Begrenztes Einstreuen und Nisten als Modell für Widrigkeiten im frühen Leben bei Mäusen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein Tiermodell, um zu untersuchen, wie sich Widrigkeiten im frühen Leben, hervorgerufen durch eine verarmte Umwelt und unvorhersehbare mütterliche Fürsorge in der frühen postnatalen Phase, auf die Gehirnentwicklung und das zukünftige Risiko psychischer Störungen auswirken.

Zusammenfassung

Widrigkeiten im frühen Leben (ELA) wie Missbrauch, Vernachlässigung, Mangel an Ressourcen und ein unvorhersehbares häusliches Umfeld sind ein bekannter Risikofaktor für die Entwicklung neuropsychiatrischer Störungen wie Depressionen. Tiermodelle für ELA wurden verwendet, um die Auswirkungen von chronischem Stress auf die Gehirnentwicklung zu untersuchen, und beruhen in der Regel auf der Manipulation der Qualität und/oder Quantität der mütterlichen Versorgung, da dies die Hauptquelle für frühe Lebenserfahrungen bei Säugetieren, einschließlich des Menschen, ist. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Anwendung des Limited Bedding and Nesting (LBN) Modells bei Mäusen zur Verfügung gestellt. Dieses Modell ahmt eine ressourcenarme Umgebung nach, die fragmentierte und unvorhersehbare Muster der mütterlichen Fürsorge während eines kritischen Entwicklungsfensters (postnatale Tage 2-9) provoziert, indem es die Menge an Nistmaterial begrenzt, das der Muttermutter zum Bau eines Nestes für ihre Jungtiere gegeben wird, und die Mäuse über eine Netzplattform im Käfig von der Einstreu trennt. Repräsentative Daten werden zur Verfügung gestellt, um die Veränderungen im mütterlichen Verhalten sowie die verminderten Jungtiergewichte und langfristigen Veränderungen der basalen Corticosteronspiegel zu veranschaulichen, die sich aus dem LBN-Modell ergeben. Als Erwachsene hat sich gezeigt, dass Nachkommen, die in der LBN-Umgebung aufgezogen wurden, eine abweichende Stressreaktion, kognitive Defizite und anhedonieähnliches Verhalten zeigen. Daher ist dieses Modell ein wichtiges Instrument, um zu definieren, wie die Reifung stressempfindlicher Gehirnschaltkreise durch ELA verändert wird und zu langfristigen Verhaltensänderungen führt, die eine Anfälligkeit für psychische Störungen verleihen.

Einleitung

Die frühe postnatale Phase ist ein kritisches Entwicklungsfenster, in dem Umwelteinflüsse den Entwicklungsverlauf verschieben können. Zum Beispiel kann Widrigkeiten im frühen Leben (ELA) die Gehirnentwicklung verändern, um langfristige Veränderungen der kognitiven und emotionalen Funktionen hervorzurufen. Beispiele für ELA sind körperlicher oder emotionaler Missbrauch, Vernachlässigung, unzureichende Ressourcen und ein unvorhersehbares häusliches Umfeld, das in der Kindheit oder Jugend auftritt¹. Es ist bekannt, dass ELA ein Risikofaktor für die Entwicklung von Störungen wie Depressionen, Substanzkonsumstörungen, posttraumatischen Belastungsstörungen (PTBS) und Angstzuständen ist 2,3,4,5. Dies ist wichtig, da sich die Kinderarmut in den USA in letzter Zeit mehr als verdoppelt hat, von 5,2 % im Jahr 2021 auf 12,4 % im Jahr 2022⁶, und obwohl Armut an sich nicht unbedingt ELA ist, erhöht sie doch die Wahrscheinlichkeit verschiedener Arten von ELA⁷.

Tiermodelle sind seit langem unerlässlich, um die Auswirkungen von Stress im frühen Leben auf die Gehirnentwicklung und die Ergebnisse bei Erwachsenen zu verstehen. Die beiden wichtigsten Tiermodelle, die in den letzten Jahren verwendet wurden, um dieses Phänomen zu untersuchen, sind die mütterliche Trennung (MS) und eine verarmte Umgebung, die durch begrenztes Einstreu- und Nistmaterial (LBN) verursacht wird. MS wurde als Modell für elterliche Benachteiligung entwickelt⁸. Darin werden Nagetier-Muttertiere ihren Jungtieren weggenommen, in der Regel für mehrere Stunden, jeden Tag bis zur Entwöhnung⁸. Es wurde festgestellt, dass das MS-Paradigma zu depressiven und angstähnlichen Verhaltensweisen im Erwachsenenalter führt⁹ sowie zu einer abweichenden Reaktion auf chronischen Stress^10,11. Auf der anderen Seite trennt das LBN-Modell, das zuerst im Baram-Labor¹² entwickelt wurde, das Muttertier nicht von den Jungen, sondern modifiziert vielmehr die Umgebung, in der die Jungtiere aufgezogen werden, und ahmt eine ressourcenarme Umgebung nach^12,13. Die Verringerung der Menge an Nistmaterial und die Verhinderung des direkten Zugangs zur Einstreu in diesem Modell führt zu einer Unterbrechung der mütterlichen Versorgung durch die Muttertiere³. Da eine robuste und vorhersagbare mütterliche Fürsorge für die ordnungsgemäße Entwicklung kognitiver und emotionaler Gehirnschaltkreise erforderlich ist¹⁴, kann eine fragmentierte mütterliche Fürsorge durch LBN zu einer Reihe von Ergebnissen führen, darunter eine überaktive Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Achse (HPA), ein verschobenes exzitatorisch-inhibitorisches Gleichgewicht in mehreren Hirnregionen, erhöhte Corticotropin-Releasing-Hormon (CRH)-Spiegel und depressives Verhalten bei den Nachkommen^13. 15,16,17,18,19.

