AC-DC Elektropenetrographie zur Untersuchung des Sondierungs- und Verschluckungsverhaltens von Culex tarsalis Mücken an menschlichen Händen

Anastasia M. W. Cooper; Kaitlin Pfeiffer; Kathryn Reif; Kristopher Silver; Dana Mitzel

doi:10.3791/66877

Methodenartikel

AC-DC Elektropenetrographie zur Untersuchung des Sondierungs- und Verschluckungsverhaltens von Culex tarsalis Mücken an menschlichen Händen

DOI:

10.3791/66877

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29. November 2024

Anastasia M. W. Cooper¹^,² , Kaitlin Pfeiffer¹ , Kathryn Reif² , Kristopher Silver¹ , Dana Mitzel³

¹Department of Entomology, Kansas State University, ²Department of Pathobiology, Auburn University, ³National Bio and Agro-Defense Facility, USDA Agricultural Research Service

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Es werden Verfahren zur Untersuchung des Sondierungs- und Verschluckungsverhaltens von Culex tarsalis-Mücken an menschlichen Händen mittels AC-DC-Elektropenetrographie beschrieben.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mücken übertragen Krankheitserreger, die sich negativ auf die Gesundheit von Mensch und Tier auswirken. Ein besseres Verständnis ihrer Biologie bei der Blutaufnahme und ihrer Wechselwirkungen mit Wirten und Krankheitserregern könnte genutzt werden, um neue Angriffspunkte für die Kontrolle von durch Stechmücken übertragenen Krankheiten zu entwickeln. Leider ist das Sondierungsverhalten (d.h. das Stechen) von Mücken nur unzureichend verstanden, da es im Wirtsgewebe stattfindet. Hier wird ein nicht-invasives Verfahren zur Verwendung der AC-DC-Elektropenetrographie (EPG) zur indirekten Visualisierung und Quantifizierung des Fressverhaltens von Mücken beschrieben, indem Änderungen der elektrischen Signale aufgezeichnet werden, die beim Sondieren und Verschlucken an menschlichen Händen erzeugt werden. Dünne Golddrähte werden mit leitfähigem Silberkleber an den Mücken befestigt und mit dem EPG-Instrument verbunden. Der menschliche Wirt hält eine Substratspannungssonde in der Hand. Die Sondierung des Wirts durch die verdrahtete Mücke vervollständigt den Stromkreis, und elektrische Signale werden auf einem Computer als "Wellenformen" aufgezeichnet, die dann gemessen und zur Analyse aufgezählt werden können. Diese Methodik wurde verwendet, um das Sondierungs- und Verschluckungsverhalten von Aedes aegypti- und Culex tarsalis-Mücken zu charakterisieren und kann auf andere Mückenarten angewendet werden. EPG kann verwendet werden, um die Auswirkungen von Krankheitserregern, Insektiziden und anderen Faktoren auf das Fressverhalten von Mücken zu untersuchen.

Einleitung

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Mücken verursachen weltweit Leid und wirtschaftliche Verluste aufgrund ihrer Rolle als Krankheitsüberträger und lästige Schädlinge¹. Anopheles-Mücken übertragen Malaria, die jährlich weltweit schätzungsweise 219 Millionen Fälle, mehr als 400.000 Todesfälle verursacht² und 12 Milliarden US-Dollar an direkten Kosten³. Aedes-Mücken sind die bemerkenswertesten Überträger von Bedeutung für die öffentliche Gesundheit, da sie fast weltweit vorkommen und Erreger von Chikungunya, Dengue-Fieber, lymphatischer Filariose, Rifttalfieber, Gelbfieber und Zika übertragen, die Menschenleben fordern, die Gesundheitssysteme überfordern und zu chronischem Leiden, lebenslanger Morbidität und Behinderung führen⁴^,⁵. Darüber hinaus übertragen Culex-Mücken Erreger der Pferdeenzephalitis, der Japanischen Enzephalitis, der lymphatischen Filariose, der St.-Louis-Enzephalitis und des West-Nil-Fiebers, die sich sowohl auf die Gesundheit von Mensch als auch Tier auswirken³^,⁴.

Die Vektorkontrolle mit insektizidbasierten Ansätzen ist die weltweit führende Methode zur Kontrolle vektorübertragener Krankheiten⁶^,⁷. Die Anzahl der Insektizide, die zur Mückenbekämpfung zur Verfügung stehen, ist jedoch begrenzt. Darüber hinaus entwickelt sich die Insektizidresistenz bei vielen Arten, insbesondere bei Aedes-Mücken, was sich auf unsere Fähigkeit auswirkt, durch Vektoren übertragene Krankheiten zu bekämpfen, und den Bedarf an neuen Bekämpfungsstrategien erhöht⁶^,⁸. Ein besseres Verständnis der Biologie der Mücke, der Interaktionen zwischen Mücke, Wirt und Krankheitserreger und der Prozesse, die die Übertragung von Krankheitserregern regulieren, kann die Entwicklung neuer Werkzeuge zur Vektorkontrolle erleichtern⁶.

Sondierungs- und Aufnahmeverhalten in Wirtsgeweben können die Übertragung von Krankheitserregern und die Krankheitspathologie beeinflussen⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹². Zum Beispiel wurden mehr Mikrofilarien aufgenommen, wenn Aedes aegypti direkt aus den Kapillaren fütterte, anstatt Blut außerhalb der geplatzten Gefäße zu sammeln¹³. Daher kann die Grundlagen- und angewandte Forschung zu diesem Thema dazu beitragen, Strategien zur Mückenbekämpfung und andere Gegenmaßnahmen zur Übertragung von Krankheitserregern zu entwickeln, zu verfeinern und zu bewerten. Es bestehen jedoch erhebliche Wissenslücken in den Details von kryptischen Blutfütterungsverhaltensweisen, die unter der Hautoberfläche des Wirts stattfinden, da diese Verhaltensweisen oft invasive Verfahren an lebenden Tiermodellen erfordern oder transparente künstliche Substrate oder flüssige Nahrungen verwenden⁹^,¹¹^,¹⁴^,¹⁵. Nicht-invasive Elektropenetrographie-Techniken (EPG; auch elektrischer Penetrationsgraph genannt) wurden verwendet, um das Fressverhalten von pflanzenfressenden Insekten im Zusammenhang mit der Übertragung von Pflanzenpathogenen, der Resistenz von Wirtspflanzen und den Wirkungsweisen von Insektiziden zu untersuchen, da sie es Forschern ermöglichen, Bewegungen und Verhaltensweisen von Mundwerkzeugen, die im Wirtsgewebe auftreten, indirekt zu beobachten, aufzuzeichnen und zu quantifizieren¹⁰^,¹².

Seit den 1950er Jahren werden elektronische Penetrationsüberwachungstechniken auf blutsaugende Arthropoden, einschließlich Mücken, angewendet¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰. EPG wurde jedoch nie allgemein für blutsaugende Arthropoden übernommen, da die biologischen Aktivitäten, die den Wellenformen entsprechen, nie verifiziert werden konnten²¹. Darüber hinaus führten das Design und die Elektronik früher Instrumente zu einer Überbetonung einiger elektrischer Signale, zu hohen Rausch-Signal-Verhältnissen, geringer Auflösung und Verzerrung der Wellenformen sowie zu Irritationen bei Wirbeltierwirten¹²^,²². Ein neueres Instrument, der AC-DC EPG Monitor²³, verfügt über variable Einstellungen und eine verbesserte Signalverarbeitung, wodurch er besser geeignet ist, blutsaugende Arthropoden aufzuzeichnen und die biologische Herkunft der Wellenformen in experimentellen Korrelationsstudien zu entschlüsseln¹⁰^,¹².

Für EPG wird ein elektrisches Signal über eine Substratspannungssonde (d.h. Referenzelektrode) an den Host angelegt. Der Gliederfüßer wird an einer Aufzeichnungselektrode befestigt und auf dem Wirt platziert. Wenn der Gliederfüßer seine Mundwerkzeuge (d. h. Stilette) in den Wirt einführt, wird das elektrische Signal zur Signalverarbeitung an den AC-DC EPG-Monitor weitergeleitet. Die elektrischen Signale werden dann auf einem Computer als "Wellenformen" angezeigt, die bestimmten Verhaltensweisen wie Mundwerkzeugbewegungen, Verschlucken, Speichelfluss und Aufnehmen/Impfen von Krankheitserregern entsprechen¹⁰^,¹². Sequenzielle und nicht-sequentielle Antwortvariablen, die sich auf die Dauer und Anzahl der Wellenformen beziehen²⁴^,²⁵ auf verschiedenen hierarchischen Ebenen (Familien, Typen und Subtypen) können dann basierend auf der Häufigkeit und Dauer der Wellenformen berechnet werden, um Einblicke in das Fressverhalten zu erhalten, das innerhalb und zwischen den Arten und als Reaktion auf biotische und abiotische Faktoren auftritt, wie z. B. Wirte, Krankheitserreger, Pestizide und Umweltbedingungen¹⁰^,¹².

Bisher wurde der AC-DC EPG-Monitor verwendet, um das Sondierungs- und Verschluckungsverhalten von Ae. aegypti²⁶ und Culex tarsalis²⁷ Stechmücken zu charakterisieren, die sich von menschlichen Händen ernähren, und von Dermacentor variabilis und Amblyomma americanum-Zecken, die sich von Rinderkälbern ernähren²⁸. Darüber hinaus wurde kürzlich ein Mausmodell für EPG^{29 entwickelt,} um Erregerstudien mit diesem Instrument zu erleichtern. Menschliche Hände sind ideal für die anfängliche Charakterisierung von Mückenwellenformen, da menschliche Wirte berichten können, wann sie die Mückensondierung sowie andere Verhaltensweisen spüren, was die Korrelation von Wellenformen mit Verhaltensweisen erleichtert (Tabelle 1). Darüber hinaus könnte ein besseres Verständnis der Plastizität des Fressverhaltens bei Stechmücken in verschiedenen menschlichen Populationen zur Entwicklung spezialisierterer Managementmaßnahmen für Stechmücken und die von ihnen übertragenen Krankheitserreger beitragen.

