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Verwendung eines isolierten funktionierenden Rattenherzmodells zum Testen von Strategien zur Erhaltung des Spenderherzens

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DOI:

10.3791/66910

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4. Oktober 2024

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1Cardiac Physiology and Transplantation, Victor Chang Cardiac Research Institute, 2St Vincent's Healthcare Clinical Campus, University of New South Wales, 3Heart and Lung Transplant Unit, St Vincent's Hospital, 4Faculty of Medicine, University of New South Wales

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein ex vivo isoliertes funktionierendes Rattenherzprotokoll, um Strategien zur Erhaltung des Spenderherzens zu testen. In diesem Artikel wird das Protokoll für die Verwendung in der statischen Kühllagerung von Nagetierspenderherzen beschrieben. Das Protokoll kann aber auch für Spenderherzen verwendet werden, die nach einer Spende nach Kreislauftod und Hirntod gewonnen wurden.

Zusammenfassung

Die Optimierung von Lösungen zur Erhaltung des Spenderherzens hat eine Schlüsselrolle bei der Reduzierung von Ischämie-Reperfusionsschäden bei Spenderherzen während der Organentnahme, des Transports und der Transplantation gespielt. Frühere Arbeiten aus unserem Labor haben gezeigt, dass die Zugabe von Glyceryltrinitrat und Erythropoietin zu Lösungen zur Erhaltung des Spenderherzens die Wiederherstellung der Herzfunktion nach längerer Kühllagerung und bei der Spende nach dem Bluttod von Herzen signifikant verbessern kann. Dieses Supplementierungsprotokoll wurde im klinischen Einsatz in Transplantationseinheiten in Australien, Belgien und dem Vereinigten Königreich implementiert. Hier skizzieren wir ein Protokoll zum Testen von Supplementierungsstrategien unter Verwendung eines ex vivo isolierten funktionierenden Rattenherz-Perfusionskreislaufs (IWRH). Mit dieser Methode können Supplementierungsstrategien im Zusammenhang mit längerer kalter statischer Lagerung, Spende nach Hirntod und Spende nach Kreislauftod und Spenderherzerhaltung getestet werden. Die Wiederherstellung der kardialen Funktionsfähigkeit, gemessen anhand des Aortenflusses, des Koronarflusses, des Herzzeitvolumens, des Pulsdrucks und der Herzfrequenz, kann verwendet werden, um festzustellen, ob eine bestimmte Konservierungsstrategie die Ischämie-Reperfusionsverletzung des Spenderherzens minimieren kann.

Einleitung

Der Erfolg einer Herztransplantation kann stark von der Konservierungsmethode des Spenderherzens beeinflusst werden. Spenderherzen sind während des gesamten Prozesses der Organentnahme, des Transports und der Transplantation ischämischen Beleidigungen ausgesetzt. Das Ausmaß der ischämischen Schädigung des Spenderorgans kann durch die Auswahl einer geeigneten Strategie zur Erhaltung des Spenderherzens gemildert werden. Die kalte statische Lagerung (CSS) ist nach wie vor die praktikabelste und gebräuchlichste Methode zur Konservierung des Spenderherzens. CSS ist jedoch nicht unbedingt die beste Option für alle Herzspendewege. Zum Beispiel werden Herzen, die über den Spendenweg nach dem Kreislauftod (DCD) gewonnen wurden, mit Hilfe der normothermen maschinellen Perfusion erhalten und auf Lebensfähigkeit untersucht, während Herzen, die über den Spendenweg nach dem Hirntod (DBD) gewonnen wurden, mit CSS oder hypothermischer maschineller Perfusion konserviert werden können. Eine weitere wichtige Determinante für die verwendete Konservierungsstrategie ist die Menge an warmer Ischämie (bei DCD) oder kalter Ischämie (bei DBD), der das Herz während der Organbeschaffung und des Transports ausgesetzt ist.

Viele Zentren verwenden eine zusätzliche pharmakologische Supplementierung der Herzkonservierungslösung, um die ischämische Toleranz zu erhöhen und die Herzfunktion nach der Transplantation zu verbessern. Nagetierstudien aus unserem Labor zeigten, dass die Supplementierung von Kardioplegie mit Erythropoietin und Glyceryltrinitrat in der Lage war, die kardiale Funktionserholung nach längerer Kältelagerung des Spenderherzens signifikant zu verbessern 1,2. Diese Studien wurden dann zu Schweinestudien zur Erhaltung des Spenderherzens weiterentwickelt und lieferten die präklinische Grundlage, die zum Einbau von Erythropoietin und Glyceryltrinitrat in die Kardioplegielösung von Herzen führte, die über einen DCD-Weg unter Verwendung der normothermen maschinellen Perfusion gewonnen wurde 3,4,5. Derzeit wird die Supplementierung mit Erythropoietin und Glyceryltrinitrat auch in australischen Transplantationseinheiten für klinische DBD-Herzentnahmen mit CSS eingesetzt. Das übergeordnete Ziel des unten beschriebenen Perfusionsprotokolls für isoliertes funktionierendes Rattenherz (IWRH) besteht darin, Strategien zur Erhaltung des Spenderherzens in einer Laborumgebung zu testen und ihre Wirksamkeit bei der Erhaltung der Herzfunktion des Spenderherzens nach der Reperfusion zu testen. Das beschriebene isolierte funktionierende Rattenherzprotokoll wird seit über zwei Jahrzehnten in unserem Labor verwendet und hat sich beim Screening auf potenzielle Nahrungsergänzungsmittel und/oder Strategien, die den Erhalt des Spenderherzens verbessern können, als äußerst nützlich erwiesen 2,7,8,9.

