Methodenartikel

Anwendung von DNA-Barcoding zur Identifizierung von Heilpflanzen

DOI:

10.3791/66925

⸱

1. November 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy, Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, 2School of Pharmacy/School of Modern Chinese Medicine Industry, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Institute of Herbgenomics, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Verwendung der DNA-Barcoding-Technologie zur Authentifizierung von pflanzlichen medizinischen Materialien und der Heilpflanze Angelica sinensis (Oliv.) Als Beispiel wurde Diels genannt.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Heilpflanzen sind weltweit wertvolle Ressourcen und werden weltweit zur Erhaltung der Gesundheit und zur Behandlung von Krankheiten eingesetzt. Das Vorhandensein von Verfälschungen behindert jedoch ihre Entwicklung. DNA-Barcoding, eine Technik zur Artidentifizierung anhand von Standard-DNA-Regionen, ermöglicht eine schnelle und genaue Identifizierung traditioneller Heilpflanzen. Der Prozess des DNA-Barcoding umfasst sechs grundlegende Schritte: 1) Verarbeitung der Heilpflanzen, 2) Extraktion hochwertiger Gesamt-DNA aus den Heilpflanzen mit der Zentrifugalsäulenmethode, 3) Amplifikation des internen transkribierten Spacers 2 der Ziel-DNA-Region (ITS2) mit universellen Pflanzenprimern und Durchführung der Sanger-Sequenzierung, 4) Spleißen und Ausrichten der Sequenz, um die Zielsequenz zu erhalten, 5) Abgleich der Barcode-Sequenz mit der Barcode-Bibliothek zur Identifizierung, 6) Ausrichtung der Sequenz, Vergleich intraspezifischer und interspezifischer Variation, Konstruktion eines phylogenetischen Nachbar-Joining-Baums. Wie die Ergebnisse zeigen, kann der universelle Primer die Zielregion amplifizieren. Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) zeigt, dass der identifizierte Prozentsatz 100 % betrug, und der Nachbarverbindungsbaum zeigt, dass die Spleißsequenzen mit der A . sinensis OR879715.1-Klade gruppiert wurden und der Wert der Kladestütze 100 beträgt. Dieses Protokoll bietet eine Referenz für die Anwendung der DNA-Barcoding-Technologie als effektive Methode zur Identifizierung von Heilpflanzen und Verfälschungsmitteln.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Heilpflanzen haben ein breites Spektrum an pharmakologischen Wirkungen und sind wichtige Substanzen für die Behandlung und Vorbeugung von Krankheiten. Die Marktnachfrage nach Heilpflanzen in pflanzlichen Arzneimitteln und pharmazeutischen Produkten ist enorm und wächst weiter. Mit dem wachsenden Markt für Heilpflanzen hat das Problem der Verfälschung die Entwicklung von Heilpflanzen behindert. Derzeit leidet die Verfälschung von Heilpflanzen unter diesen Gründen: 1) Die ähnliche Morphologie von Heilpflanzen erschwert es, sie richtig zu identifizieren und zu verwenden 1,2,3,4,5, 2) Die steigende Nachfrage nach Heilpflanzen hat zu einem unzureichenden Angebot auf dem Markt geführt 6,7, 3) Heilpflanzen sind teuer und haben schwankende Preise, und die Verwendung von billigen Kräutern anstelle von wirtschaftlich wertvollen Materialien hat zu Verfälschungen und Marktgewinngier geführt 8,9. Um die Probleme der richtigen Identifizierung und Verwendung von Heilpflanzen zu lösen, besteht ein Bedarf an einer Technologie, die es Laien ermöglicht, die Quellezu identifizieren 10.

