Isolierung von retinalen Kapillaren und subendothelialer Matrix der Maus zur Steifigkeitsmessung mittels Rasterkraftmikroskopie

Zusammenfassung

Vor kurzem haben wir die retinale Kapillarversteifung als neues Paradigma für retinale Dysfunktion im Zusammenhang mit Diabetes identifiziert. In diesem Protokoll werden die Schritte zur Isolierung von retinalen Kapillaren und der subendothelialen Matrix aus retinalen Endothelkulturen erläutert, gefolgt von einer Beschreibung der Steifigkeitsmesstechnik mittels Rasterkraftmikroskopie.

Zusammenfassung

Die retinale Kapillardegeneration ist ein klinisches Kennzeichen der frühen Stadien der diabetischen Retinopathie (DR). Unsere jüngsten Studien haben gezeigt, dass die diabetesinduzierte retinale Kapillarversteifung eine entscheidende und bisher unerkannte kausale Rolle bei der entzündungsvermittelten Degeneration der retinalen Kapillaren spielt. Die Zunahme der Steifigkeit der retinalen Kapillaren resultiert aus der Überexpression von Lysyloxidase, einem Enzym, das die subendotheliale Matrix vernetzt und versteift. Da davon ausgegangen wird, dass die Behandlung von DR im Frühstadium das Fortschreiten der DR und den damit verbundenen Sehverlust verhindert oder verlangsamt, stellen die subendotheliale Matrix und die Kapillarsteifigkeit relevante und neuartige therapeutische Ziele für die frühe DR-Behandlung dar. Darüber hinaus kann die direkte Messung der retinalen Kapillarsteifigkeit als entscheidender präklinischer Validierungsschritt für die Entwicklung neuer bildgebender Verfahren zur nicht-invasiven Beurteilung der retinalen Kapillarsteifigkeit bei Tieren und Menschen dienen. Vor diesem Hintergrund stellen wir hier ein detailliertes Protokoll für die Isolierung und Steifigkeitsmessung von retinalen Kapillaren und subendothelialen Matrizen der Maus mittels Rasterkraftmikroskopie zur Verfügung.

Einleitung

Netzhautkapillaren sind für die Aufrechterhaltung der Homöostase und der Sehfunktion der Netzhaut unerlässlich. Tatsächlich ist ihre Degeneration bei Diabetes im Frühstadium stark an der Entwicklung von sehkraftbedrohenden Komplikationen der diabetischen Retinopathie (DR) beteiligt, einer mikrovaskulären Erkrankung, von der fast 40 % aller Menschen mit Diabetes betroffen^{sind 1}. Vaskuläre Entzündungen tragen signifikant zur retinalen Kapillardegeneration bei DR bei. Frühere Studien haben gezeigt, dass aberrante molekulare und biochemische Signale bei Diabetes-induzierten retinalen Gefäßentzündungen eine wichtige Rolle spielen ^2,3. Neuere Arbeiten haben jedoch ein neues Paradigma für die DR-Pathogenese eingeführt, das die Versteifung der retinalen Kapillaren als eine entscheidende, aber bisher unerkannte Determinante der retinalen Gefäßentzündung und -degeneration identifiziert ^4,5,6.

Insbesondere wird die diabetesinduzierte Zunahme der retinalen Kapillarsteifigkeit durch die Hochregulierung des Kollagenvernetzungsenzyms Lysyloxidase (LOX) in retinalen Endothelzellen (ECs) verursacht, das die subendotheliale Matrix (Basalmembran) versteift4,5,6. Die Matrixversteifung wiederum versteift die darüber liegenden retinalen ECs (aufgrund mechanischer Reziprozität), was zu einer allgemeinen Zunahme der retinalen Kapillarsteifigkeit führt⁴. Entscheidend ist, dass diese diabetesinduzierte Kapillarversteifung der Netzhaut allein die Aktivierung der Netzhaut-EC und den entzündungsvermittelten EC-Tod fördern kann. Diese mechanische Regulation von retinalen EC-Defekten kann auf eine veränderte endotheliale Mechanotransduktion zurückgeführt werden, den Prozess, bei dem mechanische Signale in biochemische Signale umgewandelt werden, um eine biologische Reaktion hervorzurufen ^7,8,9. Wichtig ist, dass veränderte mechanische EC-Signale und die subendotheliale Matrixstruktur auch mit der choroidalen Gefäßdegeneration in Verbindung mit der frühen altersbedingten Makuladegeneration (AMD) in Verbindung gebracht wurden10,11,12, was die breiteren Auswirkungen der vaskulären Mechanobiologie auf degenerative Netzhauterkrankungen belegt.

Bemerkenswert ist, dass eine Versteifung der retinalen Kapillaren früh bei Diabetes auftritt, was mit dem Auftreten einer Netzhautentzündung zusammenfällt. Daher kann die Zunahme der retinalen Kapillarsteifigkeit sowohl als therapeutisches Ziel als auch als früher diagnostischer Marker für DR dienen. Zu diesem Zweck ist es wichtig, zuverlässige und direkte Steifigkeitsmessungen der retinalen Kapillaren und der subendothelialen Matrix zu erhalten. Dies kann durch die Verwendung eines Rasterkraftmikroskops (Rasterkraftmikroskops) erreicht werden, das eine einzigartige, empfindliche, genaue und zuverlässige Technik zur direkten Messung der Steifigkeit von Zellen, extrazellulärer Matrix und Geweben bietet¹³. Ein AFM übt eine winzige Eindringkraft (Nanonewton) auf die Probe aus, deren Steifigkeit das Ausmaß bestimmt, in dem sich der eindrückende AFM auslegert – je steifer die Probe, desto mehr biegt sich der Cantilever, und umgekehrt. Wir haben AFM ausgiebig eingesetzt, um die Steifigkeit von kultivierten Endothelzellen, subendothelialen Matrizen und isolierten retinalen Kapillaren der Maus zu messen 4,5,6,11,12. Diese Messungen der AFM-Steifigkeit haben dazu beigetragen, die endotheliale Mechanobiologie als Schlüsseldeterminante der DR- und AMD-Pathogenese zu identifizieren. Um den Anwendungsbereich der Mechanobiologie in der Sehforschung zu erweitern, stellen wir hier eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Verwendung von AFM für Steifigkeitsmessungen von isolierten retinalen Kapillaren und subendothelialen Matrizen der Maus zur Verfügung.

Protokoll

Alle Eingriffe an Tieren wurden in Übereinstimmung mit der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) für die Verwendung von Tieren in der Ophthalmologie- und Sehforschung durchgeführt und von den Institutional Animal and Care Use Committees (IACUC; Protokollnummer ARC-2020-030) an der University of California, Los Angeles (OLAW Institution Animal Welfare Assurance Number A3196-01) genehmigt. Das folgende Protokoll wurde mit Netzhautkapillaren durchgeführt, die von adulten (20 Wochen alten) männlichen C57BL/6J-Mäusen mit einem Gewicht von ~25 g (diabetische Mäuse) und ~32 g (nichtdiabetische Mäuse; Jackson Laboratory).

1. Isolierung von retinalen Kapillaren der Maus für die Messung der AFM-Steifigkeit (Tage 1-4)

HINWEIS: Dieses Protokoll, über das in einer kürzlich durchgeführten Studie^{berichtet wurde 4}, beschreibt die Enukleation und milde Fixierung des Mausauges, die Netzhautisolierung und den Trypsinverdau sowie die anschließende Montage des resultierenden retinalen Gefäßsystems auf Mikroskopieobjektträgern zur Messung der AFM-Steifigkeit.

