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Mitochondrialer Transfer durch Tunneln von Nanoröhren zwischen mesenchymalen Stammzellen und retinalem Pigmentepithel in vitro

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DOI:

10.3791/66917

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4. Oktober 2024

 , 
1Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Tongren Eye Center, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das mitochondriale Tracing, direkte Co-Kulturverfahren von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) und retinalen Pigmentepithelzellen (ARPE19) sowie die Methoden zur Beobachtung und statistischen Analyse der Bildung von tunnelnden Nanoröhren (TNT) und des mitochondrialen Transfers umfasst, um den mitochondrialen Austausch über TNTs zwischen MSCs und ARPE19-Zellen zu charakterisieren.

Zusammenfassung

Der mitochondriale Transfer ist ein normales physiologisches Phänomen, das bei verschiedenen Zelltypen weit verbreitet ist. In der bisherigen Studie ist der wichtigste Weg für den mitochondrialen Transport das Tunneln von Nanoröhren (TNTs). Es gibt viele Studien, die berichten, dass mesenchymale Stammzellen (MSCs) Mitochondrien durch TNTs auf andere Zellen übertragen können. Nur wenige Studien haben jedoch das Phänomen des bidirektionalen mitochondrialen Transfers nachgewiesen. Hier beschreibt unser Protokoll einen experimentellen Ansatz zur Untersuchung des Phänomens des mitochondrialen Transfers zwischen MSCs und retinalen Pigmentepithelzellen in vitro mit Hilfe von zwei mitochondrialen Tracing-Methoden.

Wir co-kultivierten mito-GFP-transfizierte MSCs mit mito-RFP-transfizierten ARPE19-Zellen (einer retinalen Pigmentepithelzelllinie) für 24 Stunden. Anschließend wurden alle Zellen mit Phalloidin gefärbt und durch konfokale Mikroskopie abgebildet. Wir beobachteten Mitochondrien mit grüner Fluoreszenz in ARPE19-Zellen und Mitochondrien mit roter Fluoreszenz in MSCs, was darauf hindeutet, dass ein bidirektionaler mitochondrialer Transfer zwischen MSCs und ARPE19-Zellen stattfindet. Dieses Phänomen deutet darauf hin, dass der mitochondriale Transport ein normales physiologisches Phänomen ist, das auch zwischen MSCs und ARPE19-Zellen auftritt, und dass der mitochondriale Transfer von MSCs zu ARPE19-Zellen viel häufiger stattfindet als umgekehrt. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass MSCs Mitochondrien in das retinale Pigmentepithel überführen können, und sagen in ähnlicher Weise voraus, dass MSCs in Zukunft ihr therapeutisches Potenzial durch den mitochondrialen Transport im retinalen Pigmentepithel erfüllen können. Darüber hinaus muss der mitochondriale Transfer von ARPE19-Zellen zu MSCs noch weiter erforscht werden.

Einleitung

Mitochondrien dienen als primäre Energiequelle für die meisten Zelltypen, wobei mitochondriale Dysfunktionen besonders energieintensive Gewebe wie die Netzhaut betreffen1. Stoffwechselveränderungen in der Netzhaut können eine bioenergetische Krise auslösen, die letztlich zum Absterben von Photorezeptoren und/oder RPE-Zellen führt2. Auf mesenchymalen Stammzellen (MSC) basierende Therapien haben sich bei der Behandlung von Augendegeneration als wirksam erwiesen, und einer der genauen Mechanismen, die den positiven Wirkungen von MSCs auf das Netzhautgewebe zugrunde liegen, kann auf den funktionellen mitochondrialen Transfer zurückgeführt werden 3,4,5,6. Im Jahr 2004 berichteten Rustom et al. erstmals über das Phänomen des mitochondrialen Transfers durch eine neuartige Zell-zu-Zell-Interaktion, die durch das Tunneln von Nanoröhren (TNTs) erleichtert wurde7.

In der 2D-Kultur werden tunnelnde Nanoröhren (TNTs) durch ihre dünnen (20-700 nm) Membranvorsprünge von Dutzenden bis Hunderten von Nanometern Länge identifiziert, die über dem Substrat schweben und direkte Verbindungen zwischen zwei oder mehr homotypischen und heterotypischen Zellen herstellen können. Diese Strukturen sind insbesondere mit F-Aktin angereichert und erleichtern den Transport von Fracht, wie z. B. Mitochondrien, zwischen den Zellen. Darüber hinaus besitzen TNTs Öffnungen an beiden Enden, die die Kontinuität des zytoplasmatischen Inhalts zwischen miteinander verbundenen Zellen ermöglichen8.

Es ist schwierig, einen TNT-vermittelten mitochondrialen Transfer in vivo nachzuweisen, da die Zellen dicht sind und es schwierig ist, die Mitochondrien zu verfolgen. In-vitro-Experimente unter Verwendung von Zell-Co-Kulturen und mitochondrialen Tracing-Techniken ermöglichen die Beobachtung der TNT-Bildung und des mitochondrialen Transfers 8,9. Wir beobachteten auch das Phänomen des TNT-vermittelten mitochondrialen Transfers durch Co-Kultivierung von MSCs und retinalen Pigmentepithelzellen in vitro10.

