Hellgrammit als unkonventioneller Biomonitor für die Bewertung der Gesundheit von Oberflächengewässern und der Umwelt

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Biomarkern zur Früherkennung schädlicher Auswirkungen auf aquatische Ökosysteme. Die Biomarker sind eng mit den Merkmalen der Wächter verwandt, und ihre Veränderungen helfen bei der Erkennung von Frühwarnschäden.

Zusammenfassung

Die Larven der Dobsonfliegen der Gattung Corydalus, allgemein bekannt als Hellgrammiten, zeichnen sich durch ihre bemerkenswerte Größe, ihr umfangreiches Verbreitungsspektrum und ihre lange Unreife aus, die bis zu einem Jahr dauern kann. Hellgrammite sind eindeutig dafür bekannt, dass sie empfindlich auf Verschmutzung und Auswirkungen auf die Lebensraumstruktur reagieren. Angesichts dieser einzigartigen Eigenschaften eignet sich die Verwendung von Corydalus texanus-Larven sehr gut als zuverlässiges Biomonitoring, um die ökologische Integrität aquatischer Ökosysteme zu beurteilen. Dieses Protokoll zielt darauf ab, die notwendigen Werkzeuge für die Bewertung von C. texanus bereitzustellen und ihre Wirksamkeit anhand einer Fallstudie zu demonstrieren. Die Forschungsergebnisse haben praktische Auswirkungen und deuten darauf hin, dass C . texanus-Larven frühzeitig auf die Verschmutzung durch den Bergbau reagieren und große Mengen an Schwermetallen wie Zn, Fe und Al bioakkumulieren. Das Vorhandensein oder Fehlen von C. texanus-Populationen kann als hilfreicher Indikator für die Identifizierung potenzieller Probleme im Zusammenhang mit der Gesundheit des Ökosystems dienen. Der unkonventionelle Ansatz hat gezeigt, dass frühzeitig vor Umweltverschmutzung in den vom Bergbau betroffenen Standorten gewarnt wurde, was die Notwendigkeit rechtzeitiger Maßnahmen zum Schutz der Umwelt unterstreicht. Aufgrund ihrer einzigartigen Eigenschaften wird die Verwendung von C. texanus-Larven als zuverlässiger nicht-konventioneller Bioindikator dringend empfohlen.

Einleitung

Hellgramiten sind Insektenlarven aus der Ordnung Megaloptera (Latreille, 1802), die im Erwachsenenstadium Dobsonfliegen oder Fischfliegen genannt werden. Eine geringe, aber weit verbreitete Diversität kennzeichnet diese Gruppe der Top-Raubinsektenlarven aus aquatischen Ökosystemen¹. Hellgramit-Arten kommen in genau definierten biogeographischen Regionen vor; Daher ist es relativ einfach, Arten ohne hohe taxonomische Kenntnisse zu identifizieren. Bemerkenswert ist, dass die Larven der Corydalidae die prominenteste Art aus der Ordnung der Megaloptera (20-90 mm Körperlänge)² besitzen, wodurch Hellgramite mit bloßem Auge sichtbar wird.

Hellgrammiten spielen in aquatischen Ökosystemen eine entscheidende Rolle als Raubtiere, mit einer starken Präsenz aufgrund von großen Kaubonbons, die auf ihre beeindruckende räuberische Form hinweisen. Ein dorsoventral abgeflachter Körper verbindet sich ebenfalls mit 7-8 Paaren von Filamentkiemen entlang des Körpers, und eine Kopfkapsel mit sechs Stemmata pro Seite macht Hellgrammiten zu faszinierenden Organismen für Entomologen und Fans³. Erwachsene von Corydalidae überraschen und erzeugen aufgrund ihrer auffälligen Größe ein Eindrucksbild für Menschen; Sie sind jedoch völlig harmlos. Es ist bemerkenswert, dass Hellgrammite die Fähigkeit haben, in aquatischen Umgebungen in ihrem Larvenstadium über einen beträchtlichen Zeitraum zu überleben.

Die phänotypischen Merkmale der Hellgrammite bieten eine besondere Gelegenheit, ihre Rolle in aquatischen Ökosystemen hervorzuheben; Nichtsdestotrotz ist ihr Indikatorpotenzial das am meisten gesuchte Merkmal für Aquarienökologen. Das umfangreiche Wissen über ihr Bioindikatorpotenzial in aquatischen Ökosystemen wird hervorgehoben, da ihr Vorkommen mit guten Gesundheitsbedingungen in ihren Lebensräumen zusammenhängt, da sie gegenüber organischer Verschmutzung in Oberflächengewässern unverträglich sind 4,5,6,7,8.

Die meisten Corydalidae megalopteren leben in schnell fließenden Gewässern als Riffe und Substrate, die von Kopfsteinpflaster und Kieselsteinen dominiert werden, aber Hellgrammite kommen auch in Bächen mit niedrigem Gefälle mit Haken und Sandsubstraten sowie in lentischen Lebensräumen wie Seen^{vor 3,9,10}. Ihr breites Verbreitungsspektrum spiegelt die kritischen Eigenschaften eines Top-Raubtiers und seine Fähigkeit wider, mehrere Lebensräume zu besiedeln, die auf seine effektiven Lebensstrategien abzielen¹¹. Hellgramiten verknüpften ihre Eigenschaften mit der Dynamik aquatischer Ökosysteme; Daher sind Strategien wie die Anpassung an die Luftatmung durch Spiracles (zusätzlich zu ihren ventralen Büscheln der Trachealkiemen) für die Corydalidae-Strategien typisch¹⁰.