Der genaue Mechanismus, durch den ELA zu einem erhöhten Risiko für neuropsychiatrische Störungen führt, ist nicht vollständig verstanden. Es wird angenommen, dass es mit Veränderungen in den Schaltkreisen der HPA-Achse zusammenhängt^19,20, und neuere Erkenntnisse zeigen, dass dies durch Veränderungen in der synaptischen Beschneidung der Mikroglia verursacht werden kann¹⁹. Es hat sich gezeigt, dass das LBN-Modell ein entscheidendes Instrument ist, um den Einfluss der perinatalen Umgebung auf die Gehirnentwicklung und die langfristigen Verhaltensergebnisse zu verstehen. Obwohl dieses Modell ursprünglich für Ratten entwickelt wurde, wurde es auch für Mäuse angepasst, um die Vorteile der bestehenden transgenen Werkzeuge zu nutzen ^12,13. Bemerkenswert ist, dass das Modell bei beiden Spezies sehr ähnlich ist und hochgradig konvergente Ergebnisse hervorruft, wie z. B. Veränderungen in der HPA-Achse, kognitive Defizite und depressives Verhalten, was seinen speziesübergreifenden Nutzen und sein translationales Potenzial unterstreicht. In diesem Artikel wird detailliert beschrieben, wie das Modell der begrenzten Einstreu und Nistung bei Mäusen angewendet werden kann, indem das Verhalten der Mutter und die Ergebnisse der Nachkommen gesammelt und analysiert werden, um die Wirksamkeit des Modells und die erwarteten Ergebnisse zu validieren.

Protokoll

Alle Eingriffe mit Tieren wurden in Übereinstimmung mit dem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee der Georgia State University (Zulassungsnummer A24011) genehmigt. Die Mäuse wurden in den Tierkliniken der Georgia State University gezüchtet und gehalten. Die Experimente wurden an einem C57BL/6J-Stamm während der perinatalen Periode (postnataler Tag [P] 2-10) durchgeführt und umfassten Männer und Frauen. Die für diese Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Material-Setup

1. Schneiden Sie die Netztrennwand entsprechend den Abmessungen des Käfigs zu und lassen Sie an den längeren Seiten einen Überschuss von 3 cm.
   HINWEIS: Das in der Materialtabelle angegebene Netz wird vom Hersteller zugeschnitten.
2. Falten Sie die Kanten, einschließlich des Überschusses, so, dass eine Plattform entsteht, die genau an die Kanten des Käfigs angepasst ist und eine Höhe von ~2,5 cm über dem Boden hat. Dadurch können Urin und Kot durch die Maschentrennwand fließen, ohne dass die Tiere die Maiskolbeneinstreu zurückholen können. Stellen Sie abschließend sicher, dass alle scharfen Kanten nach unten geklappt sind, um Schäden an den Tieren zu vermeiden.
   HINWEIS: Die Netztrennwände sind wiederverwendbar und sollten zwischen den Anwendungen gründlich mit heißem Wasser und Seife gereinigt und anschließend mit 70 % Ethanol besprüht werden.
3. Stellen Sie die Kameras auf Stative auf und bereiten Sie das Aufnahmesystem vor.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, eine Videoverwaltungssoftware zu verwenden. Diese Aufzeichnungen führen zu .mp4 Dateien, die automatisch in 1-Stunden-Segmente unterteilt werden.
4. Passen Sie die Einstellungen auf kontinuierliche Aufzeichnung an.
   HINWEIS: Zusätzliche empfohlene Einstellungen sind eine Auflösung von 1920 x 1080 und 30 Bilder/s.
5. Legen Sie fest, dass die resultierenden .mp4-Dateien in 1-Stunden-Segmente unterteilt werden, wenn dies nicht automatisch von der Videoverwaltungssoftware durchgeführt wird.
6. Verwenden Sie bei der Analyse der Lights-Off-Periode Infrarotbeleuchtung.
   HINWEIS: Um die Blendung der Aufnahme an der Seite des Käfigs zu reduzieren, wird empfohlen, das Infrarot (IR) der Kamera zu deaktivieren. Verwenden Sie stattdessen IR-Flutlichter im Raum während der Dunkelphasenaufnahme.

