Dieser Artikel beschreibt die Identifizierung pyroptotischer Zellen mittels Durchflusszytometrie nach dualer Färbung mit Antikörpern gegen das N-terminale Fragment von Hühner-GSDME (chGSDME-NT) und Propidiumiodid (PI).
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Methodenartikel
Untersuchung der Pyroptose mittels Durchflusszytometrie
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Pyroptose ist eine entzündliche Form des programmierten Zelltods, die hauptsächlich durch die Bildung von Plasmamembranporen durch den N-Terminus angetrieben wird, die aus den gespaltenen Proteinen der Gasdermin-Familie (GSDM) erzeugt werden. Die Untersuchung von membrangebundenem GSDM-NT mittels Western Blot ist die am häufigsten verwendete Methode zur Beurteilung der Pyroptose. Allerdings ist es mit dieser Methode schwierig, Zellen mit Pyroptose von anderen Formen des Zelltods zu unterscheiden. In dieser Studie wurden mit dem Infectious Bursal Disease Virus (IBDV) infizierte DF-1-Zellen als Modell verwendet, um den Anteil der Zellen, die einer Pyroptose unterzogen werden, mittels Durchflusszytometrie zu quantifizieren, wobei spezifische Antikörper gegen das N-terminale Fragment der Hühner-GSDME (chGSDME-NT) und Propidiumiodid (PI)-Färbung verwendet wurden. Die chGSDME-NT-positiven Zellen waren mittels Durchflusszytometrie mit Alexa Fluor 647-markierten Anti-chGSDME-NT-Antikörpern leicht nachweisbar. Darüber hinaus war der Anteil der doppelt positiven chGSDME-NT/PI-Zellen in IBDV-infizierten Zellen (rund 33 %) signifikant höher als in scheininfizierten Kontrollen (P < 0,001). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Untersuchung von membrangebundenem chGSDME-NT mittels Durchflusszytometrie ein wirksamer Ansatz zur Bestimmung pyroptotischer Zellen bei Zellen im Zelltod ist.
Einleitung
Die Pyroptose ist eine entzündliche Form des programmierten Zelltods, die bei Säugetieren hauptsächlich von der Bildung von Plasmamembranporen durch Gasdermin (GSDM) D abhängt 1,2,3. Aufgrund des genetischen Mangels an GSDMD bei Hühnern 4,5 bleibt der Mechanismus der Pyroptose bei Hühnern schwer fassbar. Die Gasdermin-Familie umfasst konservierte Proteine, darunter GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDMME und DFNB59 3,6. Studien haben gezeigt, dass GSDME aus Teleost....
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Protokoll
Die Einzelheiten zu den Reagenzien und der in der Studie verwendeten Ausrüstung sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Vorbereitung der Probenzellen
- Kultivieren Sie DF-1-Zellen (immortal chicken embryo fibroblasts) in Sechs-Well-Platten (5 x 10,5 Zellen pro Well) mit Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), in einem 5 % CO2 -Inkubator bei 38 °C.
- Wenn die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreichen, entsorgen Sie das serumhaltige Zellkulturmedium, waschen Sie die Zellen dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ....
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Ergebnisse
chGSDME-NT auf der Membran von DF-1-Zellen mit IBDV-Infektion konnte mittels Durchflusszytometrie leicht nachgewiesen werden
Eines der wichtigsten Merkmale pyroptotischer Zellen ist die Bildung von Membranporen durch GSDM-NT-Fragmente, die aus der Gasdermin-Spaltung erzeugt werden. Daher könnten pyroptotische Zellen theoretisch durch Durchflusszytometrie nachgewiesen werden, indem GSDM-NT auf Zellmembranen mit spezifischen Antikörpern untersucht wird. So wurde.......
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Diskussion
Dieser Artikel beschreibt eine effektive Methode zur Untersuchung der Pyroptose mittels Durchflusszytometrie, die durch duale Färbung infizierter Zellen mit Alexa Fluor 647-markiertem anti-chGSDME-NT McAb und PI erreicht wird. Dieser Ansatz kann auch auf verschiedene Zelltypen angewendet werden, um die Pyroptose von anderen Arten des Zelltods, wie Apoptose und Nekrose, zu unterscheiden.
Pyroptose, eine entzündliche Art des programmierten Zelltods, die in erster Linie auf der D-induz.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Wir danken Dr. Jue Liu für seine freundliche Unterstützung. Diese Studie wurde durch Zuschüsse des National Key Research and Development Program of China (Nr. 2022YFD1800300), der National Natural Science Foundation of China (Nr. 32130105) und des Earmarked Fund for Modern Agro-Industry Technology Research System (Nr. CARS-40), China.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 5 mL Polystyrol-Röhrchen mit rundem Boden (12x 75 mm) | Corning Falcon | 352052 | |
| 6-Well-Zellkulturplatte | Corning | 3516 | |
| Alexa Fluor 647 Antikörper-Markierungskits | Thermo Fisher Scientific | A20186 | |
| Anti-chGSDME-CT McAb | SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China) | EU0228 | |
| Anti-chGSDME-NT McAb | SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China) | EU0227 | |
| CellQuest Software | BD Biosciences | ||
| CO2 Inkubator | Thermo Fisher Scientific | 3100 | |
| Kryogene Gefrierzentrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco by Life Technologies | C11995500BT | |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Sigma-Aldrich | F0193-500ML | |
| Durchflusszytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Durchflusszytometrie Färbepuffer | Thermo Fisher Scientific | 00-4222-26 | |
| Hämozytometer | Qiu-jing Biochemisches Reagenz & Instrument Company (Shanghai, China) | YX-JSB52 | |
| IBDV Lx Stamm | IBDV Lx Stamm wurde freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Jue Liu, Beijing Academy of Agriculture and Forestry, Beijing, China | ||
| Inverses Mikroskop | Chongqing Photoelectric Instrument Company | XDS-1B | |
| Normales Maus-IgG | Santa Cruz Biotechnologie | sc-2025 | |
| Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS) | M& C Gentechnologie | CC017 | |
| Propidiumiodid(PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Trypsin-EDTA, 0,25% | M& C Gentechnologie | CC008 | |
| Vortex-Oszillator | MIULAB | MIX-28+ |
Referenzen
- He, W. T., et al. Gasdermin D is an executor of pyroptosis and is required for interleukin-1β secretion. Cell Res. 25 (12), 1285-1298 (2015).
- Kayagaki, N., et al. Caspase-11 cleaves Gasdermin D for non-canonical inflammasome signalling. Na....
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Nachdrucke und Genehmigungen