1. Enukleation und milde Fixierung (Tag 1)
   1. Nachdem Sie die Maus mit Kohlendioxid-Exposition und anschließender Zervixluxation eingeschläfert haben, führen Sie eine Mikrozange hinter dem Augapfel ein, halten Sie den Muskelansatz fest und ziehen Sie das Auge vorsichtig heraus, ohne die Mikrozange zu fest einzuklemmen, was den Sehnerv durchtrennen könnte.
   2. Legen Sie das enukleierte Auge für 24 Stunden bei 4 °C in 5% (v/v) Formalin in PBS für eine milde Fixierung.
      HINWEIS: Basierend auf Erfahrung⁴ führen unfixierte oder leichter fixierte Augen zu fragilen Kapillaren, die während der AFM-Probenvorbereitung und der Steifigkeitsmessung fragmentiert werden.
2. Retinale Isolation (Tag 2)
   1. Platzieren Sie das fixierte Auge auf einem Blatt Wachspapier unter einem Präpariermikroskop. Halten Sie anschließend mit einer Mikrozange die Reste des Muskels und des Sehnervs an der Außenseite des hinteren Auges fest und richten Sie das Auge so aus, dass die Hornhaut zu einer Seite zeigt (Abbildung 1).
   2. Mit einer chirurgischen Klinge einen Schnitt 1-2 mm hinter und parallel zum Limbus (Hornhaut-Sklera-Übergang) vornehmen. Während Sie das Auge mit der Mikrozange an Ort und Stelle halten, üben Sie mit der Klinge eine Kraft nach unten aus und drücken Sie weiter, bis das vordere Segment des Auges vollständig vom hinteren Ende getrennt ist (Abbildung 1). Entsorgen Sie den vorderen Augenabschnitt und die Linse. Sägen Sie nicht hin und her, da dies zu Netzhautschäden führen kann.
   3. Übertragen Sie den hinteren Augenabschnitt (Sklera, Aderhaut und Netzhaut) in eine 6 cm große Schale, die mit PBS (pH 7,4) gefüllt ist.
   4. Mit einem Mikrospatel und gleichzeitigem sanften Halten des Sehnervs mit einer Mikrozange die Netzhaut aushöhlen. Lagern Sie die Netzhaut in einem 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, das PBS enthält, bei 4 °C bis zur Kapillarisolierung.
       
3. Netzhaut-Spülungen
   1. Um eine Netzhaut zu spülen, füllen Sie sechs Vertiefungen einer 12-Well-Platte mit 1 ml doppelt destilliertem H₂O (ddH₂O). Übertragen Sie anschließend mit einer umgekehrten Pasteurpipette die Netzhaut aus dem 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen in die erste Vertiefung.
   2. Spülen Sie die Netzhaut auf dem Orbitalschüttler 30 Minuten lang bei 120 U/min bei Raumtemperatur (RT) ab.
   3. Pipettieren Sie mit einer P1000-Pipette vorsichtig Wasser in der Nähe der Netzhaut auf und ab und blasen Sie Wasser auf die Netzhaut, um eine sanfte Bewegung zu verursachen.
   4. Übertragen Sie die Netzhaut mit der umgekehrten Glaspipette in die zweite Vertiefung und wiederholen Sie die Schritte 1.3.2 und 1.3.3 4 Mal, wobei jede Spülung in einer frischen (ddH₂O-haltigen) Vertiefung durchgeführt wird.
   5. Übertragen Sie schließlich die Netzhaut in die sechste Vertiefung und spülen Sie sie über Nacht (O/N) bei RT auf dem auf 100 U/min eingestellten Orbitalschüttler, um die Trennung der retinalen Neuroglia von den Blutgefäßen während der Trypsinverdauung zu erleichtern.
4. Retinale Trypsin-Verdauung (Tag 3)
   1. Bereiten Sie eine 10%ige (w/v) Trypsinlösung vor, indem Sie Trypsin 1:250 Pulver in Tris-Puffer (pH 8; 0,1 M) auflösen. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie das konische Röhrchen mehrmals umdrehen, um die Blasenbildung zu minimieren, die es schwieriger macht, die Trypsinlöslichkeit zu bestätigen.
   2. Die 10%ige Trypsinlösung in einem 37 °C warmen Wasserbad für 10-15 min äquilibrieren. Sobald sich das Trypsinpulver vollständig aufgelöst hat, filtrieren Sie die Lösung mit einem 0,2 μm Spritzenfilter.
   3. Geben Sie in eine 12-Well-Platte 2 ml/Well/Netzhaut der gefilterten 10%igen Trypsinlösung. Geben Sie etwas zusätzliche Trypsinlösung in die benachbarte Vertiefung (um die Glaspipettenwände für die nachfolgenden Schritte auszugleichen).
   4. Geben Sie 3 mL ddH₂O in drei Vertiefungen einer 6-Well-Platte (widmen Sie diese drei Vertiefungen einer Netzhaut).
   5. Führen Sie in ein konisches 15-ml-Röhrchen eine P200-Spitze ein, bevor Sie 4 ml der filtrierten 10%igen Trypsinlösung hinzufügen. Übertragen Sie diesen konischen Schlauch in das 37 °C warme Bad, damit die Spitze 2-3 Minuten lang in Trypsin eingeweicht werden kann, da dies verhindert, dass die Netzhaut in den letzten Schritten an den Spitzenwänden kleben bleibt.
   6. Nach der O/N-Spülung der Netzhaut (aus Schritt 1.3.5) pipettieren Sie mit einer P1000-Pipette vorsichtig Wasser neben der Netzhaut auf und ab, wobei Sie Wasser auf die Netzhaut spritzen, um eine sanfte Bewegung zu verursachen.
   7. Übertragen Sie die gespülte Netzhaut mit einer umgekehrten Glaspipette in die trypsinhaltige Vertiefung der 12-Well-Platte (aus Schritt 1.4.3). Stellen Sie sicher, dass die Netzhaut mit einer minimalen Menge an restlichem ddH₂O übertragen wird, um die Trypsinlösung nicht signifikant zu verdünnen. 3 h bei 37 °C inkubieren.
   8. Zentrieren Sie die mit Trypsin getränkte P200-Spitze (aus Schritt 1.4.5) auf dem Bereich des Sehnervs und pipettieren Sie vorsichtig das gesamte Gefäßnetz auf und ab, um das nichtvaskuläre Gewebe¹⁴ zu dissoziieren.
   9. Mit einer in Trypsin vorgespülten Invertglaspipette (durch 5-maliges Auf- und Abpipettieren von Trypsin) das retinale Gefäßsystem in die erste ddH₂O-haltige Vertiefung der 6-Well-Platte (aus Schritt 1.4.4) übertragen.
   10. Schwenken Sie die Platte und pipettieren Sie das Gefäßsystem mit einer mit Trypsin gespülten Glaspipette auf und ab, um restliches nicht-vaskuläres Gewebe zu entfernen.
   11. Übertragen Sie das retinale Gefäßsystem mit der Glaspipette in die zweite ddH2O-haltige Vertiefung der 6-Well-Platte und lagern Sie es bei 4 °C, bis es für die AFM-Steifigkeitsmessung auf dem Objektträger montiert wird.
       HINWEIS: Das hydratisierte retinale Gefäßsystem (bei PBS) ist bei 4 °C bis zu 2 Wochen lang strukturell intakt. Routinemäßige Steifigkeitsmessungen sollten jedoch an frisch isolierten Kapillaren durchgeführt werden.
5. Befestigung des retinalen Gefäßsystems für die Messung der AFM-Steifigkeit (Tag 4)
   1. Übertragen Sie das retinale Gefäßsystem mit einer invertierten Trypsin-gespülten Glaspipette in die dritte ddH₂O-haltige Vertiefung der 6-Well-Platte, um alle verbleibenden Trypsinlösungen zu entfernen.
   2. Reinigen Sie gründlich (mit ddH₂O und Wischergewebe) einen geladenen Oberflächenmikroskopie-Objektträger, der für die Montage des Gefäßnetzwerks für die Messung der AFM-Steifigkeit verwendet wird.
      HINWEIS: Die geladene Oberfläche des Objektträgers sorgt für eine starke Bindung des Gefäßnetzes während der AFM-Messung.
   3. Beschriften Sie die Folie und zeichnen Sie mit einem hydrophoben Stift einen 4-5 cm breiten kreisförmigen Bereich um die Mitte, um ein Verschütten von Wasser in den folgenden Schritten zu vermeiden.
   4. Übertragen Sie das retinale Gefäßsystem vorsichtig mit einer mit Trypsin gespülten Glaspipette in die Mitte des markierten Bereichs.
   5. Entfernen Sie mit einer P200-Pipette vorsichtig so viel überschüssiges Wasser wie möglich von einer Kante, ohne versehentlich das Gefäßsystem in die Spitze zu saugen.
   6. Legen Sie die Rutsche in eine Biosicherheitswerkbank (BSL-2 Haube) nahe der Vorderseite (gefiltertes Gewebe) und lassen Sie das Restwasser verdunsten.
   7. Sobald das Gefäßsystem fast trocken ist, rehydrieren Sie es vorsichtig unter einem Phasenkontrastmikroskop (4-fache Vergrößerung), indem Sie ddH₂O mit einer P200-Pipette langsam auf eine Seite des markierten Bereichs geben. Die direkte Zugabe von ddH₂O auf das Gefäßsystem führt dazu, dass es sich ablöst.
   8. Nehmen Sie Phasenkontrastbilder des rehydrierten Gefäßsystems bei 4- und 20-facher Vergrößerung auf, um sicherzustellen, dass es eine gute strukturelle Integrität aufweist und richtig ausgebreitet (nicht auf sich selbst gefaltet) und am Objektträger befestigt ist, was ein wesentliches Kriterium für eine zuverlässige Messung der AFM-Steifigkeit ist.

