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Methodenartikel

Ein Modell der akuten Lungenschädigung nach viszeraler Ischämie-Reperfusion durch suprazöliakie-Aortenkreuzklemmung bei Ratten

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DOI:

10.3791/66896

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15. August 2025

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1Department of Vascular Surgery, Rouen University Hospital, 2INSERM U1096, FHU REMOD-VHF, Rouen University Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie beschreibt ein Modell der akuten Lungenschädigung nach viszeraler Ischämie-Reperfusion während suprazöliakie-Aorten-Cross-Clamping mittels Laparotomie bei Ratten. Es ermöglicht die Untersuchung sowohl der klinischen und biologischen Auswirkungen des Aortenklemmens als auch des Einflusses der Ischämie-Reperfusion auf darunter liegende Organe und entfernte Lungenverletzungen.

Zusammenfassung

Die offene Operation bei abdominalen Aortenaneurysmen erfordert eine vorübergehende Unterbrechung der Durchblutung, was zu einer Ischämie-Reperfusion der nachgeschalteten Organe führt. Nierenarterien, Mesenterialarterien und Arteria splanchnikus können betroffen sein. Keine Therapie hat sich als wirksam erwiesen, um eine durch Ischämie-Reperfusion nach suprazöliakieartiger Aortenklemmung verursachte Lungenschädigung aus der Ferne zu verhindern. Um die pathophysiologischen Signalwege des akuten Lungenversagens und der pharmakologischen Behandlung zu untersuchen, wurde ein experimentelles Modell der Aortenklemmung an Ratten entwickelt.

Vor dem Eingriff wird eine subkutane Analgesie mit Buprenorphin (0,05 mg/kg) verabreicht. Die Vollnarkose mit Spontanbeatmung wird mit Halogengas (Isofluran 2,5%) über eine Maske eingeleitet. Eine xypho-pubische Laparotomie wird auf einem beheizten Tisch durchgeführt (Temperatur wird intrarektal überwacht). Der Magen-Darm-Block und der Darm werden zur rechten Flanke zurückgezogen, die Leber wird in den Oberbauch mobilisiert. Das Zwerchfell und seine Säulen sind so gekennzeichnet, dass es eine schrittweise Befreiung der suprazöliakiefarbenen Aorta aus ihrem intradiaphragmatischen Durchgang ermöglicht. Die Dissektion wird schonend durchgeführt, um eine umlaufende Kontrolle der Aorta zwischen den Zwerchfellsäulen zu erreichen. Der darunter liegende Truncus coeliacus und die Arteria mesenterica superior werden sorgfältig identifiziert. Eine mikrovaskuläre Klemme kann für einen Aortenverschluss oberhalb der viszeralen Arterien verwendet werden. Die korrekte Klemmung wird durch das Fehlen einer Aortenpulsatilität bestätigt, die mit der Blässe des Dünndarms verbunden ist. Die Ratte bleibt während der gesamten Dauer der Ischämie betäubt. Am Ende der Ischämiedauer wird die Mikroklammer entfernt und die Pulsatilität der Aorta sowie die Darmverfärbung überprüft. Die Bauchdecke wird mit einer Naht verschlossen, gefolgt von einem Verschluss der Haut der Ratte. Am Ende der Reperfusionsphase wird das Tier auf die gleiche Weise betäubt. Es wird während der Blutentnahme durch Ausblutung eingeschläfert, und die Lunge kann dann entnommen werden. Lungenschäden können durch Blutgasanalyse, Lungengravimetrie und histologische Untersuchung beurteilt werden. Lungenproben können auch für RT-PCR- und Western-Blot-Analysen verwendet werden.

Einleitung

Ein Aortenaneurysma ist eine fokale und dauerhafte Erweiterung der Aorta1. Die Entwicklung eines Aneurysmas neigt zur Ruptur, die mit massiven Blutungen einhergeht und eine signifikante Mortalität mit sich bringt2. Daher liegt der Schwerpunkt der Behandlung auf der Vorbeugung dieser dramatischen Komplikation. Aortenaneurysmen sind meist infrarenal und können mit einer Aortenendoprothese behandelt werden. Ein aorto-bi-iliacas Endotransplantat ist ein abgedeckter gegabelter Stent, der minimalinvasiv durch die Oberschenkelarterien mit einem perkutanen Zugang eingeführt wird. Diese Technik erfordert keine Aortenklemmung und vermeidet eine viszerale Ischämie. Sie kann unter örtlicher Betäubung durchgeführt werden. Im Gegensatz dazu sind ausgedehntere Aortenaneurysmen - wie thorakoabdominale Aneurysmen und komplexe abdominale Aortenaneurysmen - mit endovaskulären Techniken schwieriger zu behandeln. Dies ist auf die Beteiligung der Nierenarterien, der Arteria mesenterica superior und des Truncus coeliacus innerhalb des aneurysmatischen Segments zurückzuführen (Abbildung 1). Diese großen viszeralen Arterien müssen zusätzlich zur Aorta selbst rekonstruiert werden. Der endovaskuläre, minimal-invasive Ansatz erfordert daher ein komplexeres Verfahren, bei dem gefensterte und/oder verzweigte Endotransplantate für die Rekonstruktion der viszeralen Arterie verwendet werden. Die Haupteinschränkung dieser Endotransplantate ist die lange Herstellungszeit - oft mehrere Monate -, die sie für eine Notfallbehandlung ungeeignet macht. In solchen Fällen bleibt die konventionelle offene chirurgische Reparatur eine praktikable und zuverlässige Option.