Es gibt Einschränkungen bei der korrekten Identifizierung und Verwendung von Heilpflanzen allein anhand des Aussehens und des Geruchs11. Für eine genauere Identifizierung und Qualitätskontrolle werden physikalisch-chemische Methoden eingesetzt12. Die Dünnschichtchromatographie (DC) zum Beispiel ist eine schnelle Methode zur Identifizierung von Heilkräutern und wurde in das chinesische Arzneibuch aufgenommen. Dennoch sind Referenzstandards erforderlich, um die Pflanzen zu identifizieren13. Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) kann sowohl qualitative als auch quantitative Tests durchführen und eignet sich daher für die Qualitätsprüfung von Arzneimitteln. Dieses Instrument ist jedoch teuer und erfordert spezielle Kenntnisse, um es zu bedienen14,15. Die DNA-Barcoding-Technologie ist eine schnelle und genaue Technologie zur Identifizierung von Arten, die Arten anhand stabiler DNA-Sequenzen identifiziert, um zwischen Pflanzen mit ähnlicher Morphologie zu unterscheiden. Hebert et al. schlugen eine DNA-Barcoding-Technologie zur Identifizierung von Arten vor, die eine anerkannte und relativ kurze DNA-Sequenz innerhalb des Genoms verwendet16, Chen et al. schlugen ITS2 als universelle Sequenz für die molekulare Identifizierung von Heilpflanzen vor und identifizierten mehr als 6600 Pflanzen und fanden eine hohe Identifizierungsfähigkeit17. Die Untersuchung von Heilpflanzen auf der Grundlage von ITS2- und Chloroplasten-Genfragmenten hat die Fähigkeit zur Unterscheidung von Arten auf Artebene gezeigt, mit Anwendungen in den Bereichen Ressourcenschutz, Marktregulierung und internationaler Handel 17,18,19. Die Anwendung von DNA-Barcoding kann die Einschränkungen traditioneller Identifizierungsmethoden überwinden, was hilfreich ist, um die Qualität und Sicherheit von Heilpflanzen zu gewährleisten und Ressourcenmissbrauch und Verwirrung zu verhindern20. Es hat sich als vorteilhaft für die Erforschung von Heilpflanzen erwiesen, unterstützt das Wachstum der Kräuterindustrie auf nachhaltige Weise und bietet eine Garantie, dass der Verbraucher die richtigen Medikamente einnimmt 21,22,23,24.

Das Papier skizziert Protokolle für die Anwendung von DNA-Barcoding zur Identifizierung von Heilpflanzen am Beispiel von A. sinensis. Beim DNA-Barcoding werden ein oder mehrere standardisierte kurze genetische Marker in der DNA eines Organismus verwendet, um ihn als zu einer bestimmten Spezies gehörend zu erkennen. Die derzeitigen Methoden zur Identifizierung von Heilpflanzen haben gewisse Einschränkungen. Die traditionelle morphologische Identifizierung stützt sich stark auf die umfangreiche Erfahrung von Experten, die durch menschliche Faktoren beeinflusst werden kann, während die chemische Identifizierung anfällig für Probleme wie die Verfälschung von Schlüsselverbindungen ist. Im Gegensatz dazu bietet DNA-Barcoding ein genaueres Mittel zur Identifizierung von Spezies und bietet Vorteile wie Geschwindigkeit, hohe Reproduzierbarkeit und Stabilität. Darüber hinaus ermöglicht diese Technologie die zentrale Verwaltung und den Austausch vorhandener Artensequenzdaten über das Internet und Informationsplattformen, wodurch die Effizienz und Zuverlässigkeit der Artenbestimmung erheblich verbessertwird 11,12. Aufgrund ihrer ähnlichen Morphologie und ihrer ähnlichen medizinischen Bestandteile wird A. sinensis häufig mit anderen Arten verwechselt und häufig missbraucht oder absichtlich auf dem Markt substituiert25. Yang et al. identifizierten A. anomala mithilfe von DNA-Barcoding, um es von falschen Medikamenten zu unterscheiden26. Yuan et al. sammelten 23 Arten von Angelica und verwendeten DNA-Barcoding, um zwischen den verschiedenen Arten zu unterscheiden27. Durch die Befolgung der in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren werden Benutzer in der Lage sein, pflanzliche medizinische Materialien von der Vorverarbeitung bis zum endgültigen Abgleich der Barcode-Sequenz mit der Barcode-Datenbank zu authentifizieren (Abbildung 1).