Viele frühere Studien haben nur einen unidirektionalen mitochondrialen Transfer von MSCs auf andere Zellen beobachtet 3,4,5,6. Zuvor haben wir auch versucht, den bidirektionalen mitochondrialen Transfer mit zwei Arten von Zellen zu analysieren, die mit Mito-Tracker grün bzw. Mito-Tracker rot markiert waren, aber das Crosstalk der Farbstoffe störte die experimentellen Ergebnisse. Um den mitochondrialen bidirektionalen Transfer genauer zu untersuchen, haben wir hier zwei Zelllinien mit unterschiedlicher mitochondrialer Fluoreszenz unter Verwendung der lentiviralen Transfektionstechnik konstruiert und anschließend die Phänomene der TNT-Bildung und des mitochondrialen bidirektionalen Transfers durch direkte Co-Kultur in vitro beobachtet und analysiert.

Kurz gesagt, hier wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll beschrieben, wie Mitochondrien verfolgt, MSCs mit ARPE19-Zellen co-kultiviert und die TNT-Bildung und der mitochondriale Transfer analysiert werden. Die Ergebnisse dieses Experiments zeigten einen TNT-vermittelten bidirektionalen mitochondrialen Transfer, der nicht nur bewies, dass der mitochondriale Transport ein häufiges physiologisches Phänomen ist, sondern auch die potenzielle therapeutische Fähigkeit von MSCs auf Netzhautzellen zeigte.

Protokoll

1. Erzeugung von MSC-mito-GFP- und ARPE19-mito-RFP-Zelllinien

  1. Zellkultur
    HINWEIS: Als Beispiel werden hier nur MSCs verwendet.
    1. Kulturieren Sie humane MSCs in einer 6-Well-Platte in hMSC-Medium mit 1 % Penicillin und Streptomycin (siehe Materialtabelle), bis die Zelldichte 80 %-90 % erreicht. Wechseln Sie je nach Dichte des Zellwachstums das Medium alle 2-3 Tage.
      1. Entfernen Sie das ursprüngliche Medium und waschen Sie die Zellen einmal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) (siehe Materialtabelle). 1 ml des Trypsin-EDTA-DPBS-Gemisches (0,05 % Trypsin-EDTA: 0,25 % Trypsin-EDTA verdünnt mit DPBS im Verhältnis 1:5; siehe Materialtabelle) zugeben und 3-4 min (abhängig von den Zellen) in einem 37 °C Inkubator inkubieren.
        HINWEIS: Beobachten Sie den Zellverdau unter einem Mikroskop und stoppen Sie den Verdau, wenn die meisten Zellen abgerundet und abgelöst sind.
      2. Klopfen Sie vorsichtig auf die 6-Well-Platte, um die an der Oberfläche haftenden Zellen zu lösen, und fügen Sie dann 1 ml frisches vollständiges Medium hinzu, um die Verdauung zu beenden.
      3. Resuspendieren Sie alle Zellen vorsichtig mit einer Pipettenpistole und überführen Sie anschließend alle gesammelten Zellen in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
      4. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 × g für 5 min.
      5. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen durch Zugabe von 1 ml frischem Medium. Nehmen Sie 10 μl Zellsuspension für die Zellzählung ein.
      6. Achtzehn bis 24 Stunden vor der lentiviralen Transfektion werden MSC-Zellen mit einer Dichte von 1 × 105 Zellen pro Well in 6-Well-Platten ausgesät, wobei sichergestellt wird, dass die Zelldichte zum Zeitpunkt der Transfektion etwa 50 % beträgt.
  2. Transfektion des Lentivirus
    HINWEIS: Alle Vorgänge im Zusammenhang mit der lentiviralen Transfektion müssen in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden.
    1. Ersetzen Sie das ursprüngliche Medium am nächsten Tag durch 2 mL frisches Medium und fügen Sie 25 μl Lentivirus-Suspension (5,00 E+08 TU/ml) mit Adjuvantien hinzu, gefolgt von einer Inkubation bei 37 °C.
      HINWEIS: Die Verpackung des Lentivirus wurde von einem Unternehmen unter Verwendung des Plasmids Mito-GFP (pCT-Mito-copGFP) (siehe Materialtabelle und ergänzende Abbildung S1) durchgeführt.
    2. Nach 6 Stunden Inkubation ist das virushaltige Medium durch 2 ml frisches Medium zu ersetzen. Inkubieren Sie weiter und wechseln Sie das Medium einmal täglich.
      HINWEIS: Eine signifikante mitochondriale Fluoreszenzexpression wird bei MSCs 48 h nach der Transfektion beobachtet, wobei eine weitere Verstärkung zum Zeitpunkt von 72 h erkennbar ist.
    3. Screenen Sie erfolgreich transfizierte Zellen, indem Sie das Kulturmedium 2 Tage nach der Transfektion mit Puromycin (1 μg/ml) ergänzen. Gleichzeitig wird eine äquivalente Konzentration von Puromycin zu mesenchymalen Stammzellen ohne virale Transfektion als Kontrolle hinzugefügt.
      HINWEIS: Der mito-GFP-Virusvektor wurde so entwickelt, dass er das Puromycin-Resistenzgen enthält.
    4. Wechseln Sie das Medium täglich mit der Einführung von Puromycin (1 μg/ml). Stoppen Sie die Puromycin-Zugabe bei nahezu vollständigem Zelltod in der Kontrollgruppe.
      HINWEIS: Das Medium enthält diese Konzentration von Puromycin nicht. Die Zugabe von Puromycin ist nur erforderlich, wenn das Medium in eine 6-Well-Platte gegeben wird.
    5. Fahren Sie mit der Kultivierung ohne Puromycin fort, bis die Zellen passageiert und eingefroren sind. Nennen Sie diesen Zelltyp MSC-mito-GFP.
      HINWEIS: ARPE19-Zellen wurden aus der ATCC-Zellbank gewonnen und in DMEM/F12 kultiviert, die 10 % FBS und 1 % Penicillin und Streptomycin enthielten (siehe Materialtabelle), und die Methoden ihres Verdaus und ihrer Passage sind die gleichen wie bei MSCs. Das Plasmid Mito-RFP wurde von einem Unternehmen aus Mito-GFP modifiziert. Schließlich nannten wir die erfolgreich transfizierten Zellen ARPE19-mito-RFP.