Tabelle 1: Beschreibung der Wellenformenfamilien, die zur Klassifizierung von elektrischen Signalen verwendet werden, die von Culex tarsalis an menschlichen Händen unter Verwendung von AC-DC EPG aufgezeichnet wurden. Die Sondierungsphase und die biologischen Aktivitäten, die jeder Wellenformfamilie entsprechen. Weitere Informationen finden Sie unter Cooper et al.²⁷. Abkürzung: AC = Wechselstrom, DC = Gleichstrom, EPG = Elektropenetrograph. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Um die Verwendung von EPG zur Untersuchung der Mückenbiologie und der Wirt-Vektor-Interaktionen zu erleichtern, wird hier eine Methodik zur Quantifizierung des Fressverhaltens von Cx. tarsalis-Mücken an menschlichen Händen mit dem AC-DC EPG-Monitor vorgestellt. Diese Protokolle bauen auf den grundlegenden AC-DC EPG-Verfahren auf, die in den Online-Ressourcen^{30 beschrieben} sind, und setzen voraus, dass die Benutzer über grundlegende Kenntnisse von AC-DC EPG und der zugehörigen Software verfügen³¹. Die skizzierten Verfahren können für andere Mücken- und Wirtsarten modifiziert werden und bieten eine Grundlage, um die hypothesengetriebene Erforschung des Fressverhaltens von Mücken zu erleichtern.

Tabelle 2: Definitionen der gängigen AC-DC EPG-Terminologie. Die Definitionen basieren auf den Definitionen in den Online-Ressourcen³⁰^,³¹ und in der wissenschaftlichen Literatur³². Abkürzung: AC = Wechselstrom, DC = Gleichstrom, EPG = Elektropenetrograph. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll (IRB-10729) wurde vom Institutional Review Board (IRB) for Human Research an der Kansas State University genehmigt²⁷ und ist nur für die Verwendung mit pathogenfreien Mücken vorgesehen. Menschliche Freiwillige gaben ihre Einverständniserklärung zur Teilnahme an der Studie und zur Veröffentlichung ihrer Daten. Bevor Sie mit der Arbeit mit Tieren, Menschen oder biologischen Gefahren beginnen, stellen Sie sicher, dass alle Verfahren von den entsprechenden institutionellen Regulierungsausschüssen oder Aufsichtspersonen überprüft und genehmigt wurden. In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Geräten und Materialien, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Anfängliche Vorbereitung und Einrichtung

Richten Sie den AC-DC EPG-Monitor (Abbildung 1A), den Faradayschen Käfig (Abbildung 1B,C) und die Software wie zuvor beschrieben ein³⁰^,³¹ mit den unten beschriebenen Änderungen (Schritte 1.1.1-1.1.5). In den Online-Ressourcen ³⁰ finden Sie Schritt-für-Schritt-Anleitungen zum Einrichten und Verwenden von Geräten und Software. Speichern Sie das gewünschte Setup als Standard in der Hardware-Management- und Waveform-Review-Software. In Tabelle 2 finden Sie eine Liste der gebräuchlichen AC-DC-EPG-Terminologie und ihrer Definitionen.
1. Schließen Sie einen Kopfstufenverstärker (Kopfverstärker) und eine Substratspannungssonde an Kanal 1 der Steuerbox an.
  HINWEIS: Die Aufzeichnung von einem einzigen Kanal wird angezeigt, obwohl der AC/DC-Monitor gleichzeitig vier Insekten und Wirte aufnehmen kann.
2. Stellen Sie sicher, dass Kanal 1 an der Steuerbox eingeschaltet ist und die entsprechenden Kanäle Pre-1 und Post-1 an der Switch-Interface-Box eingeschaltet sind.
  HINWEIS: Kanäle, die nicht verwendet werden, müssen ausgeschaltet bleiben.
3. Verwenden Sie die Hardware-Management-Software, um die Kanäle 1 und 3 auf der DI-710 A/D-Karte (aber nicht andere) für die Aufzeichnung der vor- und nachgleichgerichteten Signale zu aktivieren.
4. Formatieren Sie die Hardware-Management-Software so, dass die vor- und nachgleichgerichteten Wellenformen angezeigt/überlappt werden (z. B. 1 = 1 für das Vorsignal und 2 = 3 für das Nachsignal).
5. Stellen Sie die Abtastrate in der Hardware-Management-Software auf 100 Abtastungen pro Sekunde und Kanal ein (d. h. S/s/CHAN: 100).
Insekten-Stubs konstruieren²⁶^,²⁷^,²⁹^,³⁰:
1. Heizen Sie den Lötkolben auf die empfohlene Temperatur für das jeweilige Kolophonium-Kernlot vor.
2. Verwenden Sie ein Drahtschneider-Abisolierwerkzeug, um die Kunststoffbeschichtung ~6 cm vom Ende einer 20 AWG Kupferdrahtrolle entfernt abzuisolieren, aber vermeiden Sie es, das Kupferdrahtbündel im Inneren zu durchtrennen oder zu markieren (Abbildung 2A). Schneiden Sie dann das freiliegende Kupferdrahtbündel ab und entwirren Sie es in einzelne Stränge (Abbildung 2B).
3. Wickeln Sie mit einer Spitzzange einen Strang des Kupferdrahtes um den Schaft eines geeigneten Rosettenstifts unterhalb des Kopfes (d. h. flache Oberseite), so dass der größte Teil des Kupferdrahtes über den Kopf des Stifts hinausragt. Falten Sie das Ende des Drahtes über den Kopf des Stifts, um den Draht an Ort und Stelle zu befestigen (Abbildung 2C).
  HINWEIS: Passen Sie die Messrosetten des Tests an, um diejenigen zu identifizieren, die genau in den Anschluss des Kopfverstärkers passen (wenn er ausgeschaltet, ausgesteckt und auf 10⁶ Ohm (Ω) eingestellt ist).
4. Fassen Sie den Schaft des Rosettenstifts in die Löthilfe der helfenden Hände, so dass der Kupferdraht nach oben zeigt. Tragen Sie dann einen kleinen Tupfer (~0,2 cm Kugel) wasserlösliches Flussmittel auf die Verbindung zwischen dem Rosettenstift und dem Kupferdraht auf (Abbildung 2D).
  ACHTUNG: Flussmittel ist giftig und muss mit Vorsicht behandelt werden.
5. Wickeln Sie ~10 cm Lötzinn ab und richten Sie es aus. Halten Sie den heißen Lötkolben einige Sekunden lang gegen den Kopf des Stifts, bis das Flussmittel schmilzt und das Metall heiß ist. Drücken Sie dann die Spitze des Lötmittels auf den Kopf des Stifts neben dem Lötkolben, bis das Lot schmilzt und die Verbindung vollständig bedeckt, wobei der Stift und der Draht zu einem Insektenstummel verschmolzen.
6. Während der Insektenstummel abkühlt, reinigen Sie die Spitze des Lötkolbens mit Stahlwolle und einem feuchten Schwamm.
7. Nach dem Abkühlen den Insektenstummel aus den helfenden Händen nehmen. Spülen Sie den Insektenstummel mit 70 % Ethanol und dann mit Wasser ab, um Flussmittelreste zu entfernen. Schneiden Sie den Kupferdraht auf die gewünschte Länge ab (~3 cm, Abbildung 2E).
8. Wiederholen Sie die Schritte 1.2.3-1.2.7, bis 20-30 Insektenstummel erstellt sind.
Bauen Sie einen Insektensauger zusammen²⁶^,²⁷:
1. Führen Sie die Spitze einer Pasteur-Pipette aus Glas durch eine Flamme und drehen Sie die Pipette leicht. Wiederholen Sie den Vorgang, bis das Ende der Pipette die richtige Größe hat, um sich eng an den Bauch des Insekts zu schmiegen.
2. Decken Sie das große Ende der modifizierten Pasteur-Pipette mit einem Moskitonetz ab, stecken Sie es dann direkt in den Silikonschlauch, der mit einem Laborsauger verbunden ist, und befestigen Sie die Verbindung mit Isolierband, um einen Insektensauger zu bilden (Abbildung 2H).
  HINWEIS: Die Pasteur-Pipette und das Netz können in ein kurzes Stück Kunststoffschlauch eingeführt werden, das mit einem Schnelltrenner ausgestattet ist, um einen einfachen Wechsel zwischen verschiedenen Größen zu ermöglichen (Abbildung 2H).

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Abbildung 1: Die AC-DC EPG-Monitorausrüstung für die Aufzeichnung mit menschlichen Händen. (A) Komponenten des EPG, einschließlich der (1) Steuerbox, (2) der Schaltschnittstellenbox, (3) des Netzteils, (4) der DI-710 A/D-Platine, (5) des Computers, (6) des Leistungsreglers und (B) des Faradayschen Käfigs mit (C) ein Digitalmikroskop (7) auf einem Schwanenhalsständer, (8) Luftpolsterfolie und Luftkissen, (9) eine Substratspannungssonde und (10) ein Kopftischverstärker auf einem Laborstativ. Abkürzungen: AC = Wechselstrom, DC = Gleichstrom, EPG = Elektropenetrograph. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Aufzeichnungselektroden für die Verkabelung von Mücken und ein Insektensauger zur Manipulation von Mücken während der Verkabelung. (A) 20 AWG Kupferdraht mit 6 cm entfernter Kunststoffbeschichtung, um das Kupferdrahtbündel im Inneren freizulegen. (B) Einzelne Litzen des Kupferdrahtbündels. (C) Ein Strang Kupferdraht, der um den Kopf einer Messingrosette gewickelt ist, wobei der Schwanz des Drahtes über den Kopf der Nadel gefaltet ist. (D) Ein Tupfer Flussmittel auf die Verbindungsstelle zwischen dem Messingrosettenstift und dem Kupferdraht, der von einer Löthilfe mit helfenden Händen zur Vorbereitung des Lötens gehalten wird. (E) Ein fertiger Insektenstumpf, der aus einem Messingnagel besteht, der an einen Kupferdraht gelötet ist. (F) Eine Aufzeichnungselektrode aus einem Golddraht, der um die Spitze des Kupferdrahtes eines Insektenstummels gewickelt und mit Silberkleber befestigt ist. (G) Eine Nahaufnahme der goldenen Schleife an der Spitze der Aufnahmeelektrode. (H) Ein zusammengebauter (oben) und zerlegter (unten) Insektensauger aus modifizierten Pasteur-Pipetten, Moskitonetzen, Kunststoffschläuchen, Isolierband und männlichen Schnellkupplungen, neben dem Laborabsaugschlauch, der mit der weiblichen Schnellkupplung (oben rechts) ausgestattet ist. Maßstabsstäbe = 1 cm (A-F), 200 μm (G). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Verkabelung von Mücken