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Vorbereitung der Probe

  1. In der vorliegenden Studie wurde zweijähriges A. sinensis bei niedrigen Temperaturen und langer Sonneneinstrahlung in einer Höhe von 2800 m aus dem Kreis Min, Provinz Gansu, als Versuchsmaterial verwendet. Es wurden drei Pflanzen ausgewählt, von denen mehr als drei Wurzeln für die Experimente ausgewählt wurden. Spülen Sie die Wurzeln zuerst mit sterilisiertem Wasser ab und reinigen Sie sie dann mit einem Alkoholsprüher oder Alkoholtupfern, um Verunreinigungen zu vermeiden, die die Genauigkeit der Versuchsergebnisse beeinträchtigen könnten. Schneiden Sie die Wurzeln mit einem sterilisierten Skalpell in Stücke, die kleiner als 5 mm sind, und mischen Sie sie für die weitere Analyse. (Abbildung 2).
    HINWEIS: Alternativ können Sie die Wurzeln in flüssigen Stickstoff legen, um sie knusprig zu machen, damit sie leichter zu brechen sind. Je nach Form, Härte und anderen Eigenschaften der Heilpflanzen sollten Sie Instrumente verwenden, um mit ihnen umzugehen.
  2. Bereiten Sie drei Röhrchen mit experimentellen Proben für parallele Experimente vor. Beschriften Sie jede Probe als AS-1, AS-2 und AS-3. Nehmen Sie etwa 100 mg frisches oder 20 mg trockenes Gewebe (luftgetrocknet) und geben Sie es in ein 2-ml-Zentrifugenröhrchen.
  3. Legen Sie zwei 5 mm Edelstahlperlen in die 2 mL Zentrifugenröhrchen. Übertragen Sie die Röhrchen an eine Gewebeschleifmaschine mit hohem Durchsatz, die 60 s lang mit 60 Hz arbeitet.

2 DNA-Extraktion aus der Probe

HINWEIS: In dieser Studie wird ein pflanzengenomisches DNA-Extraktionskit verwendet, das auf der CTAB-Methode basiert. Die DNA-Extraktion wird gemäß der Bedienungsanleitung mit einigen Modifikationen durchgeführt, einschließlich der Hinzufügung eines einzigartigen nuklearen Isolationspuffers (NIB). Das Protokoll verbessert die DNA-Reinheit, indem es zunächst die Verunreinigungen vom Gewebe trennt und dann einen ersten Schritt zur Kernisolierung28, 29, 30 hinzufügt.