Die Behandlung durch offene Reparatur erfordert eine Laparotomie und ein supraviszerales Clamping, d.h. eine vorübergehende viszerale Ischämie. Die Komplikationsrate ist bei der Behandlung dieser thorakoabdominalen Aneurysmen hoch. Die Sterblichkeit liegt zwischen 5 und 15 %3. Lungenkomplikationen treten bei 60 % und Nierenkomplikationen bei 40 % auf4. Diese Komplikationen, die mit einer systemischen Entzündungsreaktion einhergehen, können zu einem multiviszeralen Versagen führen5. Diese Morbi-Mortalität ist multifaktoriell und umfasst chirurgische Aggression, Anästhesie, Analgesie, hämodynamische Variationen, hämorrhagischen Schock und Ischämie-Reperfusionsphänomene. Die chirurgische Aggression trägt zur Manifestation von Komplikationen bei, unabhängig davon, ob der Ansatz eine Thorakotomie, eine Phrenotomie, eine Lumbotomie oder eine Laparotomie umfasst, indem sie die Beatmungsmechanik modifiziert, insbesondere mit einer Beeinträchtigung der Zwerchfellfunktion6.

Die vorübergehende viszerale Ischämie-Reperfusion betrifft nachgeschaltete Organe, einschließlich des Verdauungstrakts, des Splanchnikussystems, der Nieren und der unteren Gliedmaßen7. Lungenkomplikationen sind die häufigsten unerwünschten Ereignisse nach einer thorakoabdominalen Aortenoperation. Ihr Ursprung ist multifaktoriell. Die suprazöliakiefarbene Aortenklemmung führt nicht direkt zu einer pulmonalen Ischämie-Reperfusion. Die Ischämie-Reperfusion der nachgeschalteten viszeralen Organe löst jedoch eine große systemische Entzündungsreaktion aus. Die Hypothese eines kausalen Zusammenhangs zwischen viszeraler Ischämie-Reperfusion und dem Auftreten von Fernverletzungen -- insbesondere Lungenschäden -- wird gut unterstützt. Die pulmonale endotheliale Dysfunktion, eine kritische Komponente der Alveolen-Kapillarmembran, scheint für die Entwicklung der akuten Lungenschädigung (ALI) von zentraler Bedeutung zu sein. Eine massive systemische Entzündungsreaktion und die Aktivierung von Neutrophilen spielen dabei eine zentrale Rolle.

ALI wird oft auf der Grundlage histologischer Kriterien und nicht auf der Grundlage des klinischen Erscheinungsbilds definiert. ALI bezieht sich auf eine akute entzündliche Erkrankung, die durch eine Störung der pulmonalen Endothel- und Epithelbarriere gekennzeichnet ist. Die Alveolen-Kapillarmembran, die Funktionseinheit der Lunge, besteht aus drei Komponenten: dem mikrovaskulären Endothel, dem interstitiellen Raum und dem Alveolarepithel.

Ein Kennzeichen von ALI ist die erhöhte Permeabilität dieser Barriere, die durch die Infiltration von Neutrophilen und die Freisetzung zytotoxischer proinflammatorischer Mediatoren angetrieben wird. Die Schädigung des Alveolarepithels betrifft sowohl Pneumozyten vom Typ I als auch vom Typ II. Typ-I-Zellen, die 95 % der Alveolaroberfläche bedecken, sind sehr anfällig für Verletzungen und spielen eine Schlüsselrolle beim Gasaustausch. Typ-II-Zellen, die zahlreicher sind, aber eine kleinere Fläche abdecken, sind für die Tensidproduktion, die Epithelreparatur und den Ionentransport unerlässlich. Nach einer Schädigung tragen Typ-II-Zellen durch ihre Regenerationsfähigkeit und Differenzierung zu Typ-I-Zellen zur Wiederherstellung der alveolären Integrität bei.

Mehrere Zelltodwege wurden mit der Epithelschädigung während der ALI in Verbindung gebracht, wobei Typ-I-Zellen besonders anfällig sind. ALI wird üblicherweise durch die Beurteilung von Lungenödemen mit oder ohne Messung der mikrovaskulären Permeabilität zur Reflexion der endothelialen Dysfunktion beurteilt.

Das Ziel dieses Modells ist es, den Zusammenhang zwischen viszeraler Ischämie-Reperfusion und der Entwicklung einer entfernten Lungenschädigung sowohl auf metabolischer als auch auf mechanistischer Ebene zu untersuchen, wie in Abbildung 2 dargestellt. Dieser spezifische Zusammenhang ist nur teilweise verstanden. Unser Aortenklemmenmodell stellt ein viszerales Ischämie-Reperfusionsszenario an einer gesunden Aorta dar, ohne dass bei Ratten ein Bauchaortenaneurysma vorhanden ist. Oberhalb des Zöliakie-Stammes gibt es weder bei Menschen noch bei Ratten größere Äste. Die Aorta oberhalb dieser Ebene entspricht der supracœliaken Aorta, aus der nur kleine parietale Äste hervorgehen, die die Thoraxwand versorgen. Daher gibt es keinen signifikanten Unterschied in der Gefäßanatomie der großen Gefäße auf dieser Ebene zwischen Menschen und Ratten.