2. Gewinnung einer subendothelialen Matrix aus retinalen mikrovaskulären Endothelzellkulturen (REC) (Tage 1-17)

HINWEIS: Dieses Protokoll, adaptiert von Beacham et al.¹⁵ und in neueren Studien^{berichtet 4,5,6}, beschreibt die REC-Kultur auf modifizierten Glasdeckgläsern, gefolgt von einer Dezellularisierung, um eine subendotheliale Matrix für die anschließende Messung der AFM-Steifigkeit zu erhalten.

1. Vorbereitung von gelatinebeschichteten Glasdeckgläsern und Zellbeschichtung (Tag 1)
   HINWEIS: Führen Sie die Gelatinebeschichtung und die nachfolgenden PBS⁺⁺-Spülschritte in einer Gewebekulturhaube durch, bevor Sie für die nachfolgenden Schritte der Glutaraldehyd- und Ethanolaminbehandlung zu einer chemischen Abzugshaube wechseln.
   1. Legen Sie ein autoklaviertes rundes Glasdeckglas mit einem Durchmesser von 12 mm auf eine Mulde einer sterilen 24-Well-Platte und fügen Sie 500 μl vorgewärmte sterile 0,2 % (w/v) Gelatine hinzu (verdünnt in PBS mit Kalzium und Magnesium; PBS⁺⁺) zu jeder Vertiefung mit Deckglas. 1 h bei 37 °C inkubieren.
   2. Aspirieren Sie die Gelatinelösung, spülen Sie die Deckgläser einmal mit sterilem PBS⁺⁺ ab und vernetzen Sie die beschichtete Gelatine durch Zugabe von 500 μl 1% (v/v) Glutaraldehyd für 30 min bei RT.
   3. Sammeln und entsorgen Sie die Glutaraldehydlösung ordnungsgemäß (gemäß den institutionellen Richtlinien), bevor Sie die Deckgläser 5 Minuten lang mit PBS⁺⁺ auf einem Orbitalschüttler bei 100 U/min in RT spülen. Wiederholen Sie diesen Spülschritt 5 Mal. Heben Sie während der ersten drei Spülgänge die Deckgläser mit einer sterilen Pinzette an, um das Glutaraldehyd gründlich abzuspülen. Jede Restmenge kann die Lebensfähigkeit der Zellen verringern.
   4. Geben Sie 800 μl 1 M Ethanolamin für 30 min bei RT in das gelatinevernetzte Deckglas, um alle verbleibenden Spuren von Glutaraldehyd in der Vertiefung zu löschen.
   5. Sammeln und entsorgen Sie die Ethanolaminlösung ordnungsgemäß (gemäß den institutionellen Richtlinien) und spülen Sie die Deckgläser 5 Mal mit PBS⁺⁺ für 5 Minuten auf einem Orbitalschüttler bei 100 U/min in RT. Heben Sie während der ersten drei Spülgänge die Deckgläser mit einer sterilen Pinzette an, um das Ethanolamin gründlich spülen zu können. Jede Restmenge kann die Lebensfähigkeit der Zellen verringern.
   6. Die vernetzten Deckgläser sind nun bereit für die Zellbeschichtung.
      HINWEIS: Obwohl wir Zellen routinemäßig unmittelbar nach der Deckglasvorbereitung plattieren, kann es sich lohnen, die Zellbeschichtung auf vernetzten Gelatine-Deckgläsern zu vergleichen, die 1-2 Tage lang in PBS⁺⁺ bei 4 °C gelagert wurden.
   7. Unter sterilen Bedingungen in einer Gewebekulturhaube werden retinale mikrovaskuläre Endothelzellen (RECs) in 500 μl Medium/Well mit einer Dichte plattiert, die innerhalb von 24 h eine Konfluenz von 100 % erreicht, wie durch Phasenkontrastmikroskopie bestätigt wurde.
      HINWEIS: Das Erreichen der Konfluenz innerhalb von 24 Stunden ist wichtig, da die resultierende REC-Ruhe die Fähigkeit der Zellen erhöht, Matrix zu sezernieren (siehe den folgenden Schritt). Nach unserer Erfahrung mit humanen RECs ist eine Plattierungsdichte von 4 x 10⁴ Zellen/^cm2 ausreichend, um innerhalb von 24 h eine Konfluenz zu erreichen. Da die REC-Größe jedoch je nach Spezies variiert (z. B. sind Maus-RECs deutlich kleiner), muss die anfängliche Plattierungsdichte möglicherweise optimiert werden.
2. Produktion subendothelialer Matrix durch REC-Kultur (Tag 2-16)
   1. Nachdem die Zellen die Konfluenz erreicht haben (~24 h), ersetzen Sie das Kulturmedium durch frisches Medium, das mit sterilfiltrierter Ascorbinsäure (Endkonzentration von 200 μg/ml) ergänzt wird.
      HINWEIS: Jede REC-Behandlung mit Krankheitsrisikofaktoren (z. B. hoher Glukosespiegel, fortgeschrittene Glykationsendprodukte usw.) oder pharmakologischen Wirkstoffen kann jetzt zusammen mit der Ascorbinsäurebehandlung beginnen.
   2. Wechseln Sie das mit Ascorbinsäure ergänzte Nährmedium 15 Tage lang jeden zweiten Tag.
      HINWEIS: Ascorbinsäure ist in Lösung instabil. Bereiten Sie jeden zweiten Tag frische 100X-Stammlösung für eine mittlere Supplementierung zu.
3. Dezellularisierung von REC-Kulturen zur Gewinnung der subendothelialen Matrix (Tag 16)
   1. Entfernen Sie nach 15 Tagen Ascorbinsäure-Behandlung das Medium und spülen Sie die Zellen mit kalzium-/magnesiumfreiem PBS.
   2. Dezellularisieren Sie die REC-Kulturen durch Zugabe von 250 μl/pro Vertiefung warmem Dezellularisierungspuffer (20 mM Ammoniumhydroxid und 0,5 % Triton X-100 in PBS) für ~2-3 Minuten. Bestätigen Sie die Entnahme der Zellen unter einem Phasenkontrastmikroskop (10-fache Vergrößerung).
   3. Entfernen Sie vorsichtig den Dezellularisierungspuffer, ohne die REC-sezernierte subendotheliale Matrix zu stören, und geben Sie 0,5 ml PBS in jede Vertiefung.
      HINWEIS: Um sicherzustellen, dass sich die subendotheliale Matrix während dieses und der nachfolgenden Spülschritte nicht ablöst, führen Sie eine sanfte Spülung nur mit einer P1000-Pipette durch. Führen Sie keine Vakuumabsaugung durch.
   4. Lagern Sie die Platten über Nacht bei 4 °C, um die REC-sezernierte Matrix zu stabilisieren.
4. DNase-Behandlung der subendothelialen Matrix zur Entfernung von Zelltrümmern (Tag 17)
   1. Spülen Sie die subendotheliale Matrix aus Schritt 2.3.4 mit 800 μl PBS/Well.
   2. Entfernen Sie das PBS vorsichtig und inkubieren Sie die Matrix mit 200 μl RNase-freier DNase I (30 K Einheiten) bei 37 °C für 30 Minuten, um alle Spuren von Zelltrümmern zu entfernen. Überprüfen Sie die Wirksamkeit der DNase-Behandlung, indem Sie unter einem Phasenkontrastmikroskop sorgfältig nach Zelltrümmern suchen.
   3. Entfernen Sie vorsichtig die DNase I-Lösung und spülen Sie die subendotheliale Matrix zweimal mit 800 μl PBS/Well.
   4. Prüfen Sie, ob die makroskalige fibröse subendotheliale Matrix unter einem Phasenkontrastmikroskop (10-fache Vergrößerung) sichtbar ist. Die Visualisierung der feineren nanoskaligen Matrixfasern erfordert topographisches AFM-Scanning oder hochauflösende konfokale Bildgebung von immunmarkierten Matrixproteinen bei 100-facher Vergrößerung.
   5. Verwenden Sie sofort die frische (unfixierte) subendotheliale Matrix für die Messung der AFM-Steifigkeit.
   6. Nach der AFM-Messung werden die Matrixproben mit 1 % (v/v) Paraformaldehyd fixiert (15 min bei Raumtemperatur) und bei 4 °C gelagert, um die Immunmarkierung mit Antikörpern gegen subendotheliale Matrixproteine und/oder vernetzende Enzyme zu ermöglichen.