  1. Geben Sie 800 μl vorgekühlte NIB hinzu und legen Sie die Probe unter 5-minütiger Vibration auf einen Vortex-Mischer.
  2. In eine Zentrifuge geben und bei 13.780 x g 10 min verarbeiten. Entfernen Sie den Überstand.
  3. Wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.2 für weitere 3 Runden.
    HINWEIS: NIB extrahiert DNA von höherer Qualität, und seine Zubereitung enthält einige gefährliche Chemikalien, die in einem Abzug gehandhabt werden müssen, was die Handhabung für Anfänger erschwert. Dieser Schritt ist jedoch nicht obligatorisch. Benutzer können sich dafür entscheiden, dieser Empfehlung zu folgen oder diese Schritte zu überspringen. Die detaillierte Formulierung ist in Tabelle 1 enthalten.
  4. Fügen Sie 600 μl Puffer P1 und 5 μl RNase A (10 mg/ml) hinzu. Legen Sie die Probe auf einen Vortex-Mischer und den Wirbel zum Mischen. Inkubieren Sie die Proben in einem Wasserbad bei 65 °C für 1,5 h und drehen Sie die Röhrchen während der Inkubation 2x-3x um.
  5. 200 μl Puffer P2 zugeben, gründlich mischen, 15 min auf Eis legen und dann 10 min bei 13.780 x g zentrifugieren.
  6. Der Überstand wird vorsichtig auf eine Filtersäule AF abgesaugt, 2 min lang bei 13.780 x g zentrifugiert und das im Auffangröhrchen gesammelte untere Filtrat in ein neues 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen überführt.
  7. Berechnen Sie das Volumen des Filtrats, fügen Sie das 1,5-fache des Volumens von P3 hinzu und schütteln Sie es sofort, um eine gemischte Lösung zu erhalten.
  8. Geben Sie 650 μl der vorbereiteten Mischung in eine Adsorptionssäule Adsorptionssäule (AC) und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang, dann zentrifugieren Sie sie bei 13.780 x g für 30-60 s.
  9. Das in Schritt 2.8 erhaltene Filtrat wieder in die Klimaanlage geben, zentrifugieren und die Abfallflüssigkeit entsorgen. Wiederholen Sie den Vorgang mit der restlichen gemischten Lösung aus Schritt 2.7.
  10. 600 μl Spüllösung WB zugeben, bei 13.780 x g für 30 s zentrifugieren, die Abfalllösung verwerfen und den Vorgang 1x wiederholen.
  11. Setzen Sie die AC-Säule wieder in das leere Auffangröhrchen ein, zentrifugieren Sie sie 2 Minuten lang bei 13.780 x g und lassen Sie sie bei Raumtemperatur stehen, um Ethanolreste zu entfernen.
  12. Nehmen Sie die Adsorptionssäule AC und legen Sie sie in ein sauberes 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie 45 μl sterilisiertes deionisiertes Wasser (ddH2O) in die Mitte der Adsorptionsmembran, die auf 65 °C erhitzt wurde. 5 Min. bei Raumtemperatur ruhen lassen. Zentrifugieren bei 13.780 x g für 2 min.
  13. Die resultierende Lösung wieder in die Säule geben und bei 13.780 x g für 2 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
  14. Sammeln Sie die gefilterte Lösung. Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die DNA-Konzentration zu bestimmen. OD260 steht für die Absorption von Nukleinsäuren. Verwenden Sie die folgenden Kriterien für den DNA-Qualitätsbestimmungsstandard: OD260/OD280 = 1,80-2,00, der Normalbereich; OD260/OD280>2.00; es gibt eine große Menge an RNA-Kontamination; OD260/OD280<1,80, es gibt Proteine, Phenole und andere Verunreinigungen.

3 Amplifikation und Detektion von Zielfragmenten

HINWEIS: Wählen Sie geeignete Amplifikationsprimer basierend auf den vorgeschlagenen DNA-Barcoding-Regionen der Pflanze aus. Die Reaktionsbedingungen sind in Tabelle 2 dargestellt.

  1. Stellen Sie die Reaktionsbedingungen ein, die der Primer-Amplifikation entsprechen. Verwenden Sie 0,2 ml-Zentrifugenröhrchen, die mit 9,5 μl ddH2O, 12,5 μl 2x PCR-Mastermix und je 1 μl Forward-Primer, Reverse-Primer und Template-DNA gefüllt sind, um ein Gesamtvolumen von 25 μl zu erhalten. Bereiten Sie eine Negativkontrolle vor und ersetzen Sie das Template durch Wasser.
  2. Fügen Sie 20 ml 1x Trisacetat-EDTA (TEA)-Puffer und 0,2 g Agarose zum Erhitzen hinzu und bereiten Sie ein 1%iges Agarosegel vor, fügen Sie dann 2 μl Nukleinsäure-Gelfärbung (10.000x) hinzu und mischen Sie gründlich. Gießen Sie die Mischung in eine Gelgießschale und lassen Sie sie sich verfestigen, um das Agarosegel zu erhalten. Geben Sie 3 μl des PCR-Produkts und 2 μl DNA-Marker 5000 bp in das Gel.
  3. Stellen Sie die Spannung auf 120 V, den Strom auf 400 mA und die Elektrophorese auf 40 min ein. Verwenden Sie ein vielseitiges Gel-Bildanalysesystem, um Gele anzuzeigen und die Ergebnisse zu überprüfen.