2. Paradigma der begrenzten Einstreu und Verschachtelung (LBN)

1. Verpaaren Sie 1-4 Hündinnen mit einem einstöckigen männlichen Züchter.
   HINWEIS: Das empfohlene Alter für die erste Paarung bei Versuchsweibchen beträgt P75. Die Verwendung von nulliparen Weibchen ist ideal, aber in Situationen, in denen dies nicht möglich ist, wie z. B. bei wertvollen transgenen Mauslinien, können mehrgebärige Weibchen noch etwa vier Monate danach fortzüchten. Es wird empfohlen, obwohl nicht vorgeschrieben, täglich nach Vaginalpfropfen zu suchen, um den Tag der Paarung (Embryonaltag [E]0) zu bestätigen.
   1. Sobald die Muttertiere trächtig sind, halten Sie die Störungen minimal.
      HINWEIS: Mehrgebärende Weibchen können in der Regel wiederverwendet werden, um bis zu fünf Würfe zu zeugen, bevor die Fruchtbarkeit abnimmt. Werden die Dämme für den Versuch wiederverwendet, sollten sie bevorzugt jedes Mal für den gleichen Zustand verwendet werden oder nur von Control auf LBN umgestellt werden, niemals aber umgekehrt, um Restwirkungen von LBN auf den Damm zu vermeiden.
2. Auf E17 (oder wenn die Stecker nicht überprüft wurden, wenn die Weibchen offensichtlich trächtig aussehen) trennen Sie die Weibchen in ihren eigenen Standard-Plexiglaskäfig und geben Sie ihnen ein Baumwollnestchen (5 x 5 cm), um ein Nest zu bauen.
   HINWEIS: Es ist optimal, getrennte Weibchen in einen ruhigen, kleinen Raum abseits des Hauptraums der Kolonie zu bringen, mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus und minimalen Unterbrechungen durch das Personal für die Kontroll- und LBN-Einrichtung.
3. Notieren Sie sich das Geburtsdatum (ca. E19).
4. Bei P2 zählen Sie die Welpen und nehmen sie ein Geschlecht. Zuweisung von Würfen nach dem Zufallsprinzip zu LBN- oder Kontrollbedingungen (wenn es sich um den ersten Wurf des Damms handelt). Diese Interaktion mit den Welpen sollte zwischen 1 und 4 Stunden nach dem Einschalten der Lichter abgeschlossen sein.
   1. Setzen Sie die Welpen vorsichtig in einen neuen, sauberen Käfig, um sie nach Geschlecht zu sortieren. Der anogenitale Abstand zwischen Anus und Genitalien ist bei Männern größer als bei Frauen und kann als Identifikator verwendet werden.
   2. Trennen Sie Männchen und Weibchen in Gruppen, um sie zu zählen.
   3. Keulen Sie Würfe mit mehr als 8 Welpen und werfen Sie Würfe mit weniger als 4 Welpen aus. Die optimale Wurfgröße liegt bei 4-8 Jungtieren, da alles außerhalb dieses Bereichs die Verteilung der mütterlichen Versorgung während der Studie beeinträchtigen kann.
      HINWEIS: Die Variablen, die aufgrund der Wurfgröße beeinflusst werden können, sind das Gewicht der Jungen, die Fütterungsmöglichkeit und die Interaktionen zwischen Mutter und Jungtier, die das Experiment verwirren könnten. Im Idealfall werden Mäuse nicht kreuzgepflegt, da sie mit geringerer Überlebenswahrscheinlichkeit überleben als Ratten.
5. Richten Sie die Bedingungen "Steuerung" und "LBN" ein, wie in Abbildung 1 dargestellt.
   1. Kontrolle: Verwenden Sie einen Maus-Schuhkarton-Käfig in Standardgröße (19,4 cm x 13,0 cm x 38,1 cm) mit ~220 g Maiskolben-Einstreu (abhängig von den Käfigabmessungen, mit dem Ziel von ~1 cm Höhe) und einem quadratischen Standard-Nestchen aus Baumwolle (5 x 5 cm).
      1. Um den Mäusen zu helfen, sich an diese ungewohnte Umgebung zu gewöhnen, legen Sie eines ihrer Kotpellets aus ihrem alten Käfig in jede Ecke des neuen Käfigs. Legen Sie außerdem eine kleine (Cent-große) Menge gebrauchter Baumwolle aus dem vorherigen Käfig über das neue Nestlet.
   2. LBN: Legen Sie den zuvor vorbereiteten Netzteiler in einen Standard-Schuhkartonkäfig mit ~110 g Maiskolbeneinstreu (mit Ziel für ~0,5 cm Höhe). Das Netz sollte einen direkten Kontakt zwischen den Mäusen und der Maiskolbeneinstreu verhindern.
      1. Zum Schluss die Hälfte eines Nestlet-Quadrats aus Baumwolle (2,5 x 5 cm) hinzufügen. Wiederholen Sie alle oben genannten Schritte, um sich zu akklimatisieren.
         HINWEIS: Es wird empfohlen, Schuhkartonkäfige auf standardmäßigen, nicht belüfteten Gestellen zu halten, da sich gezeigt hat, dass dieser Aufbau leise ist und bei Welpen, die in LBN-Käfigen²¹ aufgezogen werden, keine Unterkühlung hervorruft. Dies ist jedoch möglicherweise nicht der Fall, wenn der Luftstrom in belüfteten Käfigen erhöht wird. Daher sollten Forscher den Geräuschpegel und die PUP-Kerntemperaturen in ihrem System messen, wenn sie belüftete Käfige verwenden.
6. Setzen Sie die Welpen in den dafür vorgesehenen Käfig und setzen Sie sie auf das Nestchen. Setze als Nächstes das Muttertier in den Käfig mit dem Gesicht zu den Welpen, da es so schneller bemerkt, dass sie da sind. Stellen Sie sicher, dass mindestens 8 Tage lang genügend Futter und Wasser enthalten sind, um eine Störung des Käfigs bis zum Ende des Versuchs bei P10 zu vermeiden.
7. Platzieren Sie eine Kamera auf einem Stativ vor dem Käfig, so dass Sie eine klare Seitenansicht auf die Hündin und ihre Jungen haben. Optional können Sie Spiegel um den Käfig herum platzieren, um alle Winkel besser einzufangen. Obwohl nur 1 h Videoaufzeichnung pro Tag analysiert werden muss, ist die Kamera so eingestellt, dass sie während des Experiments 24/7 kontinuierlich aufzeichnet, so dass Störungen überwacht werden können.
   HINWEIS: Mäuse können auch persönlich beobachtet werden, und das Verhalten der Mutter kann von Hand bewertet werden, obwohl es vorzuziehen ist, auf Video aufzuzeichnen, um Störungen durch die Anwesenheit des Experimentators im Raum zu vermeiden. Wenn belüftete Gestelle verwendet werden, kann es auch erforderlich sein, ein anderes Verfahren zur Anordnung von Kameras für die Aufzeichnung der Mutterpflege als das hier beschriebene zu verwenden.
8. Bringen Sie am Morgen von P10 alle Tiere in die Standardkäfigbedingungen zurück (idealerweise identisch mit den oben genannten Kontrollbedingungen) und wiegen Sie die Jungtiere.
9. Behandeln Sie alle Welpen gleich und entwöhnen Sie sich bei P21 in Gruppen von 2-5 gleichgeschlechtlichen Wurfgeschwistern.
   HINWEIS: Versuchen Sie, gleichgeschlechtliche Wurfgeschwister nach Möglichkeit zusammen unterzubringen, aber wenn nötig, halten Sie gleichgeschlechtliche Nachkommen aus verschiedenen Würfen im gleichen Zustand zusammen. Es wird empfohlen, die Haltungskontrolle und die LBN-Nachkommen zusammen zu vermeiden (siehe Yang et al. zur Wirkung der Cagemat-Zusammensetzung auf Verhaltensphänotypen²²).