Hellgrammiten bewohnen bestimmte Ökosysteme und zeigen schnelle Reaktionen auf Abweichungen von etablierten Mustern, wodurch sie als Frühwarnsystem dienen⁷. Die Reaktionen dieser Wildtierorganismen können als wertvolles Instrument zur Abschätzung der Auswirkungen der Verschmutzung auf aquatische Ökosysteme eingesetzt werden, insbesondere im Fall von Nichtziel-Schadstoffgemischen. Einige schädliche Auswirkungen auf lebende Organismen wurden in Ökosystemen aufgrund der individuellen Toxizität von Chemikalien erkannt, aber die Wirkung von Schadstoffgemischen muss identifiziert werden. Die Frühwarnreaktionen von Hellgrammiten können es ermöglichen, schädliche Auswirkungen zu identifizieren, indem sie auf die Auswirkungen eines Schadstoffgemisches verweisen oder sogar, wenn einzelne Wirkungen von Schadstoffen eine NOEC-Konzentration ohne beobachtbare Wirkung (No Observable Effect Concentration) ^erkennen12.

Mehrere Modellorganismen wurden für experimentelle akute und chronische Tests verwendet; Sie werden jedoch unter kontrollierten Bedingungen kultiviert und gehalten¹³. Unter kontrollierten Bedingungen sind sie nicht in der Lage, die Nichtzielwirkungen mehrerer Schadstoffe, denen sie ausgesetzt sind, zu identifizieren. Außerdem wird NOEC häufig aufgrund der Komplexität des Schadstoffgemisches erkannt. Aus diesem Grund wurden in den letzten Jahrzehnten nicht modellhafte einheimische Arten mit Nicht-Zieleffekten für Screening-Systeme anerkannt, die für die Durchführung ökotoxikologischer Forschung unerlässlich sind¹⁴. Folglich scheinen Hellgrammiten in der Lage zu sein, die schädlichen Auswirkungen der Verschmutzung in aquatischen Ökosystemen zu bewerten. Merkmale wie unter anderem ihre Biologie, Genetik und Physiologie machen Nicht-Modellorganismen für die Folgenabschätzung in Ökosystemen geeignet¹⁴.

Dieses Protokoll zielt darauf ab, ein neuartiges Biomonitoring-Instrument unter Verwendung eines Nicht-Modellorganismus zu etablieren, der Frühwarnsignale als Reaktion auf Nichtziel-Schadstoffgemische erkennen kann. Um die besten Ergebnisse zu erzielen, wurden die Merkmale der Larven der Modellart C. texanus umfassend berücksichtigt und in die Analyse integriert¹⁵.

Protokoll

Abbildung 1: Schnelle Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Verwendung des unkonventionellen Biomonitors Corydalus texanus für den Einsatz in aquatischen Ökosystemen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

1. Feldforschung

1. Identifizierung von Untersuchungsstandorten, die sich flussaufwärts und flussabwärts der Verschmutzungsquelle befinden und an denen vermutete oder offensichtliche Auswirkungen erkannt werden (d. h. punktuelle oder diffuse Emissionen).
   ANMERKUNG: Das vorliegende Protokoll umfasste 15 Untersuchungsstandorte in vier Hauptflüssen: 1) Extoraz River (Standorte PB, EZ, RQ, BC); 2) Fluss Escanela-Jalpan (ES, EN, AH, JL, PI, PA); 3) Ayutla Fluss (AY); und 4) Río Santa María (SM, AT).
2. Suchen und lokalisieren Sie mindestens eine Referenzstelle (einen Ort mit geringen oder keinen Auswirkungen) und definieren Sie sie als Untersuchungsstandort.
   HINWEIS: Für die aktuellen Untersuchungszentren wurden BC, ES, SM, AY und AT als Referenzzentren berücksichtigt.
3. Erkennen Sie bestimmte Attribute von Lebensräumen, die die Wahrscheinlichkeit erhöhen, Individuen von C. texanus zu finden. Dazu gehören Kiessubstrat, felsige Lebensräume mit steileren Gradienten, Hochgeschwindigkeitsströmungen, sauerstoffreiche Gewässer, eine hohe Kronendichte sowie Lebensräume im Hoch- und Tiefland.
4. Ein 100 m langer Abschnitt des Baches ist einzuschließen, um geeignete Lebensräume für das Biomonitoring^{zu ermitteln 16}.
5. Steigen Sie in den Bach, um Proben zu sammeln.
6. Nehmen Sie Proben von mindestens sechs Individuen von C. texanus in Lebensräumen wie Riffeln, Kieselsteinen, klarem Wasser und Geröll mit einem Tretnetz mit einer Maschenweite von 500 μm.
7. Entfernen Sie Steine in Richtung des Wasserflusses und setzen Sie die Larven in das Netz um.
8. Fassen Sie das Trittnetz mit den beprobten Larven an und füllen Sie sie in dafür vorgesehene Flaschen zur vorübergehenden Unterbringung um. Gehen Sie vorsichtig mit dem Netz um und klappen Sie die Ränder nach innen, um einen Verlust der Larven zu vermeiden.
9. Die Kopfbreite der beprobten Larven wird mit einem Messschieber gemessen, um die Stadien IX bis XI (im Bereich von 6 mm bis 10 mm) zu identifizieren.
10. Reinigen Sie die Larven, indem Sie sie 30 Minuten lang in eine Flasche mit Bachwasser tauchen.
11. Die Proben werden in Plastikflaschen mit klarer Etikettierung abgefüllt und anschließend durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff (-75 °C) in einem Kryotank eingeschläfert.
12. Transportieren und lagern Sie die Proben sicher bei -45 °C im Ultratiefkühlschrank im Labor.
13. Entnehmen Sie mit einer Polyethylenflasche eine Strahlwasserprobe von 200 ml, fügen Sie 1 ml Salpetersäure hinzu und lagern Sie die Probe bei 4 °C für die anschließende Schwermetallquantifizierung im Labor.

