Isolierung subzellulärer Ribosom-Subpopulationen basierend auf rekombinanten, peptid-tag-spezifischer, ortsbeschränkter Beleuchtungsverstärkter Biotinylierung

Zusammenfassung

Die AviTag-spezifische standortbeschränkte Beleuchtungsverstärkte Biotinylierung (ALIBi) ist eine neuartige optogenetetisch aktivierte Methode, die zur Markierung und Affinitätsreinigung subzellulärer Populationen von Ribosomen für die nachgelagerte Sequenzierung und proteomische Analyse entwickelt wurde.

Zusammenfassung

Zunehmende Belege deuten darauf hin, dass mRNA-Translation ein stark kompartimentierter Prozess innerhalb einer Zelle ist und dass subzellulärer Transport und Lokalisierung spezifischer mRNAs entscheidend ist, um sicherzustellen, dass Proteine mit kompartimentspezifischen Funktionen im idealen Milieu und in angemessenen Mengen produziert werden. Allerdings sind Techniken zur subzellulären Isolierung und Charakterisierung der Ribosomen, die diese mRNAs übersetzen, bisher eingeschränkt, sodass vieles darüber unbekannt bleibt, wie die Zusammensetzung der translationalen Maschinerie zur Regulation lokalisierter mRNA-Translation beiträgt.

Hier demonstrieren wir AviTag-spezifische Location-restricted Illumination-enhanced Biotinylation (ALIBi), eine Methode, die Epitope-Tagging, eine neu entwickelte optogenetisch aktivierte Split-Biotin-Ligase und Affinitätsreinigung kombiniert, um Ribosomen, die auf jedes subzelluläre Kompartiment von Interesse lokalisiert sind, schnell und spezifisch zu markieren und zu isolieren. Erstens wird die CRISPR/Cas9-Bearbeitung verwendet, um ein AviTag-Peptid, eine Protease-Spaltstelle des Tabak-Etch-Virus (TEV) und ein FLAG-Epitop-Tag mit einem ribosomalen Protein zu fusionieren. Die gespaltene Biotin-Ligase, die mit einer organellenzielenden Domäne verschmolzen ist, wird in dieser Zelllinie exprimiert und ist unter normalen Biotinkonzentrationen inaktiv. Bei der Aktivierung durch ergänzende Biotin- und Blaulichtbeleuchtung biotinyliert die Ligase AviTagged Ribosomen in unmittelbarer Umgebung, was eine Affinitätsreinigung von biotinylierten Ribosomen sowie zugehörigen Proteinen und mRNAs auf streptavidinbeschichteten Perlen ermöglicht. Nicht-denaturierende Elution mittels TEV-Proteasespaltung liefert Proben, die für die nachgelagerte Charakterisierung von Kern-Ribosomproteinen, ribosomassoziierten Proteinen und ribosomgebundenen mRNAs mittels RNA-Sequenzierung oder Massenspektrometrie-Proteomik geeignet sind.

In diesem Protokoll überprüfen wir Designprinzipien für die Fusion von AviTag mit einem ribosomalen Protein und gezielt das gespaltene Biotin-Ligase-Enzym auf das interessierte Organelle. Wir zeigen die Aktivierung des ALIBI-Systems, Zelllyse, Affinitätsreinigung und Probenelution. Abschließend besprechen wir typische Ergebnisse und Fehlersuche.

Einleitung

Es besteht ein wichtiger Bedarf an Werkzeugen, die biologische Proben aus bestimmten subzellulären Kompartimenten isolieren können, um besser zu untersuchen, wie subzelluläre Organisation und Transport in zelluläre Prozesse einfließen. mRNA-Translation ist ein zentrales Beispiel für einen solchen Prozess: Immer mehr Hinweise deuten darauf hin, dass die Translation stark kompartimentiert ist und insbesondere viele mRNAs auf die Organellen lokalisiert sind, wo ihre codierten Proteine^{sich befinden 1,2}. Über die subzelluläre Lokalisierung translationaler Mechanismen ist jedoch weniger bekannt. Ribosomen beginnen ihre Existenz im Nukleolus und Kern, wo die Assemblage aus ribosomalen Proteinen (RPs) und ribosomalen RNAs (rRNAs) beginnt. Anschließend werden sie in das Zytoplasma exportiert, um die letzten Assemblierungsphasen durchzuführen, danach beginnen sie mit der Übersetzung von mRNAs ^3,4. Kanonische Translationsstellen sind das Zytoplasma und das endoplasmatische Retikulum; Letzteres ist der Ort, an dem integrale Membranproteine und Proteine, die für membrangebundene Organellen oder extrazelluläre Sekretion bestimmt sind, synthetisiert^werden. Neuere identifizierte Orte lokalisierter Translation sind die Mitochondrien, Peroxisom und neuronale Prozesse 6,7,8,9,10,11,12. Interessanterweise tauchen auch Hinweise darauf auf, dass translationale Mechanismen wie ribosomassoziierte Proteine, posttranslationale Modifikationen, rRNA-Modifikationen und nicht-kanonische Stöchiometrie von Kern-Ribosomproteinen an regulatorischen Mechanismen beteiligt sind, die die Translation spezifischer mRNAs und Parameter wie Translationstreue und -rate 13,14,15,16,17 steuern,^{18, 19, 20}. Zum Beispiel wurden Hunderte von Proteinen identifiziert, die mit dem Ribosom interagieren und potenziell zu Unterschieden in der subzellulären Ribosomenzusammensetzung^{führen könnten}. Allerdings sind Techniken zur Isolierung subzellulärer Ribosompopulationen bisher begrenzt; daher bleibt vieles darüber unbekannt, wie die Zusammensetzung translationaler Maschinen zur Regulierung lokalisierter mRNA-Translation beiträgt. Die Einführung vielseitiger Methoden zur Isolierung subzellulärer Ribosomenpopulationen, insbesondere solcher, die mit Säugetiermodellsystemen kompatibel sind, wird die Erforschung dieser Translationsmechanismen auf subzellulärer Ebene ermöglichen.

Die frühesten Methoden zur Isolierung subzellulärer Fraktionen mit Ribosomen basierten auf den Prinzipien der sequentiellen Lyse und Zentrifugation^21,22. Typischerweise sind diese Methoden auf bestimmte Organellen beschränkt und erfordern oft lange Verarbeitungszeiten. Eine neuere Methode basiert auf der Biotinligase BirA, die speziell ein AviTag-Peptidsubstrat 10,23,24 biotinyliert. Das BirA kann genetisch auf die interessierende Organelle in Zellen lokalisiert werden, in denen Ribosomen mit AviTag markiert wurden. Da BirA jedoch bei physiologischen Biotinkonzentrationen aktiv ist, ist es notwendig, Zellen unter Bedingungen von Biotinmangel zu kultivieren, um eine konstitutive und unspezifische Biotinylierung der AviTag-tragenden Ribosomen^10,24 zu vermeiden. Dies begrenzt die Verwendung von BirA bei Zelltypen, die empfindlich auf Biotinmangel^reagieren. Schließlich wurden promiskuitive Biotinylierungsmethoden entwickelt, die entwickelte Enzyme wie BioID, TurboID und APEX 26,27,28 verwenden. Bei der Induktion produzieren diese Enzyme ein reaktives Biotin-Zwischenprodukt, das alle Lysinreste im Radius des Enzyms kovalent verändert. Promiskuitive Biotinylierungsmethoden sind äußerst nützlich zur Kartierung subzellulärer Proteome, aber weniger informativ, um Proteine in der allgemeinen Nähe lokalisierter Ribosomen von Proteinen zu unterscheiden, die sich näher zu ihnen befinden.