4. Datenerhebung und -analyse

HINWEIS: Es gibt eine breite Palette von Software für die Sequenzzusammenstellung und -analyse. Zur Veranschaulichung verwenden wir den Codon-Code Aligner V11.0.1 und MEGA11 als Beispiele.

  1. Verwenden Sie den Aligner, um die Sequenzierungsdatei zu öffnen, um das Peak-Map zu beobachten und die bidirektionalen Sequenzierungs-Peak-Map-Dateien zu spleißen.
    1. Wählen Sie Neues Projekt erstellen und klicken Sie auf OK , um zur Startseite der Software zu gelangen. Wählen Sie im Menü Datei die Option Samples hinzufügen , wählen Sie die zu verarbeitende Datei als Sequenz-Trace-Format aus und importieren Sie sie direkt in die Software als importierte Datei unter Unassembled Samples.
    2. Wählen Sie Contig aus, wählen Sie dann im Abschnitt Advanced Assembly (Erweiterte Baugruppe) und dann Assemble in Groups (In Gruppen einbauen) aus. Erstbenutzern, die nach der Auswahl von In Gruppen zusammenbauen ausgewählt haben, wird dieses Dialogfeld angezeigt: Wählen Sie Namen definieren. Ändern Sie die Teile für die Definition von Beispielnamen entsprechend dem Dateinamen und klicken Sie auf Assemble. Die ausgerichtete Sequenz wird angezeigt.
    3. Rufen Sie die vollständigen ITS2-Sequenzen gemäß der auf dem Hidden-Markov-Modell (HMM) basierenden Modellanalyse ab. Verwenden Sie die Sequenzen31 von 5,8 s (CGAGGGCACGCCTGCCTGGGCGT) und 28 (CGACCCCAGGTCAGGCGGGGCCACC), um die ausgerichtete Sequenz von Anfang an zu durchsuchen und die Bereiche 5,8 und 28 s zu entfernen.
    4. Wählen Sie Los aus, wählen Sie dann im Abschnitt Suchsequenz aus , und klicken Sie auf OK , um die passende Sequenz abzurufen. Wählen Sie Contig aus, wählen Sie Delete in dem Abschnitt, um die 5,8s- und 28s-Regionen und die Sequenzen mit geringer Qualität zu entfernen, und dann gibt die Software die Spleißsequenzen zum Abgleichen aus.
  2. Verwenden Sie die Spleißsequenzen, die aus den drei parallelen experimentellen Schritten zur Identifizierung erhalten wurden, wählen Sie die BLAST-Suche mit der Nukleotiddatenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) und wählen Sie das Species Identification Tool und den Specific Primer ITS2 aus, die in der GPGD-Datenbank (Global Pharmacopoeia Genome Database) entsprechen.
    HINWEIS: NCBI32 und GPGD33 enthalten die Nukleotidsequenzen von Heilpflanzen und Tieren und sind als maßgebliche Datenbanken anerkannt. Ihre wichtigsten Methoden zur Identifizierung sind die Verfahren, die auf dem Sequenzvergleich34 (BLAST) basieren. Die prozentuale Identität aus den Identitätsergebnissen wird verwendet, um zu bestimmen, ob die Art mit der größten Ähnlichkeit die Zielgattung ist.
  3. Verwenden Sie MEGA11 für die Sequenzausrichtung, analysieren und vergleichen Sie intraspezifische und interspezifische Sequenzvariationen und erstellen Sie einen phylogenetischen Nachbar-Joining-Baum.
    1. Laden Sie die Sequenzen von drei Arten von Angelica und einer Art von Peucedanum praeruptorum als Outgroup vom NCBI herunter. Analysieren Sie diese Sequenzen zusammen mit der erhaltenen Ergebnissequenz.
    2. Klicken Sie auf Datei, wählen Sie Datei/Sitzung öffnen , um die Datei zu importieren, und ein Dialogfeld wird angezeigt. Wählen Sie > DNA ausrichten und dann Ausrichten nach ClustalW für den Sequenzvergleich. Wählen Sie in Daten die Option Phylogenetische Analyse aus, und kehren Sie dann zur Startseite zurück. Klicken Sie auf Neighbor-Joining-Baum in PHYLOGENIE erstellen/testen. Die Software generiert einen phylogenetischen Baum.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA-Qualität der Probe