2. Zerlegung der beprobten Larven und Gewebetrennung

1. Stellen Sie die Sezierschale aus Kunststoff auf Eis und warten Sie, bis sie 4 °C erreicht hat, und überprüfen Sie sie mit einem Thermometer.
2. Entnehmen Sie Proben aus dem Ultratiefkühlschrank und legen Sie sie auf das Seziertablett, um mit dem Präparieren zu beginnen.
3. Wählen Sie das Zielgewebe aus: Muskeln, Äste, Neuralrohr und Exoskelett.
4. Entferne den Kopf mit einem Keramikmesser und trenne die Taschentücher vorsichtig. Öffnen Sie den Körper in Längsrichtung und entfernen Sie die Kiemen auf jeder Seite.
5. Trennen Sie die Exoskelette mit einem kleineren Keramikmesser und reinigen Sie das überschüssige Gewebe. Legen Sie die Exoskelette in einen Ofen und trocknen Sie sie bei 80 °C für 48 h.
6. Lagern Sie nach Ablauf der Zeit trockene Exoskelette für die weitere Analyse.
7. Reinigen Sie das Weichgewebe unter kalten Bedingungen für die weitere Analyse durch Mikroassays.
8. Verwenden Sie ein kleines Keramikmesser, um Weichteile aus Fett zu extrahieren. Trennen und poolen Sie jedes Zielgewebe von Individuen aus demselben Probenahmepunkt.
9. Lagern Sie jeden Gewebetyp in einem 2-ml-Mikroröhrchen und halten Sie während des gesamten Prozesses kalte Bedingungen aufrecht.
10. Um jedes Zielgewebe vorzubereiten, wiegen Sie 100 mg des Gewebes und fügen Sie 1 ml PBS-Lösung mit einem pH-Wert von 7,4 hinzu. Verwenden Sie einen einhändigen Gewebereißer, um jedes Gewebe zu homogenisieren. Typischerweise benötigen Weichteile drei Zyklen von jeweils 10 s.
11. Zentrifugieren Sie die Probe bei 1.000 x g für 5 min bei 4 °C. Übertragen Sie den Überstand in ein 1-ml-Mikroröhrchen.
12. Führen Sie Biomarker-Mikroassays durch.

3. Quantifizierung von Schwermetallen

1. Wiegen Sie 250 mg getrocknete Exoskelette von mindestens sechs Proben des angegebenen Entwicklungsstadiums mit einer Analysenwaage.
2. Zermahle Exoskelette in einem Glasmörser, bis sie fein pulverisiert sind. Geben Sie 250 mL hochreine Salpetersäure in die Pulverreaktionsgefäße.
3. Um die Proben zu verdauen, werden sie für 30-45 Minuten in eine Aufschlussmikrowelle bei 180 °C gegeben.
   HINWEIS: Verwenden Sie den richtigen mikrowellengeeigneten Behälter für die Mikrowellenmarke, um die Proben sicher und effektiv zu erhitzen. Die Aufschlusszeit für Gewebeproben variiert je nach Mikrowellenmarke und dauert 30-45 Minuten. Einige Marken bieten standardisierte Methoden an.
4. Führen Sie eine Mikrowellenaufschlussmethode für Wasserproben nach der EPA3015A Methode durch, indem Sie 45 ml der Wasserprobe verwenden und 5 ml Salpetersäure hinzufügen.
5. Messung von Schwermetallen und Metalloiden in aufgeschlossenen Proben (Wasser und Gewebe) mittels optischer Emissionsspektroskopie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-OES), einschließlich Hg, Cu, Pb, Zn, Fe, Cr, Cd, Mn, Ba und As.
   HINWEIS: Verwenden Sie Argon der Güteklasse 5 und Standardlösungen jedes Metalls und Metalloids, um eine Kalibrierkurve zu erstellen.