Protokoll

Alle Tiere erhielten eine humane Pflege in Übereinstimmung mit den Richtlinien des National Health and Medical Research Council (Australien). Alle tierexperimentellen Verfahren wurden von der Tierethikkommission des Garvan Institute of Medical Research (Sydney, Australien) genehmigt.

1. Herstellung von Krebs-Henseleit (KH) -Puffer

  1. 2 l einer 20-fachen Stammlösung KH-Puffer mit 2,36 M NaCl, 0,094 M KCl, 0,024 M MgSO4 und 0,024 M KH2PO4 herstellen. In 50-ml-Röhrchen aliquotieren und bei -20 °C lagern.
  2. Bereiten Sie vor dem Experiment zwei 2-Liter-Erlenmyer-Kolben mit 1x KH-Puffer vor, die 1900 ml deionisiertes Wasser, 100 ml 20x KH-Stammpuffer, 4,20 g NaHCO3 (25 mM) und 3,96 g Glukose (11 mM) enthalten.
    1. Die Pufferkolben werden in ein 37 °C heißes Wasserbad gestellt und die Lösung mit Carbogen (95 % Sauerstoff, 5 % Kohlendioxid, Durchflussmenge auf 2 l/min) über Ausströmersteine (Aufsteckfilter) 5 min lang begast, dann 2,8 mL 1 M CaCl2 (1,4 mM) zugegeben. Lassen Sie die Lösung vor Beginn des Experiments mindestens 1 Stunde lang sprudeln. Die Verwendung eines Ausströmers unterstützt die gleichmäßige Belüftung des Puffers.
    2. Geben Sie ein kleines Volumen (~50 ml) Puffer zum Abkühlen in eine runde Metallschale bei -20 °C und bilden Sie eine Schicht aus eisgekühltem Puffer.

2. Vorbereitung des Perfusionskreislaufs

  1. Stellen Sie sicher, dass alle Schläuche und Glaswaren sauber sind und kein sichtbarer Bewuchs/Kontamination vorhanden ist.
  2. Die Höhe der Glaskammern ist so einzustellen, dass sie den erforderlichen Perfusionsdrücken entspricht, basierend auf 1 cm H2O entspricht 1,36 mmHg: Langendorff-zu-Herz 100 cm (ca. 75 mmHg), Vorspannung von Seite zu Herz 15 cm (ca. 11 mmHg), Herz-zu-Nachlast-Kammer 100 cm (ca. 75 mmHg).
  3. Beginnen Sie die Zirkulation von heißem Wasser um den Kreislauf mindestens 10 Minuten vor der Herzperfusion.
  4. Legen Sie Mikrofaserfilter (1,2 μm) in die Filterhalter und verschließen Sie diese.
  5. Grundieren Sie den Kreislauf mit KH-Puffer, stellen Sie sicher, dass die gesamte Luft entfernt wird, und verwenden Sie eine Schlauchschelle zur Durchflussregelung, um den Durchfluss auf der Langendorff-Seite (Abbildung 1A, B) auf ~50 mL/min einzustellen. Der langsamere Fluss ermöglicht eine einfache Kanülierung der Aorta und verhindert, dass das Herz vor dem Binden verschoben wird. Platzieren Sie ein Thermometer über einen T-förmigen Schlauchanschluss im Kreislauf, um die Temperatur des Puffers bei ~37 °C zu überwachen.

3. Einrichtung der Lab Chart (Datenanalyse) Software

  1. Stellen Sie sicher, dass Powerlab (Datenerfassungssystem) und Durchflussmesser eingeschaltet und mit dem Computer verbunden sind, bevor Sie die Datenanalysesoftware öffnen.
  2. Öffnen Sie eine neue Datei.
  3. Richten Sie die Datenerfassung ein, indem Sie das Dropdown-Menü Einstellungen und dann Kanaleinstellungen auswählen. Wählen Sie für Aortendruck, Aortenfluss und Herzfrequenz (Abbildung 2A).
  4. Richten Sie jeden Kanal mit den in Abbildung 2B gezeigten Einstellungen ein.

4. Vorbereitung des Tieres auf die Isolierung des Rattenherzens

HINWEIS: Die Methodik für die Isolierung und Perfusion von Rattenherzen für Nicht-DBD- und Nicht-DCD-Herzen für die kalte statische Lagerung wird im Folgenden beschrieben. Die Methoden für die Herzinstrumentierung in den Perfusionskreislauf sind relativ ähnlich, unabhängig davon, welche Spendemethode verwendet wird. Die Unterschiede im Protokoll für DBD- und DCD-Rattenherzspende treten hauptsächlich ab dem Zeitpunkt auf, an dem die Tieranästhesie wirksam geworden ist, bis zu dem Zeitpunkt, an dem das Herz aus dem Tier herausgeschnitten wird.