Der Bereich der OD260/OD280-Absorptionsverhältnisse lag zwischen 1,80 und 1,84. Die mit dem Spektralphotometer gemessene DNA-Menge für jede Probe betrug mehr als 100 ng/μl (Tabelle 3), was auf eine gute Qualität der DNA-Extraktion der Probe hinweist. Dies deutet darauf hin, dass die Proben während des Extraktionsprozesses nicht durch Proteine, RNA oder Reagenzien kontaminiert wurden und dass sie von guter Qualität und für die nachgelagerte PCR-Amplifikation geeignet waren.

PCR-Analyse

Die Gelelektrophorese wurde an dem PCR-Produkt der drei parallelen experimentellen Proben durchgeführt. Der Aufbau war: Marker, Proben 1-3 (AS-1, AS-2, AS-3) und Negativkontrolle (0), wie in Abbildung 3 gezeigt. Die Größen von AS-1, AS-2 und AS-3 liegen alle zwischen 500 bp mit einzelnen, hellen, klaren Banden, und es gibt keine Banden in der 0, was darauf hindeutet, dass die extrahierte DNA mit ITS2-Primern auf 500 bp amplifiziert wurde.

Datenbankvergleich von Sequenzierungsergebnissen

Die Sequenzierungsergebnisse identifizierten A. sinensis mit einer 100%igen Sequenzähnlichkeit, indem die BLAST-Identifizierungsergebnisse der NCBI-Datenbank kombiniert wurden, die mit den Ergebnissen der Artbestimmung der GPGD-Datenbank übereinstimmen (Tabelle 4). Das BLAST-Ergebnis wurde anhand des höchsten prozentualen Identitätswerts und des niedrigsten E-Werts ermittelt. Die Artenbestimmung galt als erfolgreich, wenn die höchste maximale prozentuale Identität eine einzelne Art umfasste und >99 % erreichte. Wenn ein Score ≤ 99 % liegt, überprüfen Sie die Qualität der Sequenzierungsdatei oder ob das PCR-Produkt kontaminiert ist.

Phylogenetische baumbasierte Analyse der Artbestimmung

Die Ergebnisse zeigten, dass in dem konstruierten NJ-Phylogenetenstammbaum alle vier Arten in separaten Kladen geclustert waren und die P. praeruptorum als Außengruppe von den Angelica-Kladen getrennt wurde. Die Spleißsequenzen wurden mit der A . sinensis OR879715.1-Klade geclustert, und der Kladenstützwert (Bootstrap) betrug 100, und dann wurden die beiden anderen Arten, A. dahurica und A. cartilaginomarginata , jeweils in einer separaten Klade geclustert, was beweist, dass es sich bei den Spleißsequenzen um A. sinensis handelte (Abbildung 4).