Hier demonstrieren wir unsere kürzlich entwickelte Methode zur Markierung und Isolierung subzellulärer Ribosompopulationen, genannt AviTag-spezifische Location-restricted Illumination-enhanced Biotinylation (ALIBi). Diese Methode nutzt einen konstruierten geteilten BirA, der mit optogenetisch verbesserten Magnet-(eMag)-Schaltern (Abbildung 1A) verschmolzen ist (Abbildung 1A), die unter blauer Lichtbeleuchtung heterodimerisieren²⁹; und ein Peptid-Tag, bestehend aus FLAG-Epitope, Tabak-Etch-Virus-(TEV)-Protease-Spaltstelle und AviTag (FTA), das mit dem Rpl31-Ribosomprotein fusioniert ist (Abbildung 1B). Das gespaltene Enzym kann genetisch auf ausgewählte Organellen gezielt eingesetzt werden, ist bei physiologischen Biotinkonzentrationen inaktiv und kann innerhalb von Minuten nach blauem Licht und der Zugabe von zusätzlichem Biotin rekonstituiert werden (Abbildung 1C-E). Die anschließende Zelllyse, Affinitätsreinigung und nicht-denaturierende enzymatische Eluation mittels TEV-Protasespaltung ergeben Ribosomen und ko-reinigende Moleküle wie mRNAs und ribosomassoziierte Proteine, die sich für nachgelagerte analytische Methoden wie RNA-Sequenzierung und Massenspektrometrie-Proteomik eignen (Abbildung 1A). Daher offenbart diese Methode nicht nur die Zusammensetzung des Ribosomen, sondern auch die mRNAs, an die Ribosomen gebunden sind. In einem kürzlich erschienenen Artikel, der die bahnbrechende Anwendung von ALIBi zur Charakterisierung subzellulärer Ribosomenpopulationen beschreibt, haben wir das Split-Enzym erfolgreich auf das Zytoplasma, den Nukleolus, den Kern, das endoplasmatische Retikulum, die Plasmamembran und die Mitochondrien gezielt (Tabelle 1)³⁰. Der daraus resultierende Vergleich der translationalen Maschinerie zwischen diesen subzellulären Kompartimenten führte zu neuartigen und unerwarteten Erkenntnissen zur Translation am endoplasmatischen Retikulum und den Mitochondrien sowie zu möglichen Ansprüchen für zukünftige Untersuchungen von Ribosomen-Biogenese-Faktoren im Kern und Nukleol.

Dieses Protokoll enthält eine detaillierte Demonstration der Transfektion und Aktivierung des ALIBi-Systems, der Zelllyse, der Affinitätsreinigung und der Probenelution. Wir erörtern außerdem, wie eine erfolgreiche Affinitätsreinigung mittels Western Blot überprüft werden kann, und geben Empfehlungen für die Durchführung von Downstream-RNA-Sequenzierung oder Massenspektrometrie-(MS)-Proteomanalyse (siehe Supplemental File 1). Dieses Protokoll ist für Experimente mit embryonalen Maus-Stammzellen (mESCs) geschrieben, die Rpl31 homozyg aus dem endogenen Rpl31-Locus an FTA (L31-FTA) exprimieren; Diese Zelllinie ist auf Anfrage von den Autoren erhältlich. Die Strategie zur Erzeugung dieser Zelllinie ist in Supplemental File 1 sowie in Supplemental Figure S1 und Supplemental Figure S2 beschrieben. Plasmide, die die aufgeteilten Enzyme codieren, die auf mehrere Organellen abzielen, sind auf Addgene verfügbar (Katalognummern #235608 bis 235643). Die Designprinzipien zur Zielsetzung der gespaltenen Enzyme auf diese Organellen sind in Ergänzungsakte 1 beschrieben. Das Protokoll geht davon aus, dass jede Probe aus mESCs stammt, die in einer 10 cm großen Platte gezüchtet wurden. Wir haben festgestellt, dass die 10-cm-Skala ausreichend Material für die Massenspektrometrie-Proteomik liefert, während die 6-Well-Skala für westliche Blots oder RNA-Sequenzierung ausreicht.

Protokoll

1. mESC-Zellkultur

HINWEIS: Vor der Aktivierung und Zelllyse von ALIBi sollten mESCs mit der standardisierten sterilen Technik für die Zellkultur behandelt werden. Die Zentrifugation intakter mESCs sollte bei 200 × g für 3 Minuten bei Raumtemperatur erfolgen, sofern nicht anders angegeben. Das Medium vor der Verwendung auf 37 °C in einem Wasserbad vorwärmen, sofern nicht anders angegeben. mESCs sollten in eine frische Gewebekulturplatte geführt werden, die über Nacht gelatinisiert wurde (siehe Schritt 1.1).

1. Am Tag vor dem Auftauen der L31-FTA-mESCs wird die Unterseite einer 10 cm langen Platte mit 5 ml 0,1 % Gelatine beschichtet. Über Nacht bei 37 °C bebrüten.
2. Kombinieren Sie die mESC-Medienkomponenten (Tabelle 2) und lassen Sie einen 0,2-μm-Filter durchlaufen. Lagern Sie bis zu einem Monat bei 4 °C.
3. Am Tag des Auftauens wird ein 5 ml Aliquot Medium zum Verdünnen der aufgetauten Zellen und ein 10 ml Aliquot zum Plattieren erhitzt.
4. Holen Sie ein Kryovial mit ~5 × 10⁶ L31-FTA mESCs aus dem flüssigen Stickstoffspeicher. Sofort auftauen, indem Sie den Boden des Fläschchens in einem 37 °C Wasserbad schwenken.
5. Mischen Sie vorsichtig 0,5–1 ml Medium aus dem 5-mL-Aliquot mit dem kryovialen Inhalt, je nach Kapazität des Fläschchens, und übertragen Sie den kryovialen Inhalt dann zurück auf das 5-mL-Medienaliquot.
6. Pellet die Zellen durch Zentrifugation. Aspiriere das Supernatant.
7. Suspendiere das Zellpellet mit dem 10-mL-Medien-Aliquot.
8. Aspirieren Sie die Gelatine von der 10 cm langen Platte und übertragen Sie sofort die Zellsuspension in die Platte. Inkubieren bei 37 °C.
9. Alle 24 Stunden (außer an Passage-Tagen) aspirieren Sie alte Medien von der Platte und ersetzen Sie sie durch 10 ml frisches Medium.
10. Wenn die Kolonien zu 70 % bis 80 % zusammenfließen (typischerweise 48 Stunden nach dem Plattieren), aspirieren Sie das alte Medium und spülen Sie zweimal mit 10 ml Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS).
11. Nach der Aspiration des DPBS wird die Platte mit 2 ml 0,05 % Trypsin beschichtet (Tabelle 2). Inkubiere bei 37 °C für 5 Minuten.
12. Neutralisiere das Trypsin, indem du 4 ml kaltes mESC-Medium zur Platte gibst. Verwenden Sie sofort ein 5 oder 10 ml serologisches Pipet, um 15x auf und ab in der Platte zu pipetieren, um die Kolonien in eine einzellige Suspension zu dissoziieren.
13. Übertragen Sie die Suspension in ein konisches Rohr. Optional können Sie einen Aliquot entfernen, um Zellen mit einem Hämozytometer zu zählen.
14. Pellet die Zellen durch Zentrifugation. Aspiriere das Supernatant.
15. Das Zellpellet in frischem Medium wieder suspendieren. Platte 5 × 10⁶Zellen (typischerweise 1:6 Passage-Verhältnis) in einer frisch gelatinisierten 10 cm großen Platte und inkubieren bei 37 °C. Wiederholen Sie die Schritte 1.9–1.15 nach Bedarf, bis Sie bereit sind, mit der Transfektion fortzufahren.
16. Um gefrorene Zelllagern herzustellen, trypsinisieren Sie eine Platte mit mESCs (wie in den Schritten 1.10–1.14). Das Zellpellet in Gefriermedium (250–500 μL pro 5 × 10⁶ Zellen) wieder suspendieren, in Kryoviale einfrieren und über Nacht langsam in einem Zellgefrierbehälter bei -80 °C einfrieren, bevor es in flüssigen Stickstoffspeicher überführt wird.