3. Messung der AFM-Steifigkeit

HINWEIS: Dieses Protokoll, das an ein Standard-AFM-Benutzerhandbuch angepasst und in neueren Studien^{berichtet wurde 4,5}, beschreibt die Erfassung und Analyse von Steifigkeitsdaten aus retinalen Kapillaren und subendothelialen Matrizen unter Verwendung einer AFM- und Datenanalysesoftware. Obwohl die unten beschriebenen Schritte auf einem bestimmten AFM-Modell basieren (siehe Materialtabelle), sind die zugrunde liegenden Prinzipien im Allgemeinen auf alle AFM-Modelle anwendbar.

1. Auswahl der Cantilever-Sonde
   HINWEIS: Weiche biologische Proben erfordern weiche Ausleger, die sich beim Eindrücken der Probe biegen können, während die Sondenabmessungen so gewählt werden, dass sie den Abmessungen der Probe entsprechen.
   1. Für die Steifigkeitsmessung von Netzhautgefäßen der Maus mit einem Durchmesser von 5 bis 8 μm ist eine Cantilever-Sonde mit einem Radius von 1 μm und einer Federkonstante (k) von 0,2 bis 0,3 N/m zu verwenden. Für die Steifigkeitsmessung einer subendothelialen Matrix, die aus nanoskaligen Fasern besteht, verwenden Sie eine Cantilever-Sonde mit einem Radius von 70 nm und einer Federkonstante (k) von 0,06-0,1 N/m.
2. Kragarm-Montage
   1. Öffnen Sie auf dem AFM-Computer die Software, die das AFM-Gerät und die Kamera steuert, die an ein Phasenkontrastmikroskop angeschlossen ist, das zur Visualisierung des Auslegers und der Probe verwendet wird.
   2. Befestigen Sie den Auslegerhalter auf dem Ausleger und montieren Sie den ausgewählten Ausleger mit einer Uhrmacherzange unter einem Stereoskop auf den Halter, ohne den Ausleger physisch zu beschädigen. Ziehen Sie die Schraube an der Halterung fest, um den Ausleger zu sichern.
   3. Setzen Sie den Auslegerhalter auf den AFM-Kopf, der auf dem Ständer ruht, und verriegeln Sie ihn.
   4. Ziehen Sie den AFM-Kopf mit der Schrittmotorfunktion in der AFM-Software auf den höchsten Punkt zurück und stellen Sie diese Position in der Software auf Nullpunkt ein. Dieser Schritt verhindert, dass der AFM-Ausleger versehentlich auf den Probentisch trifft, während der AFM-Kopf montiert wird (nächster Schritt).
   5. Heben Sie den AFM-Kopf vorsichtig von seinem Ständer und montieren Sie ihn auf dem AFM-Probentisch, indem Sie die Beine in die entsprechenden Schlitze stecken.
3. Laserausrichtung
   HINWEIS: Die anfängliche Laserausrichtung wird ohne Probe (d. h. im Luftmodus) durchgeführt, da sie eine genauere Ausrichtung des Laserstrahls auf der Cantilever-Spitze gewährleistet (durch Verhinderung der Laserbrechung in Flüssigkeit). Da biologische Proben jedoch in ein Medium getaucht werden, das einen anderen Brechungsindex als Luft hat, ist es wichtig, den Laser vor der Steifigkeitsmessung im Medium neu auszurichten.
   1. Für die Laserausrichtung in der Luft platzieren Sie den AFM-Kopf auf dem Probentisch und verwenden Sie das 10-fach-Objektiv und die daran angebrachte Kamera, um den Cantilever-Effekt auf dem Monitor im Live-Modus zu visualisieren. Der Infrarotlaser ist für den Benutzer unsichtbar, aber mit einer CCD-Kamera sichtbar.
   2. Wählen Sie in der Software die Funktion Kontaktmodus-Kraftspektroskopie aus und öffnen Sie das Fenster mit dem Titel Laserausrichtung.
   3. Fokussieren Sie den Laserstrahl mit den beiden Schrauben, die am AFM-Kopf mit dem Laser lateral markiert sind, so auf den Cantilever, dass der SUM-Wert im Laserausrichtungsfenster am höchsten ist. Um dies zu erreichen, fokussieren Sie den Laser auf oder um die Mitte des Auslegers.
   4. Stellen Sie den Fotodetektor mit den Einstellschrauben des Detektors so ein, dass sich der Laserpunkt in der Mitte des Laserausrichtungsfensters befindet.
   5. Stellen Sie den Spiegel mit der Spiegeleinstellschraube so ein, dass der SUMME-Wert auf dem höchstmöglichen Wert liegt.
      HINWEIS: Ein hoher SUM-Wert gewährleistet eine empfindliche und genaue Beurteilung der Probensteifigkeit. Daher sollten sowohl die Laserausrichtung als auch die Spiegeljustierschritte durchgeführt werden, um den höchsten SUMMEN-Wert zu erhalten.
   6. Geben Sie als Nächstes für die Laserausrichtung in Flüssigkeit das gewünschte Nährmedium in eine Schale und montieren Sie es fest auf dem Tisch, um Vibrationen oder Drift zu vermeiden, die während des Probeneindrucks Messartefakte erzeugen.
   7. Während Sie die Live-Kamera betrachten, die auf den Ausleger fokussiert ist, senken Sie ihn mit der Schrittmotorfunktion in die Flüssigkeit ab.
   8. Wiederholen Sie die Schritte 3.3.4 und 3.3.5, um sicherzustellen, dass der SUMME-Wert am höchsten bleibt und sich der Laserpunkt in der Mitte des Laserausrichtungsfensters befindet.
4. Kalibrierung der Cantilever-Federkonstante
   HINWEIS: Obwohl Cantilever-Sonden mit einer vom Hersteller kalibrierten Federkonstante (k) geliefert werden, empfiehlt es sich, ihren Wert (in Flüssigkeit) vor Beginn einer Messung unabhängig zu überprüfen. Verwenden Sie eine saubere Glasoberfläche, die Wechselwirkungen zwischen der Cantilever-Sonde und der Glasoberfläche minimiert.
   1. Die vom Ausleger aufgebrachte Sollkraft legt die maximale Laserablenkung vom Ausleger fest, die für einen Krafteindruck zulässig ist. Stellen Sie ihn zunächst auf 1,5 V ein. Wenn sich der Ausleger bei dieser gegebenen Sollkraft nicht nähert, erhöhen Sie ihn schrittweise, bis er die Probe einkerbt und eine Krafteindruckkurve erzeugt.
   2. Die Z-Länge gibt den maximalen Abstand an, um den sich der Z-Piezo zurückzieht, nachdem der Cantilever beim Probeneindruck den Sollwert erreicht hat. Die Z-Länge sollte mindestens ausreichend sein, um sicherzustellen, dass sich die Cantilever-Sonde sauber von der Probe trennt. Für die Kalibrierung der Federkonstante auf einer Glasoberfläche ist die Z-Länge auf 1 μm einzustellen.