Mücken und Silberkleber vorbereiten (am Nachmittag/Abend vor dem EPG):
1. Cx. tarsalis KNWR-Stechmücken wie zuvor beschrieben aufziehen und pflegen²⁷.
2. Schnelle adulte weibliche Mücken, 5-17 Tage nach der Eklosion, für 8-12 Stunden, um die Sondierungsraten zu erhöhen, aber den Zugang zu Wasser zu ermöglichen, um Sterblichkeit zu vermeiden.
3. Bereiten Sie frischen Silberkleber vor²⁶^,²⁷^,²⁸^,²⁹^,³⁰:
  1. 510 mg 4-8 μm Silberflocken werden in ein 20-ml-Becherglas gegeben. Tarieren Sie den Restbetrag und geben Sie 1.100 mg ungiftigen Schulkleber auf den Becher auf die Silberflocke.
  2. Tarieren Sie die Waage, geben Sie 510 mg 8-10 μm Silberflocken in das Becherglas auf dem Kleber und fügen Sie dann mit einer Pipette 1.000 μl Wasser hinzu.
  3. Geben Sie vorsichtig einen Rührstab in den Becher und legen Sie ihn auf die Rührplatte. Beginnen Sie langsam zu rühren, drehen Sie allmählich auf die Stufe "schnell" und rühren Sie 4 Minuten lang. Stellen Sie sicher, dass alle Inhalte integriert sind.
  4. Verwenden Sie eine Transferpipette (mit abgeschnittener Spitze), um den Silberkleber auf 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen zu übertragen.
  5. Wickeln Sie die Oberseiten der silbernen Leimtuben mit Parafilm ein und lagern Sie sie bis zur Verwendung auf der Arbeitsplatte.
    HINWEIS: Silberkleber hat die richtige Konsistenz für bis zu 2 Tage, aber es wird empfohlen, am Abend vor der Verwendung frischen Kleber herzustellen³⁰.
Vorbereiten der Aufzeichnungselektroden²⁶^,²⁷^,²⁹^,³⁰:
1. Den Silberkleber vor Gebrauch kräftig einwirbeln.
2. Wickeln Sie einen Schaumstoffblock mit frischer Plastikfolie ein, um die vorbereiteten Insektenstummel und kabelgebundenen Mücken aufzubewahren.
  HINWEIS: Der Schaumstoff muss groß genug sein, damit die kabelgebundenen Mücken auf der Oberfläche stehen können, ohne sich zu berühren, aber klein genug, um in eine Aufbewahrungsbox zu passen. ACHTUNG: Ausscheidungströpfchen, die nach der Blutfütterung freigesetzt werden, können Krankheitserreger enthalten. Entsorgen Sie die Plastikfolie/den Schaumstoffblock nach Gebrauch ordnungsgemäß.
3. Entfernen Sie das Anlaufen (und alten Silberkleber bei der Wiederverwendung von Insektenstummeln) von der Spitze des Kupferdrahtes, indem Sie die oberen 1 cm des Kupferdrahtes mit einer Rasierklinge abkratzen, bis sie von allen Seiten glänzend sind. Bereiten Sie für jede Mücke einen Insektenstummel vor, plus ein paar Extras.
4. Schneiden Sie Golddraht mit einem Durchmesser von 0,025 mm in 4-5 cm lange Stücke. Halten Sie den Draht immer in einer selbstschließenden Pinzette, die mit Klebeband abgedeckt ist, um eine Delle des Drahtes zu vermeiden.
  HINWEIS: Golddraht ist auf schwarzem Hintergrund viel besser zu erkennen.
5. Lege das Ende des Golddrahtes entlang der sauberen Spitze des Kupferdrahtes des Insektenstummels und wickle den Golddraht vorsichtig 3x um den Kupferdraht.
6. Verwende eine Seziersonde, um Silberkleber aufzutragen, um den Golddraht an Ort und Stelle zu halten. Stellen Sie sicher, dass kein Schwanz oder loses Ende vorhanden ist. Legen Sie den Insektenstummel in den Schaumstoff, bis der Kleber getrocknet ist.
7. Streichen Sie vorsichtig über den Golddraht, der am Insektenstummel befestigt ist, um ihn zu glätten und zu einem langen, sanften Bogen zu formen (Abbildung 2F). Schneiden Sie den Draht auf die gewünschte Länge (~2,5-3 cm) ab.
8. Verwenden Sie unter einem Präpariermikroskop eine feine Pinzette, um eine Goldschlaufe an der Spitze des Golddrahtes herzustellen, und biegen Sie die Schlaufe in einem 90°-Winkel, wie unten beschrieben (Schritte 2.2.8.1-2.2.8.4; Abbildung 2E,F). Stellen Sie sicher, dass die goldene Schlaufe vollständig geschlossen ist. Lege den Insektenstummel wieder in den Schaumstoffblock ein.
  1. Halten Sie den Insektenstummel mit der nicht dominanten Hand am Messingnagel fest, wobei die Spitze des Golddrahtes den Mikroskoptisch berührt. Fassen Sie mit der dominanten Hand das äußerste Ende des Golddrahtes mit einer feinen Pinzette.
  2. Kreuzen Sie mit der feinen Pinzette die Spitze des Golddrahtes über den Kupferdraht des Insektenstumpfes in der Nähe der Stelle, an der der Golddraht aufgeklebt ist. Berühren Sie das Ende der feinen Pinzette und des Golddrahtes nach unten gegen den Mikroskoptisch.
  3. Ziehen Sie vorsichtig am Insektenstumpf, bis der Golddraht eine kleine goldene Schlaufe um die Spitze der feinen Pinzette bildet (nicht zu fest ziehen). Lösen Sie den Golddraht und entfernen Sie vorsichtig die Pinzette.
  4. Während Sie den Insektenstummel noch in der nicht dominanten Hand halten, fassen Sie die Goldschlaufe mit der feinen Pinzette so, dass die Pinzette in einem senkrechten Winkel zum Drahthals steht und die Spitze der Pinzette die Mitte der Goldschlaufe überspannt und so beide Seiten der Schlaufe greift. Ziehen Sie vorsichtig am Insektenstummel und drehen Sie die Pinzette leicht vom Insektenstummel weg, bis die Schlaufe in einem 90°-Winkel zum Drahthals gebogen ist (Abbildung 2G).
Befestigen Sie die Aufzeichnungselektroden an den Mücken²⁶^,²⁷^,²⁹^,³⁰ (am Morgen des EPG):
1. Betäuben Sie nüchterne Mücken mit CO₂ -Gas, bis alle Bewegungen aufhören. Positionieren Sie die Mücken auf dem Rücken auf der Anästhesieunterlage, mit dem Bauch zum Forscher gewandt.
2. Legen Sie ein ~2 cm großes Stück Laborband mit der klebrigen Seite nach unten unter ein Seziermikroskop. Geben Sie einen 0,5 cm großen Tropfen (~ 10 μL) Silberkleber auf das Klebeband.
3. Aspirieren Sie den Bauch einer betäubten Mücke in die modifizierte Pasteur-Pipette mit dem Sog nur lange genug, um den Bauch an Ort und Stelle zu setzen. Halten Sie die Mücke mit dem Aspirator unter das Präparierfernrohr über den Silberkleber.
  HINWEIS: Die Flügel können sich innerhalb oder außerhalb der Spitze der modifizierten Pasteur-Pipette befinden, aber wenn sie sich im Inneren befinden, kann verhindert werden, dass die Mücke herausfällt. Vermeiden Sie es, die Flügel zu verbiegen oder zu beschädigen.
4. Tauchen Sie schnell eine winzige Stecknadel in den Silberkleber und tragen Sie eine dünne Schicht auf das Pronotum der Mücke (d. h. die dorsale Oberfläche des Brustkorbs) auf. Fahren Sie nach Möglichkeit sofort mit dem nächsten Schritt fort (oder betäuben Sie die Mücke bei Bedarf erneut).
  HINWEIS: Es wird empfohlen, Schuppen auf dem Pronotum zu entfernen, indem Sie den Stift hin und her reiben, um sicherzustellen, dass der Klebstoff in die Poren in der Nagelhaut eindringt. Vermeiden Sie es, Klebstoff auf andere Teile der Mücke zu bekommen.
5. Tauchen Sie die goldene Schlaufe an der Spitze der Aufzeichnungselektrode schnell in den silbernen Kleber und legen Sie sie auf den silbernen Klebefleck am Pronotum der Mücke. Bewegen Sie die Schlaufe hin und her, um sicherzustellen, dass sie bündig mit dem Pronotum anliegt. Halten Sie den Draht fest, bis der Kleber getrocknet ist (~20-25 s).
6. Setzen Sie den Insektenstummel in den Schaumstoff in einem Winkel ein, der es der kabelgebundenen Mücke ermöglicht, beim Aufwachen bequem zu stehen. Fahren Sie mit der Verkabelung der nächsten Mücke fort.
  HINWEIS: Es ist ratsam, sich Notizen über die Qualität jeder Verdrahtungsarbeit zu machen.
7. Sobald die gewünschte Anzahl von Mücken verkabelt ist, legen Sie den Schaumstoffblock in eine Aufbewahrungsbox. Halten Sie die Mücken bis zur Verwendung unter normalen Aufzuchtbedingungen.