Abbildung 1: Beispiel für die Einrichtung eines Käfigs. Der Käfig auf der linken Seite des Bildes zeigt einen Standard-Kontrollkäfig (CTL), der eine volle Menge Einstreu und ein vollständiges Nestchen enthält. Der Käfig auf der rechten Seite zeigt eine begrenzte Einstreu- und Nisteinrichtung (LBN) mit der Hälfte der Einstreu, der Hälfte eines Nestchens und einer Netztrennwand zur Trennung der Tiere von der Einstreu. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Bewertung des mütterlichen Verhaltens

1. Obwohl in diesem Setup kontinuierliche Aufzeichnungen erfasst werden, analysieren Sie nur 1 h von P3 bis P6. Es wird empfohlen, Videos zu analysieren, die frühestens 1 Stunde nach dem Wechsel der Ampel aufgenommen wurden, um eine Gewöhnung zu ermöglichen und Videos von einer konstanten Zeit pro Tag zu analysieren.
   HINWEIS: Der Zeitraum von P3 bis P6 enthält in der Regel die größten Unterschiede in der mütterlichen Versorgung aufgrund von LBN; Daher ist es nur in diesen Tagen notwendig, zu analysieren. Die vorgeschlagene Beobachtungs-/Aufzeichnungszeit ermöglicht die Erfassung der Aktivität nach dem Übergang vom aktiven zum inaktiven Zyklus oder umgekehrt. Die inaktive Phase ist jedoch die Phase, in der das Muttertier am ehesten mütterliche Fürsorge in Anspruch nimmt, und es wurde bereits gezeigt, dass es die größten Gruppenunterschiede im mütterlichen Verhalten aufweist³.
   HINWEIS: Erfassen Sie P2-Aufnahmen später als an anderen Tagen, da Mäuse mindestens 1 Stunde benötigen, um sich an den Käfigwechsel zu gewöhnen. Wenn es sich nicht um eine interessante Variable handelt, sollten Sie diesen Tag aus der Analyse streichen.
2. Bewerten Sie alle Verhaltensweisen, wie in Tabelle 1 dargestellt. In der Regel werden Verhaltensweisen in den ersten 50 Minuten nach Beginn der Datenerfassung bewertet.
   HINWEIS: Dies kann von Hand oder elektronisch mit der Behavioral Observation Research Interactive Software (BORIS, einer Open-Source-Software) oder einer ähnlichen Art von Software erfolgen. Die folgenden Anweisungen gelten für die Handwertung und können für jede gewählte Software angepasst werden.
3. Notieren Sie in einer ausgedruckten Tabelle das beobachtete Verhalten mit der Abkürzung, der Startzeit und Dauer des Kampfes sowie allen beschreibenden Notizen. Wenn das Hündchen zum Beispiel aktiv säugt und dann das Nest verlässt, aber die Jungtiere noch an ihr hängen, notieren Sie dies als AN, gefolgt von O. Die Beschreibung der noch angehängten Welpen (und wie viele) sollte als Notiz an der Seite aufbewahrt werden, falls dies später benötigt wird.
   HINWEIS: Verhaltensweisen mit einer Länge von weniger als 3 s werden nicht analysiert. Diese Regel hilft dabei, vorübergehende Verhaltensweisen herauszufiltern, die auf äußere Störungen wie Umgebungsgeräusche zurückzuführen sind. Eine Ausnahme wird gemacht, wenn es eine sichtbare Unterbrechung eines AN-Kampfes gibt (z. B. durch eine große Bewegung oder Dehnung), die schnell wieder aufgenommen wird. In diesem Fall ist das festgestellte Verhalten AN, gefolgt von N-AN, wie in Tabelle 1 beschrieben.
4. Falls mehrere Verhaltensweisen gleichzeitig auftreten, zeichnen Sie das aktivste auf. Ein Beispiel dafür ist, wenn das Muttertier schwach säugt, aber später mit dem Lecken und Putzen beginnt, wird festgestellt, dass das niedrige Stillen aufhört, und das nächste Verhalten sollte als LG markiert werden, mit dem Hinweis, dass dies während LN aufgetreten ist.