  1. Wiegen Sie das Tier und achten Sie darauf, dass es >330 g wiegt. Der ideale Gewichtsbereich für männliche Ratten liegt bei 330-420 g.
  2. Verabreichen Sie eine intraperitoneale Injektion von Ketamin (80 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg). Stellen Sie eine angemessene chirurgische Anästhesieebene sicher, die auf dem Fehlen eines Pedalreflexes (Zehenkneifreflex) und eines Augenblinzelreflexes basiert.
  3. Bringen Sie das Tier in Rückenlage und sichern Sie die Gliedmaßen mit Klebeband. Verabreichen Sie dem Tier Sauerstoff über einen Nasenkonus.
  4. Halten Sie den Eis-Matsch-Metallbehälter KH Puffer und einen kleinen Metallbehälter mit Eis an der Präparierstation bereit. Tränken Sie eine 7,5 cm x 7,5 cm große Gaze in KH-Puffer und legen Sie sie auf den Behälter mit Eis.
  5. Sobald eine angemessene chirurgische Anästhesie bestätigt ist, rasieren Sie die Haut an der chirurgischen Schnittstelle und reinigen Sie die Haut mit Aseptika wie Betadin oder 70% Alkohol. Machen Sie einen seitlichen Schnitt quer durch den Bauch (Laparotomie) und verschieben Sie Magen und Darm zur Seite, um den Zugang zur linken Nierenvene zu ermöglichen. Injizieren Sie 1500 IE Heparin und üben Sie Druck auf die Injektionsstelle aus, bis die Blutung aufhört. Lassen Sie 1-2 Minuten warten, bis Heparin zirkuliert, bevor Sie mit der Herzentnahme fortfahren.
  6. Öffne die Brusthöhle, indem du den Brustkorb auf beiden Seiten durchschneidest und das Zwerchfell durchschneidest. Halten und heben Sie den Herz-Lungen-Block vorsichtig an, während Sie entlang der absteigenden Aorta schneiden, um sicherzustellen, dass der Aortenbogen intakt bleibt. Dadurch bleibt genügend Aortenlänge für die Kanülierung übrig.
  7. Die Ratte wird durch die Entfernung von Herz und Lunge unter Narkose eingeschläfert. Tauchen Sie den Herz-Lungen-Block in den KH-Puffer-Eismatsch, damit das Herz stillstehen kann.

5. Kanülierung des Herzens auf den isolierten funktionierenden Herzperfusionskreislauf

  1. Übertragen Sie den Herz-Lungen-Block auf eine Gaze auf Eis. Präparieren Sie überschüssiges Fett um die Aorta, kürzen Sie die Aorta, um 3-5 mm Länge für die Kanüle zu lassen, und machen Sie einen kleinen Schnitt ~1-2 mm in der Lungenarterie. Dadurch wird ein Weg für den koronaren Abfluss ermöglicht.
  2. Legen Sie den getrimmten Herz-Lungen-Block (noch auf Eis) direkt unter die Kanülen. Stellen Sie den Durchfluss von der Langendorff-Seite mit einer Schlauchschelle zur Durchflussregelung ein, um die Aortenkanülierung zu erleichtern. Kanülieren Sie die Aorta vorsichtig auf die linke Kanüle, halten Sie sie mit einer schwarzen Klemme fest und binden Sie sie mit einer 2-0 Seidennaht fest.
  3. Erhöhen Sie den Durchfluss aus der Langendorff-Perfusion, indem Sie die Schlauchschelle vollständig öffnen. Öffnen Sie die Nachspannklemme. Stellen Sie sicher, dass ein kontinuierlicher Durchfluss aus der Langendorff-Kammer erfolgt. Beginnen Sie mit der Überwachung der Herzaktivität mit Software.
    HINWEIS: Wenn der Aortenflusswert auf dem Display des Durchflussmessers <10 ml/min beträgt, stellen Sie sicher, dass die Lungenarteriotomie eine ausreichende Größe hat. Eine niedrige Aortenflussspur/ein niedriger Wert könnte auch darauf hindeuten, dass die Aortenkanüle zu weit eingeführt wurde.
  4. Stellen Sie den Herz-Lungen-Block so ein, dass die vordere Oberfläche der Lunge dem Bediener zugewandt ist. Binden Sie den linken Lungenlappen mit einer 2-0-Seidennaht zusammen und schneiden Sie überschüssiges linkes Lungengewebe ab. Binden Sie die restlichen Lungenlappen in einem Zug mit einer 2-0 Seidennaht zusammen und schneiden Sie das Gewebe auf. Drehen Sie das Herz so, dass die gefesselten Lungen nach hinten zeigen.
  5. Schneiden Sie mit einer kleinen Vannas-Schere eine Kante von 2-3 mm am linken Vorhofohr ab und achten Sie darauf, dass eine kleine Öffnung in die Vorhöfe entsteht. Kanülieren Sie das linke Vorhofohr vorsichtig mit der linken Kanüle, halten Sie es mit einer schwarzen Klemme fest und binden Sie es mit einer 2-0-Seidennaht zusammen. Abbildung 3A zeigt die Platzierung beider Kanülen.
  6. Stellen Sie den Wassermantel der Herzkammer so ein, dass das Herz in der Mitte der Kammer sitzt.
  7. Öffnen Sie den Druckmessumformer auf Luft und stellen Sie den Druckmessumformer in der Software auf Null, indem Sie das Dropdown-Menü Aortendruck > Bridge Amp > Zero auswählen. Klicken Sie auf OK.
  8. Perfundierte des Herzens im Langendorff-Modus für 10 min. Stellen Sie sicher, dass der Langendoff-Aortenfluss zwischen 10 und 20 ml/min misst (ideal 20 mL/min).
  9. Vor dem Umschalten des Arbeitsmodus ist darauf zu achten, dass der Ausströmer (aufsteckbarer Einlauffilter) aus dem Langendorff KH Pufferbehälter in den arbeitenden KH Pufferbehälter eingelegt wird.
  10. Schalten Sie das Herz in den Arbeitsmodus, indem Sie die große Klemme schließen, die zur Aortenkanüle führt, und den Fluss öffnen, der zum linken Vorhofohr führt. Öffnen Sie den Drei-Wege-Hahn, der vom Arbeitsperfusat führt. Übertragen Sie den üblichen Rückführschlauch (Rückführung des KH-Puffers in den Behälter) vom Langendorff-Behälter in den Arbeitsbehälter.
  11. Perfundieren Sie das Herz im Arbeitsmodus für 15 Minuten. Die Aortenflusswerte müssen idealerweise am Ende der 15-minütigen Perfusion >30 ml/min betragen. Sobald sich das Herz stabilisiert hat, beginnen Sie mit der Datenaufzeichnung in einer Datenanalysesoftware.
  12. Messen Sie den koronaren Abfluss (koronarer Fluss) nach 1 min, 5 min, 10 min und 15 min.
    HINWEIS: Die koronaren Flusswerte sollten zwischen 10-20 ml/min liegen. Ein koronarer Fluss von mehr als 22 ml/min weist im Allgemeinen auf ein Leck hin, das von einem nicht gebundenen Lungengefäß ausgeht. Die Herzfrequenz sollte zwischen 200 und 300 Schlägen pro Minute liegen. Koronarabwässer können für die nachgelagerte Analyse von Gewebeverletzungsmarkern (z. B. Troponin-I, Laktatdehydrogenase-Freisetzung) gesammelt werden.