3. EPG-Aufbau und -Vorbereitung (am Morgen vor dem EPG)

Schalten Sie den AC/DC EPG-Monitor mindestens 30 Minuten vor der Aufnahme ein (durch Umlegen des Schalters am Netzteil), um eine Instrumentenäquilibrierung und eine eventuelle Fehlerbehebung zu ermöglichen.
HINWEIS: Kanäle, die an der Steuerbox und der Schaltschnittstelle verwendet werden, können eingeschaltet bleiben.
Schalten Sie den Computer ein und öffnen Sie die Hardwareverwaltungssoftware.
HINWEIS: Wenn die Signale nicht als flache, dünne Linien angezeigt werden, ist eine Fehlerbehebung erforderlich (siehe Diskussionsabschnitt).
Führen Sie den Touch-Test²⁷^,^{30 durch}, um die Funktionalität der Ausrüstung zu überprüfen:
1. Während Sie geerdet sind (d.h. den Faradayschen Käfig mit bloßer Haut berühren), drehen Sie den Drehregler am Kopfverstärker auf 10⁶ Ω und stecken Sie den Schaft eines Insektenstummels in den Anschluss.
  HINWEIS: Wenn Sie den Berührungstest bei einem höheren Eingangswiderstand (Ri) durchführen, kann der Kopfverstärker beschädigt werden.
2. Schalten Sie im geerdeten Zustand den Kopfverstärker ein und fassen Sie den Kupferdraht des Insektenstummels dreimal fest zwischen Zeigefinger und Daumen. Wenn der EPG korrekt funktioniert, erscheinen drei große Spitzen sowohl in den Vor- als auch in den Nachsignalen auf dem Bildschirm. Ist dies nicht der Fall, ist eine Fehlerbehebung erforderlich (siehe Diskussionsabschnitt).
Passen Sie die Geräteeinstellungen auf 150 mV Wechselstrom (AC) mit einem Ri von 10⁷ Ω, einer Hardware-Verstärkung von 20-40x, einem negativen Offset, einer nativen Baseline und einer Software-Verstärkung von 8-16x an²⁷^,³⁰, wie unten beschrieben (Schritte 3.4.1-3.4.3).
1. Stellen Sie die Spannung, den Stromtyp, die Hardware-Verstärkung (Bereich, Verstärkung und Multiplikator), den Offset und die Basislinie (Null) mit den Schaltern und Drehreglern auf Kanal 1 der Steuerbox ein.
  HINWEIS: Die geeignete Hardware-Verstärkungseinstellung hängt von der Qualität der Verkabelung und des Silberklebers ab, so dass Schwankungen bei den optimalen Verstärkungseinstellungen von Mücke zu Mücke und von Tag zu Tag zu erwarten sind. Die Hardware-Verstärkung muss möglicherweise während der Aufnahme angepasst werden, wenn das Signal einen Spitzenwert erreicht (definiert in Tabelle 2 und in Abbildung 3A,C) oder zu klein ist, um es zu visualisieren. Jegliche Änderungen der Hardwareverstärkung wirken sich dauerhaft auf die Aufnahme aus (siehe Abbildung 3A,C).
2. Stellen Sie den Ri-Pegel mit dem Drehregler am Kopfverstärker ein.
3. Stellen Sie die Software-Verstärkung mit der Hardware-Management-Software ein und passen Sie sie an (z. B. wählen Sie das Vor- oder Nachsignal aus und klicken Sie dann mit der linken Maustaste, um die Software-Verstärkung zu erhöhen, oder klicken Sie mit der rechten Maustaste, um die Software-Verstärkung zu verringern).
  HINWEIS: Jegliche Verstärkungsänderungen, die in der Software vorgenommen werden, wirken sich NICHT dauerhaft auf die Aufnahme aus.
Richten Sie eine neue Aufzeichnung in der Hardware-Management-Software ein, aber starten Sie die Aufzeichnung erst in Schritt 4.3 im nächsten Abschnitt.

4. EPG auf menschlichen Händen²⁶^,²⁷ :

Nachdem die Einverständniserklärung eingeholt wurde (wie vom IRB der Heimatinstitution festgelegt), lassen Sie den Gastgeber mit einem Arm nach innen neben dem Faradayschen Käfig sitzen, während er die Substratspannungssonde greift und unter den Kopfverstärker hält.
HINWEIS: Der Arm muss bequem auf Luftpolsterfolie oder einem ähnlichen nicht leitenden Substrat aufliegen. Die Hand- und Substate-Spannungssonde darf während der Aufnahme nicht mit dem Faradayschen Käfig oder dem Kopfverstärker in Berührung kommen. Um Schäden zu vermeiden, darf der Freiwillige den Kopfverstärker nach dem Einschalten unbedingt nicht berühren. Wenn der Kopfverstärker versehentlich berührt wird, führen Sie den oben beschriebenen Berührungstest durch, um seine Funktionalität zu beurteilen.
Sobald der Host in Position ist, drehen Sie den Head Amp zur Seite. Nehmen Sie eine kabelgebundene Mücke aus der Aufbewahrungsbox und schließen Sie sie an das Instrument an, indem Sie den Messingstift des Insektenstummels in die Öffnung am Head Amp stecken. Lassen Sie die Mücke baumeln.
HINWEIS: Halten Sie eine Sprühflasche mit 70 % Ethanol in der Nähe, um Mücken zu bekämpfen, die sich vom Draht lösen.
Starten Sie die Aufnahme mit der Hardware-Management-Software. Positionieren Sie den Kopfverstärker so über der Hand, dass die Mücke bequem stehen und sondieren kann.
Schalten Sie den Head-Amp ein, während er geerdet ist. Starten Sie einen 10-Minuten-Timer. Passen Sie die Position der Host-Hand nach Bedarf an, um den Erfolg der Sondierung zu unterstützen.
HINWEIS: Wenn Sie Mücken verwenden, die dazu neigen, sofort zu sondieren, schalten Sie den Kopfverstärker ein, bevor Sie die Mücke auf der Hand positionieren. Mit einem dünnen Holzdübel oder einem nicht leitenden Pinselstiel kann der Kupferdraht des Insektenstummels gebogen werden, um die Position der Mücke weiter anzupassen. Eine Lupe oder ein Digitalmikroskop auf einem Schwanenhalsstativ kann bei der Beobachtung der Mücke während des EPG hilfreich sein, insbesondere bei Verhaltenskorrelationsstudien.
Verwenden Sie die Hardware-Management-Software, um während der Aufzeichnung Beobachtungen (z. B. Ereignismarkierungen) mit Zeitstempel in Bezug auf Host-Antworten, Mückenverhalten, Verstärkungsänderungen usw. zu machen. Passen Sie die Position der Signale auf dem Bildschirm und die Softwareverstärkung nach Bedarf an, damit beide Signale auf dem Bildschirm gut sichtbar bleiben. Passen Sie die Hardware-Verstärkung an, wenn das/die Signal(e) einen Spitzenwert erreicht (Abbildung 3A,C und Tabelle 2) oder wenn die Wellen zu klein erscheinen, wenn die Software-Verstärkung maximal ist. Passen Sie den Offset an, wenn eine Gleichrichterfaltung beobachtet wird (Abbildung 3C,C" und Tabelle 2). Detaillierte Anweisungen, wie Sie diese Anpassungen vornehmen können, finden Sie in der Software manual³¹ und in den Online-Ressourcen³⁰.
1. Um die Position der Signale auf dem Bildschirm anzupassen, wählen Sie das Vor- oder Nachsignal aus (z. B. durch Klicken auf
  1 = 1 oder 2 = 3) und ziehen Sie dann das Signal an die gewünschte Position auf dem Bildschirm (idealerweise in der Mitte des Bildschirms, aber nicht überlappend).
2. Um die Softwareverstärkung anzupassen, verwenden Sie die in Schritt 3.4.3 beschriebene Hardware-Management-Software.
3. Um die Hardware-Verstärkung einzustellen, drehen Sie zunächst den Gain-Regler für Kanal 1 nach rechts oder links, um die Verstärkung zu erhöhen bzw. zu verringern. Wenn diese Anpassung nicht ausreicht, um Peaking Out zu eliminieren (zu hohe Verstärkung; Abbildung 3A,C) oder lassen Sie die Details des Signals deutlich visualisieren (Verstärkung zu niedrig), schalten Sie die Bereichs- und Multiplikatorschalter von Kanal 1 um, um die Verstärkung weiter einzustellen.
  HINWEIS: Es wird empfohlen, Ereignismarker zu verwenden, um aufzuzeichnen, wann die Hardware-Verstärkung angepasst wurde, um die Interpretation der Wellenformdaten zu erleichtern.
4. Um den Offset einzustellen, stellen Sie den Offset-Schalter für Kanal 1 an der Steuerbox auf Neg und drehen Sie dann den Offset-Regler für Kanal 1, bis die Spitzen in den Vor- und Nachsignalen auf dem Computerbildschirm in die gleiche Richtung auftreten. Wenn der Offset-Drehregler zu weit gedreht wird, schaltet das Nachsignal wieder um.
Wenn die Mücke nicht innerhalb von 10 Minuten (oder einem anderen definierten Zeitpunkt) sondiert, schalten Sie den Kopfverstärker aus. Wenn sich die Mücke zum Zeitpunkt mitten in der Sonde befindet, lassen Sie sie die Sondierung beenden, bevor Sie den Kopfverstärker ausschalten. Lassen Sie den Wirt vorsichtig seine Hand entfernen und entfernen Sie dann die Mücke mit dem beigefügten Insektenstumpf. Setze die Mücke wieder in die Aufbewahrungsbox.
Stoppen/schließen Sie die Aufnahme mit der Hardware-Management-Software. Fahren Sie mit dem EPG bei der nächsten Mücke fort (Schritt 4.2).
HINWEIS: Denken Sie daran, den Dateinamen nach jeder Mücke zu ändern.
Schalten Sie am Ende der Session den Head-Amp und die Stromquelle aus und schließen Sie die Software.
Überprüfen Sie das Participant Debriefing Statement oder Ähnliches mit dem Freiwilligen, wie im genehmigten IRB angegeben.
Entsorgen Sie Mücken gemäß den Protokollanforderungen. Entfernen Sie die Plastikfolie vom Schaumstoffblock und entsorgen Sie sie ordnungsgemäß.
Nachdem die gesamte Datenerfassung abgeschlossen ist, überprüfen und messen Sie die Wellenformen und analysieren Sie die Daten wie zuvor beschrieben²⁴^,²⁵^,²⁶^,²⁷^,²⁹^,³⁰. In den Online-Ressourcen³⁰ finden Sie Schritt-für-Schritt-Tutorials zur Verwendung der Software zur Überprüfung von Wellenformen, zum Erstellen von Abbildungen zur Darstellung der Wellenformen, zum Messen der Wellenformen, zum Exportieren der Daten zur Analyse, zum Durchführen der statistischen Analyse und zur detaillierten Erläuterung gängiger Variablen für die Signalantwort.