2. Transfektion

HINWEIS: Führen Sie Transfektion an einem Tag durch, an dem die mESCs bereit sind. Plasmide können bereits 3–5 Stunden nach der Transfektion zu exprimieren beginnen. Nach der Expression empfehlen wir, Zellen im Dunkeln zu behandeln und die Exposition gegenüber Temperaturen unter 37 °C zu minimieren, um eine vorzeitige Aktivierung zu verhindern, da frühere Arbeiten gezeigt haben, dass magnetische optogenetische Domänen nicht nur unter blauem Licht, sondern auch bei Exposition gegenüber Kalt³¹ dimerisieren. Bewahren Sie Teller in einem speziellen Inkubator auf oder schützen Sie ein Regal in einem gemeinsamen Inkubator mit Alufolie vor Licht. Wenn Sie Zellen außerhalb des Inkubators handhaben, schalten Sie vorher alle Raumlichter und Fenster aus oder blockieren Sie sie und verwenden Sie eine Stirnlampe mit rotem Licht, um zu sehen. Lassen Sie die Inkubatortür nicht länger offen als nötig. Nehmen Sie jeweils nur kleine Mengen Platten aus dem Inkubator heraus und stellen Sie die Platten während der Handhabung auf eine isolierende Oberfläche (also einen sauberen Styropor-Boxendeckel), um den Kontakt mit Zimmertemperatur-Arbeitsflächen zu minimieren. Erhitze das Medium vor der Anwendung vollständig. Untersuchen Sie die Platten nicht unter einem lichtemittierenden Mikroskop.

1. Am Tag vor der Transfektion eine 10 cm lange Platte mit Gelatine vergeben.
2. Am Tag der Transfektion wird Gelatine von der Platte abgesaugt und 7,5 ml Medium hinzugefügt, um bei 37 °C vorzuheizen. Reduziertes Serummedium bei 37 °C vorwarmen, um die Zellen zu resuspendieren.
3. Verdünnen Sie 18,75 μL des Transfektionsreagens in 250 μL Medium mit reduziertem Serum. Sanft anklopfen, um zu mischen, und 5 Minuten bei Zimmertemperatur inkubieren lassen.
4. Wenn zwei Plasmide, die die N- und C-Fragmente codieren, ko-exprimiert werden, fügen Sie 3,75 μg jedes Plasmids zu 250 μL reduziertem Serummedium hinzu. Wenn nur ein Plasmid exprimiert wird (d. h. eine GFP-Negativkontrolle oder eine vollständige BirA-Kontrolle), fügen Sie stattdessen 7,5 μg des einzelnen Plasmids hinzu.
5. Fügen Sie die Plasmid-/reduzierte Serum-Medium-Mischung zur Transfektions-/reduzierten Serum-Medium-Mischung hinzu und tappen/umkehren, um zu mischen. Inkubiere bei Zimmertemperatur für 15 Minuten.
6. In der Zwischenzeit werden mESCs trypsinisiert und pelletiert (Schritte 1.10–1.14). Setzen Sie das Pellet in erwärmtem reduziertem Serummedium auf eine Konzentration von 10 × 10⁶ Zellen/ml wieder auf.
7. Fügen Sie 7,5 × 10⁶ (750 μL) resuspendierte Zellen zur Plasmid-/Transfektionsmischung aus Reagenz und reduziertem Serummedium hinzu. Drehe das Rohr um, um zu mischen. Inkubiere 10 Minuten bei RT und drehe die Röhren gelegentlich um, um die Zellen schwebend zu halten.
8. Drehen Sie die Röhren kurz erneut um und geben Sie die mESC/Plasmid/Transfektionsreagenz/reduziertes Serummedium Gemisch auf die Platte mit dem erwärmten Medium. Schaukeln Sie die Platte vorsichtig, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.
9. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 3–5 Stunden, sodass die Zellen innerhalb dieser Zeit haften können.
   HINWEIS: Ab diesem Punkt empfehlen wir, die oben genannten Vorsichtsmaßnahmen gegen Lichtexposition und Temperaturen unter 37 °C zu beachten.
10. Aspiriere vorsichtig das alte Medium. Fügen Sie frisches, erwärmtes Medium hinzu und pipetteren Sie die Seite der Platte hinunter, um das Lösen der Zellen zu vermeiden. Inkubation bei 37 °C wird fortgesetzt.
11. Wenn du 24 Stunden nach der Transfektion aktivierst/lysierst, gehe mit Abschnitt 3 weiter. Wenn Sie planen, 48 Stunden nach der Transfektion zu aktivieren/zu lysieren, wechseln Sie das Medium ~24 Stunden nach dem Plattieren der transfizierten Zellen.

3. ALIBI-Aktivierung und Zelllyse

HINWEIS: Bearbeiten Sie weiterhin Zellen/Proben im Dunkeln bis zum Beginn der Elution (Schritt 5.4). Sobald die Zellen auf Eis gekühlt wurden (Schritt 3.15), halten Sie die Proben kalt und verwenden Sie bis zum Beginn der Elution nur gekühlte Reagenzien. Stellen Sie sicher, dass Arbeitsflächen, Geräte, Reagenzien und Kunststoffe RNAse-frei sind, indem Sie frisch geöffnete Gegenstände verwenden und harte Oberflächen mit einer RNAse-Dekontaminationslösung und 70 % Ethanol abwischen oder spülen. Tragen Sie Handschuhe beim Umgang mit Proben oder Geräten. Bei Proben, die für die MS-Proteomik vorgesehen sind, sollte auch die Keratinkontamination minimiert werden, indem der Arbeitsbereich staubfrei gehalten wird; Bedecke die nackte Haut und binde langes Haar zurück.