2. Direkte Co-Kultur von MSC- und ARPE19-Zellen

HINWEIS: In diesem Co-Kultursystem dienen MSC-mito-GFP-Zellen als Spenderzellen, während ARPE19-mito-RFP-Zellen als Empfängerzellen fungieren. Um zwischen Spender- und Empfängerzellen zu unterscheiden, haben wir Empfängerzellen verfolgt.

  1. Markieren Sie ARPE19-mito-RFP-Zellen mit CellTrace Violet (siehe Materialtabelle) in der zytoplasmatischen Membran.
    HINWEIS: Die Anregung und Emission des Farbstoffs CellTrace violett beträgt 405 nm bzw. 450 nm.
    1. Bereiten Sie eine CellTrace Violet (siehe Materialtabelle) Stammlösung vor, indem Sie 20 μl Dimethylsulfoxid (DMSO) in ein Fläschchen mit CellTrace Violet Reagenz geben und unmittelbar vor der Verwendung gut mischen.
    2. Züchten Sie die ARPE19-mito-RFP-Zellen auf die gewünschte Dichte von 80%-90%.
    3. Verdünnen Sie die CellTrace Violet Stammlösung in vorgewärmtem (37 °C) DPBS auf die gewünschte Arbeitskonzentration (1:1.000). Das ist die Ladelösung.
      HINWEIS: Die Verdünnung von CellTrace Violet muss mit DPBS durchgeführt werden und kann nicht durch Kulturmedium ersetzt werden, da dies zu sehr schlechten Färbeergebnissen führt.
    4. Entfernen Sie das Nährmedium und ersetzen Sie es durch 1 ml Ladelösung. Inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 37 °C.
      HINWEIS: Wenn die Bedingungen es zulassen, kann die Färbung nach 5 Minuten unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet werden. Die Färbung kann beendet werden, sobald die gewünschten Ergebnisse erreicht sind, da einige Zellen möglicherweise nicht in der Lage sind, eine längere Exposition gegenüber DPBS zu vertragen.
    5. Entfernen Sie die Ladelösung, waschen Sie die Zellen 2x mit DPBS und ersetzen Sie sie durch 2 mL frisches vollständiges Medium. Inkubieren Sie die Zellen nach der Färbung mindestens 10 Minuten lang, damit das CellTrace Violet einer Acetathydrolyse unterzogen werden kann.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist notwendig, damit die Zellen in ihren optimalen Zustand zurückkehren und nachfolgende Experimente nicht beeinträchtigt werden.
  2. Bereiten Sie eine 24-Well-Platte vor, indem Sie 50 μl DPBS in jede Vertiefung geben. Anschließend das Deckglas (mit einem angegebenen Durchmesser von 15 mm) (siehe Materialtabelle) in die Platte einsetzen und 1 min einwirken lassen. Entfernen Sie das DPBS aus den Vertiefungen und verwenden Sie Unterdruck, um sicherzustellen, dass sich der Abdeckschieber nahe am Boden der Schale befindet.
  3. Trypsinisieren Sie Spender-MSCs und Empfänger-ARPE19-Zellen wie in Schritt 1.1.1 beschrieben.
  4. Zellzählung
    1. 10 μl Zellsuspension zur Zählung auf eine Zählplatte geben.
      HINWEIS: Wenn die Dichte der Zellen zu hoch ist, können sie 10-fach mit Medium verdünnt werden und dann wie oben beschrieben vorgehen.
    2. 10.000 MSCs und 10.000 ARPE19-Zellen in 500 μl Medium pro Well einer 24-Well-Platte aussäen. Mischen Sie die Zellen gut, bevor Sie sie auf die 24-Well-Platte geben. Siehe die unten gezeigten Berechnungen bei einer MSC-Zahl von A/ml und einer ARPE19-Zellzahl von B/ml.
      HINWEIS: Für 4 Wells sind 40.000 MSCs und 40.000 ARPE19-Zellen in 2 ml Medium erforderlich.
      Volumen der MSC-Suspension (C) mit 40.000 MSC = 40.000/A μl
      Volumen der ARPE19-Suspension (D) mit 40.000 MSC = 40.000/B μL
      Füllen Sie das Volumen auf 2 mL mit 2 - (C + D) mL Medium auf.
  5. Beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop, schütteln Sie die Platte, bis die Zellen gleichmäßig verteilt sind, und inkubieren Sie sie dann 24 Stunden lang in der Kultur.