6. Verabreichung von Kardioplegie zur kalten statischen Lagerung des Herzens

  1. Füllen Sie die Kardioplegiekammer (in einer Höhe von 60 cm positioniert, um einen Perfusionsdruck von ca. 40 mmHg zu erzielen) mit 50 ml einer speziellen kardialen Konservierungslösung (mit oder ohne Supplementierung).
  2. Senken Sie den Wassermantel ab und schließen Sie den Drei-Wege-Wasserhahn auf der Seite des Arbeitsmodus.
  3. Stoppen Sie den Fluss zur linken Vorhofkanüle, indem Sie die Klemme schließen.
  4. Öffnen Sie den Fluss zur Aortenkanüle.
  5. Schließen Sie die Klemme von der Langendoff-Seite und an der Nachlade.
  6. Öffnen Sie die Klemme von der Kardioplegieleitung und spülen Sie 15 ml Kardioplegie aus der Druckleitung heraus. Schließen Sie den Wasserhahn an der Druckleitung.
  7. Lassen Sie das Herz über die Aortenkanüle mit Kardioplegie spülen und sammeln Sie den Koronarabfluss. Führen Sie die Kardioplegie 3 Minuten lang durch und notieren Sie das Volumen der verabreichten Kardioplegie.
  8. Stoppen Sie die Datenaufzeichnung in der Software und speichern Sie die Datei.
  9. Nach 3 Minuten schließen Sie die Kardioplegieklemme und die kleine blaue Klemme, die zur Aortenkanüle führt.
  10. Platzieren Sie eine Bulldog-Klemme auf der Aortenkanüle und eine zweite Bulldoggenklemme auf der linken Kanüle. Trennen Sie den Herzkanülenblock vom Kreislauf und legen Sie ihn in ein Becherglas mit Kardioplegie in einer Eisbox (Abbildung 3B, C).
  11. Bewahren Sie das Herz 6 h (oder die gewünschte Kühlzeit) im Kühlschrank auf.

