Dieser Artikel beschreibt die Identifizierung pyroptotischer Zellen mittels Durchflusszytometrie nach dualer Färbung mit Antikörpern gegen das N-terminale Fragment von Hühner-GSDME (chGSDME-NT) und Propidiumiodid (PI).
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Methodenartikel
Untersuchung der Pyroptose mittels Durchflusszytometrie
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Pyroptose ist eine entzündliche Form des programmierten Zelltods, die hauptsächlich durch die Bildung von Plasmamembranporen durch den N-Terminus angetrieben wird, die aus den gespaltenen Proteinen der Gasdermin-Familie (GSDM) erzeugt werden. Die Untersuchung von membrangebundenem GSDM-NT mittels Western Blot ist die am häufigsten verwendete Methode zur Beurteilung der Pyroptose. Allerdings ist es mit dieser Methode schwierig, Zellen mit Pyroptose von anderen Formen des Zelltods zu unterscheiden. In dieser Studie wurden mit dem Infectious Bursal Disease Virus (IBDV) infizierte DF-1-Zellen als Modell verwendet, um den Anteil der Zellen, die einer Pyroptose unterzogen werden, mittels Durchflusszytometrie zu quantifizieren, wobei spezifische Antikörper gegen das N-terminale Fragment der Hühner-GSDME (chGSDME-NT) und Propidiumiodid (PI)-Färbung verwendet wurden. Die chGSDME-NT-positiven Zellen waren mittels Durchflusszytometrie mit Alexa Fluor 647-markierten Anti-chGSDME-NT-Antikörpern leicht nachweisbar. Darüber hinaus war der Anteil der doppelt positiven chGSDME-NT/PI-Zellen in IBDV-infizierten Zellen (rund 33 %) signifikant höher als in scheininfizierten Kontrollen (P < 0,001). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Untersuchung von membrangebundenem chGSDME-NT mittels Durchflusszytometrie ein wirksamer Ansatz zur Bestimmung pyroptotischer Zellen bei Zellen im Zelltod ist.
Einleitung
Die Pyroptose ist eine entzündliche Form des programmierten Zelltods, die bei Säugetieren hauptsächlich von der Bildung von Plasmamembranporen durch Gasdermin (GSDM) D abhängt 1,2,3. Aufgrund des genetischen Mangels an GSDMD bei Hühnern 4,5 bleibt der Mechanismus der Pyroptose bei Hühnern schwer fassbar. Die Gasdermin-Familie umfasst konservierte Proteine, darunter GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDMME und DFNB59 3,6. Studien haben gezeigt, dass GSDME aus Teleostfischen und Enten durch Caspase-1/3/7 oder Caspase-3/7 gespalten wird, um den pyroptotischen Zelltod zu induzieren 7,8. Die Rolle der GSDME-vermittelten Pyroptose bei der Wirtsreaktion auf pathogene Infektionen bei Hühnern muss jedoch noch geklärt werden.
Die Infektiöse Schleimbeutelkrankheit (CED) ist eine akute, hochansteckende und immunsuppressive Geflügelkrankheit, die durch IBDV9 verursacht wird. IBDV, ein unbehülltes bi-segmentiertes doppelsträngiges (ds) RNA-Virus, gehört zur Gattung Avibirnavirus in der Familie der Birnaviridae10. Frühere Studien anderer und unseres Labors haben gezeigt, dass eine IBDV-Infektion den Zelltod in Wirtszellen über verschiedene Wege induziert 11,12,13,14. Frühere Ergebnisse haben gezeigt, dass eine IBDV-Infektion die Freisetzung von Laktatdehydrogenase (LDH) auslöst, einem Indikator für den lytischen Zelltod 6,15, was darauf hindeutet, dass eine IBDV-Infektion den lytischen Zelltod in Wirtszellen induziert. Darüber hinaus zeigen die Daten, dass IBDV-infizierte Zellen morphologische Merkmale des pyroptotischen Zelltods aufweisen, einschließlich einer Zellschwellung mit großen Blasen, die aus der Plasmamembran wehen, und einer positiven Propidiumiodid (PI)-Färbung, was darauf hindeutet, dass eine IBDV-Infektion Pyroptose in Zellen induziert.