figure-protocol-3
Abbildung 3: Beispiele für suboptimale Aufnahmen aufgrund von Peaking Out, Verstärkungsänderungen der Steuerbox, unklaren Spannungsänderungen durch minderwertige Verkabelung, Gleichrichterfaltung und Rauschen. Wellenformen von Culex tarsalis-Mücken, die sich an menschlichen Händen ernähren, verzerrt durch (A) Peaking Out (blauer horizontaler Pfeil) und anschließende Verstärkungsänderungen der Kontrollbox von 100x auf 80x auf 40x auf 60x auf 40x bis 20x (orangefarbene vertikale Pfeile), (B) unklare Spannungsänderungen und (C) Gleichrichterfaltung im Nachsignal (schwarz) im Vergleich zum Vorsignal (rot) (siehe Wellenform J, Nahaufnahme in Feld C'), Leitungsrauschen (11 Hz Sinuswelle nur im Vorgleichrichtersignal (rot) sichtbar, Nahaufnahme in Feld C'), Peaking Out (blauer horizontaler Pfeil) und eine Änderung der Verstärkung der Steuerbox von 500x auf 200x (orangefarbener vertikaler Pfeil). Die Namen der Wellenformen werden oben in jedem Bedienfeld angezeigt. Die violetten Pfeile in der unteren rechten Ecke von Panel C zeigen an, wann der Kopfverstärker ausgeschaltet wurde, nachdem die Sonde abgeschlossen war, und sind ein weiteres Beispiel für das Einklappen des Gleichrichters. Rote horizontale Linien, die mit dem Vorgleichrichtungssignal in Feld C verbunden sind, zeigen an, wann Event-Marker zum Aufzeichnen von Noten mit Zeitstempel verwendet wurden. Ri-Pegel, angelegte Signale, Zeitskalen und Software-Verstärkungen sind (A) 10⁷ Ω, 150 mV DC, 13,2 s/div, 8x; (B) 10⁷ Ω, 150 mV Gleichstrom, 4,4 s/div, 128x; und (C) 10⁷ Ω, 150 mV AC, 7,4 s/div, 2x; (C') 0,2 s/div, 8-fach. Abkürzungen: AC = Wechselstrom, DC = Gleichstrom, Ri = Eingangswiderstand, mV = Millivolt, Ω = Ohm, s/div = Sekunden pro Teilung. Diese Abbildung wurde mit Daten von Cooper et al.^{27 erstellt}. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AC-DC EPG-Aufzeichnungen von Cx. tarsalis-Mücken, die sich an menschlichen Händen ernähren (Abbildung 4) erzeugten interpretierbare Wellenformen, die für die Analyse und Veröffentlichung geeignet sind²⁷. Interpretierbare Wellenformen enthielten eindeutige, sich wiederholende Muster, die in Wellenformfamilien (Tabelle 1 und Abbildung 4), Typen und Untertypen klassifiziert werden konnten, wenn die Kompression (definiert in Tabelle 2) und die Softwareverstärkung in der Wellenformüberprüfung software²⁷^,^{31 angepasst wurden}. Alle Wellenformfamilien (J, K, L, M, N) und Typen (L1, L2, M1, M2), die zuvor in Ae. aegypti beim Fressen an menschlichen Händen^{26 beschrieben} wurden, wurden in den Wellenformen identifiziert, die von Cx. tarsalis erzeugt wurden, das sich an menschlichen Händen ernährte, was die Gültigkeit der hier beschriebenen Methoden bestätigt. Darüber hinaus wurden drei neue Wellenformtypen (M3, N1, N2) und zahlreiche Subtypen von L1, L2, M1 und M2 identifiziert²⁷. Darüber hinaus wurde der Spannungsabfall zurück auf die Grundlinie, wenn die Mundwerkzeuge vom Host zurückgezogen werden, als Wellenformfamilie W^{27 bezeichnet}.

Die systematische Variation der Geräteeinstellungen (Stromtyp und Ri-Werte) unter Befolgung der hier beschriebenen Verfahren ermöglichte die Bestimmung der optimalen Einstellungen für die Aufzeichnung von Cx. tarsalis, die sich von menschlichen Händen ernährt, die elektrischen Ursprünge jeder Wellenform, die durchschnittliche Dauer in Sekunden von vollständigen und unvollständigen Sonden pro Mücke und für den statistischen Vergleich der Wellenformdauer in Sekunden pro Insekt (WDI), die Anzahl der Wellenformereignisse pro Insekt (NWEI) und die Wellenformdauer in Sekunden pro Ereignis pro Insekt (WDEI) über die Einstellungen²⁷. Mücken wurden auch während verschiedener Wellenformen unterbrochen und präpariert, um zu bestimmen, welche Wellenform mit der Blutaufnahme korrelierte²⁷. Eine ähnliche Untersuchung wurde für Ae. aegypti mit einer vergleichbaren Methodik durchgeführt²⁶.

Aufgrund der empfindlichen und komplizierten Natur von EPGs waren nicht alle Aufnahmen so makellos wie die in Abbildung 4 gezeigten. Peaking Out (Abbildung 3A,C), Änderungen der Hardware-Verstärkung (Abbildung 3A,C), minderwertige Verdrahtungsarbeiten (Abbildung 3B), Gleichrichterfaltung in der Wellenform J (Abbildung 3C,C") und elektrisches Rauschen (Abbildung 3C,C") verzerrten und maskierten gelegentlich die Wellenformen, so dass sie für die Verwendung in Zahlen zur Veröffentlichungsqualität ungeeignet waren und die Bewertung und Analyse erschwert wurden. Daher wird ein Front-End-Aufwand empfohlen, um die Verdrahtungsfähigkeiten zu perfektionieren, die Verstärkungs- und Spannungseinstellungen zu optimieren, den Offset anzupassen und das elektrische Rauschen zu kontrollieren. Interessanterweise wurde die Gleichrichterfaltung nur in der Wellenformfamilie J für Cx. tarsalis (Abbildung 3C,C') beobachtet und trat nach anfänglicher Anpassung des Offsets nicht wieder auf, selbst wenn andere Mückenarten (Ae. aegypti und Culex quinquefasciatus) verwendet wurden (Daten nicht gezeigt). Darüber hinaus ergab die Fehlerbehebung, dass das unkontrollierte elektrische Rauschen, das in Abbildung 3 (Panels C und C') gezeigt wird, von einem fehlerhaften Faradayschen Käfig herrührt. Die Aufnahmen, die in dem fehlerhaften Faradayschen Käfig gemacht wurden, waren immer noch brauchbar, aber die Geräuschprobleme wurden behoben, als ein verbesserter Faradayscher Käfig gebaut wurde (Abbildung 1B).

Selbst wenn alle Vorsichtsmaßnahmen und Frontend-Optimierungen getroffen wurden, machten geringfügige Abweichungen in der Qualität der Elektrodenbefestigung an der Mücke und andere unbekannte Faktoren, die das Signal verzerrten und das Signal-Rausch-Verhältnis veränderten, periodisch notwendig, die Hardware-Verstärkung während der Aufnahme anzupassen, um sicherzustellen, dass das Signal im sichtbaren Bereich lag und die Auflösung der Spitzen in jeder Wellenform für die Identifizierung und Charakterisierung der Wellenform ausreichend war. Leider kann das Anpassen der Hardware-Verstärkung während der Aufnahme zu abrupten Spannungsverschiebungen führen (Abbildung 3A, C), wodurch die Wellenformen für die Veröffentlichung ungeeignet sind, aber immer noch (ganz oder teilweise) für Messungen und Analysen verwendet werden können.

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Abbildung 4: Repräsentative Wellenformen einer Culex Tarsalis-Sonde an einer menschlichen Hand, aufgenommen mit einem Ri von 10⁷ Ω unter Verwendung eines angelegten Signals von 250 mV AC. Wellenformnamen auf Familienebene (NP, J, K, L, M, W) werden oben in jedem Feld angezeigt. Die unteren Felder zeigen Vergrößerungen ausgewählter Regionen in Feld A. Eingefügte Felder zeigen Vergrößerungen der angezeigten Bereiche. Zeitskalen und Softwaregewinne sind (A) 7,0 s/div, 16x; (B) 1,0 s/div, 64-fach; (B') 0,2 s/div, 64x; (C) 1,0 s/div, 64-fach; (C') 0,2 s/div, 32x; (D) 1,0 s/div, 64-fach; (D') 0,2 s/div, 64x. Abkürzungen: AC = Wechselstrom, Ri = Eingangswiderstand, mV = Millivolt, Ω = Ohm, s/div = Sekunden pro Teilung. Diese Abbildung wurde mit Daten von Cooper et al.^{27 erstellt}. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bei der Verwendung des AC/DC-EPG ist es entscheidend, ein grundlegendes Verständnis des Hardware- und Softwarebetriebs³⁰ zu haben und die hierin beschriebenen Protokolle sorgfältig zu befolgen, um eine Beschädigung des Geräts zu vermeiden. Vermeiden Sie es vor allem, den Kopfverstärker zu berühren, wenn er eingeschaltet ist, es sei denn, er ist am Faradayschen Käfig geerdet. Es wird empfohlen, so weit wie möglich im Faradayschen Käfig aufzunehmen³⁰. Die Käfigtüren müssen nicht unbedingt geschlossen werden, um interpretierbare Wellenformen zu erhalten, es sei denn, die Aufnahme erfolgt in einer Umgebung mit übermäßigem elektrischem Umgebungsrauschen. Nichts Motorisiertes kann im Faradayschen Käfig sein. Es ist wichtig zu beachten, dass der Faradaysche Käfig selbst ausschließlich über den Kopfverstärker elektrisch geerdet werden muss, damit er ordnungsgemäß funktioniert. Dies wird erreicht, indem der Kopfverstärker an einen Laborständer aus Metall angeschlossen wird, wobei die Farbe an einem Fuß des Ständers abgeschliffen wird, um einen leitenden Weg für die vom Faradayschen Käfig erfasste Elektrizität zu ermöglichen, die zum Laborständer, in das Metallgehäuse des Kopfverstärkers und über das Kabel zum Schaltkasten fließt. durch das Netzteil in eine ordnungsgemäß geerdete Steckdose und durch den Baugrund³⁰ in die Erde. Ein Multimeter kann verwendet werden, um die Qualität der Verbindung zwischen den Komponenten im Inneren des Käfigs zu überprüfen, indem der spezifische Widerstand (der die Umkehrung der Leitfähigkeit ist) zwischen verschiedenen Punkten gemessen wird. Ein drahtloses AM-Radio kann auch im Faradayschen Käfig platziert werden, um zu überprüfen, ob der Schall beim Schließen der Türen deutlich reduziert (oder idealerweise eliminiert) wird, um zu bestätigen, dass der Faradaysche Käfig elektrische Signale in der Luft ausreichend erfasst (E. Backus per. Comm.).