Art des Verhaltens		Abkürzung	Beschreibung
Lecken / Pflegen		LG	Die Hündin ist damit beschäftigt, ihre Jungen zu lecken/zu pflegen.
Aktive Pflege		EIN	Die Hündin säugt ihre Jungen im Stehen, während ihr Rücken gewölbt ist.
Neue aktive Pflege		N-AN	Dieses Verhalten wird speziell dann angewendet, wenn das Muttertier das Stillen unterbrochen hat, aber schnell wieder aufgenommen wird. Dies ist eine Ausnahme von der 3er-Regel.
Geringe Pflege		LN	Die Hündin säugt ihre Jungen aktiv, aber ihr Rücken ist niedrig oder fast flach. Dieses Verhalten tritt in der Regel nach einer gewissen Zeit auf AN auf.
Seitliche Pflege		SN	Die Hündin liegt beim Säugen auf der Seite (auch passives Stillen genannt).
Aus dem Nest		O	Die Hündin ist nicht auf dem Nest und sie frisst/trinkt nicht. Dies kann man daran beobachten, dass sie um den Käfig herumläuft oder auf Erkundungstour geht.
Essen/Trinken		E	Der Damm ist vom Nest weg und frisst oder trinkt.
Selbstpflege		SG	Die Mutter putzt sich selbst.
Welpen tragen		C	Das Muttertier trägt die Jungen, in der Regel, um sie zurück ins Nest zu bringen.
Nestbau		NB	Der Damm baut oder verlegt das Nest.
Auf Nest verschieben		M	Der Damm bewegt sich auf dem Nest. Dies zeigt sich darin, dass das Muttertier mit den Welpen auf eine andere Weise interagiert als LG oder jede Art des Säugens, wie z. B. Schnüffeln, Aufziehen oder Treten auf die Jungen.

Tabelle 1: Beschreibung des Betreuungsverhaltens von Müttern.

4. Analyse von Daten zum mütterlichen Verhalten

1. Stellen Sie die Bewertungsergebnisse in einer Tabelle zusammen.
2. Wenn die Videos elektronisch analysiert wurden, löschen Sie die Verhaltensweisen mit Anfällen, die kürzer als 3 s sind, wie in Schritt 3 beschrieben.
3. Berechnen Sie die durchschnittliche Kampflänge, die durchschnittliche Häufigkeit und die Gesamtdauer des Leckens und Putzens für jeden Beobachtungstag.
   HINWEIS: Deskriptive Statistiken können für jedes der bewerteten Verhaltensweisen durchgeführt werden, aber Lecken und Putzen stellen in der Regel die offensichtlichste Störung in Bezug auf die Fragmentierung nach LBN dar (d. h. kürzere, häufigere Kämpfe). Diese Variablen können als Durchschnitt über P3-P6 oder als wiederholte Messungen pro Tag analysiert werden, um nach Veränderungen im Laufe der Zeit zu suchen, wenn dies von Interesse ist.

5. Berechnung der Entropie

HINWEIS: Die Entropie oder Unvorhersehbarkeit des mütterlichen Betreuungsverhaltens wird auf der Grundlage der von Vegetabile et ^al.23 vorgeschlagenen Methode berechnet. Diese Methode basiert auf der Annahme, dass das mütterliche Pflegeverhalten als Markov-Kette wirkt, mit der die Entropierate einer Verhaltenssequenz abgeschätzt werden kann. Die Abfolge der Verhaltensweisen jedes Mutters wird mit Hilfe der empirischen Übergangsmatrix charakterisiert

ij> _{i,j = 1... 7} der bedingten Wahrscheinlichkeiten des Übergangs von einem Verhalten (i) zu einem anderen Verhalten (j), und die Entropierate wird daraus wie zuvor beschrieben^{berechnet 3,23} und wie folgt:

Dabei ist p_ij die bedingte Wahrscheinlichkeit, dass das Verhalten J als nächstes beobachtet wird, nachdem ein DAM beobachtet wurde, der das Verhalten i ausführt, π_i die Häufigkeit ist, mit der das Verhalten i beobachtet wird, und M (=7) die Gesamtzahl der verschiedenen Verhaltensweisen ist. Der Leser wird auf Vegetabile et ^al.23 verwiesen, um die theoretischen Grundlagen der Gleichungen zu erörtern; Hier liegt der Fokus auf der Anwendung der Methode im LBN-Modell.