1. Kühlen Sie die Zentrifuge auf 4 °C vor.
2. Mit ausgeschaltetem Licht werden die transfizierten Platten in einen temporären 37 °C Inkubator gebracht, damit sie nach dem Einsetzen des Transilluminators im Hauptinkubator nicht Temperaturschwankungen ausgesetzt sind.
3. Wische den Blaulichttransilluminator mit 70 % Ethanol ab und schließe ihn an den Strom an. Platziere den Transilluminator in den Hauptinkubator und lass die Inkubatorbedingungen sich beim weiteren Aufbau wieder ausgleichen.
4. Erhitze ein Aliquot von Medien, das mit Biotin und Cycloheximid (CHX) (10 ml Medium pro 10 cm Platte) dosiert wird, auf 37 °C. Wenn Kontrollproben ohne zusätzliches Biotin durchgeführt werden, erwärmen Sie außerdem einen separaten Aliquot, der nur mit CHX dosiert wird.
   HINWEIS: Einige Pufferkomponenten können am Tag vor der Verwendung gemischt und über Nacht bei 4 °C gelagert werden (siehe Tabelle 2). Beachten Sie, dass verschiedene Lyse- und Wash-Puffer-Rezepte für Experimente für Western Blot oder MS-Proteomik und für RNA-Sequenzierung verwendet wurden.
5. Kühlen Sie ein Aliquot DPBS, das mit CHX (20 ml pro 10 cm Platte) dosiert wird.
6. Bereiten Sie den RNAse-Entfernungspuffer, die Salzwäsche, den Lysispuffer und die Waschpuffer vor (siehe Tabelle 2). Bei Puffern mit dichten/viskosen Komponenten wie Glycerol und Triton X-100 wird der fertige Puffer gepipetiert, um eine gleichmäßige Mischung sicherzustellen. Kühlen Sie Puffer auf Eis vor der Benutzung.
   HINWEIS: Für die Perlenwäsche sollten Sie das Rohr mit den Perlen kurz in ihrem aktuellen Puffer in einer Taschenzentrifuge drehen, um den Inhalt am Boden aufzusammeln. Stelle das Rohr für 1 Minute in ein magnetisches Rack oder bis die Perlen vollständig wandern sind. Aspirieren Sie das Überdachungsmittel, ohne das Perlenpellet zu berühren. Ohne das Perlenpellet trocknen zu lassen, fügen Sie den nächsten Puffer hinzu. Um das Perlenpellet wieder aufzuhängen, pipettiert man vorsichtig oder rollt das geschlossene Rohr zwischen den Fingern, während man es gegen das magnetische Regal hält, sodass die Perlen schnell in verschiedene Richtungen vom Magneten gezogen werden. Kehren Sie schließlich die umgehängten Perlen mehrmals um, um sicherzustellen, dass die Innenwände des Rohrs gewaschen werden.
7. Suspendiere die Serienflasche mit Streptavidinperlen durch sanftes Pipettern oder Schaukeln wieder. Übertragen Sie 450 μL Perlen auf ein proteinarmes Bindungsrohr für jede 10 cm lange Platte mESCs.
8. Nach dem obigen Hinweis zum Perlenwaschen entsorgen Sie den Perlenspeicherpuffer und waschen Sie die Perlen zweimal mit 900 μL RNAse-Entfernungspuffer.
   HINWEIS: Gehen Sie ohne Verzögerung zum nächsten Schritt über; eine verlängerte Zeit im RNAse-Entfernungspuffer kann die Bindungskapazität der Perlen verringern.
9. Wasch-Perlen 1x mit 900 μL Salzwäsche.
10. Waschkugeln zweimal mit 900 μL Wash I Buffer. Nach dem Wiederaufhängen der Perlen in der zweiten Runde von Wash I Puffer lagern Sie die Perlen im Wash I Puffer bei 4 °C, während Sie die Aktivierung und Zelllyse durchführen.
11. Fügen Sie je nach Bedarf Biotin (50 μM Endkonzentration; 1:1.000 Verdünnung von 50 mM Lager) und CHX (100 μg/mL Endkonzentration; 1:1.000 Verdünnung von 100 mg/mL Lager) zu den erwärmten Aliquot(en) des Mediums hinzu. Bis zur Anwendung bei 37 °C halten.
12. Fügen Sie CHX (100 μg/mL Endkonzentration; 1:1.000 Verdünnung von 100 mg/mL Lager) zum kalten Aliquot von DPBS hinzu und halten Sie es bis zur Anwendung gekühlt.
    HINWEIS: Die folgenden zwei Schritte beschreiben die Aktivierung von ALIBi durch ergänzende Biotin- und Blaulichtbeleuchtung. Eine ideale Aktivierungsdauer ist lang genug, um eine ausreichende Menge an Ribosom-Biotinylierung für nachgelagerte Assays zu ermöglichen, aber kurz genug, um die räumliche Auflösung zu erhalten. Die ideale Aktivierungszeit kann je nach Parametern wie Zelltyp, Umfang des Experiments, Expressionsniveau der gespaltenen Enzyme, Häufigkeit von Ribosomen in der Nähe der interessierten Organelle und der Empfindlichkeit der Analysetechnik variieren. Wir empfehlen 15 Minuten als Ausgangspunkt, was die Aktivierungszeit ist, die in unseren repräsentativen Ergebnissen (Abbildung 2) und in unserer begleitenden Arbeit³⁰ Minuten verwendet wird.
13. Aspirationsmedien von den transfifektierten Platten. Fügen Sie sofort 10 ml des warmen Mediums mit CHX ± Biotin pro Platte hinzu.
14. Damit negative Kontrollplatten nicht beleuchtet sind, platziere sie in einen dunklen Brutkasten. Um Platten zu beleuchten, platzieren Sie sie direkt auf den Transilluminator, schalten Sie den Transilluminator ein und inkubieren Sie 15 Minuten lang.
15. Nach Abschluss der Beleuchtung wird die Platten sofort zweimal mit 10 ml kaltem DPBS + CHX pro Platte gewaschen. Stelle die Teller zwischen und nach den Wascharbeiten auf Eis. Nach dem Aspiratieren der zweiten Waschanlage kippen Sie die Platte und saugen Sie eventuelle verbleibende DPBS ab.
16. Indem jede Platte so flach wie möglich auf Eis bleibt, wird die Lyse mit 2 ml Eiskalte Lysepuffer durchgeführt. Inkubiere die Platte 5 Minuten auf Eis und tippe während dieser Zeit 2–3 Mal auf die Platte, um die Zellen zu lösen.
    HINWEIS: Wenn sie unter Folie und auf Eis dunkel gehalten werden, können Platten während dieser Zeit aus dem Zellkulturbereich in einen anderen dunklen Raum bewegt werden.
17. Entfernen Sie alle verbleibenden Zellen, indem Sie mit einer Mikropipette das Lysat auf der Plattenoberfläche auf und ab pipettieren, ohne die Bildung von Blasen zu vermeiden, und dann das Lysat in ein gekühltes und markiertes Protein-Tiefbindungsrohr zu übertragen.
    HINWEIS: OPTIONAL: Bei einigen schwer zu lysierenden Organellen wie dem Kern und dem Nukleolus kann die Sonikation helfen.
18. Im Fall schwer zu lysierender Organellen wird alle Proben im Experiment 45 Sekunden lang bei 4 °C (Leistungseinstellung 3 Watt) soniziert. Wenn das Sonikator-Design das Einführen einer Sonde in ein offenes Proberöhrchen erfordert, wird das Lysat zunächst von der Platte in ein größeres Rohr übertragen, um Überlauf während der Sonikation zu verhindern; dann übertrage ich es in eine 2-mL-Röhre.
19. Inkubiere das Lysat 15 Minuten auf Eis.
20. Zentrifugiere das Lysat bei 17.000 × g für 3 Minuten bei 4 °C. Übertragen Sie das Supernatant (klarisiertes Lysat) in ein gekühltes, niedrigbindendes Proteinröhrchen, ohne das Pellet der Zellreste zu stören.
    HINWEIS: Wenn eine RNA-Seq-Analyse beabsichtigt ist, kann nun ein Aliquot des klarisierten Lysats als Gesamt-RNA-Anteil entnommen werden (siehe Supplemental File 1, "Empfehlungen für RNA-Sequenzierung" Schritt 1.1) für Details.
    HINWEIS: Wenn die Zellmengen, Transfektions-/Kulturbedingungen und Lysebedingungen für alle Proben einheitlich waren, gehen wir typischerweise davon aus, dass die Lysatkonzentrationen zwischen den Proben vergleichbar sind, und gehen ohne Quantifizierung der Gesamtproteinkonzentration vor. Dies minimiert die vergangene Zeit zwischen Aktivierung und Affinitätsreinigung.