Die Verwendung dieses Modells ermöglicht eine umfangreiche Erkundung. Es wird dazu beitragen, frühe Biomarker für die Entwicklung von Gewebeverletzungen aus der Ferne zu identifizieren. Darüber hinaus ermöglicht dieses Modell die Untersuchung potenzieller Inhibitoren, einschließlich Inhibitoren zirkulierender Mediatoren oder Inhibitoren spezifischer Verletzungen entfernter Organe.

Andere Ischämie-Reperfusionsmodelle werden verwendet, um entfernte Verletzungen zu untersuchen. Zerebrale, intestinale und renale Ischämie-Reperfusionsmodelle sind stark vertreten 8,9,10. Es gibt umfangreiche Forschungen zu Lungenschäden nach intestinaler Ischämie-Reperfusion aufgrund eines vorübergehenden Verschlusses der Arteria mesenterica superior (SMA)11,12,13. Die Dauer von Ischämie und Reperfusion ist äußerst variabel und reicht von Minuten bis zu mehreren Stunden14,15. Die Begründung für die Dauer der Ischämie besteht darin, eine ausreichende Aggression zu induzieren, um eine signifikante Reaktion auszulösen, die zum Auftreten von Verletzungen aus der Ferne führt. Eine zu kurze Dauer der Ischämie führt möglicherweise nicht zu einer signifikanten Veränderung des untersuchten Stoffwechselwegs. In Bezug auf die Reperfusionsdauer liegt die Begründung im frühen Auftreten von Fernverletzungen und der potentiell vorübergehenden Natur pathophysiologischer Veränderungen. Eine ideale Reperfusionsdauer sollte weder zu früh noch zu spät sein, um eine metabolische Beeinträchtigung angemessen zu charakterisieren.

Die Modelle sind hauptsächlich in Nagetieren. Zu den Vorteilen von Nagetieren gehören ihre geringe Größe, ihre einfache Wartung, ihr kurzer Lebenszyklus und ihre reichlich vorhandenen genetischen Ressourcen16. Der Einsatz von Großtieren wie Schweinen, Hunden oder Primaten scheint mangels Zusatznutzens nicht gerechtfertigt, was mit den ethischen Regeln von Tierversuchen in Bezug auf die Verfeinerung übereinstimmt. Darüber hinaus ermöglichen Nagetiere aufgrund ihrer anatomischen, physiologischen und genetischen Ähnlichkeit mit dem Menschen translationale Studien16.

Eine der Haupteinschränkungen von SMA-Klemmmodellen besteht darin, dass in der klinischen Praxis der Beginn der intestinalen Ischämie-Phase nicht erkennbar ist. Dies macht die Extrapolation auf klinische Situationen beim Menschen unsicherer. Im Gegensatz dazu sind bei der komplexen Aortenchirurgie die Ischämie- und Reperfusionsphasen verschiedener Organe eindeutig zu erkennen. Darüber hinaus befinden sich bei der suprazöliakie-Aortenklemmung alle darunter liegenden Eingeweide in einer ischämischen Phase (Verdauungstrakt, Leber, Milz, Nieren, Beckenorgane und untere Gliedmaßen). Alle diese Organe durchlaufen das Phänomen der Ischämie-Reperfusion. Umgekehrt sind Modelle der Ischämie-Reperfusion, die sich auf ein bestimmtes Organ (Darm, Niere, Leber usw.) konzentrieren, Modelle der Aortenklemmung und damit der Ischämie-Reperfusion mehrerer Organe mit metabolischer Pathophysiologie weniger untersucht. Ebenso sind entfernte Verletzungen wie Lungenläsionen nach Aortenklemmung in Bezug auf den Stoffwechsel wenig untersucht17,18.

Bestehende Aortenklemmmodelle konzentrieren sich hauptsächlich auf die Klemmung der Bauchschlagader unterhalb der Nierenarterien. Die Einschränkung dieses Modells besteht darin, dass es keine viszerale Ischämie-Reperfusion induziert. Daher lässt sich kein Zusammenhang zwischen viszeraler Ischämie-Reperfusion und möglichen Fernverletzungen nachweisen18,19. Außerdem gibt es kein in vitro Modell, das die Untersuchung der Ischämie-Reperfusion durch Aortenklemmung ermöglicht, weshalb eine Analyse mit in vivo Modellen notwendig bleibt.

Daher ermöglicht dieses experimentelle Modell des suprazöliakiefarbenen Aortenklemmens bei Ratten eine umfassende Untersuchung der pathophysiologischen Mechanismen und pharmakologischen Interventionen, die auf entfernte Lungenverletzungen abzielen.