In Anbetracht der Tatsache, dass die Bildung von Membranporen in pyroptotischen Zellen durch das N-terminale Fragment von gespaltenem GSDM (GSDM-NT) ein Kennzeichen der Pyroptose ist, könnten pyroptotische Zellen theoretisch durch Durchflusszytometrie nachgewiesen werden, indem GSDM-NT auf der Zellmembran mit spezifischen Antikörpern untersucht wird. In pyroptotischen Zellen von Vögeln bildet das N-terminale Fragment von Hühnergasdermin E (chGSDME-NT) Membranporen, die es Propidiumiodid (PI) ermöglichen, die DNA zu durchdringen und zu binden. So kann der Anteil pyroptotischer Zellen mittels Durchflusszytometrie nachgewiesen werden, wodurch die Pyroptose von anderen Formen des Zelltods, wie Apoptose und Nekrose, unterschieden wird. Über die Methode zur Untersuchung pyroptotischer Zellen mittels Durchflusszytometrie wurde jedoch nicht berichtet. In dieser Studie wurden DF-1-Zellen mit IBDV infiziert, und es wurde eine Durchflusszytometrie durchgeführt, um pyroptotische Zellen mit monoklonalen Antikörpern (McAb) gegen das chGSDME-NT-Fragment (membrangebunden) und PI-Färbung zu untersuchen. Überraschenderweise konnten pyroptotische Zellen mit Hilfe der Durchflusszytometrie effektiv nachgewiesen werden. Darüber hinaus konnte der Anteil pyroptotischer Zellen quantifiziert werden. Diese Erkenntnisse stellen ein leistungsfähiges und effektives Mittel zur Bestimmung der Pyroptose dar.
In diesem Artikel wird eine Methode zur Untersuchung der Pyroptose in IBDV-infizierten Zellen mittels Durchflusszytometrie mittels anti-chGGME-NT, MCAB- und PI-Färbung beschrieben. Diese Methode kann auch auf andere erregerinfizierte Zellen ausgeweitet und angewendet werden, um verschiedene Zelltypen mit Pyroptose zu untersuchen und sie von anderen Formen des Zelltods zu unterscheiden.
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Protokoll
Die Einzelheiten zu den Reagenzien und der in der Studie verwendeten Ausrüstung sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Vorbereitung der Probenzellen
- Kultivieren Sie DF-1-Zellen (immortal chicken embryo fibroblasts) in Sechs-Well-Platten (5 x 10,5 Zellen pro Well) mit Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), in einem 5 % CO2 -Inkubator bei 38 °C.
- Wenn die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreichen, entsorgen Sie das serumhaltige Zellkulturmedium, waschen Sie die Zellen dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und fügen Sie dann 2 ml serumfreies Zellkulturmedium in jede Vertiefung hinzu.
- Fügen Sie die IBDV-Viruslösung (mit dem berechneten MOI) zu jeder Vertiefung hinzu und richten Sie eine simulierte infizierte Kontrolle ein, indem Sie das DMEM-Volumen hinzufügen, das dem der Viruslösung entspricht.
- Nach 1 h Virusadsorption verwerfen Sie das Kulturmedium, waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS, geben Sie 2 ml DMEM mit 2 % FBS in jede Vertiefung und setzen Sie die Zellkulturen 24 Stunden lang fort.
- 24 h nach der IBDV-Infektion, führen Sie eine Trypsin-Behandlung (500 μl pro Well) für 1 min durch und neutralisieren Sie anschließend mit DMEM, ergänzt mit 10 % FBS (2 mL pro Well). Anschließend müssen die Zellen geerntet werden, um Einzelzellsuspensionen für die Durchflusszytometrie herzustellen.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 x g für 5 min bei 2-8 °C. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in PBS und wirbeln Sie die Röhren vorsichtig 3 s lang.
- Die Zellen werden wie in Schritt 1.6 beschrieben zentrifugiert (400 x g für 5 min bei 2-8 °C).
- Wiederholen Sie das Waschen der Zellen wie in Schritt 1.7 und Schritt 1.8 beschrieben.
- Führen Sie die Zellzählung mit einem Hämozytometer unter einem Mikroskop durch. Dann resuspendieren Sie die Zellen in einem geeigneten Volumen Durchflusszytometrie-Färbepuffer (so dass die endgültige Zellkonzentration 1 x 107 Zellen/ml beträgt). Wirbeln Sie die Suspensionen vorsichtig ein.
2. Zellfärbung für die Durchflusszytometrie
- 100 μl der einzelligen Suspensionen aus Schritt 1.10 werden in 5-ml-Polystyrolröhrchen mit rundem Boden (12 mm × 75 mm) gegeben. Bereiten Sie Schein- und IBDV-infizierte Zellen für die anti-chGSDME-NT/CT-Antikörperfärbung vor und verwenden Sie normales Maus-IgG als Isotypkontrolle. Bereiten Sie in der Zwischenzeit eine Blindkontrolle und einzelne gefärbte Röhrchen mit IBDV-infizierten Zellen vor.
- Geben Sie 1 μg entweder Alexa Fluor 647-markiertes anti-chGSDME-NT McAb, anti-chGSDME-CT McAb oder normales Maus-IgG (als Isotypkontrolle) in IBDV-infizierte bzw. Mock-Control-Röhrchen. Anschließend die Röhren 3 s lang vorsichtig durchwirbeln.
- Inkubieren Sie die gefärbten Zellen bei 2-8 °C oder 30 min im Dunkeln auf Eis. Alle 10 min die Schläuche sanft vortexen.
- Waschen Sie die Zellen mit 1 mL Durchflusszytometrie-Färbepuffer durch Zentrifugation bei 400 x g für 5 min bei 2-8 °C. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette.
- Wiederholen Sie das Waschen der Zellen wie in Schritt 2.4 beschrieben.
