Home Depot638977für den Bau von Faradayschen Käfigen
Das Digitalmultimeter Fluke 15B+ für elektrische Anwendungen misst AC/DC-Spannungs- und -Strommessungen bis zu 1000 V und 10 A sowie Widerstands-, Durchgangs-, Dioden- und KapazitätsfunktionenAmazon.comfür die Prüfung des Faradayschen Käfigs
Tragbares Radio AM FM, Goodes Transistorradio mit Lautsprecher, Kopfhöreranschluss, batteriebetriebenes 2AA-Radio für den Empfang über große Entfernungen, Taschenradio für den Innen-, Außen- und NotfallgebrauchAmazon.comzum Testen des Faraday-Käfigs
Reiner Kupferschirm, 16 x 16 Mesh mit 0,11 Drahtdurchmesser, 36" x 12'MetroScreenworksfür die Wände des Faradayschen Käfigs
Rundkopf-Combo-Maschinenschrauben, #6-32 x 3/4"Home Depot528466für Faradayscher Käfigbau
Schleifpapier, 1/2" x 1", 150 KörnungHome Depot19036-20-CCzum Entfernen der Farbe von der Unterseite des Laborständers
Siebrahmenecken, 5/16"  Home DepotWCORN516für die Wände des Faradayschen Käfigs
Siebverzahnung, 0,14"Home Depot3034719für die Wände des Faradayschen Käfigs
Insektenstummel
Messing RosettenDepot801294für die Herstellung von Insektenstummeln   
Kupferdraht, 20 AWGAmazon.comfür die Konstruktion von Insektenstümpfen   
Harris wasserlösliche Grippe Home Depot355398zum Löten, Beschichten des Insektenstichs und zum Herstellen einer starken Verbindung
SpitzzangeHome Depotzum Biegen von Draht beim Bau von Insektenstummeln
Pro's Kit 900-015 Helping Hands LöthilfeAmazon.comzum Halten von Rosettenstiften während des Lötens
Lötzinn (mit Kolophoniumkern)Home Depot296497zum Konstruieren von Insektenstümpfen   
Drahtschneider AbisolierwerkzeugHome Depotzum Abisolieren und Schneiden von Kupferdraht beim Bau von Insektenstummeln
YIHUA 928D-III Lötkolben, 110W High Power, volldigitaler Display-LötkolbenAmazon.comzum Konstruieren von Insektenstummeln; kommt mit einem Ständer, Schwamm und Stahlwolle zum Reinigen
Insektensauger
Accuris ASPIRE LaborsaugerAccuris instrumentsV0020für die Absaugung des Insektensaugers; enthält den tragbaren Vakuumregler, den Edelstahladapter mit feiner Spitze (40 mm) und den Pipettenspitzenadapter
Chemglass Life Sciences Pasteur-Pipetten, 5 3/4" langeFisherScientific NC0230004für den Einsatz als Insektensauger bei der Verkabelung von Mücken
Kommerzielles elektrisches farbiges Vinyl-IsolierbandHome Depotzum Befestigen der modifizierten Pasteur-Pipette an der Vakuumleitung
Moskitonetz-Gebrauchsgewebe, 10 x 10 cm quadratischJoann Fabrics16651622um zu verhindern, dass Mücken in die Vakuumpumpe abgesaugt werden
Saint Gobain Performance Plastics Tube Tygon 1/4 x 7/16Fisher Scientific50-206-8914für den schnellen und einfachen Wechsel zwischen verschiedenen modifizierten Pasteurpipetten
Thermo Scientific Nalgene HDPE-Schnellkupplungen (3/8 bis 7/16 Zoll) Ausweis)Fisher Scientific15-315Bfür den schnellen und einfachen Wechsel zwischen verschiedenen modifizierten Pasteur-Pipetten
Silver Glue 
Elmer's Glue-All Multi Purpose White GlueAmazon.comfür die Vorbereitung von Silberleim
Silver Flake 99,9% rein,   4-8 & micro; mThermoFisher786.09für die Silberleimvorbereitung