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Protokoll

Die Erstellung dieses Modells entspricht den Richtlinien für Tierhaltung und -versuche sowie den französischen und europäischen Rechtsvorschriften. Dieses Modell wurde in einer experimentellen Tierstudie validiert, die von der Regionalen Ethikkommission der Universität in der Normandie, Rouen, Frankreich, genehmigt wurde (Nr. APAFIS: #18974).

1. Tiermodell und Akklimatisierung

  1. Anpassungsphase des Tiermodells
    HINWEIS: Das Modell hält sich an die Prinzipien der Verfeinerung.
    1. Unterbringen Sie die Tiere eine Woche lang in nicht überfüllten Einrichtungen, um sich vor der Operation anpassen zu können.
    2. Halten Sie die Ratten zu zweit pro Käfig mit ad libitum Zugang zu Wasser und Futter, das täglich von erfahrenem Personal kontrolliert wird.
    3. Überprüfen Sie täglich die Sauberkeit der Einstreu (Papierstreifen) und wechseln Sie sie systematisch zweimal pro Woche oder bei Bedarf öfter durch erfahrenes Personal.
    4. Nach einer einwöchigen Akklimatisierungsphase, in der sie täglichen Kontakt mit dem Experimentator haben und 12-stündigen Beleuchtungszyklen ausgesetzt sind, finden die Eingriffe in einem separaten, ruhigen Raum mit demselben Experimentator statt.
  2. Tiermodell-Spezies
    1. Verwenden Sie männliche Wistar- oder Sprague-Dawley-Ratten, um hormonelle Einflüsse wie Östradiol auf die Analyse der viszeralen Ischämie-Reperfusions-Physiopathologie aus einer akkreditierten und zertifizierten Zuchteinrichtung zu vermeiden11,20.
    2. Bestimmen Sie im Vorfeld die Versuchsgruppen und die Anzahl der Tiere pro Gruppe.
    3. Wählen Sie das Alter, für die Verwendung werden 6-10 Wochen alte Ratten (350 g) empfohlen.

2. Anästhesie und Analgesie

  1. Analgesie
    1. Wiegen Sie jedes Tier am Tag des Eingriffs.
    2. Buprenorphin (0,05 mg/kg) subkutan auf Höhe der Rückenhaut der Ratte 1 h vor dem Eingriff zu analgetischen Zwecken mit einer 25-G-Nadel und einer 2-ml-Spritze verabreichen.
    3. Tragen Sie Lidocainhydrochlorid-Gel 1% auf die Haut des Bauches auf Höhe des zukünftigen Hautschnitts auf. Regelmäßige (mindestens zweimal tägliche) postoperative Schmerzbestimmung mit einer Skala zur Beurteilung des Gesichtsausdrucks von Schmerzen bei Ratten21.
    4. Während der ersten 24 Stunden ist alle 8 Stunden systematische subkutane Injektionen von Buprenorphin (0,01 bis 0,05 mg/kg) zu verabreichen.
    5. Verabreichen Sie anschließend Buprenorphin-Injektionen (0,01 bis 0,05 mg/kg) auf der Grundlage der Gesichtsschmerzskala des National Centre for the Replacement, Refinement, and Reduction of Animals in Research und wiederholen Sie sie bei Bedarf alle 8 Stunden21.
  2. Allgemeinanästhesie
    1. Verwenden Sie halogenierte Gase (Isofluran) für die Vollnarkose22.
    2. Für die Induktionsphase ist eine belüftete Kammer mit Isofluran (5 %) bei einem Luftdurchsatz von 2 l/min für 2 min zu verwenden.
    3. Um die Anästhesie aufrechtzuerhalten, stellen Sie die Ratte während der gesamten Operation auf eine individuell angepasste Maske für die Spontanbeatmung mit Isofluran (2-2,5%) mit einer Luftstromrate von 2 l/min um.
    4. Befreien Sie die oberen Atemwege, indem Sie die Zunge aus der Mundhöhle bewegen, um die Belüftung über die Maske zu ermöglichen.
    5. Überwachen Sie die Anästhesietiefe während des Eingriffs kontinuierlich und passen Sie die Isoflurankonzentration nach Bedarf an.

3. Platzierung der Ratte während des Eingriffs

  1. Legen Sie die Ratte in Rückenlage, wobei die vorderen und hinteren Gliedmaßen mit Klebeband ruhiggestellt werden, wobei die physiologischen Gelenkbewegungsbereiche der Ratte zu beachten sind.
  2. Legen Sie die Ratte auf ein auf 37 °C eingestelltes Wärmekissen mit Überwachung der Rektaltemperatur.
  3. Schützen Sie die Augen durch das Auftragen von Dakryogel. Rasieren Sie das Bauchfell und desinfizieren Sie den Bauch gründlich mit Povidon-Jod-Lösung.