4. Mikroassays zur Bewertung von oxidativem Stress und Biomarkern

1. Vorbereitung von Reagenzien
   1. Mischen Sie 6 g NaH₂PO₄ mit 1000 mL Reinstwasser, um einen 50 mM monobasischen Phosphatpuffer herzustellen. In einem Kolben bei 2-8 °C unbegrenzt lagern.
   2. Um 8,1 % SDS herzustellen, lösen Sie 450 mg Natriumdodecylsulfat (SDS) in 5 ml Reinstwasser. Bereiten Sie sich kurz vor Gebrauch vor.
   3. 2 ml Trichlorethansäure (TCA) in 8 ml Reinstwasser verdünnen (bei Bedarf frisches Reagenz vorbereiten).
   4. 100 mg Tetrabutylammonium (TBA) in 10 ml Reinstwasser auflösen (bei Bedarf frisches Reagenz vorbereiten).
   5. Um 50 mM PBS pH 7,8 herzustellen, lösen Sie 97 mg Na₂HPO₄ und 59 mg NaH₂PO₄ in 10 ml Reinstwasser. Stellen Sie dann den pH-Wert auf 7,8 ein, indem Sie NaOH zur Erhöhung oder HCl zur Senkung verwenden.
   6. Eine Lösung von 200 μg/ml Rinderkatalase herstellen, indem 8 mg davon in 40 μl Reinstwasser gelöst werden (bei Bedarf frisches Reagenz vorbereiten).
   7. Um eine 50 mM TRIS/5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Lösung herzustellen, fügen Sie 6,05 g Tris (Hydroxymethyl)aminomethan (TRIS) und 0,073 g EDTA zu 45 ml Reinstwasser hinzu. Stellen Sie den pH-Wert mit HCl auf 7,6 ein und lagern Sie ihn bis zur Verwendung bei 4 °C.
   8. Für 0,1 M reduziertes Glutathion (GSH) (für 45 duplizierte Proben) werden 0,0184 g GSH gewogen und in 600 μl 10 mM HCl gelöst.
   9. Zur Herstellung von 10 mM HCl fügen Sie 0,5 μl konzentriertes HCl zu 599,5 μl Reinstwasser hinzu.
   10. Fügen Sie 28,5 μl Glutathionreduktase zu 1,4 mL 0,1 M TRIS/HCl 0,5 mM EDTA pH 8,0 hinzu.
   11. Mischen Sie 1,211 g TRIS und 0,0146 g EDTA mit 90 mL Reinstwasser, um eine 0,1 M TRIS/HCl und 0,5 mM EDTA-Lösung bei einem pH-Wert von 8,0 herzustellen. Fügen Sie HCl hinzu, um den pH-Wert bei Bedarf anzupassen. Die Lösung kann unbegrenzt bei 2-8 °C gelagert werden.
   12. Wiegen Sie 0,075 g NADPH und fügen Sie es zu 2,25 mL 1 % NaHCO₃ 1 mM EDTA hinzu.
   13. Mischen Sie 1 g NaHCO₃ und 0,0282 g EDTA in 100 mL Reinstwasser, um eine 1%ige NaHCO3- und 1 mM EDTA-Lösung herzustellen. Lagern Sie die Lösung auf unbestimmte Zeit bei 4-8 °C.
   14. Mischen Sie 2 μl t-Butylhydroperoxid mit 2 mL Reinstwasser, um eine 7 mM Lösung herzustellen. Unmittelbar vor Gebrauch mischen.
   15. Mischen Sie 1 g Rinderserumalbumin (BSA) mit 1 ml Reinstwasser, um eine Stammlösung von 1 μg/μl herzustellen.
2. Thiobarbitursäure-reaktive Substanzen (TBARS) (Lipidperoxidation, LPO)¹⁷
   1. Geben Sie 5 μl Gewebeüberstand in ein 1 ml-Mikroröhrchen. 45 μl 50 mM PBS (frische und Stammlösung) zugeben.
   2. Fügen Sie 12,5 μl 8,1 % SDS (frisch zubereitet) hinzu. 93,5 μl 20 % TCA pH 3,5 (frisch zubereitet) hinzufügen.
   3. 93,5 μl 1 % TBA (frisch zubereitet) zugeben. Vervollständigen Sie das Volumen durch Zugabe von 50,5 μl Reinstwasser. Schließen Sie den Deckel der Tube und wirbeln Sie sie 30 s lang ein.
   4. Den Deckel des Mikroröhrchens mit einer Nadel durchstechen und 10 Minuten in kochendem Wasser inkubieren.
   5. Kühlen Sie das Röhrchen bei Raumtemperatur (RT) ab und zentrifugieren Sie es dann bei 1000 x g für 10 min.
   6. Geben Sie 150 μl Überstand in eine Vertiefung in einer 96-Well-Mikroplatte und messen Sie die Absorption bei 530 nm mit einem Mikroplatten-Spektralphotometer.
   7. Zur Quantifizierung von Lipidperoxiden erstellen Sie eine 8-Punkt-TBARS-Kalibrierkurve (0-160 μM) unter Verwendung von Malondialdehyd bis (Dimethylacetal), wie in Tabelle 1 beschrieben. Passen Sie die Malondialdehyd (MDA)-Kurve je nach Gewebetyp oder vermutetem Schadensgrad an.
   8. Geben Sie die Ergebnisse als nmol MDA eq·mg⁻¹ Protein an.
3. Superoxiddismutase Antioxidans-Enzym-Mikroassay (SOD)¹⁸
   1. Verwenden Sie eine 96-Well-Platte. 147 μl 1 M TRIS/5 mM HCl EDTA pH 8 in zwei Vertiefungen als Blindproben geben. 144 μl 1 M TRIS/5 mM HCl EDTA pH 8 durch Duplizieren in andere Vertiefungen geben.
   2. Entnehmen Sie 3 μl aus dem Überstand und geben Sie es in die Probenvertiefungen. Mischen Sie den Inhalt auf dem Teller mehrmals vorsichtig an.
   3. Geben Sie innerhalb von 30 s 3 μl 10 mM Pyrogallsäure in jede Vertiefung. Sofort vorsichtig mischen.
   4. Die Extinktion wird bei T0 (Zeit = 0 s) und T10 (Zeit = 10 s), bei 420 nm und 25 °C gemessen.
   5. Bestimmen Sie die SOD, indem Sie den Prozentsatz der Pyrogallol-Hemmung in der Probe unter Verwendung der folgenden Gleichung berechnen:
      