1. Um dies zu berechnen, ordnen Sie das für die Analyse erforderliche Format an.
   1. Kombinieren Sie AN, LN, SN und N-AN in einer einzigen Variablen mit dem Namen N, indem Sie die Zeiten addieren, da sie alle Pflege beinhalten.
      HINWEIS: In Tabelle 1 finden Sie eine Beschreibung des Betreuungsverhaltens von Müttern.
   2. Fügen Sie die Verhaltensweisen, die nicht mit selbst- oder welpengesteuerten Verhaltensweisen (M und O) zusammenhängen, zu O hinzu.
   3. Geben Sie LG, E, SG, C und NB separat ein, um insgesamt 7 Verhalten zu erhalten.
2. Erstellen Sie eine Tabelle mit Spalten in der folgenden Reihenfolge: Maus-ID, Wurf-ID, Wurf #, Behandlung, Tag, Uhrzeit, Verhalten und Status.
   1. Fügen Sie in der Maus-ID die Mauslinie/den Genotyp der Mutter hinzu.
   2. Verwenden Sie in der Wurf-ID die Kennung des Muttertiers, gefolgt von der Wurfnummer.
   3. Geben Sie in Wurf # die Anzahl der Würfe an, die der Damm hatte.
   4. Stellen Sie sicher, dass die Behandlung LBN oder Kontrolle ist, je nach den Bedingungen, unter denen die Tiere untergebracht wurden.
   5. Geben Sie den Tag als entsprechenden postnatalen Tag an, der analysiert wurde.
   6. Geben Sie die Zeit als Zeitstempel im Video an, wann das Verhalten gestartet und beendet wurde (relativ zum Beginn der Aufzeichnung).
   7. Wählen Sie das Verhalten aus den sieben zuvor beschriebenen Verhalten (N, O, LG, E, SG, C und NB) aus (Tabelle 1).
   8. Markieren Sie die beiden Statustypen START und STOP. Daher wird jedes Verhalten zweimal angezeigt. Die erste Notation markiert den Start, die zweite den Stopp.
3. Fügen Sie diesem Format folgend die Informationen aller analysierten Tage hinzu.
4. Importieren Sie in der R-Umgebung die Datasets, die wie oben formatiert wurden.
5. Installieren Sie die Pakete, die unter https://github.com/bvegetabile/entropyRate verfügbar sind.
   HINWEIS: Das Ausführen dieses Codes führt zu einem Ordner mit dem Namen LBN. Unabhängig von der Bedingung enthält dieser Ordner die berechnete Entropie. Zusätzlich kann die Entropie jedes Tages dann vom Probanden für P3-P6 gemittelt und zwischen den Bedingungen verglichen werden.

Ergebnisse

Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, wie ELA, die durch eine verarmte Umgebung in LBN-Käfigen auferlegt wird, die mütterliche Fürsorge von Muttertieren und die physiologischen Ergebnisse der Nachkommen beeinflusst. Die tägliche Entropie im mütterlichen Betreuungsverhalten ist in LBN über die Tage P3-P6 höher (F_1,58 = 7,21, p = 0,0094; Abbildung 2A) sowie die durchschnittliche Entropie jedes Damms aus diesem Zeitraum (t₁₅ = 3,03, p = 0,0085; Abbildung 2B). Bemerkenswert ist, dass es keinen signifikanten Unterschied in der durchschnittlichen Entropierate zwischen verschiedenen Würfen desselben Muttertiers gibt, wenn sie innerhalb derselben Behandlungsgruppe gehalten werden (F_{1.699, 4.247} = 0.57, p = 0.58; Abbildung 2C), was darauf hindeutet, dass die Entropierate für jeden Damm ein einigermaßen stabiles Merkmal sein könnte. Unter all den Verhaltensweisen ist das Lecken und Pflegen dasjenige, das sich bei LBN³ als am fragmentiertesten erwiesen hat. Die LBN-Muttertiere zeigen eine höhere Häufigkeit des Leckens und Putzens ihrer Jungtiere (LG) (t₁₆ = 4,04, p = 0,0010; Abbildung 2D) und in kürzeren Kämpfen (t₁₆ = 3,25, p = 0,0050; Abbildung 2E). Es gibt jedoch keinen signifikanten Unterschied in der Gesamtdauer von LG zwischen den Control- und LBN-Dämmen (t₁₆ = 1,52, p = 0,15; Abbildung 2F).

Abbildung 2: Analyse des mütterlichen Verhaltens. (A) Die tägliche Entropierate ist bei Müttern mit begrenzter Einstreu und Nistfähigkeit (LBN) höher als bei Müttern mit begrenzter Einstreu und Nist. Kontrolle (CTL), wie sie mit dem Mixed-Effects-Modell analysiert wurde (F_1,58 = 7,21, p = 0,0094). (B) Die durchschnittliche Entropierate ist in LBN-Staudämmen höher als in der Region. CTL (t₁₅ = 3,03, p = 0,0085). (C) Die durchschnittliche Entropierate (P3-P6) unterscheidet sich nicht signifikant zwischen mehreren Würfen innerhalb desselben Muttertiers, wenn sie in derselben Behandlungsgruppe gehalten wird (F_1,699,4,247 = 0,57, p = 0,58). Jede Linie stellt einen einzelnen Damm dar. (D) Die kumulative Häufigkeit von Leck- und Pflegeereignissen (LG) ist bei LG-Muttertieren höher als bei LG-Muttertieren. CTL (t₁₆ = 4,04, p = 0,0010). (E) Die LG-Durchschnittslänge ist bei LG-Müttern kürzer als bei LG-Müttern. CTL (t₁₆ = 3,25, p = 0,0050). (F) Die kumulierte Zeit, die auf LG verbracht wird, unterscheidet sich aufgrund von LBN nicht signifikant (t₁₆ = 1,52, p = 0,15). Die Daten sind Mittelwerte ± SEM, * p < 0,05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Jungtiere, die unter LBN-Bedingungen aufgezogen wurden, sind mit P10 signifikant kleiner (t₆₁ = 6,30, p < 0,0001; Abbildung 3A). Dieser Unterschied besteht typischerweise im Entwöhnungsalter fort (t₆₂ = 6,29, p = <0,0001; Abbildung 3B) wird aber im Erwachsenenalter nicht mehr beobachtet (T₃₈ = 1,08, P = 0,29; Abbildung 3C). Der Corticosteronspiegel ist jedoch zu Studienbeginn im Erwachsenenalter erhöht (t_18,79 = 2,23, p = 0,038; Abbildung 3D), was auf anhaltende physiologische Wirkungen von LBN hindeutet. Dies sind die zu erwartenden Unterschiede in einem erfolgreichen Versuchsaufbau. Im Falle eines suboptimalen Setups können die Werte der LG-Kampflänge, der Entropie und der Pup-Gewichte keine Unterschiede aufweisen, wahrscheinlich aufgrund einer gestressten "Kontroll"-Gruppe. Für die Zwecke dieser Arbeit wurde das Geschlecht bei der Analyse der Nachkommenergebnisse kollabiert, da Geschlechtsunterschiede in den hier beschriebenen physiologischen Ergebnissen typischerweise nicht beobachtet werden; Geschlechtsunterschiede bei anderen Arten von Ergebnissen, wie z. B. kognitivem und emotionalem Verhalten, werden in diesem Modell jedoch häufig berichtet und sollten weiter untersucht werden⁴.