7. Herzreperfusion nach kalter statischer Lagerung

  1. Bereiten Sie den KH-Puffer gemäß Abschnitt 1 vor.
  2. Entlüften Sie den Perfusionskreislauf gemäß Abschnitt 2.
  3. Öffnen Sie die gespeicherte Datei aus der Basislinienperfusion.
  4. Nehmen Sie den Herzkanülenblock vorsichtig aus der Eisbox und befestigen Sie ihn am Perfusionskreislauf. Verwenden Sie vor dem Wiederanschließen der Aortenkanüle eine stumpfe 18-G-Spritze, die mit KH-Puffer gefüllt ist, um die Luft aus der Kanüle zu entfernen. Schließen Sie zuerst die Aortenkanüle an, öffnen Sie die Schlauchschelle auf der Langendorff-Seite und stellen Sie sicher, dass die Nachlader-Schlauchschelle geöffnet ist.
  5. Schließen Sie die linke Vorhofkanüle wieder an und stellen Sie sicher, dass die Luft aus der Kanüle entfernt wurde, bevor Sie sie an den Perfusionskreislauf anschließen. Halten Sie die Arbeitsseitenklemme geschlossen, bis es Zeit ist, vom Langendorff-Modus in den Arbeitsmodus zu wechseln.
  6. Perfundierte das Herz im Langendorff-Modus für 15 min. Stellen Sie sicher, dass die Datenaufzeichnung zu Beginn der Langendorff-Reperfusion beginnt.
  7. Legen Sie vor dem Umschalten in den Arbeitsmodus beide Blasensteine in den KH-Puffer, öffnen Sie den 3-Wege-Hahn auf der Arbeitsseite und führen Sie den gemeinsamen Rücklaufschlauch in den Arbeitsbehälter ein.
  8. Schließen Sie die weiße Langendorff-Klemme, öffnen Sie die weiße Arbeitsseitenklemme und perfundieren Sie das Herz für 30 min. Messen und sammeln Sie koronare Abwässer zu bestimmten Zeitpunkten für die nachgelagerte Analyse (z. B. Marker für Herzverletzungen). Stellen Sie sicher, dass die Softwareaufzeichnung gestoppt und neu gestartet wird, um ein neues Segment zu starten (oder alternativ einen Kommentar hinzuzufügen).
  9. Schließen Sie bei ca. 15 Minuten Reperfusion im Arbeitsmodus den Drei-Wege-Hahn.
  10. Am Ende der Reperfusion speichern Sie die Datendatei, stoppen Sie den Fluss durch den Kreislauf und trennen Sie den Herzblock. Entnahme von Proben des linken Ventrikels für die histologische Verarbeitung und/oder Schockfrost für zukünftige Studien (z. B. Proteinextraktion für Western-Blot-Studien).
  11. Entfernen Sie die Filter aus den Filterhaltern, entleeren Sie den Puffer aus dem Kreislauf und spülen Sie zweimal mit 5 l destilliertem Wasser.
    HINWEIS: Obwohl es nicht notwendig ist, hilft es, das destillierte Wasser in einem großen Behälter im Wasserbad vorzuwärmen.

8. Analyse der funktionellen Wiederherstellung

  1. Öffnen Sie die LabChart-Datei.
  2. Markieren Sie einen Aufnahmebereich von mindestens 30 s und klicken Sie dann auf Befehl > Datenauswahl hinzufügen ODER Mehrfaches Hinzufügen zu Daten. Dadurch werden die gewünschten Parameter zu einer DataPad-Datei in der Software hinzugefügt.
  3. Wählen Sie das Dropdown-Menü Fenster > DataPad aus.
  4. Markieren Sie die Wiederherstellungswerte, und kopieren Sie sie aus DataPad in eine Tabelle, um die Funktionswiederherstellung zu analysieren. Berechnen Sie die funktionelle Wiederherstellung als Prozentsatz des jeweiligen Ausgangswerts 1,6,7.

Ergebnisse

Die Ergebnisse der Basisperfusion werden bestimmen, ob das erste Experiment (vor der Lagerung) erfolgreich war. Der Aortenfluss, der im Langendorff-Modus angezeigt wird, sollte zwischen 14 und 22 mL/min liegen. Die Langendorff-Strömung wird aufgrund der retrograden Perfusion der Aorta als negativer Wert auf dem Durchflussmesser angezeigt. Ein Beispiel für eine akzeptable Langendorff-Kurve ist in Abbildung 4A dargestellt.

Nach dem Umschalten in den Arbeitsmodus sollte der Aortenfluss mindestens 30 ml/min betragen, sobald sich das Herz beruhigt hat. Es ist normal, dass der Fluss zunächst auf etwa 50 ml/min ansteigt, dann auf etwa 25 ml/min abnimmt, bevor er wieder auf einen stabilen Aortenfluss ansteigt. Sobald die Ausgangsparameter zufriedenstellend sind (AF > 30 ml/min, CF 10-20 mL/min, HR 200-300 bpm), kann das Herz gelagert werden. Ein Beispiel für eine gute Baseline-Ablaufverfolgung ist in Abbildung 4B dargestellt.

Abhängig von der getesteten Konservierungslösung liefern einige Herzen nach längerer kalter statischer Lagerung keine gute Erholung, obwohl sie eine hervorragende Ausgangsbasis aufweisen. Ein Beispiel für eine Ablaufverfolgung, die auf eine schlechte Wiederherstellung im Arbeitsmodus hinweist, ist in Abbildung 4C dargestellt.

Die endgültige funktionelle Wiederherstellung des Aortenflusses kann auf der Grundlage des endgültigen Messwerts des Aortenflusses als Prozentsatz des Ausgangswerts berechnet werden. Wenn beispielsweise der Ausgangswert des Vorhofflimmerns am Herzen 40 ml/min und der Vorhofflimmern am Ende der Reperfusion nach kalter statischer Lagerung 20 ml/min betrug, betrug die Wiederfindung des Vorhofflimmerns bei diesem Herzen 50 %. Ein Beispiel für diese Datendarstellung ist in Abbildung 5 dargestellt.