   3. Die Z-Geschwindigkeit bezieht sich auf die Geschwindigkeit, mit der der Z-Piezo den Cantilever-Kondensator während des Krafteindrucks senkrecht nach unten in Richtung Probe bewegt. Es sollte optimiert werden, da eine sehr niedrige Geschwindigkeit in erster Linie das viskose Verhalten der Probe erfasst, während eine sehr hohe Geschwindigkeit hauptsächlich das elastische Verhalten erfasst. Es wird erwartet, dass die optimale Geschwindigkeit die wahre viskoelastische Natur biologischer Proben erfasst. Stellen Sie die Z-Geschwindigkeit für die viskoelastischen biologischen Proben auf 2 μm/s ein.
   4. Die Zielhöhe im Z-Bereich gibt den ungefähren Abstand von der Probe an, in dem sich der Z-Piezo nach der Messung eines Kraftverlaufs und vor dem Bewegen an eine andere Position auf der Probe befindet. Die Zielhöhe des Z-Bereichs sollte größer sein als die Höhe der Beispiel-Features. Stellen Sie die Zielhöhe im Z-Bereich auf 7,5 μm ein.
   5. Bringen Sie den Cantilever-Motor mit der Schrittmotor-Funktion ziemlich nah an die Probenoberfläche heran (gemessen am Fokus im Phasenkontrastbild bei 10-facher Vergrößerung), bevor Sie die Annäherungsfunktion im Fenster der Kontaktmodus-Kraftspektroskopie auswählen, um den Cantilever in kleineren Schritten von 15 μm nach unten zu bringen.
   6. Klicken Sie auf Erfassen , um eine Kraftkurve zu erfassen.
   7. Wählen Sie die Kraftkurve aus, öffnen Sie sie im Fenster des Kalibrierungs-Managers und wählen Sie im Methodenbereich Kontaktbasierter Modus .
   8. Wählen Sie mit der Funktion "Bereich auswählen " die Ausleger-Rückzugskurve für eine lineare Kurvenanpassung aus. Aktivieren Sie anschließend das Kontrollkästchen Empfindlichkeit , um die Krafteinheit von V in N umzuwandeln.
   9. Heben Sie den Ausleger um 100-200 μm in der Flüssigkeit an und wählen Sie die Funktion Thermal Noise . Passen Sie auch hier mit Select Fit Range die Glockenkurve des thermischen Rauschens an eine Lorentzkurve an. Wählen Sie nach der Kurvenanpassung das Feld Federkonstante (k) aus. Vergewissern Sie sich, dass die Federkonstante (k) nahe am Herstellerwert liegt, und notieren Sie sie zum späteren Nachschlagen. Nach der Kalibrierung ändert sich die Einheit für den Sollwert von mV auf nN.
      HINWEIS: Thermisches Rauschen ist die Eigenfrequenz des Auslegers bei einer bestimmten Temperatur. Für eine genaue Messung der Federkonstante ist eine Korrektur des thermischen Rauschens erforderlich.
5. Erfassung von Kraft-Weg-Kurven
   1. Platzieren Sie die auf dem Objektträger montierte Probe (Netzhautgefäße oder subendotheliale Matrix) auf dem AFM-Tisch und wählen Sie im Experimentbereich der Software die Option Kontaktmodus-Kraftspektroskopie .
   2. Stellen Sie die Sollkraft auf 0,5 nN ein und klicken Sie auf den Anflug, der deutlich höher ist als die thermische Ablenkung der Cantilever-Sonden SAA-SPH 1 μm und PFQNM-LC-A 70 nm, was eine gleichmäßige Cantilever-Annäherung an die Probe gewährleistet.
   3. Nachdem der Cantilever die Oberfläche erkannt hat und auf seine Ruhezielhöhe zurückgekehrt ist, wird der Sollwert auf 0,2 nN für die steifere SAA-SPH 1 μm Cantilever-Sonde oder 0,1 nN für die weichere PFQNM-LC-A 70 nm Cantilever-Sonde festgelegt. Diese Sollwerteinstellung stellt sicher, dass sich sowohl steife als auch weiche Ausleger während des Probeneindrucks leicht biegen (siehe Abschnitt 3.1).
   4. Stellen Sie die Z-Länge auf ~2,5 μm ein, um eine saubere Trennung der Cantilever-Sonde von biologischen Proben während des Rückzugs zu gewährleisten (siehe Schritt 3.4.2) und die Z-Geschwindigkeit auf 2 μm/s (siehe Schritt 3.4.3).
   5. Positionieren Sie die Cantilever-Sonde mit den Tischschrauben am AFM-Tisch vorsichtig an einer gewünschten Stelle auf der Probe.
      HINWEIS: Da sich die Kapillaren nicht immer flach auf dem Objektträger ausbreiten, ist es sicher, den Cantilever weitere 10-20 μm von seiner Ruhezielhöhe zurückzuziehen, bevor der Tisch bewegt wird.
   6. Klicken Sie auf Annäherung , um den Cantilever-Ausleger zuerst näher an die Probe zu bringen, und klicken Sie dann auf Erfassen , um die Kraftkurven für die gewünschten Positionen zu erfassen. Speichern Sie alle Kraftverläufe für die Analyse.
6. Datenanalyse
   1. Öffnen Sie die Kraftkurve in der Datenverarbeitungssoftware.
   2. Wählen Sie die Rückzugskraftkurve für die Datenanalyse aus (ähnlich wie in Schritt 3.4.8).
   3. Mit der Datenglättungsfunktion glätten Sie die Kraftkurve mit einem Gaußschen Filter, um das unerwünschte Rauschen in den erfassten Daten zu entfernen.
   4. Passen Sie mit der Subtraktionsfunktion Basislinie den Wert der Steigung und den Betrag des (berührungslosen) Basislinienanteils der Kraftkurve auf Null an.
   5. Klicken Sie auf die Funktion Kontaktpunkt , um den Kontaktpunkt der Kraftkurve automatisch auf die Koordinaten (0,0) auf der X- und Y-Achse zu bringen.
   6. Berechnen Sie mit der Funktion "Position der vertikalen Spitze " die tatsächliche vertikale Position des Auslegers auf der Y-Achse, indem Sie alle Probeneindrücke korrigieren.
   7. Wenden Sie auf die verarbeitete Kraftkurve die Funktion "Elastizitätsanpassung " an, indem Sie zuerst die Spitzenform und den Radius auswählen (basierend auf dem ausgewählten Cantilever-Tastkopf), gefolgt von der Kraftkurvenanpassung mit dem Hertz/Sneddon-Modell.
      1. Wenn die Matrixeindrücke durch die Sonde mit einem Radius von 70 nm 70 nm überschreitet, was normalerweise der Fall ist, wählen Sie die Form der Paraboloidspitze . Bei der Messung der Kapillarsteifigkeit überschreitet der Probeneindruck mit der Sonde mit einem Radius von 1 μm nie 1 μm, wählen Sie daher die Form der Kugelspitze . Wenn der Kontaktpunkt der angepassten Kurve nicht mit dem Kontaktpunkt der tatsächlichen Rückzugskurve übereinstimmt, aktivieren Sie das Kontrollkästchen Kurve verschieben .
   8. Notieren und speichern Sie den Wert des Elastizitätsmoduls (Steifigkeit).