Abbildung 3: Ergebnisse der Nachkommen. (A) Begrenztes Einstreuen und Nisten (LBN) verringert das Gewicht der Jungen, gemessen bei P10, kurz vor der Rückkehr in die Standardkäfige (t₆₁ = 6,30, p < 0,0001). (B) Das Gewicht wird durch LBN im Entwöhnungsalter immer noch verringert (t₆₂ = 6,29, p < 0,0001). (C) Das Erwachsenengewicht unterscheidet sich nicht mehr aufgrund von LBN (t₃₈ = 1,08, p = 0,29). (D) Die Ausgangskonzentration von Corticosteron im Erwachsenenalter wird durch LBN erhöht, wie mit dem Welch-t-Test analysiert (t_18,79 = 2,23, p = 0,038). In allen Diagrammen werden Frauen mit Kreisen und Männer mit Dreiecken dargestellt. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM, *p < 0,05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Dieser Artikel enthält ein detailliertes Protokoll zur Anwendung des LBN-Modells bei Mäusen. Dieses Modell ist ein wichtiges Instrument, um zu verstehen, wie eine ethologisch und translational relevante Form von chronischem Stress im frühen Leben zur Entwicklung neuropsychiatrischer Störungen bei den Nachkommen beiträgt¹³. Es ist auch nützlich, um das Verhalten von Müttern und Veränderungen im Gehirn der Muttertiere aus molekularer, neuroendokriner oder schaltkreisbasierter Perspektive zu untersuchen²⁴. Bei dieser Art von Fragen kann die Multiparität eine wichtigere Variable sein, die es zu berücksichtigen gilt. Wir haben beobachtet, dass die Entropiewerte des mütterlichen Verhaltens über mehrere Würfe innerhalb desselben Muttertiers hinweg konsistent bleiben (Abbildung 2C), was darauf hindeutet, dass die Entropie für jedes Muttertier ein einigermaßen stabiles Merkmal sein könnte. Diese Erkenntnis kann die Verwendung von mehrgebärenden weiblichen Mäusen rechtfertigen, wenn es nicht möglich ist, nur nullipare weibliche Mäuse zu verwenden, wie z. B. bei teuren oder seltenen transgenen Mäusen. Aufgrund der möglichen unbeabsichtigten Auswirkungen der Multiparität auf andere Variablen (z. B. intrauterine Umgebung) wird empfohlen, dass der Versuchsleiter die Verwendung von mehrgebärenden Weibchen während der Datenanalyse statistisch kontrolliert.

Es ist wichtig zu beachten, dass dieses Modell sehr empfindlich auf Umweltstörungen reagiert. Mehrere Faktoren können die Tiere stören und zu Problemen und suboptimalen Ergebnissen führen, wie z. B. Käfigüberflutungen oder laute Geräusche, z. B. von nahe gelegenen Baustellen. In der Regel führen diese Störungen dazu, dass die Kontrolltiere gestresst werden, so dass es keine Unterschiede zwischen den Kontroll- und LBN-Bedingungen gibt. Ein Indikator für diese Probleme könnten ähnliche Gewichte bei Kontroll- und LBN-Jungtieren bei P10 und ähnliche Entropiewerte im mütterlichen Pflegeverhalten sein. Aus diesem Grund ist die ideale Einrichtung ein Mütterpflegeraum, der nur zu diesem Zweck genutzt wird, ruhig und fern von der Kolonie und anderem Laborpersonal. Störungen können auch zu Kannibalismus bei Jungtieren führen, insbesondere bei Muttertieren, die jünger als P75 sind. Das Risiko, Jungtiere durch Kannibalismus zu verlieren, ist bei Muttertieren nach P75 und oft nach dem ersten Wurf geringer. Eine alternative Version dieser Methode verschiebt den Zeitpunkt der experimentellen Manipulation auf P4-P11, um das Risiko von Kannibalismus noch weiter zu verringern^25,26; Dies ist unter den vorliegenden Laborbedingungen jedoch nicht erforderlich. Eine andere Version von LBN verwendet keinen Netzteiler, begrenzt aber dennoch die Menge an Einstreu und Nistmaterial für die gesamte postnatale Periode vor der Entwöhnung²⁷. Es ist wichtig zu beachten, dass eine Änderung des Zeitplans zu unterschiedlichen Ergebnissen führen kann, wie z. B. missbräuchlichem mütterlichem Verhalten, was wiederum zu unterschiedlichen Ergebnissen der Nachkommen führen kann, wie z. B. angstähnliches Verhalten^25,28. Andere häufige Probleme sind der Verlust von Daten über das Verhalten der Mutter aufgrund des Kamerawinkels und der großen Nestgröße; Um dies zu erleichtern, wird empfohlen, einen Spiegel im hinteren Teil des Käfigs anzubringen und darauf zu achten, dass Sie nur ein einzelnes Nestchen in der Kontrollbedingung bereitstellen, um zu verhindern, dass das Nest zu groß wird und die Jungtiere vor der Kamera verborgen bleiben. Schließlich ist es wichtig, dass das Netz richtig in den Käfig passt, um zu verhindern, dass Welpen stecken bleiben oder sich verletzen.