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Abbildung 1: Perfusionskreislauf des funktionierenden Herzens. (A) Foto des isolierten funktionierenden Herzperfusionskreislaufs der Ratte. Das rote Kästchen zeigt an, wo sich das isolierte Herz befindet. (B) Schematische Darstellung des isolierten funktionierenden Herzperfusionskreislaufs, der die Flussrichtung des KH-Puffers durch den Kreislauf für die Langendorff- (gestrichelte Linie) und die Arbeitsmodus-Perfusion (durchgezogene Linie) anzeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Einrichtung der LabChart-Software. (A) Einrichtung der Kanaleinstellungen für Aortendruck, Aortenfluss und Herzfrequenz. (B) Beispiel für eine LabChart-Vorlage, die mit drei Kanälen eingerichtet ist. Fenster auf der rechten Seite zeigen jeden einzelnen eingerichteten Kanal an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Kanülierung und Kardioplegie. (A) Kanülierung des Herzens vor dem Einsetzen in die Wassermantelkammer. Die linke Kanüle wird in die Aorta eingeführt, die rechte Kanüle wird über das linke Vorhofohr in die linke Herzkammer eingeführt. Die Lungengefäße wurden gebunden und das Lungengewebe präpariert. (B) Nach der Verabreichung der Kardioplegie wird das Herz in ein Becherglas gelegt, das die Kardioplegielösung enthält. Die Kanülen wurden mit Bulldog-Clips festgeklemmt, bevor sie vom Rig getrennt wurden. (C) Beispiel für Herzen, die für eine längere Kühllagerung in eine Eisbox gelegt werden. Hier wurden zwei Herzen für die Reperfusion gelagert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Beispiele für LabChart-Ablaufverfolgungen. Spuren für Druck (rote Grafik), Aortenfluss (blaue Grafik) und Herzfrequenz (grüne Grafik) für ein Herz mit (A) guter Langendorff-Spur, (B) guter Erholungsweg während der Reperfusion im Arbeitsmodus, (C) schlechter Erholung während der Reperfusion im Arbeitsmodus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Repräsentative Diagramme für die funktionelle Wiederherstellung. (A) Aortenfluss, (B) Koronarfluss, (C) Herzzeitvolumen und (D) Herzfrequenz. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Gao et al.8 wiederverwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Angesichts der Empfindlichkeit der Ausgangsfunktion des Herzens muss darauf geachtet werden, dass das Perfusionspräparat sauber und mit kompatiblen Komponenten ausgestattet bleibt. So muss zum Beispiel der richtige PVC-Schlauch verwendet werden. Einige Schlauchmaterialien, wie z. B. Silikon, können zu einer geringeren Aortenströmung und Kontraktilität beitragen, was auf den Sauerstoffverlust über die Schläuche zurückzuführen sein kann. Es gibt zwar isolierte funktionierende Rattenherzperfusionskreisläufe, die im Handel erhältlich sind, aber die meisten von ihnen werden hauptsächlich nur für die Langendorff-Perfusion verwendet. Im Allgemeinen können funktionelle Messungen in einem Langendoff-Perfusionsmodell durch das Einführen eines Ballonkatheters in den linken Ventrikel durchgeführt werden, um Messungen des linksventrikulären diastolischen Drucks (LVDP) zu erhalten. Die Messung des rohen Aortenflusses und des Herzzeitvolumens in einem Langendoff-Perfusionssystem ist jedoch nicht möglich. Ein Hauptvorteil des IWRH-Protokolls ist die Möglichkeit, Messungen des Aortenflusses und des Herzzeitvolumens durchzuführen, ohne dass zusätzliche Eingriffe am Herzen (z. B. Ballonkatheter) erforderlich sind. Es gibt kommerzielle Optionen für ein funktionierendes Rattenherzperfusionssystem, und obwohl diese an individuelle Studienanforderungen angepasst werden können, können diese Systeme kostspielig sein.

Es gibt kritische Schritte im Protokoll, um eine optimale Grundfunktion des Nagetierherzens während der Perfusion zu gewährleisten. Die Herstellung von KHB-Pufferstofflösungen sollte nicht älter als 4 Wochen sein. Der Perfusionskreislauf muss beim Ansaugen frei von Luftblasen sein. Bei der Kanülierung des linken Vorhofohrs ist Vorsicht geboten. Ein übermäßiger Umgang mit dem Gewebe kann das Risiko eines Risses erhöhen und auch zur funktionellen Reizbarkeit des Herzens beitragen.