3. Indirekte Co-Kultur von MSC- und ARPE19-Zellen in einem Transwell-System

  1. Führen Sie Zellkultur, Markierung, Verdau und Zählung durch, wie in den Schritten 2.1 bis 2.4.1 beschrieben.
  2. Keimen Sie 20.000 ARPE19-Zellen in 1 ml Medium pro Well einer 24-Well-Platte.
    HINWEIS: In diesem Experiment haben wir ARPE19-Zellen ohne markierte Mitochondrien verwendet.
  3. Setzen Sie den Einsatz in die Vertiefung ein, in die die Zelle ausgesät wurde.
  4. 10.000 MSCs in 100 μl Medium in der oberen Zellkammer pro Vertiefung aussäen.
  5. Wiederholen Sie Schritt 2.5.

4. Färbung des Zytoskeletts

HINWEIS: Während des gesamten Experiments vor Licht schützen.

  1. Entfernen Sie das Medium von den 24-Well-Platten. Waschen Sie alle Zellen einmal mit 500 μl/Vertiefung 4 % Polyformaldehyd (PFA), fügen Sie 500 μl frisches 4 % PFA hinzu und fixieren Sie die Proben für 20 Minuten.
    HINWEIS: Die Einschübe des Transwell-Systems werden verworfen.
    HINWEIS: Da Nanoröhren sehr zerbrechlich sind, haben wir die Zellen direkt mit 4 % PFA anstelle von DPBS gewaschen, um die Retention intakter Nanoröhren zu maximieren.
  2. Entfernen Sie das Fixiermittel und waschen Sie die Proben 3 x 10 min lang mit DPBS.
  3. 500 μl/Vertiefung Blockierungslösung bestehend aus 0,5 % Triton X-100 (siehe Materialtabelle) und 4 % Rinderserumalbumin (BSA) (siehe Materialtabelle) zugeben und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
  4. Entfernen Sie die Blockierlösung und waschen Sie die Proben 3 x 10 min lang mit DPBS.
  5. Herstellung der Phalloidin-Färbelösung (siehe Materialtabelle)
    HINWEIS: Die Anregung und Emission von Phalloidin beträgt 650 nm bzw. 668 nm.
    1. Bereiten Sie Stammlösungen vor, indem Sie den Inhalt des Fläschchens in 150 μl wasserfreiem DMSO auflösen, um eine 400-fache Stammlösung zu erhalten.
    2. Bereiten Sie die Färbelösung vor, indem Sie die 400-fache Lagerlösung mit DPBS auf 1-fach verdünnen. Dies ist die Phalloidin-Färbelösung.
  6. 200 μl Phalloidin-Färbelösung in jede Vertiefung geben und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
  7. Die Färbelösung zurückgewinnen und die Probe 3 x 10 min mit DPBS waschen.
    HINWEIS: Wenn Sie die Zellen mit DPBS waschen, ist es besser, die Platte auf einem Schüttler zu belassen.
  8. Nehmen Sie das Deckglas mit einer Spritzennadel heraus und lassen Sie es an der Luft trocknen.
    HINWEIS: Der optimale Zustand ist einer, in dem keine sichtbare Flüssigkeit auf dem Deckglas zu sehen ist, das Glas aber auch nicht trocken ist.
  9. Tragen Sie eine kleine Menge Eindeckmittel (siehe Materialtabelle) auf den Objektträger auf und drehen Sie das Deckglas auf dem Objektträger vorsichtig um, um sicherzustellen, dass das Medium die gesamte Oberfläche gleichmäßig bedeckt. Versiegeln Sie die Ränder mit Nagellack.
    HINWEIS: Warten Sie einige Minuten, bis der Nagellack ausgetrocknet ist.
  10. Nehmen Sie umgehend ein konfokales Bild auf oder übertragen Sie es in eine Slice-Box und lagern Sie es für kurze Zeit bei 4 °C.
    HINWEIS: Die ideale Lagerzeit beträgt 2 Wochen. Wird diese Zeit überschritten, kann sich der Abbildungseffekt verschlechtern.