Ergebnisse

Netzhautkapillaren der Maus
Die Messung der AFM-Steifigkeit isolierter Netzhautkapillaren umfasst Schritte bei der Probenhandhabung, die möglicherweise ihre mechanostrukturelle Integrität beeinträchtigen könnten. Um dies zu verhindern und damit die Durchführbarkeit, Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit von AFM-Messungen zu gewährleisten, werden die enukleierten Augen vor der Gefäßisolierung über Nacht bei 4 °C in 5 % Formalin fixiert. Dieses milde Fixierungsprotokoll mit reduzierter Formalinkonzentration, niedriger Fixierungstemperatur, begrenzter Fixierungszeit und fehlender Hornhautpunktion wurde entwickelt, um mögliche Vernetzungs-/Versteifungsartefakte, die durch chemische Fixierung verursacht werden, zu minimieren. Wie in Abbildung 2B,C gezeigt, stellt diese relativ milde Fixierung sicher, dass das isolierte retinale Gefäßsystem strukturell robust und ausreichend langlebig für die AFM-Messung ist. Im Gegensatz dazu werden retinale Gefäße^, die aus nicht fixierten Augen (mit der hypotonen Methode)4 oder kurzzeitig fixierten Augen (für 8 h) isoliert wurden, fragmentiert oder kollabieren, wodurch sie für die AFM-Messung ungeeignet sind (Abbildung 2B).

Retinale subendotheliale Matrix
Die Gefäßsteifigkeit spiegelt die kombinierte Steifigkeit der Gefäßzellen und der Basalmembran (subendotheliale Matrix) ^wider4. Da sich Zellen an die Matrixsteifigkeit anpassen, indem sie eine ähnliche Änderung ihrer eigenen Steifigkeit erfahren, wird ein Prozess, der als mechanische Reziprozität⁹ bezeichnet wird, die subendotheliale Matrixsteifigkeit, zu einer wichtigen Determinante für die gesamte Gefäßsteifigkeit. Für die Messung der Matrixsteifigkeit ist es wichtig, eine homogen dichte subendotheliale Matrix zu erhalten. Bei humanen retinalen ECs, die in ascorbinsäure-supplementiertem Kulturmedium gezüchtet werden, dauert dies in der Regel 10-15 Tage (Abbildung 3A)^4,5,6. Dieser Unterschied in der Kulturperiode kann auf Chargenunterschiede bei kommerziell erhältlichen primären retinalen ECs zurückzuführen sein. Darüber hinaus stellen wir im Allgemeinen fest, dass kommerziell erhältliche retinale ECs von C57BL/6-Mäusen im Vergleich zu primären humanen retinalen EC-Kulturen eine dichtere Matrix ablagern, was auf speziesspezifische Unterschiede hinweist. Wie in Abbildung 3A gezeigt, bieten Phasenkontrastbilder nur eine grobe Ansicht der Matrix auf Makroebene. Die feinere nano- bis mikroskalige fibrilläre Struktur wird jedoch in hochauflösenden konfokalen Fluoreszenzbildern der mit Antikörpern gegen die Matrixstrukturproteine Kollagen IV und Fibronektin immunmarkierten Matrix deutlich (Abbildung 3B). Es sollte beachtet werden, dass diese Matrixproteine auch lehrreiche Hinweise für Endothelzellen liefern, indem sie an spezifische Integrinrezeptoren binden⁹.

Messung der AFM-Steifigkeit
Die Auswahl der geeigneten Cantilever-Steifigkeit (Federkonstante, k) und Sondenabmessung ist für zuverlässige und empfindliche Messungen unerlässlich. Diese Parameter sollten so gewählt werden, dass sie der Steifigkeit und den Abmessungen der biologischen Probe entsprechen. Nachdem der ausgewählte Ausleger auf dem AFM montiert wurde, muss der Infrarot-Laserstrahl auf die Spitze des Auslegers fokussiert werden, und der reflektierte Laserpunkt muss auf dem Photodetektor zentriert werden. Diese Laserausrichtung gewährleistet eine präzise und empfindliche Detektion der Auslenkung und damit die Steifigkeitsmessung. Eine AFM-Steifigkeitsmessung beginnt damit, dass der Z-Piezo den Cantilever senkrecht nach unten in Richtung der Probe bewegt. Zu diesem Zeitpunkt gibt es keine Auslenkung des Auslegers, was zu einer flachen Grundlinie der Annäherungskurve führt (Abbildung 4A). Wenn die Cantilever-Sonde die Probe berührt und einkerbt, biegt sich der Cantilever, was zu einer Laserablenkung auf dem Photodetektor führt, die durch die vertikale Ablenkung der Annäherungskurve dargestellt wird. Nach dem Aufbringen einer voreingestellten Eindringkraft (Sollkraft) auf die Probe fährt der Ausleger in die Ausgangsposition (Z-Zielhöhe) von der Probe weg zurück. Die abgelenkte Rückzugskurve wird dann an das Hertz/Sneddon-Modell angepasst, um den Elastizitätsmodul (Steifigkeit) der Probe zu berechnen.

Aus der repräsentativen Krafteindringmessung, die in Abbildung 4 gezeigt wird, wird deutlich, dass die Annäherungs- und Retraktionskurven einer Netzhautkapillare, die von einer diabetischen Maus isoliert wurde (Abbildung 4B), wesentlich steiler sind als die einer nicht-diabetischen Maus (Abbildung 4A). Die steilere Steigung der Krafteindringkurven deutet auf eine größere Auslenkung des Auslegers hin, die durch einen höheren Widerstand der Probe gegen den Krafteindruck verursacht wird, was eine höhere Probensteifigkeit^{widerspiegelt 13}. Tatsächlich zeigte die anschließende Datenanalyse mehrerer Krafteindruckkurven, dass die retinalen Kapillaren der Maus bei Diabetes signifikant steifer werden⁴. Es sollte auch beachtet werden, dass der Kontakt zwischen der Cantilever-Sonde und biologischen Proben häufig eine unspezifische Oberflächenadhäsion verursacht, die zu einer negativen Cantilever-Auslenkung während der Retraktion führt, wie aus der Verlängerung der Retraktionskurve über die Basislinie hinaus zu sehen ist (Abbildung 4B). Darüber hinaus sind biologische Proben wie Zellen, Matrix und Blutgefäße von Natur aus viskoelastisch und können daher nach einer Krafteindringung eine bleibende Verformung und/oder Änderung der scheinbaren Steifigkeit erfahren. Wenn ja, spiegelt sich dies in der Fehlausrichtung von Anfahr- und Retraktionskurve (Hysterese) wider. In der Tat bestätigt der Vergleich von Abbildung 4A und Abbildung 4B den erwarteten Trend, bei dem die Krafteinkerbung weicherer Kapillaren bei nicht-diabetischen Mäusen eine größere Hysterese hervorruft als bei ihren steiferen Gegenstücken. Wie bereits berichtet ^5,6, wird auch die Steifigkeit (Elastizitätsmodul) von subendothelialen Matrizen, die aus retinalen EC-Kulturen gewonnen wurden, auf die oben genannte Weise berechnet.