      Wo
      x% = prozentualer Anteil der Oxidation von Pyrogallol durch SOD in der Probe; Daher beträgt die Oxidation von Pyrogallol 100 - x%
      HINWEIS: Die Berechnung der SOD-Aktivität unter Berücksichtigung von 1 IE ist das Volumen, das 50 % der Pyrogalloloxidation hemmt, wie unten beschrieben:
      
      Wo
      y = Probenvolumen auf Milliliter (hemmt 50% der PyroGallone)
      50% = Prozentsatz der Hemmung von Pyrogallol entspricht 1 HE SOD
      0,003 = Volumen in Milliliter der Probe
      100 - x% = Hemmung von Pyrogallol in Prozent durch die Probe
   6. Bestimmen Sie abschließend die SOD-Aktivität mit der Gleichung:
      
      SOD = Aktivität von SOD in internationalen Einheiten pro Mikrogramm Protein
      Y = Probenvolumen, das 50 % des Pyrogallols hemmt
      100 = Umrechnungsfaktor von Deziliter zu Milliliter.
      Protein = die Proteinkonzentration, die sich aus der Bradford-Quantifizierung ergibt, wird in Mikrogramm pro Milliliter ausgedrückt; Es ist notwendig, durch 10 zu dividieren, um in Gramm pro Deziliter umzurechnen
4. Katalase-Antioxidans-Enzym-Mikroassay (CAT)^19,20
   1. Verwenden Sie eine 96-Well-Mikrotiterplatte. 20 μl Probenüberstand in die Vertiefungen geben (durch Duplikat).
   2. Geben Sie standardmäßig 20 μl frische Katalase (200 μg/ml) in die Vertiefungen (durch Duplikat). Geben Sie 100 μl 50 mM PBS pH 7,8 in die Probe und verschließen Sie die Vertiefungen.
   3. Geben Sie 100 μl 90 mM (30%) H₂O₂ in die Vertiefungen, um die Reaktion zu starten. Nach Zugabe von H₂O₂ die Absorption alle 15 s für 2,5 min bei 240 nm ablesen.
   4. Berechnen Sie die Aktivität anhand der Gleichung:
      
      
      
      
      
5. Glutathionperoxidase-Enzym-Mikroassay (GPx)²¹
   1. Verwenden Sie eine 96-Well-Mikrotiterplatte.
   2. Mischen Sie 240 μl 0,1 M GSH-Lösung, 1 200 μl 10 μl GSH-Rd-Lösung und 1 200 μl 4 mM NADPH. Bewahren Sie die Lösung auf Eis auf.
   3. 100 μl 50 mM TRIS/HCl 5 mM EDTA pH 7,6 in die Vertiefungen geben. 1 μl der überstehenden Probe in zweifacher Ausführung zugeben. Klopfen Sie auf die Mikroplatte und mischen Sie vorsichtig.
   4. 50 μl der Mischlösung (Schritt 4.5.2) zugeben und vorsichtig mischen.
   5. Geben Sie 20 μl der 7 mM t-Butylhydroperoxidlösung in die Vertiefungen, um die Reaktion zu starten (es dauert etwa 15 s, um die Reaktion in 16 duplizierten Proben zu starten). Mischen Sie die Mikroplatte schnell.
   6. Überwachen Sie die Absorption in einem Intervall von 1 Minute für 5 Minuten bei 25 °C bei 340 nm.
   7. Berechnen Sie die GPx-Aktivität mit der Gleichung:
      
      Wo
      GPx = Aktivität in Millimolar pro Minute pro Mikrogramm Protein
      ΔAbs_340/min= Mittlere Extinktion in Delta
      10³ = Umwandlung von molaren in millimolare
6. mg prot = Proteinkonzentration aus der Bradford-Bestimmung, ausgedrückt in Mikrogramm pro Mikroliter
   1. Proteinquantifizierung durch Bradford-Analyse²²
   2. Es wird eine Standardkurve aus Rinderserumalbuminlösungen (BSA) durchgeführt, die aus Stammlösung von 1 μg/μl eingestellt wird, wie in Tabelle 2 dargestellt.
   3. Verwenden Sie eine 96-Well-Mikrotiterplatte. Geben Sie 190 μl Bradford-Reagenz in die Probe und die Standard-Wells.
   4. Fügen Sie 10 μl BSA in Standard-Wells durch Duplizieren hinzu. 10 μl Überstand durch Duplizieren in die Probenvertiefungen geben.
   5. Vorsichtig mit der Pipettenspitze mischen.
   6. Extinktion bei 595 nm ablesen. Quantifizieren Sie die Proteinkonzentration mit der Standardkurve.