5. Konfokale Bildgebung

HINWEIS: Die konfokale Bildgebung wird gemäß der Bedienungsanleitung durchgeführt und kann je nach Mikroskop variieren. Hier geben wir nur einige der wichtigsten Schritte an.

  1. Starten Sie das konfokale Mikroskop und öffnen Sie vier Laserkanäle (405, 488, 561, 640) gemäß Bedienungsanleitung.
  2. Greifen Sie auf die Software am Computer zu und führen Sie vorläufige Parametrierungen der Software durch.
    1. Fügen Sie die Fluoreszenzkanäle CF-405, CF-488, CF-561 und CF-640 im Bereich Prozessmanagement hinzu.
    2. Stellen Sie die Belichtungszeit jedes Fluoreszenzkanals auf 200 ms ein und stellen Sie die Verstärkungsintensität in der Kamerasteuerung auf 2 ein.
    3. Stellen Sie den Laser/LED-Combiner auf einen Wert von 80 ein.
  3. Manipulieren Sie das externe Bedienfeld des Mikroskops, um das Objektiv auf eine 20-fache Vergrößerung einzustellen und sicherzustellen, dass das Objektiv auf der niedrigsten Einstellung positioniert ist.
  4. Positionieren Sie die Schiene in umgekehrter Ausrichtung auf dem Trägertisch.
  5. Aktivieren Sie den 405-nm-Laser und manipulieren Sie den Fokus mit den groben und feinen Fokussierspiralen. Beobachten Sie die Probe unter dem Okular, bis blau fluoreszierende Zellen sichtbar sind.
  6. Wählen Sie Live Imaging in der Software-Oberfläche des Computers, wechseln Sie zum CF-405-Kanal und stellen Sie die Feinfokus-Helix neu ein, bis ein deutliches Bild der Zellen mit blauer Fluoreszenz auf dem Computerbildschirm sichtbar ist.
  7. Stellen Sie das Objektiv auf 40-fache Vergrößerung und Übergang zum CF-640-Kanal ein und stellen Sie dann den Fokus vorsichtig ein, bis eine deutliche zelluläre Mikrofilamentstruktur sichtbar ist.
  8. Beibehaltung einer konstanten Brennweite, sequentieller Übergang zu den Kanälen CF-405, CF-488 und CF-561 und Änderung der Parameter für die optimale Belichtungszeit, Verstärkungsintensität und Laser /LED-Combiner für die Bildgebung innerhalb jedes Kanals nach Bedarf.
  9. Aktivieren Sie die Funktion Z-Bildstapel und definieren Sie den Anfangs- und Endpunkt der Z-Achse, indem Sie die Brennweite manipulieren, um ein Bild mit Tiefe mit der Z-Achse aufzunehmen.
  10. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start im Bereich Prozessmanagement , um ein Foto aufzunehmen.
  11. Wählen Sie 10 Sichtfelder nach dem Zufallsprinzip für jedes Segment aus.
    HINWEIS: Es sollte keine Überlappung zwischen zwei beliebigen Sichtfeldern geben.
  12. Aktivieren Sie die Zeitrafferfunktion, indem Sie eine Gesamtbilddauer von 24 h und ein Fotointervall von 5 min nach Identifizierung des gewünschten Sichtfeldes angeben.
    HINWEIS: Um eine Zeitraffersequenz aufzunehmen, ist es notwendig, die Zellen in einer Schale mit Glasboden zu inokulieren und sie in einer belüfteten Box mit 5 % CO2 -Gas zu positionieren.
  13. Speichern und exportieren Sie alle Bilder.
    HINWEIS: Um die Untersuchung von TNT und mitochondrialem Transfer zu verbessern, wurde superhochauflösende Bildgebung eingesetzt. Die hochauflösende Bildgebung wurde mit kommerzialisierter HIS-SIM durchgeführt, die als HIS-SIM (High Intelligent and Sensitive SIM) bezeichnet wurde und von einem Unternehmen bereitgestellt wurde. Die Bilder wurden mit einem 100x/1,5 NA Ölimmersionsobjektiv aufgenommen.