4. Chirurgischer Eingriff

  1. Zustand des chirurgischen Eingriffs
    1. Führen Sie den Eingriff unter einer mikrochirurgischen Lupe durch, um filigrane Manöver zu erleichtern, obwohl dies nicht unbedingt erforderlich ist.
  2. Einschnitt
    1. Nach dem Abtasten des Processus xiphoideus am oberen Rand des Schnittes wird die Haut in der Mitte des Bauches eingeschnitten, wodurch die Linea alba der Bauchmuskulatur zum Vorschein kommt.
    2. Mittlerer Schnitt des Bauchmuskels an der Linea alba, um Blutungen aus den Bauchmuskeln zu vermeiden.
  3. Intraabdominale Exposition
    1. Halten Sie die Bauchdecke auf beiden Seiten mit selbsthaltenden Retraktoren fest.
    2. Stellen Sie sicher, dass keine Anomalien (Tumore) vorhanden sind, mobilisieren Sie die Eingeweide, den Magen, die Milz und die Leber auf die rechte Seite des Bauches und legen Sie dann die suprazöliakiefarbene Aorta frei.
    3. Halten Sie alle Eingeweide so weit wie möglich im Bauch mit einer kleinen Kompresse, die in Längsrichtung gefaltet und in warmer (37 °C) Kochsalzlösung eingeweicht wird.
    4. Decken Sie alle Eingeweide mit einer Kompresse ab, die in einer auf 37 °C erwärmten Kochsalzlösung getränkt ist, um Unterkühlung und Austrocknung zu vermeiden.
  4. Identifizierung der wichtigsten intraabdominalen Gefäße
    1. Identifizieren Sie die suprazöliakiefarbene Aorta anhand ihrer Pulsationen und ihrer Lage zwischen den Zwerchfellsäulen.
    2. Kontrolle der Aorta zwischen den Zwerchfellsäulen mit sanfter und sorgfältiger Dissektion mit Hilfe von Applikatoren mit Wattespitze und Präparierzange, um die Aorta so atraumatisch wie möglich zu lösen.
    3. Umschließen Sie die suprazöliakiefarbene Aorta mit einer 5-0 monofilen Naht mit einer Präparier- und Ligaturzange.
    4. Überprüfen Sie den Ursprung des Truncus coeliacus und der darunter liegenden Mesenterialarterie. Die Dauer dieses chirurgischen Eingriffs beträgt 10 bis 15 Minuten pro Ratte.
    5. Die zugrundeliegende Identifizierung der subrenalen unteren Hohlvene ist aufgrund der Transparenz des Retroperitoneums einfach.
    6. Lösen Sie die untere Hohlvene der Subniere nur auf ihrer vorderen Oberfläche, was eine direkte intravenöse Verabreichung eines pharmakologischen Wirkstoffs ermöglicht.
  5. Intravenöse Injektion
    1. Verwenden Sie zu diesem Zweck eine 30-G-Nadel zur Injektion und legen Sie einige Millimeter hämostatische Kompresse auf, um eine Blutstillung zu erreichen.
    2. Wenn Sie eine pharmakologische Präkonditionierung durchführen, ist die Injektion vor dem Aortenklemmen zu verabreichen. Verabreichen Sie es nach der Konditionierung während oder nach der Aortenklemmung.
    3. Dieses Protokoll untersuchte die pharmakologische Präkonditionierung, also 5 Minuten vor dem Aortenklemmen verabreichen.
  6. Ischämische Periode
    1. Klemmen Sie die Aorta coeliacus mit einer atraumatischen mikrovaskulären Klemme für die gesamte ischämische Periode von 40 Minuten fest. Überprüfen Sie die Wirksamkeit der Klemme durch das mehrfache Verschwinden der zugrunde liegenden Aortenpulsationen und die Verfärbung der Eingeweide und Gliedmaßen während der Klemmung.
    2. Verschließen Sie den Bauch teilweise mit drei einfachen 5-0 geflochtenen resorbierbaren Nähten, um den Wasser- und Wärmeverlust zu begrenzen. Decken Sie den chirurgischen Schnitt für die gesamte Dauer der Ischämie mit einer sterilen Kompresse ab, die in warmer Kochsalzlösung getränkt ist.
  7. Reperfusionszeit
    1. Am Ende der ischämischen Periode öffnen Sie den Bauch wieder und legen Sie die Aorta auf die gleiche Weise frei, wie zuvor beschrieben.
    2. Entfernen Sie die Gefäßklemme und überprüfen Sie die Wiederaufnahme der zugrunde liegenden Aortenpulsatilität und die Neufärbung der Eingeweide und Gliedmaßen. Die Reperfusionsphase beginnt unmittelbar nach dem Entfernen der Mikroklemme.
  8. Abdomen-Verschluss
    1. Bringen Sie die Eingeweide wieder in ihre ursprüngliche Position zurück und verschließen Sie den Bauch mit einer 5-0 geflochtenen resorbierbaren Naht auf der Linea alba und die Haut mit einer 5-0 monofilen resorbierbaren Naht.
  9. Erweckung der Tiere
    1. Bringen Sie die Ratte in eine linke laterale Dekubitusposition, um eine Kompression der unteren Hohlvene durch die viszerale Masse und den Kontext der Hypovolämie zu vermeiden. Setzen Sie die Ratte in einen Einzelkäfig mit einer Wärmelampe, um die Temperatur bis zum Aufwachen etwa 10 Minuten später zu halten.
  10. Zweite Vollnarkose
    1. Am Ende der 180-minütigen Reperfusionsphase wird die Ratte mit der gleichen Gasanästhesie durch eine beatmete Kammer mit Isofluran (5%) bei einem Luftdurchsatz von 2 l/min für 2 min für die Induktionsphase anästhesiert.
    2. Zur Aufrechterhaltung der Anästhesie wechseln Sie die Ratte zu einer individuell angepassten Maske für die Spontanbeatmung mit Isofluran (2-2,5%) bei einem Luftdurchsatz von 2 l/min während des gesamten Gewebeentnahmezeitraums.