Ergebnisse

Die Ergebnisse der Studie zeigen, dass Schwermetalle, insbesondere Aluminium (Al), Eisen (Fe) und Zink (Zn), schädliche Auswirkungen auf die Umwelt haben, wie Abbildung 2 zeigt. Der Nachweis hoher Schwermetallgehalte sowohl in Gewebe- als auch in Wasserproben, die an allen Stellen entnommen wurden, hat zu einem ungünstigen Ergebnis geführt. Es wurden Ausreißer mit einem Bioakkumulationsfaktor (BAF) von 600 festgestellt, insbesondere in bergbauintensiven Gebieten wie dem Extoraz-Fluss (Standorte PB, EP, RQ und BC in Abbildung 3 dargestellt). Bemerkenswert ist, dass es an einigen Studienstandorten, an denen die Zinkkonzentrationen im Wasser ungewöhnlich hoch waren (PB), nicht möglich war, Exemplare von C. texanus zu finden. Dies deutet darauf hin, dass die Bioakkumulationsschwelle wahrscheinlich überschritten wurde.

Abbildung 2: Boxplot des Bioakkumulationsfaktors (BAF) bei Corydalus texanus-Individuen , die an 15 Studienstandorten beprobt wurden. Der Bioakkumulationsfaktor (BAF) wurde für Al-, Fe- und Zn-Metalle anhand der Analyse von Wasserproben und Exoskeletten von C. texanus-Individuen berechnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Da es sich bei SGBR um ein Naturschutzgebiet handelt, muss unbedingt sichergestellt werden, dass keine Umweltveränderungen auftreten, die sich auf den Wächterorganismus auswirken könnten. Es wurden jedoch Gradienten in den Reaktionen von Biomarkern für oxidativen Stress beobachtet (Abbildung 3). Der Bewertung zufolge waren die Stellen mit den geringsten Zellmembranschäden, wie sie durch LPO-Spiegel belegt werden, EN, SM und CN. Dieselben Stellen wiesen eine geringe SOD-Aktivität auf, die als primäres Enzym bei der körpereigenen Abwehr gegen oxidativen Stress dient. Dies deutet darauf hin, dass an diesen Stellen nur minimaler oxidativer Stress auftritt und daher Eingriffe in Betracht gezogen werden könnten, die die Wächterorganismen nicht betreffen. Im Gegensatz dazu wurde beobachtet, dass die Aktivität von GPx an verschiedenen Stellen, nämlich EP, RQ, BC und ES, signifikant geringer war, wo hohe LPO-Werte aufgezeichnet wurden. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass der Organismus auf die Stressbedingungen reagiert, die hauptsächlich durch den Bergbau verursacht werden. Bei der Auswertung der Frühwarnmarker in diesem speziellen Organismus wurde festgestellt, dass bestimmte Stellen geringe und hohe Auswirkungen haben. Diese Ergebnisse zeigen eindrucksvoll, wie nützlich es ist, diese Spezies als unkonventionellen Wächter zu nutzen.

Abbildung 3: Boxplot der untersuchten Biomarker-Reaktionen in Proben von Corydalus texanus an 15 Probenahmestellen in drei Hauptflüssen, die während der Trocken- und Regenzeit in ein Becken in Mexiko (Sierra Gorda Biosphärenreservat) münden. Die Reaktionen wurden anhand von drei Biomarkern gemessen: (A) das Lipidperoxidationsniveau (LPO), das die frühe Schädigung der Zellen widerspiegelt, (B) die antioxidative Reaktion der Superoxiddismutase (SOD) der zellulären Abwehr der ersten Linie und (C) die antioxidative Reaktion der zellulären Abwehr durch Glutathionperoxidase (GPx). Rote Pfeile zeigen das Fehlen von Biomonitor-Individuen oder eine sehr begrenzte Anzahl von Proben an, die nur einmal aufgetreten sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Rohr	200 μM MDA bis (μL)	Reinstwasser (μL)	MDA-bis-Konzentration (μM)
1	0	1000	0
2	12.5	987.5	2.5
3	25	975	5
4	50	950	10
5	100	900	20
6	200	800	40
7	400	600	80
8	800	200	160

Tabelle 1: MDA-Konzentration, die zur Erstellung der MDA-Konzentrationskurve erforderlich ist.

Konzentration (μg/μL)	Stammlösung (μL)	Reinstwasser (μL)
0	0	50
0.1	5	45
0.2	10	40
0.4	20	30
0.8	40	10
1	50	0

Tabelle 2: BSA-Konzentration für die Proteinquantifizierungskurve.