4. Affinitätsreinigung

1. Pelletiere die gewaschenen Streptavidinperlen mit dem magnetischen Rack. Aspiriere den Wash-I-Puffer.
2. Übertragen Sie 1.200 μL geklärtes Lysat in das Rohr mit den gewaschenen Perlen. Pipettieren Sie vorsichtig, um die Perlen wieder aufzuhängen. Den Rest des geklärten Lysats bei -80 °C lagern.
3. Inkubieren Sie das Lysat mit Perlen bei 4 °C im Dunkeln für 1 Stunde am Röhrenrotator.
4. Während dieser Inkubation bereiten Sie den TEV-Elutionspuffer vor (Tabelle 2).

5. Elution

1. Nach den Anmerkungen zum Perlenwaschen in Abschnitt 3 pelletieren Sie die Perlen auf ein magnetisches Gestell und übertragen Sie das Supernatant in ein gekühltes, niedrigbindendes Proteinrohr. Lagern Sie das Supernatant bei -80 °C.
2. Waschperlen 2x mit 900 μL Wash I Puffer.
3. Waschperlen 1x mit 900 μL Wash II Puffer.
   HINWEIS: Nach Abschluss dieses Schritts müssen die Proben nicht mehr im Dunkeln behandelt werden.
4. Füge 450 μL TEV-Elutionspuffer zu den Perlen hinzu.
5. Inkubiere Perlen im TEV-Elutionspuffer für 1 Stunde bei Raumtemperatur auf dem Röhrenrotator. Bei kleineren Experimenten mit geringen TEV-Elutionspuffern wird die Röhren stattdessen mit 1.000–2.000 U/min auf einem Shaker inkubiert.
6. Pellet die Perlen auf das magnetische Regal. Übertragen Sie das Eluat in ein proteinarmes Bindungsrohr. Wenn eine Proteomik-Analyse oder Western Blot beabsichtigt ist, wird das Eluat bei -80 °C gelagert. Wenn eine RNA-Seq-Analyse vorgesehen ist, siehe Supplemental File 1 "Recommendations for RNA sequencing" Schritt 1.2 für Anweisungen zur Eluate-Speicherung.
7. OPTIONAL: Um vorläufig festzustellen, ob die Affinitätsreinigung nennenswerte rRNA/mRNA ergeben hat (was darauf hindeutet, dass Ribosomen isoliert wurden), analysieren Sie Eluate auf einem Mikrovolumenspektrophotometer unter Verwendung des TEV-Eluationspuffers als Blank.
   HINWEIS: Eluate von Zellen, die das aktivierte System enthalten, sollten bei 260 nm eine höhere Absorption haben als Eluate von Zellen, die nicht die geteilten Enzyme, blaues Licht/Biotin oder L31-FTA besitzen.

6. Westlicher Blot

HINWEIS: Bis Lysat- und Durchflussproben im Laemmli-Puffer denaturiert wurden, empfehlen wir, weiterhin Lichteinwirkung zu vermeiden. Wir verwenden Fertiggele, handelsübliche Transferpuffer und Laufpuffer sowie ein halbtrockenes Transfersystem (siehe Materialtabelle). SDS-PAGE und Western Blot werden gemäß den Herstelleranweisungen für diese Komponenten durchgeführt, sofern unten nicht anders angegeben.

1. Fügen Sie 6x Laemmli-Puffer zum Lysat, Durchfluss und/oder Eluatproben hinzu, um eine Endkonzentration von 1x Laemmli-Puffer zu erreichen. Erhitze bei 95 °C in einem Heizblock oder Thermocycler für 10 Minuten. Wenn sich Kondensation am Rohrdeckel oder an den Wänden bildet, dann die Rohre kurzzeitig durchdrehen.
2. Richte ein Gel mit laufendem Puffer im Geltank gemäß den Anweisungen des Tankherstellers ein. Lade die Proben und die Leiter.
3. Lassen Sie das Gel 45–75 Minuten bei 125 V laufen, bis die Farbfront sich dem Boden des Gels nähert. In der Zwischenzeit bereiten Sie PBST und Blockpuffer vor (Tabelle 2).
4. Führen Sie gemäß den Anweisungen des Herstellers des Transfersystems einen halbtrockenen Transfer durch.
   HINWEIS: Für alle Membranwasch- und Inkubationsschritte sollten Sie sicherstellen, dass die Membran vollständig untergetaucht ist, und die Membranschale auf einen orbitalen oder kippbaren Kipphebel stellen. Für eine 10 x 15 cm große Schale benötigt man 25–50 ml Puffer.
5. Entfernen Sie die Membran aus dem Transferstapel und gehen Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort, um sicherzustellen, dass die Membran nicht austrocknet.
   HINWEIS: OPTIONAL: Trockene Stellen auf der Membran können zu ungleichmäßiger Blockierung oder Probe-Bindung führen, insbesondere bei Sonden mit kurzen Inkubationen wie Streptavidin-Meerrettichperoxidase. Um dieses Problem zu vermeiden, befeuchten wir die Membranen nach dem Transfer erneut in 100 % Methanol für 30 Sekunden und dann 5 Minuten in Wasser. Diese Maßnahme ähnelt den allgemeinen Empfehlungen zur Wiederbenetzung von PVDF-Membranen, die nach dem Transfer getrocknet^{sind 32,33}.
6. Waschen Sie die Membran mit PBST 3 x 10 Minuten bei Zimmertemperatur.
7. Nach den in Tabelle 3 angegebenen Bedingungen für jede Western-Blot-Sonde führen Sie das Blockieren, Waschen, Probe-Inkubations- und Sekundärantikörper-Inkubationsverfahren durch.
8. Nach dem letzten Waschen in Schritt 6.7 Mische die ECL-Substratkomponenten gemäß den Anweisungen des Herstellers und beschichte die Membran gleichmäßig damit. Nehmen Sie das Bild mit einem chemilumineszenz-Gel-Bildgebungssystem auf.

Ergebnisse

Western Blot (Protokollabschnitt 6) ist der schnellste Weg, um den Erfolg eines Experiments vorläufig zu bewerten. Wenn Membranen mit Streptavikin-HRP untersucht werden, sollte Lysat aus Zellen, in denen alle Komponenten des Systems vorhanden waren, ein Band enthalten, das dem biotinylierten L31-FTA entspricht (Abbildung 2A, Bahn 20). Dasselbe Band sollte vorhanden sein, meist mit größerer Intensität, wenn Zellen mit vollwertigem BirA als positiver Kontrolle transfektiert wurden (Abbildung 2A, Bahnen 1–4). Dieses Band sollte in Proben, in denen eine oder mehrere Systemkomponenten ausgelassen wurden, schwächer oder fehlen (Abbildung 2A, alle anderen Spuren). Da Säugetierzellen mehrere endogene biotinylierte Carboxylaseproteine im Bereich von 70–80 und 120–130 kDa^34,35 enthalten, sehen wir typischerweise Bänder mit diesen Molekulargewichten in allen Lysatproben. Membranen können auch mit einem Anti-V5-Antikörper untersucht werden, um die Expression der gespaltenen BirA-Fragmente zu bestätigen.