5. Probenahme

  1. Blutproben
    1. Entnehmen Sie Blutproben mit einer 23-G-Nadel und einer 5-ml-Spritze durch direkte Punktion in die untere Hohlvene unterhalb der Nierenvenen.
    2. Erreichen Sie die Blutstillung nach der Punktion, indem Sie ein kleines Stück hämostatische Kompresse auftragen.
    3. Verwenden Sie eine kleine Portion (100 μl) des Gesamtblutes für die Gas- und Standardblutanalyse auf einer einzelnen Raumtemperatur-Testkarte.
    4. Sammeln Sie das restliche Vollblut in einem 4-ml-EDTA-Röhrchen und zentrifugieren Sie es 10 Minuten lang bei +4 °C bei 1.000 × g .
    5. Das Plasma in Kryoröhrchen in flüssigem Stickstoff einfrieren und bis zur Analyse bei -80 °C lagern.
  2. Gewebeproben
    1. Gewebe-Probenahme
      1. Entnahme von Gewebeproben (Lunge, Darm, Niere, Leber und Herz) während der Euthanasie des Tieres. Durchführung der Sterbehilfe durch Blutentnahme, die nach Vollnarkose mit Isofluran zur Blutentblutung führt, nach dem gleichen Protokoll wie zuvor erwähnt.
      2. Entnehmen Sie durch den offenen Bauch 50 mg von jedem Gewebe: dem oberen Pol der linken Niere, dem linken Leberlappen und dem distalen Dünndarm 1 cm vor dem Blinddarm.
      3. Führen Sie dann schnell eine mediane Sternotomie durch, um Herz und Lunge zu identifizieren.
      4. Befreien Sie die linke Lunge von ihrem Band und entfernen Sie sie vollständig für die histologische Analyse. Befreien Sie die rechte mehrlappige Lunge von ihren Bändern. Trennen Sie den Vorderlappen für Nukleinsäure- und Proteinanalysen, lagern Sie den Rest in einem Becher mit physiologischem Serum bei 37 °C für einige Minuten, um anschließend eine Gravimetrie durchzuführen.
      5. Entnehmen Sie das Herz als ganzen Block mit Abschnitten der Aorta, der Lungenarterie und beider Hohlvenen. Nehmen Sie eine Probe eines Stücks des linken Ventrikels für Nukleinsäure- und Proteinanalysen, lagern Sie den Rest in einem Becher mit physiologischem Serum bei 37 °C für einige Minuten, um anschließend eine Gravimetrie durchzuführen.
    2. Nukleinsäure-Analyse
      1. Für die Nukleinsäureanalyse entnehmen Sie sofort eine 50 g Portion Gewebe. Frieren Sie es in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie es dann bis zur Analyse bei -80 °C.
      2. Extrahieren Sie die Gesamt-RNA mit einem gebrauchsfertigen Reagenz für die Isolierung hochwertiger Gesamt-RNA gemäß dem Protokoll des Herstellers.
      3. Bestimmen Sie die RNA-Konzentration und -Reinheit mit einem Spektralphotometer. Messen Sie die RNA-Konzentration mit 2 μl Probe und 2 μl RNase-freiem Wasser als Blankoreferenz. Verwenden Sie die Extinktion bei 260 nm, um die RNA-Konzentration zu bestimmen.
        HINWEIS: Die akzeptable RNA-Reinheit wurde als ein Absorptionsverhältnis von 260/280 und 260/230 im Bereich zwischen 1,7 und 2,0 definiert.
      4. Verwenden Sie 1 μg jeder RNA-Probe für die reverse Transkription.
      5. Messen Sie die mRNA-Spiegel von proinflammatorischen Zytokinen (IL-1beta, TNF-alpha, IL-6) und einer internen Referenz (beta2-Mikroglobulin) durch Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) in einem schnellen, plattenbasierten Thermoblockcycler mit integrierten Echtzeit-Online-Detektionsfunktionen unter Verwendung einer gebrauchsfertigen Heißstart-Reaktionsmischung (Primer sind in Tabelle 1 aufgeführt).