Ein Vorteil des LBN-Modells besteht darin, dass es leicht angepasst und mit anderen experimentellen Faktoren kombiniert werden kann. Beispiele für die Variablen, die zu diesem Protokoll hinzugefügt werden können, sind die Ernährung^29,30, die Immunherausforderungen^30,31, verschiedene transgene Linien^32,33 und die Chemogenetik¹⁹. Darüber hinaus verwenden einige Versionen dieses Modells einen Zeitrahmen von P10-P17 und kombinieren ihn mit der mütterlichen Trennung (MS)34,35,36. Dieses Paradigma wurde auch als pränataler Stressor adaptiert, bei dem Muttertiere in der LBN-Umgebung von E14 bis E19^37,38 untergebracht sind, die Jungtiere jedoch nie direkt dem Stress ausgesetzt sind. Schließlich verwenden einige Studien ein Two-Hit-Modell, das ELA in Kombination mit verschiedenen Stresstests an den Nachkommen im Erwachsenenalter beinhaltet^19,39.

Eine der Einschränkungen dieser Methode besteht darin, dass sie keinen hohen Durchsatz aufweist. Die Menge der dabei produzierten Daten ist durch die Anzahl der Kameras und den gleichzeitig verfügbaren Platz begrenzt, obwohl die Würfe im Laufe der Zeit leicht gestaffelt werden können. Die manuelle Bewertung des mütterlichen Verhaltens ist besonders zeitaufwändig und kann zu Beobachterverzerrungen führen, aber die automatisierte Bewertung wird derzeit dank des Aufkommens von Ansätzen, die auf maschinellem Lernen basieren, entwickelt⁴⁰. Wenn die Daten von Hand bewertet werden, wird empfohlen, dass dieselbe Person alle Videos für ein Experiment bewertet, um die Variabilität zwischen den Beobachtern zu verringern. Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass dieses Modell für Nagetiere konzipiert ist, die hauptsächlich auf die mütterliche Fürsorge angewiesen sind, was es schwierig macht, die biparentale Fürsorge zu untersuchen. Einige Gruppen haben jedoch die väterliche Deprivation als Alternative zur MS bei biparentalen Arten wie der Kalifornischen Maus^{angenommen 41,42}, so dass es denkbar ist, dass LBN auch für diese Arten angepasst werden könnte.

Neben LBN ist die mütterliche Trennung das andere prominenteste Modell für ELA, da andere Formen von Stress, die bei Erwachsenen eingesetzt werden (z. B. Restraint-Stress), ethologisch nicht relevant sind und Jungtiere nicht auf die gleiche Weise betreffen. LBN unterscheidet sich von MS dadurch, dass es sich um eine Form von chronischem Stress handelt, die fragmentiertes und unvorhersehbares mütterliches Verhalten hervorruft, während bei MS die Deprivation intermittierend ist und in der Regel zu vorhersehbaren Zeiten jeden Tag auftritt⁴³. Interessanterweise können beide Modelle Veränderungen in der HPA-Achse und depressive Verhaltensweisen bei Nagetieren verursachen, obwohl LBN ein reproduzierbareres Protokoll mit weniger Interaktion mit Experimentatoren und höherer Konsistenz in den Laboratorien sein^könnte 1,11,13,16. Obwohl dieses Protokoll nützlich ist, um einige Ursachen der Variabilität zu mildern (z. B. im Zusammenhang mit dem Versuchsator), können andere Aspekte wie Unterschiede in den Tiereinrichtungen, der Herkunft der Tiere oder dem Stamm die Ergebnisse beeinflussen. Zum Beispiel ist bekannt, dass BALB/c-Mäuse stärker auf chronischen Fixierungsstress reagieren und unterschiedlich empfindlich auf ELA reagieren können als C57BL/6J^27,44.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das LBN-Modell eine ressourcenarme Umgebung mit unvorhersehbarer mütterlicher Fürsorge verwendet und ein nützlicher Ansatz ist, um zu verstehen, wie Stress in der Kindheit eine Vielzahl von Prozessen beeinflusst, wie z. B. physiologische Anpassungen an Stress, mütterliches Verhalten und Gehirnentwicklung. Insbesondere wurde dieses Modell verwendet, um zu verstehen, wie und warum ELA ein Risikofaktor für neuropsychiatrische Störungen ist 1,5,9,12. In Zukunft wird der Einsatz von LBN unser Verständnis der biologischen Grundlagen sowohl psychischer als auch körperlicher Störungen verbessern und dazu beitragen, neue therapeutische Ziele zur Behandlung der Auswirkungen von Stress während der sensiblen perinatalen Periode aufzuklären.

Materialien

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