Westlicher Blot der Lysat-, Durchfluss- und Eluatproben kann beurteilen, ob ein Affinitätsreinigungsexperiment erfolgreich war (Abbildung 2B). Ein Rückgang des biotinylierten L31-FTA im Durchfluss relativ zum Lysat zeigt, dass ein erheblicher Anteil der biotinylierten Ribosomen durch Affinitätsreinigung erfasst wurde. Da Streptavidin mit AviTag distal zur TEV-Spaltstelle auf L31-FTA konjugiert, wird der biotinylierte Teil von L31-FTA während der TEV-vermittelten Eluation gespalten, sodass kein biotinyliertes L31-FTA im Eluat vorhanden sein sollte. L31-FTA in den nicht-biotinylierten, biotinylierten und TEV-gespaltenen Zuständen sind alle durch Anti-FLAG-Antikörper nachweisbar, was zeigen sollte, dass das Eluat ein gespaltenes L31-FTA-Band mit einem etwas niedrigeren Molekulargewicht als das intakte L31-FTA enthält. Beachten Sie, dass die L31-FTA-Bänder im Lysat und Durchfluss oft eine vergleichbare Intensität haben, wenn sie mit Anti-FLAG-Antikörpern untersucht werden; da die Aktivierung kurzzeitig erfolgt, wird nur ein kleiner Bruchteil des gesamten L31-FTA biotinyliert und affinitätsgefangen. Untersuchungen nach anderen ribosomalen Proteinen wie Rps12 zeigen das Vorhandensein der kleinen ribosomalen Untereinheit im Eluat, was darauf hindeutet, dass die Affinitätsreinigung von biotinyliertem L31-FTA ganze Ribosomen einfängt. Umgekehrt zeigt das Untersuchen mit Anti-V5-Antikörpern, dass Proteine, die nicht an das Ribosom binden, wie die gespaltenen BirA-Fragmente selbst, im Eluat fehlen.

Die Bestimmung des optimalen Perlen-Lysat-Verhältnisses ist wichtig, und Abbildung 2C zeigt den abnehmenden Nutzen einer Erhöhung der Lysatmenge über die Kapazität der Perlen hinaus. In diesem Experiment wurde 2,5-fach mehr Lysat mit denselben 450 μL streptavidinbeschichteten Perlen verwendet. Folglich verfiel eine beträchtliche Menge biotinylierten L31-FTA im Durchfluss. Dies geschah zum Teil, weil die endogenen biotinylierten Proteine auch Bindungsstellen auf den mit Streptavidin beschichteten Perlen besetzen, was sich an ihrer partiellen Erschöpfung im Durchfluss zeigt. Die endogenen biotinylierten Proteine sind im Eluat nicht nachweisbar, da sie während der TEV-vermittelten Eluation nicht aus den Perlen freigesetzt werden, aber sie werden wiedergewonnen, wenn die Perlen nach der Eluation im Laemmli-Puffer erhitzt werden.

Immunfluoreszenzbilder, die die Lokalisierung von gespaltenen Enzymen an gezielten Organellen zeigen, sowie Ergebnisse anderer systembasierter Experimente wie RNA-seq und MS-Proteomik von Eluaten, finden sich in unserer aktuellen Veröffentlichung³⁰.

Abbildung 1: Schaltplan für ALIBI-Komponenten und Experiment-Workflow. (A) Rolle jeder Komponente bei Aktivierung, Affinitätsreinigung und Elution. (B) Position von FLAG-TEV-AviTag in der Rpl31-Codierungssequenz und Position von Rpl31 auf der Struktur des Ribosoms (PDB 4V6X). (C) Struktur des N-Fragments (rosa) und des C-Fragments (violett) des gespaltenen BirA-Enzyms, wobei die Pfeilspitze die Spaltstelle bezeichnet (PDB 1BIB). (D) Beispiele für Konstruktpaare, die verwendet werden, um die gespaltenen BirA-Enzymfragmente auf Organellen zu richten. (E) Zeitleiste eines typischen Experiments. Diese Abbildung wurde aus Zhang et ^al.30 adaptiert. Abkürzungen: ? = hypothetische kopurisierende Proteine; ALIBi = AviTag-spezifische Ortsbeschränkte Beleuchtungsverstärkte Biotinylierung; TEV = Tabak-Etch-Virus; MS = Massenspektrometrie; CDS = Codierungssequenz; ER = endoplasmatisches Retikulum; eMag = verstärkter Magnet; NES = nukleare Exportsequenz; MAVS = mitochondriales antivirales Signalprotein. Adaptiert mit Genehmigung von Zhang et ^al.30. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Repräsentative West-Blot-Ergebnisse. (A) Biotinylierung von L31-FTA, wie sie durch Streptavidin-HRP nachgewiesen wird, unter Bedingungen mit unterschiedlichen Kombinationen von ALIBBI-Komponenten. Anti-V5-Antikörper detektiert die N- und C-terminalen Fragmente bei niedrigeren bzw. höheren Molekulargewichten. GAPDH dient als Ladekontrolle. Das vollständige BirA dient als positive Kontrolle. Bahnen mit GFP, die anstelle von gespaltenen Enzymen exprimiert werden, oder mit unmarkierten mESCs, dienen als negative Kontrollen. Dieses Panel wurde adaptiert aus Zhang et ^al.30 (B) Abundance of biotinylated L31-FTA (detektiert durch Streptavidin-HRP), Gesamt-L31-FTA (detektiert durch Anti-FLAG-Antikörper), gespaltenen Enzymfragmente (detektiert durch Anti-V5-Antikörper) und dem ribosomalen kleinen Subunit-Protein Rps12 in Lysat-, Durchfluss- und Eluatfraktionen. Prozentsätze geben den Anteil des gesamten Probenvolumens an, der geladen war. (C) Reichheit an biotinyliertem L31-FTA, Gesamt-L31-FTA und gespaltenen Enzymfragmenten in Fraktionen aus einem Affinitätspulldown-Experiment, bei dem 2,5-fache Lysatmenge zusammen mit den üblichen 450 μL streptavidinbeschichteten Perlen verwendet wurde. Für Bahn 4 wurden die Perlen nach der Elution bei 95 °C für 10 Minuten in 450 μL 1x Laemmli-Puffer erhitzt. Abkürzungen: ALIBi = AviTag-spezifische Ortsbeschränkte Beleuchtungsverstärkte Biotinylierung; HRP = Meerrettichperoxidase; GFP = grünes fluoreszierendes Protein; mESCs = embryonale Stammzellen der Maus. Panel (A) wurde mit Genehmigung von Zhang et al.30 adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Tabelle 1: Subzelluläre Lokalisierungssequenzen. Peptidsequenzen, die verwendet werden, um die gespaltenen Enzyme auf interessierende Organellen zu zielen 36,37,38,39,40,41. Adaptiert mit Genehmigung von Zhang et ^al.30. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Pufferrezepte. Enthält Puffer, die für Zellkultur, Zelllyse, Affinitätsreinigung/-eluation und Western Blot verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 3: Westliche Blot-Bedingungen. Enthält Probe-/Antikörperverdünnungen sowie Bedingungen für Blockieren, Waschen sowie Probe-/Antikörper-Inkubationsschritte. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzungsakte 1: Beispielstrategie zur Einfügung von FTA in ein endogenes ribosomales Proteingen mittels CRISPR. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S1: Beispiel CRISPR-Strategie zur Einschleusung von FLAG-TEV-AviTag in ein endogentes ribosomales Protein-Gen. Zwei PX459-basierte Plasmide, die jeweils ein Cas9-Protein exprimieren, das mit T2A fusioniert ist, und ein Puromycin-Resistenzprotein sowie eine Guide-RNA, werden in Wildtyp-mESCs transfiziert, um zwei Cas9-gRNAs zu erzeugen. Gleichzeitig wird auch ein Spenderplasmid transfektiert. Die Cas9-gRNAs schneiden dann die genomische DNA an den Stellen rund um das Stopcodon und das Donorplasmid, um eine linearisierte dsDNA-Reparaturvorlage freizusetzen. Dies ermöglicht eine homologiegesteuerte Reparatur der genomischen DNA. In der erfolgreich bearbeiteten genomischen DNA beherbergen die ursprünglichen gRNA-Schnittstellen nun Mutationen, um ein erneutes Schneiden zu verhindern. Abkürzungen: CRISPR = gruppierte, regelmäßig übereinanderliegende kurze palindromische Wiederholungen; TEV = Tabak-Etch-Virus; puroR = Puromycin-Resistenzprotein; gRNA = Leit-RNA; mESCs = embryonale Mausstammzellen; RP = ribosomales Protein. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S2: Empfohlenes Primer-Design für das Genotyp-Screening von Post-CRISPR-Klonen. Die Konfigurationen A und B sind empfohlene Zünderplatzierungen, bei denen mindestens ein Primer in jedem Paar distal zu den 300-bp-Flankenregionen liegt. Konfiguration C wird nicht empfohlen, da das Risiko eines falsch-positiven Problems durch Amplifikation des Restspenderplasmids besteht. Abkürzungen: CRISPR = gruppierte, regelmäßig übereinanderliegende kurze palindromische Wiederholungen; gRNA = Leit-RNA; RP = ribosomales Protein. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