- Resuspendieren Sie das Pellet in 100 μl Durchflusszytometrie-Färbepuffer.
- Die Zellen der IBDV-infizierten Gruppe und der Schein-infizierten Gruppe sowie der PI-Einzelfärberöhrchen werden 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 10 μg/ml PI gefärbt, gefolgt von der Zugabe von 400 μl Durchflusszytometrie-Färbepuffer für den Durchflusszytometrie-Assay.
3. Durchführung des Durchflusszytometrie-Assays
- Schalten Sie das Durchflusszytometer ein, um das Gerät zu initialisieren und die Software zu starten.
- Beginnen Sie mit dem Ausführen des blinden Kontrollrohrs, gefolgt von den einzelnen gefärbten Röhrchen, um die Spannung und die Kompensationsparameter des Durchflusszytometers einzustellen. Verwenden Sie FL3- und FL4-Fluoreszenzkanäle, die bei 635 nm emittieren, zum Nachweis von PI- bzw. Alexa Fluor 647-Fluorophoren.
- Nachdem Sie alle Parameter konfiguriert haben, führen Sie alle Beispiele nacheinander aus.
4. Analyse von Durchflusszytometrie-Daten
- Analysieren Sie die Alexa Fluor 647-Färbung jeder Probe im FL4-Kanalhistogramm.
- Um den Anteil der doppelt positiven Zellen in jeder Probe zu bewerten, verwenden Sie das Vier-Quadranten-Punktdiagramm von FL3/FL4.
- Festlegung positiver Schwellenwerte auf der Grundlage von doppelt gefärbten IgG/PI-Proben der Isotypkontroll, um sicherzustellen, dass der Anteil der doppelt positiven Zellen unter 1 % bleibt. Dieser Ansatz ermöglicht es, den Anteil der doppelt positiven Zellen in allen Proben zu messen.
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Ergebnisse
chGSDME-NT auf der Membran von DF-1-Zellen mit IBDV-Infektion konnte mittels Durchflusszytometrie leicht nachgewiesen werden
Eines der wichtigsten Merkmale pyroptotischer Zellen ist die Bildung von Membranporen durch GSDM-NT-Fragmente, die aus der Gasdermin-Spaltung erzeugt werden. Daher könnten pyroptotische Zellen theoretisch durch Durchflusszytometrie nachgewiesen werden, indem GSDM-NT auf Zellmembranen mit spezifischen Antikörpern untersucht wird. So wurde...
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Diskussion
Dieser Artikel beschreibt eine effektive Methode zur Untersuchung der Pyroptose mittels Durchflusszytometrie, die durch duale Färbung infizierter Zellen mit Alexa Fluor 647-markiertem anti-chGSDME-NT McAb und PI erreicht wird. Dieser Ansatz kann auch auf verschiedene Zelltypen angewendet werden, um die Pyroptose von anderen Arten des Zelltods, wie Apoptose und Nekrose, zu unterscheiden.
Pyroptose, eine entzündliche Art des programmierten Zelltods, die in erster Linie auf der D-induz...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Wir danken Dr. Jue Liu für seine freundliche Unterstützung. Diese Studie wurde durch Zuschüsse des National Key Research and Development Program of China (Nr. 2022YFD1800300), der National Natural Science Foundation of China (Nr. 32130105) und des Earmarked Fund for Modern Agro-Industry Technology Research System (Nr. CARS-40), China.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 5 mL Polystyrol-Röhrchen mit rundem Boden (12x 75 mm) | Corning Falcon | 352052 | |
| 6-Well-Zellkulturplatte | Corning | 3516 | |
| Alexa Fluor 647 Antikörper-Markierungskits | Thermo Fisher Scientific | A20186 | |
| Anti-chGSDME-CT McAb | SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China) | EU0228 | |
| Anti-chGSDME-NT McAb | SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China) | EU0227 | |
| CellQuest Software | BD Biosciences | ||
| CO2 Inkubator | Thermo Fisher Scientific | 3100 | |
| Kryogene Gefrierzentrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco by Life Technologies | C11995500BT | |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Sigma-Aldrich | F0193-500ML | |
| Durchflusszytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Durchflusszytometrie Färbepuffer | Thermo Fisher Scientific | 00-4222-26 | |
| Hämozytometer | Qiu-jing Biochemisches Reagenz & Instrument Company (Shanghai, China) | YX-JSB52 | |
| IBDV Lx Stamm | IBDV Lx Stamm wurde freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Jue Liu, Beijing Academy of Agriculture and Forestry, Beijing, China | ||
| Inverses Mikroskop | Chongqing Photoelectric Instrument Company | XDS-1B | |
| Normales Maus-IgG | Santa Cruz Biotechnologie | sc-2025 | |
| Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS) | M& C Gentechnologie | CC017 | |
| Propidiumiodid(PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Trypsin-EDTA, 0,25% | M& C Gentechnologie | CC008 | |
| Vortex-Oszillator | MIULAB | MIX-28+ |
Referenzen
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