Diskussion

Obwohl die Verwendung von C. texanus für die Bewertung optimal ist, ist es notwendig, mehrere Aspekte seiner Verwendung und Sammlung zu berücksichtigen. Die ausgewählten Untersuchungsstandorte erweisen sich aufgrund mehrerer Faktoren wie ungünstigen Wetterbedingungen, geografischer Unzugänglichkeit, hoher Trockenheit oder unzureichender Sicherheitsprotokolle in ausgewählten Regionen als schwierig. Angegebene Einschränkungen und Einschränkungen können bei der Durchführung von Feldforschung oft eine Herausforderung darstellen. Bei der Bewertung bestimmter Regionen, insbesondere in tropischen Bächen, kann die Entnahme von Proben eine Herausforderung darstellen. Obwohl die Richtlinien von Barbour²³ zu diesem Zweck eingehalten wurden, kann es in einigen Ökosystemen aufgrund ihrer besonderen Merkmale Hindernisse bei der Anpassung von Protokollen geben. Wie bereits erwähnt, stellt die Probenentnahme in tropischen lotischen Umgebungen aufgrund regionaler und lokaler Faktoren eine Vielzahl von Herausforderungen dar. Zu diesen Faktoren gehören die hohe Heterogenität der Umwelt, Substrate mit hoher Variation, Einzugsgebiet, Breite, Tiefe, Strömung, Ufervegetation und das breite Spektrum physikalisch-chemischer Bedingungen²⁴. Folglich kann es sich als schwierig erweisen, eine einheitliche Größe für Proben zu erhalten, da sie auf natürliche Weise von einem bestimmten Faktorbereich beeinflusst werden, insbesondere als Reaktion auf saisonale Veränderungen. Folglich kann die Standardisierung ihrer Größe ein komplexes Unterfangen sein. Nach erfolgreichem Abschluss der Feldarbeit werden die nachfolgenden Laborverfahren erleichtert, die weitere Analysen ermöglichen.

Die Durchführung einer Frühwarnbewertung bei C. texanus hat gezeigt, dass sie bei der Spiegelung von Auswirkungen auf aquatische Ökosysteme geeignet ist. In diesem Zusammenhang hat sich die Identifizierung aquatischer Makroinvertebraten als zuverlässiger Indikator für den Einfluss des Menschen als praktischer Ansatz erwiesen^25,26. Die aktuelle Forschung hat gezeigt, dass C. texanus ein hocheffektives, nicht-traditionelles Modell zur schnellen Bewertung von Umweltbedingungen darstellt. Im Falle der aktuellen Studie zeigte sich, dass C. texanus unterschiedliche Reaktionen auf die durch den Bergbau verursachte Schwermetallbelastung zeigte. Zusätzliche Effekte von Habitatveränderungen ermöglichen die Erkennung einer hohen Sensitivitätsklasse bei C. texanus. Während es in dem Gebiet Hinweise auf Bergbauaktivitäten gab, erkannten traditionelle Verschmutzungsindikatoren, wie der in Rico-Sanchez et ^al.27 berechnete Diversitätsindex, die Auswirkungen der Schwermetallbelastung in Kernzonen oder Naturschutzgebieten nicht an. Veränderungen wurden jedoch in Gebieten wie BC oder SM beobachtet, die sich in Kernzonen befinden. Obwohl Naturschutzgebiete für den Naturschutz wirksam sind, deuten die Befunde zu C. texanus darauf hin, dass Frühwarnsignale für Schäden bereits unbemerkt auftreten. Die Einbeziehung nicht-konventioneller und einheimischer Fauna muss in die Erforschung von Protokollen und künftigen Vorschriften in ihren jeweiligen Ländern einbezogen werden, insbesondere in tropischen Regionen, in denen sich die Flussökosysteme erheblich von denen in gemäßigten Gebieten unterscheiden²⁸. Die Verwendung eines unkonventionellen Biomonitors wie C. texanus kann dazu beitragen, die Genauigkeit und Relevanz von Forschungsergebnissen zu verbessern und die Schutzbemühungen für diese wichtigen Arten und ihren Lebensraum zu verbessern.

Die Verwendung von Corydalus sp. zeigte auch eine hohe Sensitivität gegenüber verschiedenen Einflüssen menschlicher Aktivitäten (d. ^h. landwirtschaftliche Einflüsse wie Landnutzungsänderungen und der Einsatz von Agrochemikalien), wie im Filobobos-Fluss (einem Ort im Becken des Golfs von Mexiko) beobachtet wurde. Die fragliche Studie unterstreicht die signifikante Rolle von Kalzium bei der Induktion von Stress für Corydalus sp. aufgrund des erhöhten Anstiegs der LPO-Gehalte unter ungewöhnlich gehärtetem Wasser im Filobobos-Fluss. Diese Ergebnisse und die vorliegenden Ergebnisse belegen die Nützlichkeit der Gattung Corydalus bei der Beurteilung aquatischer Ökosysteme in intertropischen Breitengraden. Bevor jedoch ein bestimmtes aquatisches Ökosystem bewertet werden kann, ist es notwendig, Vorkenntnisse über das Untersuchungsgebiet zu haben. Durch eine gründliche Analyse müssen die optimalen Forschungsstandorte ermittelt werden, um möglichst umfangreiche und vollständige Daten zu sammeln.