ALIBi bietet mehrere Vorteile im Vergleich zu bestehenden Techniken zur Untersuchung subzellulärer Translation und hat potenzielle zukünftige Anwendungen in der Ribosomenbiologie und darüber hinaus. Dieses Protokoll benötigt eine ähnliche oder kürzere Zeit als sequentielle Lyse und Zentrifugation^21,22 und ist potenziell auf jedes subzelluläre Kompartiment anwendbar, das genetisch mit einer lokalisierenden Peptidsequenz gezielt werden kann. Im Vergleich zum konstitutiv aktiven BirA ^10,24 erfordert diese Methode keine Zellkulturen in biotin-depleierten Medien. Zuvor berichtete Biotinkonzentrationen im fetalen Rinderserum reichen von 0,04 μM bis 0,2 μM 25,42,43; Daher hat unser mESC-Medien, das 15 % fetales Rinderserum und keine weiteren biotinhaltigen Komponenten enthält, eine geschätzte Biotinkonzentration von 0,006–0,03 μM. Im Vergleich zu promiskuitiven Proximitätsbiotinylierungsmethoden 26,27,28 isoliert dieser Ansatz subzelluläre Translationsmaschinerie statt subzellulärer Proteome. Darüber hinaus erlaubt sie eine nicht-denaturierende Elution, sodass die elutierte translationale Maschinerie theoretisch für nachgelagerte Assays geeignet ist, die native Komplexe erfordern.

Der Nutzen dieser Methode wurde durch unsere jüngste Arbeit³⁰ illustriert, in der der bahnbrechende Einsatz des Ansatzes einen beispiellosen Vergleich von Ribosomen-Subpopulationen in Säugetierzellen durch die Charakterisierung assoziierter mRNAs und ribosomassoziierter Proteine ermöglichte. Zukünftige Anwendungen könnten sich auf andere subzelluläre Kompartimente ausweiten, in denen lokale Übersetzung beschrieben wurde. Weitere translationale Mechanismen wie posttranslationale Modifikationen, RP-Splicing-Isoformen und rRNA-Modifikationen sind ebenfalls auf subzellulärer Ebene noch zu erforschen. Neben den zusätzlichen Anwendungen in der Ribosomenbiologie könnte ALIBi prinzipiell auch zur Untersuchung subzellulärer Populationen anderer Proteinkomplexe verwendet werden.

Diese Methode birgt jedoch einige Einschränkungen und Herausforderungen. Erstens erfordert es die Einfügung von FTA in ein ribosomales Protein und die Expression der Split-Enzym-Konstrukte, was in Modellsystemen mit begrenzten Möglichkeiten zur genetischen Manipulation schwierig sein könnte. Es erfordert außerdem das Arbeiten unter dunklen Bedingungen für einen Teil des Protokolls und die Aufrechterhaltung der Temperaturkontrolle der Proben, um eine vorzeitige Aktivierung zu verhindern. Es ist daher entscheidend, die Licht- und Temperaturexposition unter 37 °C nach der Transfektion und vor der Aktivierung zu minimieren und die Aktivierung, Lyse und Affinitätsreinigung ohne Verzögerung durchzuführen. Sobald die Proben während der Lyse gekühlt sind, sollten sie nicht über 4 °C erwärmt werden, um den Abbau und die fortgesetzte BirA-Aktivität zu minimieren.

Fehlerbehebung kann erforderlich sein, wenn der erwartete Grad der L31-FTA-Biotinylierung nicht eingehalten wird. Wenn nach der Aktivierung keine Biotinylierung in Lysaten nachgewiesen wird, wird zunächst bestätigt, dass alle Komponenten vorhanden sind (L31-FTA, gespaltene BirA-N- und C-Fragmente, ergänzendes Biotin, blaues Licht), und prüfen, ob Biotinylierung in einer positiven Kontrollprobe mit vollständiger BirA nachgewiesen wird. Außerdem drücken mESCs in unseren Händen ausreichend hohe Mengen endogener biotinylierter Proteine aus (Abbildung 2B, C), sodass sie bestätigen können, dass Streptavidin-HRP die Biotinylierung angemessen erkennt. Betrachten Sie, die Aktivierungsdauer, die Menge des auf SDS-PAGE geladenen Lysats und die Expositionszeit für die Detektion der Western-Blot-Chemiliszenzenz zu erhöhen. Wenn eine bisher ungetestete FTA-markierte Zelllinie oder ein organell-gezieltes Split-Enzym verwendet wird, sollten Sie prüfen, ob der FTA-tragende Teil des Ribosoms ausreichend mit dem Split-Enzym interagiert, damit eine Biotinylierung stattfinden kann.

Umgekehrt wäre die Beobachtung einer erheblichen Biotinylierung in nicht aktivierten Kontrollproben ebenfalls ein unerwünschtes Ergebnis, da dies darauf hindeuten würde, dass die AviTag-Biotinylierung außerhalb der Aktivierungsphase stattfindet. Da Ribosomen und Pre-Ribosomen zwischen subzellulären Kompartimenten (d. h. zwischen Nukleolus und Zellkern zum Zytoplasma während der Biogenese ^3,4 oder vom Cytoplasma zum ER über signalerkennungsvermitteltes Andocken an Translokon ⁵) transportieren), können Ribosomen, die vor dem Aktivierungs-/Lysezeitpunkt biotinyliert waren, nicht mehr auf das interessierende Organelle lokalisiert sein und somit keine organellenspezifischen Eigenschaften mehr aufweisen. Wenn die Hintergrundbiotinylierung trotz minimaler Licht- und Temperaturschwankungen auftritt, sollten Sie die Menge des transfectierten gespaltenen Enzymplasmids verringern und untersuchen, ob Medienbestandteile einen höheren als erwarteten Biotingehalt enthalten. Während die Eliminierung aller Hintergrundbiotinylierung vor der Aktivierung möglicherweise nicht möglich ist, reicht nach unserer Erfahrung eine Fünffache Zunahme der Biotinylierung bei Aktivierung aus, um unterschiedliche Ribosom-Subpopulationen³⁰ zu isolieren.

Der Affinitätsreinigungsprozess kann ebenfalls eine Fehlersuche erfordern, die typischerweise die Optimierung des Perlen-Lysat-Verhältnisses oder der Strengkeit der Wascharbeiten beinhaltet. Beachten Sie, dass bei Lysaten mit einer großen Menge biotinylierter Ribosomen (d. h. vollständiger BirA- oder zytosol-gezielter gespaltener BirA) nicht eingefangenes biotinyliertes L31-FTA im Durchfluss verbleiben kann. Der Pulldown aller biotinylierten Ribosomen ist nicht immer notwendig, um genügend Material für die nachgelagerte Analyse zu erhalten.