Die richtige und standardisierte Vorbereitung des Silberklebers und die Befestigung der Aufzeichnungselektroden an Insekten sind entscheidend, um brauchbare Aufzeichnungen zu erhalten. Die Kutikula eines Insekts ist ein Isolator und wirkt als Kondensator, wenn der Silberkleber nicht ausreichend in die Poren der Nagelhaut eindringt, um einen Weg zu schaffen, auf dem Elektrizität vom Inneren des Insekts zum Golddraht auf der Oberfläche des Pronotums³⁰ gelangt. Bereiten Sie den Silberkleber vor jeder EPG-Sitzung gleichzeitig vor, arbeiten Sie mit frischem Silberkleber aus der Röhre und ersetzen Sie ihn während des Verdrahtungsvorgangs häufig durch kräftig verwirbelten Silberkleber. Stellen Sie sicher, dass die goldene Schlaufe am Brustkorb anliegt, so dass die gesamte Schlaufe in Kontakt mit der Nagelhaut ist und nicht zur Seite gekippt oder durch eine dicke Schicht Silberkleber und Schuppen getrennt ist, um eine starke elektrische Verbindung herzustellen und ein Ablösen und Entweichen der Mücke vom Draht zu verhindern.

Die hier beschriebenen Protokolle müssen bei der Arbeit mit verschiedenen Mückenarten optimiert werden. Die optimalen EPG-Einstellungen (Ri-Pegel, Spannung, Stromtyp und Hardware-Verstärkung) für die Aufzeichnung auf einem bestimmten Arthropoden müssen experimentell bestimmt werden^12,30. Sobald der Versatz jedoch angepasst ist, muss er nicht mehr nachjustiert werden, wenn mit ähnlichen Mücken gearbeitet wird. Optimale Einstellungen wurden für AC-DC EPG mit Ae. aegypti²⁶ und Cx. tarsalis²⁷ ermittelt. Wellenformbibliotheken (definiert in Tabelle 2) für zusätzliche Spezies werden die Einführung von EPG für Stechmücken erleichtern. Es ist auch notwendig, die Anästhesie für die interessierende Mücke zu optimieren, da das Blutsaugverhalten je nach Mückenart und Anästhesiewahl unterschiedlich beeinflusst werden kann. Zum Beispiel benötigen Cx. tarsalis eine Erholungsphase von 4 Stunden nach 15 Minuten Anästhesie mit CO₂, während für Ae. aegypti eine Erholungsphase von 15 Minuten nach einer 15-minütigen Anästhesie mit Eis ausreichend ist. Culex tarsalis sind jedoch bei Kälteeinwirkung nur schwer zu besiegen, so dass trotz der langen Erholungsphase überwiegend CO₂ verwendet wird.

Obwohl der AC-DC EPG-Monitor nach der Durchsicht von Online-Ressourcen^30,31 oder einer Schulung mit einem erfahrenen Benutzer einfach zu bedienen ist, ist eine gewisse Fehlerbehebung erforderlich. Anfänglich wiesen die EPG-Aufzeichnungen des Autors von Mückensonden eine unerwartete 11-Hz-Zeichenwelle im Vorsignal auf, die von Wayadande und Kollegen nicht beobachtet oder berichtet worden war²⁶. Rücksprache mit E. Backus deutete darauf hin, dass der Faradaysche Käfig wahrscheinlich das Problem war, da es störende Erdschleifen gab. Ein neuer Faradayscher Käfig, der aus einem hochleitfähigen Kupferschirm bestand, der mit einem Aluminiumrahmen verbunden war, der mit einer großen Aluminiumbodenplatte verschraubt war, die von Gummifüßen getragen wurde, um ihn von der untenstehenden Tabelle zu isolieren (Abbildung 1B), löste das 11-Hz-Rauschsignal (Abbildung 3C, C'). Darüber hinaus erschienen gelegentlich beim ersten Einschalten des EPG-Netzteils die Vor- und Nachgleichrichtersignale als dicke, unscharfe Linien anstelle von geraden, glatten, dünnen Linien. Dies wurde in der Regel behoben, indem das Instrument ausgeschaltet und alle Kabelverbindungen überprüft wurden. Wenn dies fehlschlug, half es normalerweise, das Instrument für 1-3 Minuten vom Stromnetz zu trennen. Sehr selten werden die Vor- und Nachsignale während des Betriebs dick und unscharf, was dadurch behoben wurde, dass das Instrument ausgeschaltet und an eine andere Steckdose angeschlossen wurde oder ein Spannungsregler und ein Power Conditioner verwendet wurden, um das EPG anzuschließen, bevor es an die Steckdose angeschlossen wurde. Im Idealfall würde eine dedizierte Leitung für den EPG-Monitor das Leitungsrauschen von Kühlschränken und anderen Geräten eliminieren, die an denselben Stromkreis wie der EPG³⁰ angeschlossen sind.

Derzeit gibt es zwei Haupteinschränkungen bei der Verwendung von EPG zur Untersuchung von Mücken. Erstens wurden nur wenige Korrelationsstudien durchgeführt, um zu überprüfen, welches Sondierungsverhalten den Wellenformen entspricht. Es gibt zwar starke Hypothesen darüber, was während jeder Wellenformfamilie (Tabelle 1) und einiger der Wellenformtypen (M1 und M2) passiert, aber nur wenige dieser Hypothesen wurden experimentell bestätigt, mit der Ausnahme, dass die Blutaufnahme mit der Wellenformfamilie M^{korreliert ist 26,27}. Am wichtigsten ist, dass Wellenformen identifiziert werden müssen, die dem Speichelfluss entsprechen, da viele Krankheitserreger im Speichel übertragen werden. Die Korrelation von EPG-Wellenformen mit biologischen Aktivitäten in Mücken ist erforderlich, um signifikante Unterschiede in der Wellenformdauer und -anzahl zwischen den Behandlungsgruppen sinnvoll interpretieren zu können. Zweitens können die Sondierungs- und Erfassungsraten während des EPG viel niedriger sein als erwartet²⁷. Das individuelle Anbinden von Mücken an kurze Drähte und das direkte Platzieren auf dem Wirt könnte die Wirtssuche über große Entfernungen und das soziale Fressverhalten verhindern, was sich auf das Sondierungs- und Verschluckungsverhalten auswirken kann. Richtig verdrahtete Insekten können normal laufen und fliegen. Dennoch ziehen Mücken oft an den Drähten und verheddern sich manchmal oder halten sich in unnatürlichen Winkeln, was darauf hindeutet, dass die Verdrahtung ihr Verhalten bis zu einem gewissen Grad beeinflusst. Die Autoren testeten viele Strategien, um die Sondierungsraten während des EPG zu erhöhen, und das Fasten der Mücken über Nacht, die Verwendung älterer Personen, die Exposition gegenüber menschlichem Atem unmittelbar vor dem Aufsetzen auf die Hand und das Auftragen von menschlichem Speichel auf die Hand waren am effektivsten, sowie die Verwendung von Wirten, die ständig feine Anpassungen an der Position ihrer Hand vornahmen, um sicherzustellen, dass sich die Mücke in der idealen Position zum Sondieren befand²⁷.