6. Datenanalyse

  1. Für die statistische Analyse jedes Bildes quantifizieren Sie die Gesamtzahl der Zellen, die Anzahl der Nanoröhren, die Anzahl der Violett-positiven ARPE19-Mito-RFE-Zellen, die Anzahl der Violett-positiven Zellen mit grüner Fluoreszenz (entspricht der Anzahl der ARPE19-Zellen mit mitochondrialem Transfer von MSCs) und die Anzahl der violett-negativen Zellen mit roter Fluoreszenz (entspricht der Anzahl der MSC-Zellen mit mitochondrialem Transfer von ARPE19-Zellen).
    1. Um die TNT-Bildung zu quantifizieren, berechnen Sie das Verhältnis der Anzahl der interzellulären Nanoröhren zur Gesamtzahl der Zellen.
    2. Berechnen Sie die mitochondriale Transferrate als das Verhältnis der Anzahl der violett-positiven Zellen mit grüner Fluoreszenz zur Gesamtzahl der violett-positiven Zellen (entspricht dem mitochondrialen Transfer von MSCs zu ARPE19-Zellen) oder dem Verhältnis der Anzahl der violett-negativen Zellen mit roter Fluoreszenz zur Gesamtzahl der violett-negativen Zellen (entspricht dem mitochondrialen Transfer von ARPE19-Zellen zu MSCs).

Ergebnisse

Das schematische Diagramm, das die direkte Co-Kultur von mesenchymalen Stammzellen (MSC) und ARPE19-Zellen veranschaulicht, ist in Abbildung 1 dargestellt. MSCs, die so konstruiert wurden, dass sie Mito-GFP exprimieren, wie die Spenderzellen, und ARPE19-Mito-RFP-Zellen mit violett markierten zytoplasmatischen Membranen als Empfängerzellen wurden in einem Verhältnis von 1:1 kokultiviert. Nach einer 24-stündigen Co-Kultur-Periode wurden die Zellen auf Phalloidin gefärbt und konfokalmikroskopisch untersucht. Die resultierenden Zellpopulationen umfassten MSC-mito-GFP-Zellen, ARPE19-mito-RFP-Zellen, ARPE19-mito-RFP-Zellen, die mito-GFP enthalten, und MSC-mito-GFP-Zellen, die mito-RFP enthalten. Bemerkenswert ist, dass das Vorhandensein von mito-GFP in ARPE19-Zellen und mito-RFP in MSCs auf einen mitochondrialen bidirektionalen Transfer hindeutet.

Spezifische Details der TNT-Bildung sind in Abbildung 2 dargestellt. Diese Strukturen können interzelluläre Verbindungen zwischen Zellen desselben Typs (Abbildung 2A-C) sowie zwischen Zellen verschiedener Typen (Abbildung 2D) herstellen. Tunnelnde Nanoröhren (TNTs) dienen als Kanäle, die benachbarte Zellen verbinden, und weisen eine charakteristische F-Aktin-reiche Membranstruktur mit offenen Enden auf, die die zytoplasmatische Kontinuität und den Transport von Mitochondrien erleichtern. Mit Hilfe der Z-Achsen-Bildgebung ist es offensichtlich, dass TNTs nicht fest an der extrazellulären Matrix verankert sind, sondern im Kulturmedium suspendiert sind, wodurch sie von herkömmlichen zellulären Vorsprüngen unterschieden werden. Der mitochondriale Transfer ist in Abbildung 3 zu sehen, wo violett-positive ARPE19-Zellen eine dispergierte, grün gepunktete Fluoreszenz aufweisen, die auf Mitochondrien hinweist, die von MSCs stammen (Abbildung 3A). Violett-negative MSCs, die rot gepunktete Fluoreszenz enthalten, stellen den mitochondrialen Transfer von ARPE19-Zellen dar (Abbildung 3B). Abbildung 4 zeigt die TNT-Bildung und den mitochondrialen Transfer unter superauflösender Bildgebung, aus der wir mehr Details des mitochondrialen Transfers über TNT sehen können. Video 1 zeigt die Dynamik des mitochondrialen Transports durch TNT.

Um weiter zu zeigen, dass die Voraussetzung für den mitochondrialen Transfer physischer Kontakt wie TNT und nicht die mitochondriale Sekretion und -aufnahme ist, verwendeten wir eine zuvor berichtete Co-Kultur-Methode10. Wie in Abbildung 5A gezeigt, wurden MSCs und ARPE19-Zellen in die obere bzw. untere Kammer einer Transwell-Platte ausgesät. Sie wurden durch einen Filter mit 0,4 μm Poren getrennt, der den direkten Kontakt zwischen MSCs und ARPE19-Zellen blockierte, aber den Durchgang von Mitochondrien ermöglichte. Nach 24 Stunden Co-Kultur wurden ARPE19-Zellen in der unteren Kammer untersucht und es wurde wenig Mito-GFP von MSCs in der oberen Kammer beobachtet (Abbildung 5B). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der mitochondriale Transfer einen direkten Kontakt zwischen MSCs und ARPE19-Zellen erfordert.

Abschließend wurde die Quantifizierung der TNT-Bildung und des mitochondrialen Transfers durchgeführt, wobei die entsprechenden Ergebnisse in Abbildung 6 dargestellt sind. MSCs waren signifikant besser in der Lage, Mitochondrien zu spenden als ARPE19-Zellen (p = 0,0286). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass MSCs die Fähigkeit besitzen, Mitochondrien auf retinale Pigmentepithelzellen zu übertragen.