figure-results-1
Abbildung 1: Flussdiagramm zur Identifizierung von Arzneipflanzenarten. (A) Prozesspflanze, Extraktions-DNA und Sequenzierung von Heilpflanzen, (B) Vergleich der Artensequenz anhand von Datenbanken und (C) Verwendung phylogenetischer Bäume zur taxonomischen Validierung, um die phylogenetischen Beziehungen zwischen den Arten zu bestätigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-2
Abbildung 2: Arbeitsablauf bei der Extraktion von Arzneipflanzen-DNA. (A) Bei der Extraktion von DNA aus Heilpflanzen sind insgesamt 6 Schritte erforderlich. (B) Amplifikation von PCR-Instrumenten und PCR-Zyklusprozess. (C) Elektrophorese. (D) Sanger-Sequenzierung und das Sequenzierungschromatogramm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-3
Abbildung 3: Gelelektrophorese von Angelica sinensis (Oliv.) Diels. Unter Verwendung des DNA-Markers DL5000 als molekularer Marker werden AS-1, AS-2 und AS-3 als Proben und 0 als Kontrollgruppe verwendet. Die Gelelektrophorese wurde durchgeführt, und die Ergebnisse zeigten, dass die AS-1-, AS-2- und AS-3-Proben alle Banden bei 500 bp aufwiesen, während die Kontrolle keine Banden aufwies. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-4
Abbildung 4: Neighbor-Joining-Stammbaum, der aus 13 Sequenzen erstellt wurde. Insgesamt wurden 10 Sequenzen von vier Pflanzenarten aus der NCBI-Datenbank heruntergeladen und die Spleißsequenzen verglichen, um intraspezifische und interspezifische Sequenzvariationen zu analysieren und zu vergleichen und phylogenetische Nachbarbäume zu konstruieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Name des Materials/der AusrüstungDosis
Polyvinylpyrrolidonca. 10 g
Tris-HCl1 M 50 ml
Ethylendiamintetraessigsäure0,5 M 20 mL
NaClca. 20,45 Gramm
β-Mercaptoethanol10 mL
sterilisiertes deionisiertes Wasser500 mL

Tabelle 1: Reagenzien für die Formulierung von Kernisolationspuffern.

BarcodeFibelPrimer-Sequenz (5'-3')PCR-Amplifikations-Sequenzierung
ITS2R:3RGACGCTTCTCCAGACTACAAT94°C5 Minuten
94°C30er Jahre40Zyklen
56°C30er Jahre
F:2FATGCGATACTTGGTGTGAAT72°C45 Sek.
72°C10 Minuten

Tabelle 2: DNA-Barcode-Primer und PCR-Reaktionsbedingungen.

probenDNA-Extraktion (ng/μL)OD260/OD280
AS-11241.84
AS-21841.81
AS-31641.82

Tabelle 3: Angelica sinensis (Oliv.) Diels extrahierte DNA-Qualität.

ProbenAusgerichtete Sequenzlänge (bp)Länge der Spleißsequenz (bp)GC(%)NCBI:Prozentualer BLAST(%)GPGD:Prozentuale Identifizierung von Arten (%)
AS-1500 Basispunkte229 Basispunkte55.50%100%100%
AS-2504 Basispunkte229 Basispunkte55.50%100%100%
AS-3499 Basispunkte229 Basispunkte55.50%100%100%

Tabelle 4: Datenbankvergleich der Sequenzierungsergebnisse.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die molekulare Identifikationstechnologie ist leichter zu erlernen und zu beherrschen als herkömmliche Identifizierungsmethoden. Sie überwindet die Grenzen der traditionellen Identifizierung von Heilkräutern, da sie nicht vom Wachstumsstadium der Pflanze beeinflusst wird und nicht auf subjektiver Beurteilung oder der Anhäufung von Fachkenntnissen beruht35. Andere Arten werden aufgrund ihrer ähnlichen Morphologie und ihrer medizinischen Bestandteile mit A. sinensis verwechselt, aber mit Hilfe von DNA-Barcoding kann sie definitiv identifiziert werden36.

Die wichtigsten Schritte in diesem Protokoll beinhalten mehrere kritische Überlegungen. Erstens ist die Vermeidung von Kontaminationen beim Umgang mit Kräutern und der Extraktion von DNA unerlässlich, um zu verhindern, dass fremde DNA oder Verunreinigungen die Ergebnisse beeinträchtigen. Eine ordnungsgemäße Reinigung der Proben ist notwendig, um externe Verunreinigungen zu entfernen, während eine gründliche Pulverisierung die DNA-Extraktion verbessert, indem sie die Oberfläche für die Interaktion mit den Reagenzien vergrößert. Es ist auch wichtig, eine angemessene Probenmenge zu verwenden, um ein effizientes Mischen mit den Reagenzien zu gewährleisten und eine bessere Zytolyse und Freisetzung der DNA zu ermöglichen. Schließlich ist die Kontrolle der Wasserbadzeit von entscheidender Bedeutung, da übermäßige Erhitzung zu einem DNA-Abbau führen kann, der die Qualität der extrahierten DNA beeinträchtigt. Zusammen stellen diese Schritte die erfolgreiche Extraktion hochwertiger DNA für die Analyse sicher.