Die Wirksamkeit der Laborarbeit hängt stark vom Einsatz geeigneter Entnahmetechniken ab. Die Entnahme größerer Proben kann sich bei der Durchführung von Dissektionen als vorteilhaft erweisen, da mehr Weichgewebe und Exoskelett für die Analyse zur Verfügung stehen. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass saisonale Schwankungen die Akkumulation von Fettgewebe beeinflussen können, was es schwierig macht, die Weichteile und Exoskelette während temporärer Studien zu trennen. In solchen Fällen kann es ratsam sein, sich auf die Kiemen und die verfügbaren Muskeln jedes Einzelnen zu konzentrieren. Eine signifikante Anzahl von Personen zu gewinnen, kann eine kritische Herausforderung darstellen. Aufgrund der zuvor genannten Schwankungen könnte es schwieriger sein, genügend Gewebe zur Beurteilung des Schwermetallgehalts und der Reaktion der Biomarker zu erhalten. Die vorliegende Studie zeigte ein Beispiel für diesen Fall, da es nicht möglich war, Katalase in Proben aus dem SGBR zu bestimmen. Vor dem vorliegenden Protokoll erforderte die Beurteilung der Katalase eine hohe Menge an Gewebe; Nichtsdestotrotz bietet der aktuelle Vorschlag zur Katalasebestimmung eine Mindestgewebemenge für deren Beurteilung.

Der aktuelle Protokollvorschlag bietet eine geeignete Chance, eine praktikable Annäherung an die ökologische Integrität anhand von Gewöhnlichen Hellgrammiten in aquatischen Ökosystemen vorzunehmen. Es liefert wichtige Informationen für die Identifizierung von punktueller Verschmutzung oder indirekten schädlichen Auswirkungen menschlicher Einflüsse und ermöglicht Interessengruppen, Ökologen und Wasserwissenschaftlern geeignete Informationen. Obwohl die Kosten des aktuellen Protokolls erheblich gesenkt wurden, sind sie aufgrund der Notwendigkeit mehrerer Reagenzien und der Verwendung spezieller Geräte immer noch relativ teuer. Darüber hinaus begrenzt der Bedarf an Spezialgeräten die Anzahl der Standorte, an denen der gesamte Assay durchgeführt werden kann.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Analysenwaage von 220 g	Ohaus	PR224/E	Diese Waage ist nützlich zum Wiegen des extrahierten Gewebes aus Proben.
Wathosen	LaCrosse	700152M	Wir empfehlen die Verwendung von Wathosen für die Probenentnahme. Alternativ kannst du zum Sampling auch Stiefel mit Gummi-Hüftstiefeln verwenden.
Schneidebrett	True	TRUE915121	Es wird empfohlen, weiße Bretter und Kunststoffbretter zu verwenden.
Pinzette	DR Instruments	112	Es wird empfohlen, eine 12-Zylinder-Pinzette aus Edelstahl zu verwenden.
Induktiv gekoppeltes plasmaoptisches Emissionsspektroskopie-System	Perkin Elmer	7300 DV	Ein Gerät zur Quantifizierung von Schwermetallen mittels Spektroskopie.
Trittnetz	LaMotte	0021-P	Eine alternative Methode zur Herstellung eines Trittnetzes besteht darin, ein Netz mit einer Dicke von 500 Mikrometern manuell herzustellen.
Flüssiger Stickstoff	NA	NA	NA
Flüssigstickstoff Dewar Statischer Kryobehälter	BestEquip	DF0504	Es wird empfohlen, einen Aluminiumtank mit Kanistern zu verwenden.
Mörser- und Stößelset	Cole-Parmer	EW-63100-54	Dies ist ein Porzellanmörser und Stößel, der zum Schleifen von trockenem Gewebe verwendet wird.
Multiwave GO Plus		C93IP001EN-E	Multiwave von Anton Paar ist ein nützliches Werkzeug für den Aufschluss mehrerer Proben.
Ofen zum Trocknen	Fisher scientific	506G	Ein Inkubatorofen, auch bekannt als Trockengewebeofen, ist für die Trocknung von Geweben bei Temperaturen von mindestens 80 °C unerlässlich.
Präzisionsskalpell	Xcelite von Weller	037103-48768	Es wird empfohlen, ein Skalpell aus Aluminium zu verwenden.
Tissue-Homogenisator (Tearer)	Kopro	K110000	Es wird empfohlen, einen Tissue-Tearer mit Basis zu verwenden. Einige Unternehmen bieten Ultraschall-Tearer an, die möglicherweise die optimale Wahl sind.
Ultratiefkühltruhe	REVCO	CA89200-384	Viele Unternehmen bieten Gefrierschränke an, aber es wird empfohlen, einen mit einer Lagertemperatur von mindestens -40 °C zu wählen.
Weithals-Plastikflaschen	United Scientific	81900	Die Verwendung von Polypropylenflaschen mit breiten Verschlüssen und Mündungen wird dringend empfohlen.