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Schnitts an einem Mausauge zur Netzhautisolierung. Mit einer Pinzette, um den Sehnerv zu halten, wird mit einem Skalpell ein vollständiger Schnitt hinter dem Limbus vorgenommen, um die Netzhaut der Maus von der Linse und der Vorderkammer zu trennen. Die violette gestrichelte Linie zeigt die Position des vertikalen Schnitts. Dieses Schema wurde mit einer wissenschaftlichen Bild- und Illustrationssoftware gezeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Protokolloptimierung für die Isolierung intakter Maus-Netzhautgefäße für die AFM-Messung. (A) Das Stereoskopbild zeigt eine intakte Netzhaut, die vor den Kapillarisolationsschritten aus einem leicht fixierten Mausauge isoliert wurde. Maßstabsbalken: 2 mm. (B) Repräsentative Phasenkontrastbilder bei 4-facher Vergrößerung zeigen retinale Gefäße der Maus, die mit den verschiedenen Isolationsmethoden gewonnen wurden. Beim Vergleich der strukturellen Integrität und Haltbarkeit der isolierten Gefäße zeigte sich, dass der Trypsinverdau von Netzhäuten aus enukleierten Augen, die 24 h lang bei 4 °C in 5 % Formalin fixiert waren (roter Kasten), das am besten geeignete retinale Gefäßsystem für die Messung der AFM-Steifigkeit ergab. Netzhautgefäße, die mit dieser Methode isoliert wurden, wiesen ein klares Gefäßnetz auf, das sich gleichmäßig entlang der Glasoberfläche ausbreitete. Maßstabsbalken: 500 μm. (C) Die Ansicht eines intakten retinalen Kapillarnetzwerks mit hoher Vergrößerung (20x), ähnlich dem in (B) gezeigten, bestätigt die hohe strukturelle Integrität von Kapillaren, die aus leicht fixierten Augen gewonnen werden. Maßstab: 100 μm. Diese Zahl wurde von⁴ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Dezellularisierte Matrizen, die aus primären REC-Kulturen von Mensch und Maus gewonnen wurden. (A) Repräsentative Phasenkontrastbilder bei 20-facher Vergrößerung, die subendotheliale Matrixaggregate auf Glasdeckgläsern nach der Dezellularisierung von 10-Tage- (10 d) oder 15-Tage-(15 d) Kulturen von Human- oder Maus-RECs zeigen. Maßstabsbalken: 100 μm. (B) Repräsentative konfokale Fluoreszenzbilder mit hoher Vergrößerung (100x) von dezellularisierten Matrizen, die aus 15-Tage-Human-REC-Kulturen gewonnen und mit Anti-Kollagen-IV- und Anti-Fibronektin-Antikörpern markiert wurden, zeigen ein dichtes nanofibrilläres Kollagen IV und Fibronektinmatrix. Maßstab: 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Kraftabstandskurven aus der AFM-Steifigkeitsmessung von retinalen Kapillaren der Maus. Liniendiagramme zeigen eine repräsentative Annäherungs- (helle Farbe) und Retraktionskurve (dunkle Farbe) von einer einzelnen Krafteindruckmessung an einer Stelle einer Netzhautkapillare der Maus, die von einer (A) nichtdiabetischen oder (B) diabetischen Maus isoliert wurde. Die Kraftkurven, die mit einer halbkugelförmigen Cantilever-Sonde SAA-SPH mit einem Radius von 1 μm erhalten wurden, stellen die Beziehung zwischen dem Cantilever-Probenabstand (gesteuert durch den z-Piezo) und der aufgewendeten vertikalen Kraft dar, die die Cantilever-Ablenkung verursacht. (A) Der gelbe Pfeil zeigt die Z-Piezo-gesteuerte Cantilever-Annäherung an die Probe an, der weiße Pfeil zeigt den Kontaktpunkt an, an dem die Cantilever-Sonde mit der Probe in Kontakt kommt, und der grüne Pfeil zeigt die Cantilever-Auslenkung bis zu einer Soll-Eindringkraft (Spitze) (*) an. (B) Sowohl die Annäherungs- als auch die Retraktionskurve einer retinalen Kapillare, die von diabetischen Mäusen isoliert wurde, weisen eine deutlich steilere Steigung auf als die ihrer nicht-diabetischen Gegenstücke (siehe A), was auf eine höhere Kapillarsteifigkeit bei diabetischen Mäusen hinweist. Die Pfeilspitze zeigt eine Vertiefung der Rückzugskurve unter die Basislinie, die die negative Ablenkung der Cantilever-Sonde widerspiegelt, die durch die Adhäsion zwischen Sonde und Probe während des Eindrucks verursacht wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

AFM wird häufig zur Messung krankheitsassoziierter Veränderungen der Steifigkeit größerer Gefäße wie der Aorta und der Arterien eingesetzt¹⁶. Diese Erkenntnisse haben dazu beigetragen, die Rolle der endothelialen Mechanobiologie bei kardiovaskulären Komplikationen wie Atherosklerose zu etablieren¹⁷. Basierend auf diesen Erkenntnissen haben wir begonnen, die bisher unerkannte Rolle der endothelialen Mechanobiologie bei der Entwicklung retinaler mikrovaskulärer Läsionen in der frühen DR zu untersuchen. Der Erfolg in diesem Bestreben hängt jedoch von der genauen Messung von diabetesinduzierten Veränderungen der retinalen Kapillarsteifigkeit ab. Neuere Studien haben gezeigt, dass ähnlich wie bei großen Gefäßen auch die Steifigkeit der retinalen Kapillaren und der retinalen EC-sezernierten subendothelialen Matrix mit dem AFM ^4,5,6 direkt, genau und zuverlässig gemessen werden kann.

Bei diesem Ansatz werden retinale Kapillaren der Maus aus leicht fixierten Augen mittels Trypsinverdau isoliert. Erfahrungsgemäß ist dieser sanfte Fixationsschritt notwendig, da Kapillaren, die von nicht fixierten Augen isoliert wurden (mit der hypotonen Methode), brüchig sind und fragmentiert werden, was sie für die Messung der AFM-Steifigkeit ungeeignet macht⁴. Umgekehrt können eine stärkere Fixierung und die daraus resultierende Notwendigkeit eines ausgedehnten Trypsinverdaus, über den in anderen retinalen Trypsinverdauungsprotokollen^{berichtet wurde 18}, auch die strukturelle Integrität der Kapillaren beeinträchtigen, wie durch die Störung der Tight Junctions beurteilt wird. So tragen die hier eingesetzte milde Kapillarfixierung und der schonende Trypsinaufschluss dazu bei, Steifigkeitsartefakte zu reduzieren, die durch übermäßige Formalin-induzierte Vernetzung entstehen, und die strukturelle Integrität der Kapillaren für eine zuverlässige AFM-Steifigkeitsmessung zu gewährleisten.

Als alternativer Ansatz wurde in einer kürzlich durchgeführten Studie über die Messung der AFM-Steifigkeit von Netzhautkapillaren von leicht fixierten retinalen flachen Halterungen berichtet¹⁹. Durch die Durchführung von AFM-Krafteindrücken an retinalen Kapillaren innerhalb der intakten Netzhaut ermöglicht dieser Ansatz eine in situ Steifigkeitsmessung. Diese Messungen der Kapillarsteifigkeit umfassen jedoch wahrscheinlich die Steifigkeit der inneren Grenzmembran. Darüber hinaus ist dieser Ansatz auf die Messung nur oberflächlicher Kapillaren beschränkt, die auf einer retinalen flachen Halterung zugänglich sind, während der tiefer liegende Kapillarplexus, der in der frühen DR²⁰ spezifisch betroffen ist, weggelassen wird. Diese Probleme können mit diesem Ansatz gelöst werden, bei dem die Gefäße sauber (frei von residualem Netzhautgewebe) aus allen Netzhautschichten extrahiert werden. Wir optimieren derzeit dieses Protokoll, um Aderhautgefäße aus Tiermodellen der frühen AMD zu isolieren. Wir sind uns jedoch bewusst, dass die milde Formalinfixierung, die im Protokoll verwendet wird, bei AFM-Messungen ein Vernetzungs-assoziiertes Versteifungsartefakt verursachen kann. Daher wäre es ratsam, die mit diesem Ansatz erhaltenen Gefäßsteifigkeitswerte eher als relative Änderungen der Steifigkeit (zwischen verschiedenen Versuchsgruppen) als als absolute Steifigkeit zu interpretieren.