Trotz dieser Einschränkungen hat AC-DC EPG zahlreiche Vorteile gegenüber anderen Ansätzen zur Untersuchung des Sondierungs- und Verschluckungsverhaltens. Systeme wie das BiteOScope¹¹, das flyPAD¹⁵ und die Automated Biomaterial Platform¹⁴, die zur Quantifizierung des Sondierungs- und Verschluckungsverhaltens und der Speichelsekretion während der Blutfütterung entwickelt wurden, verwenden transparente künstliche Substrate und flüssige Diäten, denen normale Wirtsgewebssysteme und Wirtshinweise fehlen. Während diese synthetischen Plattformen für viele experimentelle Zwecke nützlich sind, ist ein klarer Vorteil von AC-DC EPG die Möglichkeit, diese Verhaltensweisen und Variablen von Interesse innerhalb natürlicher Wirtssysteme zu untersuchen. Ferner bietet die benutzerdefinierte Anpassungsfähigkeit des AC-DC-EPG-Systems einen zusätzlichen Vorteil gegenüber anderen EPG-Instrumenten²²^, ³³ und EPG-ähnlichen elektronischen Überwachungsgeräten¹⁶^, ²¹, die keine einstellbaren Ri-Pegel, Stromarten und Spannungspegel aufweisen, die erforderlich sind, um Wellenformen mit der maximalen Informationsmenge zu erhalten und nachteilige Auswirkungen auf ein breites Spektrum der Wirte und Arthropoden zu minimieren²²^.²³. Urheberrecht Elektromyographie-Techniken (EMG) werden auch verwendet, um die Bluternährung zu untersuchen. Der elektrische Schaltkreis umfasst jedoch in der Regel nur den Gliederfüßer und es werden nur Muskelpotentiale aufgezeichnet, die der Aufzeichnungselektrode am nächsten liegen, so dass die Wellenformen keine Informationen über detaillierte Aktivitäten an der Wirt-Insekten-Grenzfläche liefern, wie z. B. Zellrupturen, Stilettpositionen und -aktivitäten sowie Strömungspotentiale durch die Mundwerkzeuge^28,34. Intravitalmikroskopische Techniken können verwendet werden, um detaillierte Mundwerkzeugbewegungen und -aktivitäten in lebenden Wirtsgeweben direkt sichtbar zu machen, aber diese Techniken beinhalten invasive Verfahren an lebenden Tiermodellen⁹. Nur der AC-DC EPG-Monitor kann in Echtzeit sehr detaillierte Informationen über Sondierungs-, Verschluckungs- und Speichelverhalten liefern, die in lebenden undurchsichtigen Wirtsgeweben auftreten, ohne dass invasive Verfahren erforderlich sind, und ist für den Einsatz bei einer Vielzahl von Arthropoden anpassbar^10,12.

