Verbesserte Extraktion von niedermolekularer DNA aus Abwasser zur umfassenden Bewertung von Antibiotikaresistenzen

Zusammenfassung

Hier stellen wir eine einfache Technik zur Bewertung der antimikrobiellen Resistenz in der Umwelt (AMR) vor, indem der Anteil an niedermolekularer extrazellulärer DNA erhöht wird. Eine vorherige Behandlung mit 20%-30% PEG und 1,2 M NaCl ermöglicht den Nachweis sowohl genomischer als auch horizontal übertragener AMR-Gene. Das Protokoll eignet sich für einen kitfreien Prozess mit zusätzlicher Optimierung.

Zusammenfassung

Die Umweltüberwachung gilt als wichtiges Instrument zur Bewertung der öffentlichen Gesundheit in der Zeit nach der Pandemie. Wasser, insbesondere Abwasser, hat sich als die Quelle der Wahl herauskristallisiert, um Proben von Krankheitserregern in der Umwelt zu nehmen. Abwässer aus offenen Abflüssen und kommunalen Wasseraufbereitungsanlagen sind ein Reservoir sowohl für Krankheitserreger als auch für Gene für antimikrobielle Resistenzen (AMR) und kommen häufig mit Menschen in Kontakt. Es gibt zwar viele Methoden, um AMR aus dem Wasser zu verfolgen, aber die Isolierung von qualitativ hochwertiger DNA mit hohen Ausbeuten aus heterogenen Proben bleibt eine Herausforderung. Um dies zu kompensieren, müssen die Probenvolumina oft hoch sein, was zu praktischen Einschränkungen führt. Darüber hinaus ist die Umwelt-DNA häufig fragmentiert, und die Quellen von AMR (Plasmide, Phagen, lineare DNA) bestehen aus niedermolekularer DNA. Dennoch haben sich nur wenige Extraktionsverfahren auf Methoden zur Extraktion von linearer und niedermolekularer DNA mit hoher Ausbeute konzentriert. Hier wird über eine einfache Methode zur linearen DNA-Extraktion mit hoher Ausbeute aus kleinen Abwassermengen unter Verwendung der Fällungseigenschaften von Polyethylenglykol (PEG) berichtet. Diese Studie plädiert dafür, die Gesamt-DNA-Ausbeute von Wasserproben zu erhöhen, die für metagenomische Analysen entnommen wurden, indem der Anteil der linearen DNA angereichert wird. Darüber hinaus überwindet die Verbesserung der niedermolekularen DNA das derzeitige Problem der Unterbeprobung von umweltbedingter AMR aufgrund der Fokussierung auf hochmolekulare und intrazelluläre DNA. Es wird erwartet, dass diese Methode besonders nützlich ist, wenn extrazelluläre DNA vorhanden ist, jedoch in geringen Konzentrationen, z. B. bei Abwässern aus Kläranlagen. Es sollte auch die Umweltprobenahme von AMR-Genfragmenten verbessern, die sich durch horizontalen Gentransfer ausbreiten.

Einleitung

SARS-CoV-2 und seine Folgen unterstrichen die Bedeutung der Umweltüberwachung für die Überwachung und Vorhersage von Ausbrüchen von Infektionskrankheiten ^1,2. Während Viruspandemien offensichtlich sind, wird die Zunahme von Antibiotikaresistenzen (AMR) oft als heimtückische Pandemie bezeichnet, die weltweit ein Hauptproblem für die öffentliche Gesundheit darstellt ^3,4. Folglich besteht ein dringender Bedarf an koordinierten Strategien, um die Entwicklung und Ausbreitung von AMR zu verstehen. Gewässer sowie Abwasser können sowohl für Krankheitserreger a....

Protokoll

1. Probenahme von Abwasser

1. Tauchen Sie ein 500-ml-Polypropylen-Becherglas in den offenen Abfluss oder das Reservoir der Kläranlage (STP) und sammeln Sie ~300 mL Abwasserprobe.
2. Übertragen Sie ~250 mL der Probe in eine 250 mL Flasche aus autoklaviertem Polypropylen.
3. Schrauben Sie den Deckel der Flasche auf und verschließen Sie ihn mit einer Plastikfolie. Bewahren Sie die Flasche aufrecht in einem geschlossenen Beutel auf.
4. Transportieren Sie die Probe aufrecht in einem geschlossenen Behälter bei Umgebungstemperatur.
5. Die Probe wird 4 h lang bei 70 °C in einem Heißluftofen hitzeinaktiviert, bevor sie für di....

Ergebnisse

Etablierung eines Protokolls für die Extraktion von DNA aus Abwasserproben mit hoher Ausbeute
Für die Extraktion von hochwertiger DNA und RNA aus Wasserproben wurde eine modifizierte Version von zuvor etablierten Protokollen verwendet¹⁷. Die Proben stammten aus offenen Abflüssen sowie aus Kläranlagen in der Region Delhi-NCR in Nordindien. Nach der Vorverarbeitung mit PEG und NaCl (Abbildung 1) wurden die Proben durc.......

Diskussion

AMR ist heute eine der 10 größten Gesundheitsbedrohungen, wie von der WHO aufgeführt, und die Umweltüberwachung für AMR ist weltweit als wichtiges Instrument anerkannt. Wie in der Einleitung erwähnt, umfasst eine umfassende Aufzeichnung von umweltbedingter AMR niedermolekulare, fragmentierte und extrazelluläre DNA. Das hier beschriebene Vorverarbeitungsprotokoll mit einer hohen Konzentration von PEG in Kombination mit Salz (30 % PEG und 1,2 M NaCl) erreicht dieses Ergebnis, indem es den Anteil an niedermolekularer DNA an.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Mikrozentrifuge / 24 Sitze	Eppendorf Centrifuge 5425 R	EP5406000046
Absolute Ethanol (EMSURE ACS, ISO, Reag. Ph Eur Ethanol absolut für die Analyse)	Supelco	100983-0511
Agarose	Invitrogen	16500500
Tischkühlzentrifuge	Eppendorf Centrifuge 5920 R	EP5948000131
ChemiDoc Imaging System	BioRad	12003153
DNeasy PowerSoil Pro Kit	Qiagen	47014
DNeasy PowerWater Pro Kit	Qiagen	14900-100-NF
dNTPs (dNTP-Mix je 10 mM, 0,2 mL, R0191)	Thermo Fisher	R0191
DreamTaq DNA-Polymerase, 5 μk; L + 10x DreamTaq Puffer*	Thermofscientific	EP0702
E-Gel 1 Kb Plus Express DNA Ladder	Invitrogen	10488091
Maxiamp PCR-Röhrchen 0,2 mL	Tarsons	510051
Molekularbiologie Wasser für PCR	HiMedia	ML065-1,5ML
NanoDrop OneC Mikrovolumen UV-Vis Spektralphotometer	Thermo Scientific	13400519
Parafilm	Bemis	S37440
PEG-8000	SRL	54866
QIAquick PCR & Gel-Cleanup-Kit	Qiagen	28506
Qubit 4 Fluorometer (mit WiFi)	Thermofisher	Q33238
Qubit-Assay-Röhrchen	Thermofisher	Q32856
Qubitt-Reagenzien-Kit für ds-DNA, breites Spektrum	Thermo Scientific	Q32853 (500 Assays)
Natriumchlorid	HiMedia	TC046M-500G
SYBR Sicherer DNA-Gel-Fleck	Invitrogen	S33102
T100 Thermocycler	BioRad	1861096
Thermocycler (ProFlex 3 x 32-Well-PCR-System)	Applied Biosystems	4484073
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1125