Im Gegensatz zu retinalen Kapillaren, die eine milde Fixierung erfordern, kann die subendotheliale Matrix, die aus retinalen EC-Kulturen gewonnen wird, ohne Modifikation beurteilt werden. Dies ist vor allem auf die Robustheit der abgeschiedenen Matrix zurückzuführen, die sich aus einer Kombination mehrerer Faktoren ergibt, darunter die Zugabe von Ascorbinsäure im Kulturmedium (die die Kollagensynthese verbessert¹⁵), die chemische Modifikation von Glasdeckgläsern, die eine Matrixablösung während der Dezellularisierung verhindert, und die verlängerte Kulturdauer (10-15 Tage). Wichtig ist, dass wir gezeigt haben, dass die Hyperglykämie-induzierte Zunahme der subendothelialen Matrixsteifigkeit in vitro mit der diabetesinduzierten Zunahme der retinalen Kapillarsteifigkeit in vivo übereinstimmt ⁴. Dies ist nicht überraschend, da erwartet wird, dass eine Erhöhung der Matrixsteifigkeit die Steifigkeit der darüber liegenden retinalen ECs (aufgrund mechanischer Reziprozität) erhöht, was zusammen die Gesamtsteifigkeit der Kapillaren erhöht. Tatsächlich haben wir kürzlich gezeigt, dass retinale ECs steifer werden, wenn sie unter diabetischen Bedingungen gezüchtet werden⁴, wahrscheinlich durch einen Anstieg der Rho/ROCK-abhängigen Aktin-Zytoskelett-Spannung²¹. Diese Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass die choroidale EC-Versteifung, die im Rhesusaffenmodell der frühen AMD beobachtet wurde, die erhöhte Steifigkeit der choroidalen subendothelialen Matrix und der intakten Gefäße widerspiegelt¹², eine Idee, die in laufenden Studien getestet wird. Insgesamt bezeugt die Tatsache, dass Steifigkeitsveränderungen in der unfixierten retinalen subendothelialen Matrix und ECs den Trend widerspiegeln, der bei leicht fixierten intakten retinalen Gefäßen beobachtet wird, die Gültigkeit des milden Fixationsansatzes.

Die direkte Steifigkeitsmessung von retinalen Kapillaren aus Tiermodellen der DR trägt nicht nur dazu bei, die endotheliale Mechanobiologie als neues therapeutisches Ziel für das DR-Management zu etablieren, sondern bietet auch eine gute Grundlage für die Entwicklung neuer empfindlicher Bildgebungsverfahren zur nicht-invasiven Beurteilung der retinalen Kapillarsteifigkeit bei DR-Patienten in der Zukunft. Solche nicht-invasiven Techniken könnten möglicherweise subtile Veränderungen des Blutflusses erkennen, die sich voraussichtlich aus einer Kapillarversteifung ergeben, ähnlich wie die Veränderungen der arteriellen Pulswellengeschwindigkeit, die häufig bei diabetesinduzierten Herz-Kreislauf-Erkrankungen festgestellt werden. AFM-Steifigkeitsmessungen von Netzhautkapillaren, die aus postmortalen menschlichen Augen von diabetischen Spendern isoliert wurden, werden in dieser Hinsicht einen wichtigen Wirksamkeitsnachweis liefern. Angesichts der Tatsache, dass die retinale Kapillarsteifigkeit im Mausmodell (Streptozotocin) des Typ-1-Diabetes⁴ früh zunimmt, könnte der erfolgreiche Einsatz von AFM bei der Validierung von Bildgebungsmodalitäten zur Messung der Steifigkeit zur Identifizierung der retinalen Kapillarsteifigkeit als klinischer Biomarker für eine frühe DR-Pathogenese führen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Retinale Kapillarisolation
0,22 & Mikro; m PVDF-Spritzenfilter	Merck Millipore	SLGVM33RS	Low Protein Binding Durapore
10X Dulbecco's Phosphat Buffered Kochsalzlösung ohne Calcium % Magnesium	Corning	20-031-CV	Endkonzentration 1X, pH 7,4
12-Well-Platte	Falcon Corning	353043
15 mL Zentrifugenröhrchen	Corning	430791	Rnase-Dnase-frei, pyrogenfrei
20 mL Luer-Lok TIP Spritze	BD	302830
5 3/4 Zoll Einweg-Pipette aus Borosilikatglas/unsteril Pasteur-Pipette	FisherBrand	13-678-20A
60x15 mm Gewebekulturschale	Falcon Corning	353002
6-Well-Platte	Falcon Corning	353046
Aqua-Hold 2 Pap - 13 mL Pen	Wissenschaftliches Gerät Labor	9804-02
Klingenhalter	X-ACTO
Chirurgische Klinge aus Kohlenstoffstahl #10	Bard-Parker	371110
Zahnwachs	Elektronenmikroskopie Wissenschaften	50-949-027
Präpariermikroskop	Am-scope
Formalinlösung, neutral gepuffert, 10%	Millipore Sigma	HT501128-4L	Endkonzentration 5% (v/v)
Kimwipes - Wischtuch	Kimtech Science	34133
Mikrospatel	Fine Science Tools	10089-11
Orbitalschüttler	Lab Genius	SK-O180
PELCO Economy #7 Edelstahl 115mm  Pinzette	Ted Pella, Inc.	5667
Phasenkontrastmikroskop	Nikon TS2
Purifier Logic+ Klasse II, Typ A2 Biosicherheitswerkbank	Labconco	302380001
Safe-Lock Mikrozentrifugenröhrchen 2 mL	Eppendorf	22363352
Stereoskop	AmScope	SM-3 Series Zoom Trinokulares Stereomikroskop 3,5X-90X
Superfrost Plus Objektträger für Mikroskopie - Weißer Lasche - Vorgereinigt - 25x75x1,0 mm	FisherBrand	1255015 Tris-Puffer
, 0,1 M Lösung, pH 7,4 - Biotechnologie	VWR	E553-500ML	pH 8 für Trypsinlösung
Trypsin 1:250 Pulver Gewebekulturqualität	VWR	VWRV0458-25G	10 % (w/v) Trypsinlösung
Wasser Molekularbiologie	Corning	46-000-CM
Subendothelial Matrix
10X PBS	Corning	20-031-CV
1X PBS mit Calcium und Magnesium	Thermo Fisher Scientific	14040-117	pH 7,4
Ammoniumhydroxid	Sigma-Aldrich	338818
Ascorbinsäure	Sigma-Aldrich	A4034
Kollagen IV Antikörper	Novus Biologicals	NBP1-26549
DNase I	Qiagen	79254
Ethanolamin	Sigma-Aldrich	398136
Fibronektin Antikörper	Sigma-Aldrich	F6140
Fluoromount	Invitrogen-Thermo Fisher Scientific	00-4958-02
Gelatine	Sigma-Aldrich	G1890
Deckgläser aus Glas (12mm)	Fisher	12-541-000
Glutaraldehyd-Elektronenmikroskopie	Sciences	16220
Menschliche retinale Endothelzellen (HREC)	Cell Systems Corp	ACBRI 181
MCDB131 medium	Corning	15-100-CV
Retinale Endothelzellen der Maus (mREC)	Zellbiologika	C57-6065
Triton X-100	Thermo Fisher Wissenschaftlich	BP151-100
Trypsin	Gibco-Thermo Fisher Scientific	25200-056
AFM Messung
1 & Mikro; m Sonde	Bruker	SAA-SPH-1UM	Eine 19 μm hohe halbkugelförmige Sonde mit 1 μm Endradius, Federkonstante 0,25 N/m
70 nm LC-Sonde	Bruker	PFQNM-LC-V2	Eine 19 μm hohe halbkugelförmige Sonde mit 70 nm Endradius,   Federkonstante 0,1 N/m
Kamera	XCAM Familie	Toupcam	1080P HDMI
Desktop zum Ausführen der Kamera	Asus	Asus Desktop	Intel i5-6600 CPU , 8GB RAM
Schalenhalter für Deckglas	Cellvis	D29-14-1.5-N	29mm Glasbodenschale mit   14 mm Mikrotopf
Nanowizard 4	Bruker	Nanowizard 4	Bioscience Rasterkraftmikroskop montiert auf einem optischen Mikroskop zur sensitiven Messung der mechanostrukturellen Eigenschaften (Steifigkeit und Topographie) von weichen biologischen Proben
Phasenkontrast-Mikrofon	Zeiss	Axiovert 200	Inverses Mikroskop mit 10X Objektiv