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Abbildung 1: Schematische Darstellung der Co-Kultur von MSCs und ARPE19-Zellen. MSCs, die mito-GFP- und ARPE19-mito-RFP-Zellen exprimieren und mit CellTrace Violet markiert sind, werden 24 Stunden lang in einem Verhältnis von 1:1 co-kultiviert. Mito-GFP in violett+ Zellen markiert den Transfer von Mitochondrien von MSCs zu ARPE19-Zellen, während Mito-RFP in violetten Zellen den Transfer von Mitochondrien von ARPE19-Zellen zu MSCs markiert. Abkürzungen: GFP = grün fluoreszierendes Protein; RFP = rot fluoreszierendes Protein; MSCs = mesenchymale Stammzellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: TNT-Bildung zwischen MSCs und ARPE19-Zellen. Weiße Pfeilspitzen zeigen die TNT-Bildung an, grüne Pfeilspitzen zeigen Mitochondrien mit Mito-GFP und rote Pfeilspitzen zeigen Mitochondrien mit Mito-RFP an. (A,B) TNT-Bildung zwischen ARPE19-Zellen. (C) TNT-Bildung zwischen MSCs. (D) TNT-Bildung zwischen MSCs und ARPE19-Zellen. Z-Achsen-Bildgebung mit TNTs, die in Kulturmedium suspendiert sind. Maßstabsleisten = 25 μm. Abkürzungen: MSCs = mesenchymale Stammzellen; TNTs = tunnelnde Nanoröhren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Mitochondrialer Transfer von MSCs zu ARPE19-Zellen. (A) Der weiße gestrichelte Kreis zeigt den mitochondrialen (mito-GFP) Transfer von MSCs zu ARPE19-Zellen und (B) der gelbe gestrichelte Kreis zeigt den mitochondrialen (mito-RFP) Transfer von ARPE19-Zellen zu MSCs. Maßstabsbalken = 20 μm. Abkürzung: GFP = grün fluoreszierendes Protein; RFP = rot fluoreszierendes Protein; MSCs = mesenchymale Stammzellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: TNT-Bildung und mitochondrialer Transfer zwischen MSCs und ARPE19-Zellen mittels hochauflösender Mikroskopie. (A und B) Mitochondrialer Transport von MSCs zu ARPE19-Zellen. (C) Detail von TNTs unter superauflösender Bildgebung. (D) Grüne Mitochondrien von MSCs, die in ARPE19-Zellen unter superauflösender Bildgebung vorhanden sind. Maßstabsleiste = 5 μm. Abkürzungen: MSCs = mesenchymale Stammzellen; TNTs = tunnelnde Nanoröhren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Nahezu nicht nachweisbarer mitochondrialer Transfer in indirekter Co-Kultur im Transwell-System von MSCs und ARPE19-Zellen. (A) Schematische Darstellung der Co-Kultur von MSCs und ARPE19-Zellen im Transwell-System. (B) Repräsentative Bilder von ARPE19-Zellen am Boden der Transwell-Platte nach indirekter Co-Kultur mit MSCs für 24 Stunden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Abbildung 6: Quantifizierung der TNT-Bildung und des mitochondrialen Transfers. (A) TNT-Bildung, (B) mitochondrialer Transfer. Abkürzungen: M = MSCs = mesenchymale Stammzellen; A = ARPE19-Zellen; TNTs = tunnelnde Nanoröhren; M-A = TNT-Bildung zwischen MSCs und ARPE19-Zellen; M-M = TNT-Bildung zwischen MSCs; A-A = TNT-Bildung zwischen ARPE19-Zellen. n = 4, Mittelwert ± SD, Mann-Whitney U-Test, *p < 0,05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung S1: Kartierung des Plasmids pCT-Mito-copGFP. Mito-GFP (CYTO102-PA-1) wurde gekauft. Der Mitochondria Cyto-Tracer, pCT-Mito-GFP (CMV), fusioniert über einen Cox8-Tag mit copGFP, was zur Markierung der Mitochondrien mit copGFP führt. Diese copGFP-Fusion wird durch den CMV-Promotor angetrieben und ermöglicht eine robuste Expression in Zelllinien wie HeLa, HEK293 und HT1080. Mito-RFP wurde von mito-GFP modifiziert, indem GFP durch RFP ersetzt wurde. Es trägt ein Puromycin-Resistenzgen. Die lentivirale Verpackung dieses Plasmids wird von spezialisierten Unternehmen durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Video 1: TNT-vermittelter mitochondrialer Transport zwischen MSCs und ARPE19-Zellen. TNT wird durch die bidirektionale Bewegung von MSC- und ARPE19-Zellen erzeugt, was den Transfer von Mitochondrien von MSC-Zellen zu ARPE19-Zellen erleichtert. Abkürzungen: MSCs = mesenchymale Stammzellen; TNTs = tunnelnde Nanoröhren. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Diskussion

Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass das Phänomen des TNT-vermittelten mitochondrialen Transfers ein weit verbreiteter physiologischer Prozess in verschiedenen Arten von Gewebezellen ist 10,11,12,13. Die funktionelle mitochondriale Spende von MSCs an Zellen mit mitochondrialer Dysfunktion weist ein starkes therapeutisches Potenzialauf 3,14,15,16,17,18.