Die Leistungsqualität des IWRH-Perfusionskreislaufs kann im Allgemeinen durch die Ausgangswerte in Herzen bestimmt werden (AF > 30 mL/min, CF ~20 mL/min). Weitere Qualitätskontrolltests in einem CSS-Modell können durchgeführt werden, indem das Herz in Celsior-Konservierungslösung, die mit 1 μmol/l Zonipurid plus 0,1 mg/ml Glyceryltrinitrat ergänzt wird, verhaftet und gelagert wird. Mit Celsior versetzte Herzen, die mit Glyceryltrinitrat plus Zoniporid versetzt wurden, garantieren eine sofortige Wiederherstellung der Langendorff-Reperfusion und eine endgültige funktionelle Wiederherstellung zwischen 40-60% nach 6 Stunden Kühllagerung. Wenn Sie Zweifel haben, ob das Bohrgerät eine gute Leistung erbringt, ist diese Ergänzung zur Qualitätskontrolle nützlich.

Die Methoden zur Verwendung von Nagetierherzen, die nach dem Kreislauftod durch Spende beschafft wurden, wurden bereits beschrieben10,11. Kurz gesagt, die Ratten werden betäubt, die Halsschlagader kanüliert und Druckwerte erhalten. Heparin (500 IE) wird über die Kanüle der Halsschlagader injiziert. Die Luftröhre wird ligiert, um den Entzug der lebenserhaltenden Maßnahmen einzuleiten. Sobald die erforderliche warme ischämische Zeit erreicht ist, kann das Herz herausgeschnitten und in den Perfusionskreislauf kanüliert werden. Für die Verabreichung der Konservierungslösung in das DCD-Herz werden 60 mL Konservierungslösung über die Druckleitung am Kreislauf durch die Aorta (~20 mL/min) gespült. Die Lungengefäße werden abgebunden, die Lunge präpariert, die linke Kanüle eingeführt und dann 40 ml Konservierungslösung über die Druckleitung gespült. Das Herz wird dann gemäß dem obigen Protokoll perfundiert. Die funktionelle Wiederherstellung wird als Rohwert der funktionellen Hämodynamik genommen, und die statistische Analyse wird durchgeführt, indem die Werte mit den Herzen verglichen werden, die scheinoperiert wurden (kein DCD, jedoch auf dem Rig gespült).

Die Verfahren zur Verwendung von Nagetierherzen, die nach dem Hirntod beschafft wurden, wurden bereits beschrieben12. Kurz gesagt, die Tiere werden anästhesiert, intubiert und beatmet, wobei die hämodynamische Überwachung gemäß dem DCD-Nagetierprotokoll erfolgt. Im temporoparietalen Schädel wird ein Bohrloch durchgeführt und ein 3F-Embolektomiekatheter subdual platziert. Scheinkontrollen haben Bohrlöcher, aber keine Kathetereinführung. Der Ballon wird über 2 min mit 0,3 mL Wasser aufgeblasen und 1 h lang aufgeblasen. Nach 1 h hämodynamischer Beobachtung werden die Herzen explantiert und in den isolierten funktionierenden Herzperfusionskreislauf gelegt, die Ausgangswerte werden aufgezeichnet, die Kardioplegie wird verabreicht und die Herzen werden wie oben beschrieben kalt gelagert.