      6. Berechnen Sie den relativen mRNA-Spiegel mit der 2-ΔΔCT-Methode.
    3. Proteinanalytik
      1. Für die Proteinanalyse werden 50 mg Gewebe in ein 2-ml-Lyseröhrchen gegeben, das fünfzig 2,8 mm Zirkonoxid-Keramikkügelchen enthält. Dieses Lyseröhrchen enthält 1 ml RIPA-Lysepuffer (Radioimmunoprecipitation Assay) mit einer Proteasehemmer-Tablette und einer Phosphatase-Hemmer-Tablette.
      2. Extraktion des Proteins aus den Proben durch Homogenisierung auf der Laborrohrmühle mit 3 Wiederholungen einer 5-s-Kontrolle, gefolgt von einer 10-s-Ruhephase.
      3. Zentrifugieren Sie die Proben bei 10.000 g bei +4 °C für 10 min und lagern Sie die Überstände bis zur Analyse in Kryoröhrchen bei -20 °C.
      4. Bestimmen Sie die Proteinkonzentrationen mit einem Bradford-basierten Proteinassay und halten Sie die Proben bei -80 °C.
      5. Trennen Sie mit SDS-PAGE die gleiche Menge an Proteinen aus jeder Probe.
      6. Getrennte Proteine auf 0,2 μm Nitrozellulosemembranen übertragen.
      7. Inkubieren Sie die Membran nach der Blockierung mit 5 % fettfreier TBS-Tween-Trockenmilch für 1 h mit einem Primärantikörper gegen das spezifische Protein Ihrer Wahl. Um beispielsweise Heparanase zu erforschen, verwenden Sie einen polyklonalen Kaninchen-Primärantikörper gegen humane Heparanase (Verdünnung 1:2000) und ein Kontrollprotein als GAPDH, verwenden Sie einen monoklonalen Ziegen-Primärantikörper gegen GAPDH (Verdünnung 1:5000) über Nacht bei 4 °C.
      8. Waschen Sie die Blots dreimal mit TBST-Tween 0,1% Puffer.
      9. Inkubieren Sie mit einem HRP-konjugierten Sekundärantikörper, der gegen den Primärantikörper gerichtet ist, bei Raumtemperatur (RT) für 1 h in Blockierungslösung. Um beispielsweise Heparanase zu erforschen, verwenden Sie den Sekundärantikörper Ziege gegen Kaninchen (Verdünnung 1:5000) und zur Erforschung von GAPDH den Sekundärantikörper Kaninchen gegen Ziege (Verdünnung 1:10000).
      10. Weisen Sie die Immunkomplexe mit einem ECL-Detektionssystem (Enhanced Chemilumineszenz) nach.
      11. Analysieren Sie die Membranen mit einer speziellen Software, um die densitometrischen Werte der Zielbanden zu bestimmen, wobei GAPDH als interne Kontrolle verwendet wird. Führen Sie eine densitometrische Analyse der Bande durch, die der Heparanase (50 kDa) entspricht, und normalisieren Sie sie auf die GAPDH-Proteinbande (35 kDa), um die relative Signalintensität zu bestimmen.
    4. Histologische Analyse
      1. Für die histologische Analyse wird die linke unilobäre Lunge am Hilum entnommen und dann durch den linken Hauptbronchus mit einer Kryokonservierungslösung unter Verwendung eines 16-G-Katheters infundiert. Frieren Sie es in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie es bei -80 °C.
    5. Gravimetrie-Analyse
      1. Nach den Proben für die Nukleinsäure- und Proteinanalyse wird der verbleibende Teil des Herzens und der rechten multilobulären Lunge durch Gravimetrie analysiert, wobei die Trocknung in Öfen bei 70 °C erfolgt, so dass das Nass-Trocken-Gewichtsverhältnis eine Abschätzung des Gewebeödems ermöglicht.