Um den TNT-vermittelten bidirektionalen mitochondrialen Transfer zwischen MSCs und ARPE19-Zellen zu präsentieren, haben wir MSC-mito-GFP und ARPE19-mito-RFP Zelllinien konstruiert. Anschließend wurden die beiden Zellarten 24 Stunden lang co-kultiviert, und am Ende der Co-Kultur wurde eine Zytoskelettfärbung durchgeführt. Mittels konfokaler Bildgebung beobachteten und zählten wir die TNT-Bildung und die mitochondriale Transferrate. Die Ergebnisse dieser Beobachtungen können durch Faktoren wie den Anteil der kokultivierten Zellen und die Zelldichte beeinflusst werden. Während der Co-Kultur ist es zwingend erforderlich, die beiden Zelltypen gründlich zu mischen und in einem Einzelzellzustand zu halten, um die Bildung von Zellkolonien durch homotypische Zellen zu minimieren und dadurch das Auftreten eines mitochondrialen Transfers zwischen den beiden Zelltypen zu reduzieren.

Die durchflusszytometrische Analyse kann in ähnlicher Weise zur Analyse der mitochondrialen Transferraten verwendet werden, und diese Methode ist einfacher als die Postimaging-Statistik. Die mit dieser Methode berechnete mitochondriale Transferrate wird jedoch etwas niedriger sein als der tatsächliche Wert, da geringe Mengen an mitochondrialem Transfer möglicherweise nicht aufgezeichnet werden. In diesem Protokoll muss die Zählung der Bildgebungsergebnisse sehr sorgfältig durchgeführt werden, um Auslassungen oder falsche Zählungen von fluoreszierenden Störsignalen zu vermeiden.

Die Untersuchung des bidirektionalen mitochondrialen Transfers durch die Konstruktion von zwei Zelllinien mit mitochondrialer Fluoreszenz ist eine Innovation dieses Protokolls. Die Methode vermeidet die Interferenz von Fluoreszenzfarbstoffen und macht die experimentellen Ergebnisse glaubwürdiger. Der Transfer von Mitochondrien von Netzhautzellen auf MSCs verdient weitere Studien, um beispielsweise Veränderungen im Anteil der Mitochondrien zu untersuchen, die unter Stressbedingungen in beide Richtungen übertragen werden.

Durch die Einhaltung der in diesem Protokoll beschriebenen experimentellen Verfahren konnten wir feststellen, dass MSCs Mitochondrien durch tunnelnde Nanoröhren auf retinale Pigmentepithelzellen übertragen können. Dieses Phänomen könnte als plausibler Mechanismus dienen, der den vorteilhaften Auswirkungen von MSCs auf Netzhautgewebe zugrunde liegt und damit zur Aufklärung von MSCs-gesteuerten regenerativen Therapien für Augengewebe beiträgt.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine widerstreitenden Interessen haben.

Danksagungen

Wir danken Guangzhou CSR Biotech Co. Ltd für die Bildgebung mit ihrem kommerziellen Super-Resolution-Mikroskop (HIS-SIM), die Datenerfassung, die SR-Bildrekonstruktion, die Analyse und die Diskussion. Diese Arbeit wird teilweise von der National Natural Science Foundation of China (82125007,92368206) und der Beijing Natural Science Foundation (Z200014) unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,25 % Trypsin-EDTAGibco25200-056
4 % ParaformaldehydSolarbioP1110
6-Well-PlatteNEST703001
15 mL ZentrifugenröhrchenBD Falcon352097
24-Well-PlatteNEST702001
ARPE19-ZellenATCCCRL-2302Zelllinien
Rinderserumalbumin (BSA)BeyotimeST025
CellTrace violettInvitrogenC34557
DeckfolieNEST801007
DMSOsigmaD2650
DPBSGibcoC141905005BT
DMEM/F-12-GlutaMAXGibco10565-042
Fötales Rind Serum (FBS)VivaCellC04002-500
FluorSave ReagenzMillipore345789
MSCsNuwacellRC02003Zelllinien
ncMissionShowninRP02010
Pen StrepGibco15140-122
pCT-Mito-GFPSBICYTO102-PA-1Plasmid; Von  https://www.systembio.com/mitochondria-cyto-tracer-pct-mito-gfp-cmv
PuromycinMCEHY-B1743A
PipetteAxygenTF-1000-R-S
PhalloidinInvitrogenA22287
Triton X-100SolarbioT8200
Transwell-PlatteCorning3470

Referenzen

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Schlagwörter

Bidirektionaler mitochondrialer Transfermitochondriales TracingKonfokalmikroskopieZell KokulturMito GFP MarkierungMito RFP Markierung

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