Die Haupteinschränkung bei der Verwendung des IWRH-Perfusionskreislaufs besteht darin, dass kein blutbasierter Perfusionspuffer verwendet werden kann, um durch das System zu zirkulieren. Es wäre unmöglich, genügend Nagetierblut zu beschaffen, um es dem Perfusat hinzuzufügen; Daher ist eine blutbasierte Perfusion nicht möglich. Alternative Modelle, wie z. B. heterotope Herztransplantationen bei Nagetieren oder orthotope Herztransplantationsstudien an Großtieren, müssten wahrscheinlich durchgeführt werden, um die Auswirkungen der blutbasierten Perfusion zu testen. Diese alternativen Methoden erfordern jedoch Fachwissen in mikrochirurgischen Fähigkeiten und/oder großtierchirurgische Einrichtungen sowie erfahrene Anästhesisten, Perfusionisten und Herz-Thorax-Chirurgen.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Die hier beschriebenen Studien wurden durch Zuschüsse finanziert, die P.S. Macdonald vom National Health and Medical Research Council Australia, der St. Vincent's Clinic Foundation und dem NSW Health Cardiovascular Research Capacity Senior Investigator Grant gewährt wurden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,5 mL farbloses Eppendorff-Röhrchen, 1000 pro BoxBio Strategy Pty Ltd0030.125.150
15 mL Cent/Röhrchen (S) Hülse/25 PP ctn/500Sigma-aldrich Pty LtdCLS430791-500ea
BP Wandler/KabelsatzADInstrumentsMLT1199Datenerfassungsbrücke
VerstärkerADInstrumentsFE221Datenerfassung
Carbogen 555G2BOCBOC002
Checktemp1 ThermometerHanna InstrumentsHI98509Rig Construction
Clamp Pinch 1/4-7/16 PK 12Thomas Scientific2848Y40Rig Construction
Clamp mit Verlängerung Stem Med.Thomas Scientific8847T08Rig Construction
Klemme mit Verlängerung Vorbau Sm.Thomas Scientific8847T02Rig Construction
Clips, Gefäß, 60 g DruckCoherent Scientific14121Chirurgische Geräte
Geschlossener AnschlussThomas Scientific8847E25Rig Construction
Covidien Sofsilk 2-0 schwarz vorgestanzt 45 cm Schachtel mit 24medizinischen FachartikelnS195Chirurgische Verbrauchsmaterialien
Maßgeschneiderte 250 mL MantelentgaserCustom Blown Glassware Pty LtdN/ARig Construction
Custom Made 750 mL ReservoirCustom Blown Glassware Pty LtdN/ARig Construction
D-(+)-Glukose wasserfrei SigmaUltraSigma-aldrich Pty LtdG7528-1KgZur Herstellung Krebs Buffer
Dual Channel KonsoleADInstrumentsTS402Datenerfassung
Erlenmyer Kolben 2 L 
Filter Mikrofaser Typ GF/C Glasfaser 47 mm, 100Bio-strategy Pty Ltd1822047
Pinzette, 15 cm, 0,3 mm, CRVDCoherent Scientific14114Chirurgisches Gerät
Vier Zinkenklemmen mit 9 mm x 115 mm langem Arm zum Halten von Gegenständen mit einem Durchmesser von 2-70 mm. VinylbeschichteteMet-App Australia Pty Ltd1352Rig Construction
Heizung Zirkulator. Digitale Halbleitersteuerung. (1020 Watt/240 Volt)Thermoline ScientificTU3Rig Construction
Heparin 5000 U/5 mL Box 50 Pfizer 02112115Clffird Hallam Healthcare Pty Ltd1258693Drugs
Ilium Xylazil 20 Inj 50 mLCenvet Australia Pty LtdX5010Anaesthetic
Johns Hopkins Bulldog ClampCoherent Scientific CS-WPI-14117
Ketamin 100 mg/50 mLProvet (NSW) Pty LtdKETAI1Anästhesie-Magnesiumsulfat-Heptahydrat
AR 500 g ChemsupplyBio Strategy Pty LtdMA048-500gZur Herstellung von Krebs Buffer
Male/Female Hinged AdapterThomas Scientific8847V08Rig Construction
Masterflex L/S Easy-Load-Kopf für Präzisionsschläuche, PPS, CRS-RotorJohn Morris1015164Rig Construction
Metzenbaum Schere, 11,5 cm gebogenCoherent ScientificWPI-501748Chirurgische Geräte
Metzenbaum Schere, 14,5 cm geradeCoherent ScientificWPI-501252Chirurgische Geräte
Montageteile F/2-KÖPFE SSJohn Morris1014414Befestigungsschrauben für Pumpenköpfe
Offener AnschlussThomas Scientific8847E05Rig Construction
ParaformadehydeSigma-AldrichP6148-500GProbenverarbeitung
Kaliumchlorid (AnalaR NORMAPUR) 500 gVWR Chemikalien 26764.26zur Herstellung von Krebs Buffer
Kaliumphosphat einbasisch Sigma-Aldrich Pty LtdP5379-500gZur Herstellung von Krebs Buffer
Powerlab 2/26, 2-Kanal-Recorder + Labchart-SoftwareADInstrumentsML826Computer Hardware und Software
Precision XN Inline Flowsensor, 3,2 mm (1/8")ID ME4PXN-KR37 XFADInstrumentsME4PXNRig Construction
Scalpel mit Griff Einweg #11 pkt/10BSN Medical (Aust) Pty Ltd73252-36
Silikondichtung für Swinnex 47 mm 5/PKMerck MilliporeSX0004701Rig Construction
Silikon O-Ring 5-329 10/PKMerck MilliporeXX1104707Rig Construction
Single Buret ClampThomas Scientific8847T32Rig
Construction Slip-on Inlet Filter Porengröße 10 & micro; m (Bubbler)Sigma-aldrich59277Rig Construction
Sm. 360 Rotation ConnectorThomas Scientific8847E35Rig Construction
NatriumbicarbonatSigma-Aldrich Pty LtdS6297 - 250gZur Herstellung von Krebs Buffer
Swinnex Filterhalter, 47 mmMerck MilliporeSX0004700Rig Construction
Spritzen 1 mL Box/100Becton Dickinson Pty Ltd302100
Dreipolige Klemmen mit 9 mm Durchmesser x 125 mm langem Arm und Doppelschraube zum Halten von 5-80 mmMet-App Australia Pty Ltd1356Rig Construction
Tubing Flowmeter Module TS410ADInstrumentsTS410Datenerfassungsschlauch
PVC 6,35 mm ID x 9,52 mm OD 50ft Rolle 15,24 m, klar, DEHP phthalatfrei, lebensmittelecht entspricht REACThermo FisherNAL 8701-0600Bau von Bohranlagen
Schlauch PVC 7,94 mm ID x 11,1 mm OD 50ft Rolle 15,24 m, klar, DEHP phthalatfrei, lebensmittelecht entspricht REACThermo FisherNAL 8701-0900Rig Construction
Schlauch PVC 9,52 mm ID x 12,7 mm OD 100ft RolleThermo FisherNAL 8701-4120Rig Construction
Vannas Schere, 8,5 cm, gerade, 7 mm KlingenCoherent ScientificWPI-500-086Chirurgische Ausrüstung
Wasserbad 30 Liter mit hängender WanneThermoline ScientificTLWB-30Rig Aufbau

Referenzen

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