Silberflocken 99,95% rein, 8-10 & Mikro; mInframat Advanced Materials47MR-12Ffür die Herstellung von Silberkleber
Insektenanästhesie
CO2 Bubbler Kit, 1000 mL, #9 GummistopfenFlyStuff59-181zur Verhinderung von Insektenaustrocknung bei der Verwendung des Flypad
Flypad  Rahmen, StandardgrößeFlyStuff59-118verhindert das Herunterfallen von Mücken Flystation
BrushFlyStuff59-205zur Reduzierung der statischen Aufladung bei Arbeiten auf einem
Flypad Flystuff  Flypad  FlyStuff59-114AKA "Anästhesiekissen" zur Betäubung von Mücken
Trichter (4 Zoll Durchmesser)Amazon.comzum Begasen von Mückenbechern vor dem Transfer auf das Flypad
Plexiglas oder ein flacher Kunststoffdeckel (zugeschnitten)Home DepotMC-27zum Abdecken des Flypads, wenn die Mücken aufzuwachen beginnen
Absperrbare Schlauchschellen für Kunststoffschläuche Einzelne Position und einstellbare Öffnung (Sorte 1/8" bis 1/2")Amazon.comzum Umleiten von Gas zwischen Flypad und Trichter
Einstufiger CO2ReglerFlyStuff59-142zur Regulierung des Gasflusses aus dem CO2Tank
" T” Passend für 1/8" ID SchlauchFlyStuff59-123zum Anschluss des Flypads und des Trichters an den CO2 Tank
Schlauch, durchsichtig FlyStuff59-124Czum Verbinden des Trichters und des Flypads mit dem Atemregler am CO2 Tank
Insect Wiring
Black Cardstock, (65Lb, 176 g/m2) 8,5" x 11"Michael's Stores Inc.327826, um Golddraht leichter sichtbar zu machen
Schwarzes Bastelpapier Quadrat 3,5" x 4,0"Heftklammern956221, um Golddraht leichter sichtbar zu machen
WattebäuscheAmazon.comzum Fasten Mücken
Bastelschaum #12 Block (3,1 cm x 17,2 cm x 30,2 cm)Joann Fabric and Craft Store1941079zum Halten von drahtgebundenen Mücken
Deflecto Ribbon Spender, durchsichtigeAmazon.comzur Aufbewahrung von Golddraht
Federleichte Entomologie-PinzetteFisher ScientificS72110zur Insektenmanipulation
Feine Pinzette (FST by Dumont: #5 91150-20, Inox-Electronic)Fine Science Tools91150-20zur Herstellung einer Goldschlaufe beim Verdrahten von Mücken
Feine Spitze PinselAmazon.comzur Manipulation von Mücken während der Verkabelung und des EPG; Muss bei Verwendung für EPG einen Kunststoff- oder Holzgriff haben
Standard-Transferpipetten mit feiner Spitze, schmal, 5,8 mLThomas Scientific7761D21für die Herstellung von Silberleim
Golddraht, 99,99 % rein, 0,025 mm DickeGoodfellowAU005121für die Verkabelung von Mücken
Minutien Pins, Spitze 0,2 mm, 1 cmFisher ScientificNC9681411zum Auftragen von Klebstoff auf die Mücken
Pappbecher Starre Papierröhrefür nüchternde Mücken     
SchraubstockFisher Scientific50-996-811zum Halten des winzigen Stifts während der Insektenverkabelung
Aufbewahrungsbox aus Kunststoff mit Deckel (7 Zoll x 9 Zoll x 14 Zoll)Amazon.comzum Transport von kabelgebundenen Mücken
Plexiglas oder ein flacher Kunststoffdeckel (auf Maß zugeschnitten)Home DepotMC-27zum Abdecken des Fliegenpolsters, wenn die Mücken aufzuwachen beginnen
Selbstschließende PinzetteFisher Scientific08-906zum Halten und Manipulieren von Golddraht
Compressed Gas
CO2 GastankMatheson Gaszur Betäubung von Mücken mit einem Flypad