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Ergebnisse

Dieses Protokoll erwies sich als sicher, mit minimalen Tierverlusten (weniger als 5 %) während der Anästhesie und Operation und wirksam bei der Einleitung akuter Lungenverletzungen. Eine Anästhesie mit Isofluran war sicherer als Ketamin in Kombination mit einer Xylazin-Anästhesie (Verlust ca. 15%), mit schnellem Erwachen und besserer Erholung der Ratte (Daten nicht gezeigt). Alle anästhesierten Tiere konnten sich mit dieser Methode sicher und effektiv einer Aortenklemmung unterziehen. Alle Tiere (100%) mit wirksamer Aort...

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Diskussion

Dieses chirurgische Modell des Aortenkreuzklemmens bietet den Vorteil, dass es eine umfassende Analyse der akuten Lungenschädigung nach viszeraler Ischämie-Reperfusion sowohl gewebe- als auch plasmabasiert ermöglicht. Es bietet auch die Möglichkeit, pharmakologische Moleküle mit intraperitonealer, enteraler oder intravenöser Verabreichung vor oder nach der Konditionierung zu testen.

Einer der kritischen Schritte bleibt die suprazöliakiefarbene Aortenklemmung w...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,2 &Mikro; m Nitrozellulose-Membranen Trans-Blot Turbo Transfert PackBio-Rad16201500,2 &Mikro; M Nitrozellulose-Membranen vorgeschnitten
1cc Luer Slip Spritze ohne NadelTerumoMDSS01SE1cc Luer Slip Spritze ohne Nadel
2cc Luer Slip Spritze ohne NadelBecton Dinckinson2cc Luer Slip Spritze ohne Nadel
4 mL EDTA-Röhrchen BD K3 13 mm x75 mmBD VacutainerBD3688605 mL EDTA-Röhrchen BD K3 13 mm x 75 mm
5-0 geflochtenes Nahtmaterial / Vicryl 5-0 (Ethicon) oder Novosyn (B. Braun)Ethicon - Johnson & JohnsonV7970EVicryl 5-0 Nadelspitze, 1/2 Kreis, 13 mm, Länge: 45 cm
5-0 monofiles resorbierbares Nahtmaterial / Monocryil PoliglecapronEthicon - Johnson & JohnsonY493GNadel 3/8 Kreis Länge 18in
5cc Luer Slip Spritze ohne NadelTerumoSS-05LE15cc Luer Slip Spritze ohne Nadel
Atraumatische mikrovaskuläre Klemme/Einweg-Gefäßklemmen für VenenAROSurgischTKF-1-20gAtraumatische mikrovaskuläre Klemme für die Venenanwendung, um die Aorta der Ratte zu klemmen
BD Mikrolanze 3 23 G x 1 0,6 x 25 mmBD Vacutainer300800BD Mikrolanze 3 23 G x 1 0,6 x 25 mm
BD Mikrolanze 3 25 G x 5/8 0,5 x 16 mmBD Vacutainer300600BD Mikrolanze 3 25 G x 5/8 0,5 x 16 mm
BD Mikrolanze 3 30 G x 1/2 0,3 x 13 mmBD Vacutainer304000BD Mikrolanze 3 30 G x 1/2 0,3 x 13 mm
Beta-Aktin InvitrogenCarlsbad, Vereinigte Staaten von Amerika15G5A11/E2
Protein-Assay mit Bradford-basierter MethodeBiorad, Marnes-la-Coquette, Frankreich5000201
BuprenorphinBuprenorphin
Zentrifugator Sigma 3-30Sigma, Deutschland10375, 10376, 10377, 10378, 10379, 91276, 109014Zentrifugator für eppendorf
cOmplete MiniRoche11836153001Proteasehemmer Cocktail 25 Tabletten
Wattestäbchen
Dakryogel /  Augengel Lubrithal 10 gDechra VeterinärprodukteCode  ACL7376464Augengel Lubrithal 10 g
Einweg-SkalpellHöchstPDSS11Einweg-Skalpellklinge n° 11
ElektrokauterisationDentRMedEMB/87400Hämostatischer Pen mit hoher Temperatur
Erweitertes ECL-ErkennungssystemBiorad, Hercules, Kalifornien, USA1705060S
Fisherbrand Kugelmühle 24Fischer wissenschaftlich15515799Verwendet für  Vermahlung, Lyse und Homogenisierung biologischer Proben vor der molekularen Extraktion
Mulltupfer Raffin.010106Mulltupfer 
ImageLabTM SoftwareBioradauf USB-Laufwerk oder Lizenz
Isofluran 5%Isofluran 5%
Lidocain Prilocain Gel 5% Aguettant, Lyon, FrankreichLidocain Prilocain Gel 5% 
LightCycler 480 GerätRoche, Bâ le, Schweiz5015243001Thermocycler
Gleitgel Steril K-Y 82 gRECKITT BENCKISERGleitgel Steril K-Y 82 g
NanoDrop 2000TermoScientific, Waltham, Massachusetts, Vereinigte Staaten von AmerikaND-2000Spektralphotometer
Peha Pince anatomischHartmann991063Anatomische Zange
PhosSTOPRoche4906837001Phosphatasehemmer 20 Tabletten
Gips/KlebebandAnapore135320Chirurgisches Klebeband/Pflaster
Povion-Jod-Lösung / Vé té dine LösungVé ToquinolAntiseptische Lösung zur äußerlichen Anwendung
Precellys Lysing Kit Tube Homogenisierung von Hartgewebe CK28, BertinCK28Precellys Lysing Kit Tube 
Prolè ne Prolypropylen-NahtEthicon - Johnson & Johnson7472HProlè ne 5-0 Nadelspitzenschnitt 3/8 Kreis 13 mm Länge 75 cm
Safe-Lock Röhrchen 1,5 mLEppendorf.0030120086Safe-Lock Röhrchen 1,5cc ohne Farbe 1000 Röhrchen zum Zentrifugieren
Safe-Lock Röhrchen 2 mLEppendorf.0030120094Safe-Lock Röhrchen 2,0cc ohne Farbe 1000 Röhrchen zum Zentrifugieren
Safe-Lock Röhrchen 5 mLEppendorf.0030119401Safe-Lock Röhrchen 5,0cc ohne Farbe 200 Röhrchen zum Zentrifugieren
Kochsalzlösung NaCl 0,9%Aguettant, Lyon, Frankreich600502Kochsalzlösung 0,9% 500 mL
SDB-SEITESigma-Alrich
Surflash IV Katheter 16 GTerumoSR*FF1651
SurgicelEthicon - Johnson & JohnsonHämostatisch resorbierbare Tupfer
Nahtset n° 12Hartmann4701762Steriles Nahtset mit Adhäsin-Champ, Cisoren, Adson-Zange, Nadelhalter
SYBR Grün KIT Light Cycler 480 SYBR Grün I MasternRoche4707516001SYBR Grün
TBST-Tween 0,1% Puffer Sigma-Alrich
Test-Cards Epoc 24 Karten 13 ParameterSiemens-Healthineers
Gewebe TEKSakura FinetecLösung zur Kryokonservierung 
TRIzol-Reagenz InvitrogenThermo Fisher Scientific, Carlsbad, Kalifornien, USA15596026TRIzol-Reagenz

Referenzen

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