Schließlich kann es beim Vergleich von zwei oder mehr subzellulären Ribosomenpopulationen durch RNA-Sequenzierung oder MS-Proteomik an erwarteten Unterschieden auftreten. Wir empfehlen die Verwendung von Immunfluoreszenz, um zu prüfen, ob beide gespaltenen Enzymfragmente ausreichend auf das gewünschte subzelluläre Kompartiment lokalisiert sind. Erwägen Sie, andere organellenzielende Sequenzen zu testen. Die Isolierung organellenlokalisierter Ribosomen kann ebenfalls durch unzureichende Organellenlyse behindert werden; Erwägen Sie, andere Lysis-Reinigungsmittel oder Sonikation zu testen. Organellenspezifische Unterschiede in der translationalen Maschinerie können ebenfalls verdeckt werden, wenn vor der Aktivierung oder nach der Lyse ein ungewöhnlich hohes Maß an gespaltener BirA-Aktivität vorliegt, was zu einer unspezifischen Ribosomen-Biotinylierung führt; siehe oben für Maßnahmen zur Reduzierung unerwünschter Biotinylierung. Ebenso könnte eine zu lange Durchführung der Aktivierung dazu führen, dass organellenlokalisierte Ribosomen wegwandern und ihre organellenspezifischen Eigenschaften vor der Zelllyse verlieren. Zusätzlich sollten Sie die Strenge der Washes verringern, um das Entfernen organellenspezifischer, ribosomassozoziierter Moleküle zu vermeiden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
-80 °C Lagerung			Für Zellkultur
0,1% Gelatine in Wasser	MilliporeSigma	ES-006-B	Für Zellkultur
0,2 µm Filtereinheiten	Fisher	04-977-158	Für Zellkultur
0,5% Trypsin-EDTA (10X)	ThermoFisher	15400-054	Für Zellkultur
1 M MgCl2	ThermoFisher	AM9010	Für Lysis & Affinitätsreinigung
1 M Tris pH 7,5	ThermoFisher	15567027	Für Lysis & Affinitätsreinigung
1 M Tris pH 8	ThermoFisher	AM9855G	Optional: zum Einfügen von FTA in ein endogenes ribosomales Protein-Locus
1,5 und 2 mL Mikrozentrifugenrohre, autoklaviert			Für Transfektion
1,5, 2 mL und 5 mL Protein-Low-Binding-Mikrozentrifugenrohre	Eppendorf	022431081, 022431102, 0030108302	Für Lysis & Affinitätsreinigung
10 cm Gewebekulturplatten			Für Zellkultur
10 M NaOH	MilliporeSigma	72068-100ML	Für Lysis & Affinitätsreinigung
10x Tris/Glycin/SDS-Laufpufferkonzentrat	Bio-Rad	1610772	Für Western Blot
37 °C Gewebekulturinkubator x 2			Für Zellkultur. Einer dieser dient als Hauptinkubator für Zellkultur und Beleuchtung transfizierter Zellen. Am Tag der ALIBi-Aktivierung wird vorübergehend Platz in einem zweiten Inkubator benötigt, um transfizierte Zellen unterzubringen, während der Transilluminator im Hauptinkubator eingerichtet wird.
37 °C Wasserbad			Für Zellkultur
5 M NaCl	ThermoFisher	AM9010	Für Lysis & Affinitätsreinigung
50 mM Biotin	ThermoFisher	B20656	Für Lysis & Affinitätsreinigung
6x Laemmli-Puffer	FIsher	50-196-784	Für Western Blot
70% Ethanol			Für Desinfektion
Acetonitril	Fisher	A955	Optional: für Massenspektrometrie-Stichprobenvorbereitung
AcTEV Protease Kit	ThermoFisher	12575015	Für Lysis & Affinitätsreinigung
ALIBi C-Fragment-Plasmid	Addgene	#235615, 235636 – 235641	Midi-Prep-Skala ist für die Transfektion erforderlich
ALIBi N-Fragment-Plasmid	Addgene	#235614, 235635, 235642, 235643	Midi-Prep-Skala ist für die Transfektion erforderlich
Aluminiumfolie			Für Lysis & Affinitätsreinigung
Ammoniumbicarbonat	MilliporeSigma	5.3305	Optional: für Massenspektrometrie-Stichprobenvorbereitung
anti-FLAG-Antikörper	MilliporeSigma	F3165	Für Western Blot
anti-GAPDH-Antikörper	Cell Signaling	5174	Für Western Blot
anti-Maus-Sekundärantikörper	GE Healthcare	NA931V	Für Western Blot
anti-Kaninchen-Sekundärantikörper	GE Healthcare	NA934V	Für Western Blot
anti-Rpl12-Antikörper	Abcam	ab175219	Für Western Blot
anti-Rpl31-Antikörper	Abcam	ab103991	Für Western Blot
anti-Rpl5-Antikörper	ProteinTech	15430-1-AP	Für Western Blot
anti-V5-Antikörper	ThermoFisher	R960-25	Für Western Blot
Apyrase	NEB	M0398L	Für Lysis & Affinitätsreinigung
Beta-Mercaptoethanol (55 mM)	ThermoFisher	21985-023	Für Zellkultur
Blaulicht-Transilluminator	Clare Research Chemical	DR46B (klein) oder DR196 (groß)	Für Lysis & Affinitätsreinigung
Rinderserumalbumin (BSA)	Fisher	BP1600-100	Für Western Blot
C18-Tips (OMIX C18-Tips)	Agilent	A57003100	Optional: für Massenspektrometrie-Stichprobenvorbereitung
Zellgefriercontainer			Für Zellkultur
Zentrifuge für 15 mL und/oder 50 mL Konusrohre			Für Zellkultur
Zentrifuge für 1,5-2 mL Mikrozentrifugenrohre			Für Lysis & Affinitätsreinigung. Sollte in der Lage sein, bis auf 4 °C gekühlt zu werden und Geschwindigkeiten bis zu 17.000 g. Idealerweise befindet es sich in einem Raum, der vorübergehend abgedunkelt werden kann, während Rohre hinein und heraus übertragen werden.
Clarity ECL Kit	Bio-Rad	170-5061	Für Western Blot
Criterion Geltank	Bio-Rad	1656001	Für Western Blot
Criterion TGX Fertiggele, 4-20%	Bio-Rad	5671095	Für Western Blot. Zusätzliche Wellsgrößen und Layouts verfügbar
Cycloheximid	MilliporeSigma	C7698-5G	Für Lysis & Affinitätsreinigung
Desoxycholat	MilliporeSigma	S1827	Für Lysis & Affinitätsreinigung
Dithiothreitol	ThermoFisher	PIA39255	Optional: für Massenspektrometrie-Stichprobenvorbereitung
DPBS, ohne Calcium, ohne Magnesium	ThermoFisher	14190-250	Für Zellkultur
ES-qualifiziertes FBS	MilliporeSigma	ES-009-B	Für Zellkultur
Ethanol	Gold Shield	412828	Für Western Blot
Ethanol	MilliporeSigma	459828	Optional: für Massenspektrometrie-Stichprobenvorbereitung
Formicsäure	MilliporeSigma	A117	Optional: für Massenspektrometrie-Stichprobenvorbereitung
Fragmentgrößenanalysator und Verbrauchsmaterialien		Agilent	Optional: für RNA-Sequenzierungsbibliotheksvorbereitung. Agilent 2100 Bio