Dies ist die erste detaillierte Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Verkabelung von Mücken, den Bau eines Insektensaugers und die Durchführung von EPG an menschlichen Wirten. Es wird erwartet, dass diese Protokolle die Einführung von AC-DC EPG bei Stechmücken erleichtern werden, die sich von menschlichen Wirten ernähren. Beispiele für zukünftige Forschungsbemühungen unter Verwendung von AC-DC EPG könnten Studien zu grundlegenden Mechanismen der Bluternährung und der Schädigung des Wirtsgewebes¹⁰ umfassen, einschließlich der Identifizierung stereotyper Sequenzen von Sondierungsverhaltensweisen vor der Blutaufnahme, der Untersuchung des Blutflusses durch Mundwerkzeuge und des Vergleichs der Plastizität der Nahrungsaufnahme innerhalb und zwischen Arthropodenarten/Entwicklungsstadien²⁶. EPG kann auch verwendet werden, um die Wirkung von Insektiziden, Antifeedants und Repellentien zu quantifizieren¹². Die hier vorgestellten Verfahren zur Verwendung von AC-DC EPG zur Untersuchung von Stechmücken an menschlichen Händen werden diese Studien beschleunigen und neue Einblicke in die Biologie der Blutfresser von Mücken ermöglichen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen. Die Erwähnung von Handelsnamen oder kommerziellen Produkten in dieser Veröffentlichung dient ausschließlich dem Zweck, spezifische Informationen bereitzustellen, und impliziert keine Empfehlung oder Billigung durch das US-Landwirtschaftsministerium. Die Schlussfolgerungen in diesem Bericht sind die der Autoren und geben nicht unbedingt die Ansichten des USDA wieder.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Prof. Astri Wayadande von der Oklahoma State University für ihre Pionierarbeit beim Verdrahtungsverfahren für Mücken, und Dr. Elaine Backus von der USDA-ARS in Parlier, CA, und Mr. Andrew Dowell von EPG Technologies Inc. in Gainesville, FL, für ihre Unterstützung bei der Fehlerbehebung der EPG-Geräte. Wir danken auch Dr. Dustin Swanson und Mr. William Yarnell vom USDA-ARS Insectary in Manhattan, KS, für die Bereitstellung von Moskitos, und Miss Miriam Ruhinda von der Kansas State University in Manhattan, KS für ihre Unterstützung beim Filmen der Verfahrensvideos. Diese Arbeit wurde durch den Zugang zum Integrated Molecular Entomology Core (IEMC) an der Kansas State University ermöglicht. Diese Forschung wurde durch das USDA Research, Education, and Economics Workforce Development Agreement (#58-3022-0-002) und das Hatch Multistate Project (NE1943) unterstützt. Dieses Manuskript ist Beitrag Nr. 24-194-J von der Kansas Agricultural Experiment Station, Kansas State University, Manhattan, KS, USA.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Instrumentierung
AC-DC 4-Kanal-Elektropenetrograph	EPG Technologies, Inc.		Enthält für EPG das Netzteil, die Steuerbox, die Schaltschnittstellenbox, vier Kopfstufenverstärker, vier Substratspannungsson
		Kabel Luftkissen	denen der menschliche Host während des EPG seine Hand/seinen Arm ablegen
DI-710 Datenerfassungshardware (AD-Platine)	DATAQ Instruments Inc.		zur Digitalisierung der analogen EPG-Signale, damit sie auf einem Computer visualisiert werden können
Dimmbare LED-Lupenlampe, große 5-fache Freisprechlupe mit Licht und Ständer zum Lesen Hobbys Basteln Nähwerkbank	Amazon.com		zur Verhaltensbeobachtung während des EPG; nur während des EPGs unplugged verwenden, da sonst Geräusche auftreten können
Dino-Lite Edge Digitalmikroskop (250-fache Vergrößerung)	Dino-Lite	AF4915ZT	zur Verhaltensbeobachtung während des EPGs
Dino-Lite Flex-Arm	Desktop-Stativ Dino-Lite	MS22B	zum Halten und Manipulieren der Kamera
Eisco Steel Retort Base Stand und Rod Set	Fisher	Scientific S41740	zum Halten des Kopftischverstärkers & Erdung des Faradayschen Käfigs (muss aus Metall sein)
EPG Online Workshop	UF IFAS Erweiterung	https://ifas-crec-entomology.catalog.instructure.com/courses/epg-workshop-2022	AKA, "Online-Ressourcen" zum Erlernen von EPG (Geräteeinrichtung, Datenerfassung und -analyse, Faradaysche Konstruktion, Silberleimvorbereitung, Konstruktion von Insektenstummeln usw.)
Furman P-1800 AR Power Regulator/Power Conditioner	Amazon.com		zur Reduzierung von Leitungsrauschen
Small Bubble Cushioning Wrap	Amazon.com		zur Verwendung als Barriere zwischen dem Host und dem Faradayschen
Käfig Troemner Talboys Labjaws Regular Clamp Holder	Fisher Scientific	02-217-121	zum Halten des Kopfstufenverstärkers & zur Erdung des Faradayschen Käfigs (muss aus Metall bestehen und darf nicht mit Kunststoff überzogen sein)
Windows Computer	Best Buy		für EPG & statistische
AnalysenSoftware
Backus 2.0 Data Analysis SAS Programm	UF IFAS Extension	https://crec.ifas.ufl.edu/extension/epg/data-analysis/	für die statistische Analyse von Signaldaten
Ebert 1.0 File Manipulator and Error Checker SAS Programme	UF IFAS Extension	https://crec.ifas.ufl.edu/extension/epg/data-analysis/	für die Vorbereitung von Dateien für die statistische Analyse von Signaldaten
SAS Version 9.4	SAS Institute Inc.		für die statistische Analyse von Signaldaten
WinDaq Lite	DATAQ Instruments Inc.		zum Aufzeichnen und Überprüfen von EPG-Daten. Enthält die WinDaq Hardware Manager Software (AKA, "Hardware Management Software") und die WinDaq Waveform Browser Software (AKA, "Waveform Reviewing Software"). Nur für die Verwendung auf Windows-Computern.
Faraday Cage
Aluminium-Siebrahmen	Home Depot	MSCF5167	für die Wände des Faradayschen Käfigs
Aluminiumblech, 0,125 (1/8) dick 3003-H14	Metals Depot	S318	für die Basis der Faradayschen
Käfig-Eckstreben, 1"	Home Depot	339547	für die Wände des Faradayschen Käfigs
Flachkopf-Kreuzschlitzschrauben, #6-32 x 1"	Home Depot	459999	für den Bau von Faradayschen
Unterlegscheiben, #6	Home Depot	638977	für den Bau von Faradayschen Käfigen
Das Digitalmultimeter Fluke 15B+ für elektrische Anwendungen misst AC/DC-Spannungs- und -Strommessungen bis zu 1000 V und 10 A sowie Widerstands-, Durchgangs-, Dioden- und Kapazitätsfunktionen	Amazon.com		für die Prüfung des Faradayschen Käfigs
Tragbares Radio AM FM, Goodes Transistorradio mit Lautsprecher, Kopfhöreranschluss, batteriebetriebenes 2AA-Radio für den Empfang über große Entfernungen, Taschenradio für den Innen-, Außen- und Notfallgebrauch	Amazon.com		zum Testen des Faraday-Käfigs
Reiner Kupferschirm, 16 x 16 Mesh mit 0,11 Drahtdurchmesser, 36" x 12'Metro	Screenworks		für die Wände des Faradayschen Käfigs
Rundkopf-Combo-Maschinenschrauben, #6-32 x 3/4"	Home Depot	528466	für Faradayscher Käfigbau
Schleifpapier, 1/2" x 1", 150 Körnung	Home Depot	19036-20-CC	zum Entfernen der Farbe von der Unterseite des Laborständers
Siebrahmenecken, 5/16"	Home Depot	WCORN516	für die Wände des Faradayschen Käfigs
Siebverzahnung, 0,14"	Home Depot	3034719	für die Wände des Faradayschen Käfigs
Insektenstummel
Messing Rosetten	Depot	801294	für die Herstellung von Insektenstummeln
Kupferdraht, 20 AWG	Amazon.com		für die Konstruktion von Insektenstümpfen
Harris wasserlösliche Grippe	Home Depot	355398	zum Löten, Beschichten des Insektenstichs und zum Herstellen einer starken Verbindung
Spitzzange	Home Depot		zum Biegen von Draht beim Bau von Insektenstummeln
Pro's Kit 900-015 Helping Hands Löthilfe	Amazon.com		zum Halten von Rosettenstiften während des Lötens
Lötzinn (mit Kolophoniumkern)	Home Depot	296497	zum Konstruieren von Insektenstümpfen
Drahtschneider Abisolierwerkzeug	Home Depot		zum Abisolieren und Schneiden von Kupferdraht beim Bau von Insektenstummeln
YIHUA 928D-III Lötkolben, 110W High Power, volldigitaler Display-Lötkolben	Amazon.com		zum Konstruieren von Insektenstummeln; kommt mit einem Ständer, Schwamm und Stahlwolle zum Reinigen
Insektensauger
Accuris ASPIRE Laborsauger	Accuris instruments	V0020	für die Absaugung des Insektensaugers; enthält den tragbaren Vakuumregler, den Edelstahladapter mit feiner Spitze (40 mm) und den Pipettenspitzenadapter
Chemglass Life Sciences Pasteur-Pipetten, 5 3/4" lange	Fisher	Scientific NC0230004	für den Einsatz als Insektensauger bei der Verkabelung von Mücken
Kommerzielles elektrisches farbiges Vinyl-Isolierband	Home Depot		zum Befestigen der modifizierten Pasteur-Pipette an der Vakuumleitung
Moskitonetz-Gebrauchsgewebe, 10 x 10 cm quadratisch	Joann Fabrics	16651622	um zu verhindern, dass Mücken in die Vakuumpumpe abgesaugt werden
Saint Gobain Performance Plastics Tube Tygon 1/4 x 7/16	Fisher Scientific	50-206-8914	für den schnellen und einfachen Wechsel zwischen verschiedenen modifizierten Pasteurpipetten
Thermo Scientific Nalgene HDPE-Schnellkupplungen (3/8 bis 7/16 Zoll) Ausweis)	Fisher Scientific	15-315B	für den schnellen und einfachen Wechsel zwischen verschiedenen modifizierten Pasteur-Pipetten
Silver Glue
Elmer's Glue-All Multi Purpose White Glue	Amazon.com		für die Vorbereitung von Silberleim
Silver Flake 99,9% rein, 4-8 & micro; m	ThermoFisher	786.09	für die Silberleimvorbereitung
Silberflocken 99,95% rein, 8-10 & Mikro; m	Inframat Advanced Materials	47MR-12F	für die Herstellung von Silberkleber
Insektenanästhesie
CO₂ Bubbler Kit, 1000 mL, #9 Gummistopfen	FlyStuff	59-181	zur Verhinderung von Insektenaustrocknung bei der Verwendung des Flypad
Flypad Rahmen, Standardgröße	FlyStuff	59-118	verhindert das Herunterfallen von Mücken Flystation
Brush	FlyStuff	59-205	zur Reduzierung der statischen Aufladung bei Arbeiten auf einem
Flypad Flystuff Flypad	FlyStuff	59-114	AKA "Anästhesiekissen" zur Betäubung von Mücken
Trichter (4 Zoll Durchmesser)	Amazon.com		zum Begasen von Mückenbechern vor dem Transfer auf das Flypad
Plexiglas oder ein flacher Kunststoffdeckel (zugeschnitten)	Home Depot	MC-27	zum Abdecken des Flypads, wenn die Mücken aufzuwachen beginnen
Absperrbare Schlauchschellen für Kunststoffschläuche Einzelne Position und einstellbare Öffnung (Sorte 1/8" bis 1/2")	Amazon.com		zum Umleiten von Gas zwischen Flypad und Trichter
Einstufiger CO₂Regler	FlyStuff	59-142	zur Regulierung des Gasflusses aus dem CO₂Tank
" T” Passend für 1/8" ID Schlauch	FlyStuff	59-123	zum Anschluss des Flypads und des Trichters an den CO₂ Tank
Schlauch, durchsichtig	FlyStuff	59-124C	zum Verbinden des Trichters und des Flypads mit dem Atemregler am CO₂ Tank
Insect Wiring
Black Cardstock, (65Lb, 176 g/m²) 8,5" x 11"	Michael's Stores Inc.	327826	, um Golddraht leichter sichtbar zu machen
Schwarzes Bastelpapier Quadrat 3,5" x 4,0"	Heftklammern	956221	, um Golddraht leichter sichtbar zu machen
Wattebäusche	Amazon.com		zum Fasten Mücken
Bastelschaum #12 Block (3,1 cm x 17,2 cm x 30,2 cm)	Joann Fabric and Craft Store	1941079	zum Halten von drahtgebundenen Mücken
Deflecto Ribbon Spender, durchsichtige	Amazon.com		zur Aufbewahrung von Golddraht
Federleichte Entomologie-Pinzette	Fisher Scientific	S72110	zur Insektenmanipulation
Feine Pinzette (FST by Dumont: #5 91150-20, Inox-Electronic)	Fine Science Tools	91150-20	zur Herstellung einer Goldschlaufe beim Verdrahten von Mücken
Feine Spitze Pinsel	Amazon.com		zur Manipulation von Mücken während der Verkabelung und des EPG; Muss bei Verwendung für EPG einen Kunststoff- oder Holzgriff haben
Standard-Transferpipetten mit feiner Spitze, schmal, 5,8 mL	Thomas Scientific	7761D21	für die Herstellung von Silberleim
Golddraht, 99,99 % rein, 0,025 mm Dicke	Goodfellow	AU005121	für die Verkabelung von Mücken
Minutien Pins, Spitze 0,2 mm, 1 cm	Fisher Scientific	NC9681411	zum Auftragen von Klebstoff auf die Mücken
Pappbecher	Starre Papierröhre		für nüchternde Mücken
Schraubstock	Fisher Scientific	50-996-811	zum Halten des winzigen Stifts während der Insektenverkabelung
Aufbewahrungsbox aus Kunststoff mit Deckel (7 Zoll x 9 Zoll x 14 Zoll)	Amazon.com		zum Transport von kabelgebundenen Mücken
Plexiglas oder ein flacher Kunststoffdeckel (auf Maß zugeschnitten)	Home Depot	MC-27	zum Abdecken des Fliegenpolsters, wenn die Mücken aufzuwachen beginnen
Selbstschließende Pinzette	Fisher Scientific	08-906	zum Halten und Manipulieren von Golddraht
Compressed Gas
CO₂Gastank	Matheson Gas		zur Betäubung von Mücken mit einem Flypad
*Common Lab Items*
Biohazard Einweg-Autoklavenbeutel, 8 1/2" x 11"	Fisher Scientific	03-410-591	zur Entsorgung von blutgefütterten Mücken
Bunsenbrenner oder Propanbrenner	Amazon.com		zur Modifikation von Pasteur-Pipetten
Farbiges Laborband	Daigger Supplies	EF9763R	zum Etikettieren, Vorbereiten von Silberkleber und Abdeckzange
Einweg-Pipettenspitzen, 1000 & Mikro; L	Fisher Wissenschaftlich		zum Aliquotieren von Wasser bei der Herstellung von Silberkleber
Seziermikroskop	Leica Microsystems		für die Verkabelung von Mücken
Präpariersonde	Fisher Scientific	NC9109673	zum Rühren und Auftragen von Silberkleber
Erlenmeyerkolben, 1000 mL	Fisher Scientific		zur Verhinderung der Austrocknung von Insekten bei der Verwendung des Flypads
Ethanol, 70%	Fisher Scientific	04-355-122	zur Bergung entflohener Mücken
Petrischalen aus Glas	Fisher Scientific	08-747B	zur Betäubung von Mücken mit Eis
Handschuhe Fisher	Scientific		für den persönlichen Schutz
Kimwipes KimTech Science Marke Wischtücher für empfindliche Aufgaben	Fisher Scientific	06-666	zum Zerkleinern von Mücken
Laborkittel	Fisher Scientific		für den persönlichen Schutz
LiBa-Sprühflaschen, wiederbefüllbare leere Sprühflaschen (waschalkoholsicher)	Amazon.com		zum Bergen entflohener Mücken
Magnetrührstab, 2 cm lang	Fisher Scientific		zum Mischen von Silberkleber
Mechanische Einkanalpipette, 1000 & micro; L	Fisher Wissenschaftlich	13-690-032	zum Aliquotieren von Wasser bei der Herstellung von
Mikrozentrifugenröhrchen mit Silberkleber, 1,5 mL	Fisher Scientific	780420	zur Aufbewahrung von Silberkleber
Parafilm M	Fisher Scientific	50-998-944	zum Abdichten von Tuben aus Silberkleber
Plastikfolie	Amazon.com		zum Abdecken des Schaumstoffblocks
Pyrex 20 mL Becherglas	Fisher Scientific	07-250-051	zum Vermischen von Silberkleber
Semi-Micro	Balance Fisher Scientific	10-919-370	zum Wiegen von Kleber und Silberflocken
Sharpie-Stift, feine Spitze	Amazon.com		zum Beschriften
Einschneidige Rasierklinge	Elektronenmikroskopie Sciences	71980	zum Reinigen von Insektenstummeln
Standard Einweg-Transferpipetten	Fisher Scientific	133-711-7mL	zum Umfüllen von Silberkleber in ein Vorratsrohr
Rührplatte	Fisher Scientific		zum Mischen von Silberkleber
Timer/Stoppuhr	Fisher Scientific		für die Zeitmessung, wie lange der Wirt jedem Insekt ausgesetzt ist
Ultrareines (18 MΩ) Wasser	Fisher Scientific		zur Vorbereitung von Silberleim
Gebrauchsschere	Fisher Scientific	08-945	zum Schneiden von Golddraht
Vortex-Mischer	Fisher Scientific		zum Mischen von Silberkleber
*Study Organisms*
Culex tarsalis Mücken	USDA ARS Center for Grain and Animal Health Research in Manhattan, KS		zur Verwendung als Studienteilnehmer

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Referenzen

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Fressverhalten von M cken Sondierverhalten Ingestionsverhalten Blutmahlzeit Aufzeichnung elektrischer Signale Pathogen bertragung Golddrahtelektrode Interaktion mit menschlichen Wirten

AC-DC Elektropenetrographie zur Untersuchung des Sondierungs- und Verschluckungsverhaltens von Culex tarsalis Mücken an menschlichen Händen

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