Common Lab Items
Biohazard Einweg-Autoklavenbeutel, 8 1/2" x 11"Fisher Scientific03-410-591zur Entsorgung von blutgefütterten Mücken
Bunsenbrenner oder PropanbrennerAmazon.comzur Modifikation von Pasteur-Pipetten
Farbiges LaborbandDaigger SuppliesEF9763Rzum Etikettieren, Vorbereiten von Silberkleber und Abdeckzange
Einweg-Pipettenspitzen, 1000 & Mikro; LFisher Wissenschaftlich zum Aliquotieren von Wasser bei der Herstellung von Silberkleber
SeziermikroskopLeica Microsystemsfür die Verkabelung von Mücken
PräpariersondeFisher ScientificNC9109673zum Rühren und Auftragen von Silberkleber
Erlenmeyerkolben, 1000 mLFisher Scientific zur Verhinderung der Austrocknung von Insekten bei der Verwendung des Flypads
Ethanol, 70% Fisher Scientific04-355-122zur Bergung entflohener Mücken
Petrischalen aus GlasFisher Scientific08-747Bzur Betäubung von Mücken mit Eis
Handschuhe FisherScientificfür den persönlichen Schutz
Kimwipes KimTech Science Marke Wischtücher für empfindliche AufgabenFisher Scientific06-666zum Zerkleinern von Mücken
LaborkittelFisher Scientificfür den persönlichen Schutz
LiBa-Sprühflaschen, wiederbefüllbare leere Sprühflaschen (waschalkoholsicher)Amazon.comzum Bergen entflohener Mücken
Magnetrührstab, 2 cm langFisher Scientificzum Mischen von Silberkleber
Mechanische Einkanalpipette, 1000 & micro; LFisher Wissenschaftlich 13-690-032zum Aliquotieren von Wasser bei der Herstellung von
Mikrozentrifugenröhrchen mit Silberkleber, 1,5 mLFisher Scientific 780420zur Aufbewahrung von Silberkleber
Parafilm M Fisher Scientific50-998-944zum Abdichten von Tuben aus Silberkleber
PlastikfolieAmazon.comzum Abdecken des Schaumstoffblocks
Pyrex 20 mL BecherglasFisher Scientific 07-250-051zum Vermischen von Silberkleber
Semi-MicroBalance Fisher Scientific 10-919-370zum Wiegen von Kleber und Silberflocken
Sharpie-Stift, feine SpitzeAmazon.comzum Beschriften
Einschneidige RasierklingeElektronenmikroskopie Sciences71980zum Reinigen von Insektenstummeln
Standard Einweg-TransferpipettenFisher Scientific133-711-7mLzum Umfüllen von Silberkleber in ein Vorratsrohr 
RührplatteFisher Scientific zum Mischen von Silberkleber
Timer/StoppuhrFisher Scientificfür die Zeitmessung, wie lange der Wirt jedem Insekt ausgesetzt ist
Ultrareines (18 MΩ) WasserFisher Scientific zur Vorbereitung von Silberleim
GebrauchsschereFisher Scientific08-945zum Schneiden von Golddraht
Vortex-MischerFisher Scientificzum Mischen von Silberkleber
Study Organisms
Culex tarsalis MückenUSDA ARS Center for Grain and Animal Health Research in Manhattan, KSzur Verwendung als Studienteilnehmer
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Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Fressverhalten von MückenSondierverhaltenIngestionsverhaltenBlutmahlzeitAufzeichnung elektrischer SignalePathogenübertragungGolddrahtelektrodeInteraktion mit menschlichen Wirten
AC-DC Elektropenetrographie zur Untersuchung des Sondierungs- und Verschluckungsverhaltens von Culex tarsalis Mücken an menschlichen Händen
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