Heilpflanzen enthalten Polysaccharide und Polyphenole, die die DNA-Extraktion und -Amplifikation beeinflussen. Die Verwendung von Nuclear Isolation Buffer reduziert die Wirkung dieser Substanzen und ermöglicht die Zellkernlyse, was zu einer besseren Extraktion der hochreinen gDNA 28,29,30 führt. Derzeit gibt es drei primäre DNA-Extraktionsmethoden: die Zentrifugalsäulenmethode, die CTAB-Methode und die SDS-Methode. In dieser Studie wurde jedoch die Zentrifugalsäulenmethode für die Experimente aufgrund ihrer Stabilität, Einfachheit, Effizienz und der Fähigkeit, hohe Konzentrationen von DNA37 zu extrahieren, gewählt, und das Erhitzen des Elutionspuffers kann dazu beitragen, DNA mit besserer Qualität zu eluieren. Hier wurden in dieser Studie ITS2-spezifische Primer17,38 ausgewählt, wobei die kurze ITS2-Sequenz als effizientes taxonomisches Sequenz-Tag im Vergleich zu den anderen Primern39 dient, die eine hohe interspezifische Variation und ein breiteres Spektrum an Identifikationen aufweisen. Der mögliche Grund für das Versagen der Amplifikation ist der DNA-Abbau in einigen Proben; Eine andere Möglichkeit besteht darin, dass das verwendete Paar von ITS2-Universalprimern für bestimmte Spezies oder unter Verwendung des alternativen Satzes von Universalprimern40 nicht funktioniert. Das BLAST-Ergebnis wurde anhand des höchsten prozentualen Identitätswerts und des niedrigsten E-Werts ermittelt. Die Speziesidentifikation galt als erfolgreich, wenn die höchste maximale prozentuale Identität eine einzelne Spezies umfasste und einen Wert von >99 %40,41 erreichte, wobei für den Wert ≤99 % die Qualität der Sequenzierungsdatei oder die Frage überprüft wurde, ob das PCR-Produkt kontaminiert ist.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass DNA-Barcoding eine Schlüsselrolle bei der Qualitätskontrolle der traditionellen Pflanzenheilkunde und des internationalen Kräuterhandels spielen sollte. Dieses Papier bietet einige Einblicke in die Extraktion von Pflanzen-DNA und eine detaillierte Anleitung zur Verwendung der DNA-Barcoding-Technologie zur Identifizierung von Heilpflanzen. Er hebt die wichtigsten Punkte hervor, die während des experimentellen Prozesses zu beachten sind. Daher bietet dieses Papier Referenzen für die grundlegende Identifizierung von Kräutern und hilft mehr Menschen, die Technologie schnell zu beherrschen. In besonderen Fällen, in denen die Effizienz der Barcode-Identifizierung mit einem einzigen Ort nicht ausreicht, hängt dies jedoch von der Referenzbibliothek ab. Der Aufbau einer Referenzbibliothek mit hoher Artenabdeckung wäre ein wichtiger Schritt zur Identifizierung von Arten anhand von DNA-Barcodes42, und viele Forscher haben vorgeschlagen, dass die Multi-Locus-Barcoding-Technologie die Effizienz verbessern kann43,44. Darüber hinaus kombinierten Zheng et al. mit der Entwicklung der Molekulartechnologie die DNA-Barcoding-Technologie mit der isothermen DNA-Amplifikationstechnologie und dem RPA-LFD-Nachweis, um giftige Pflanzen schnell zu authentifizieren45 und es wurden auch einige handelsübliche Kits entwickelt46. Die DNA-Barcode-Datenbank wird ständig verbessert, was eine wichtige Rolle bei der Förderung der Verallgemeinerung, Standardisierung und Internationalisierung der Identifizierungsmethoden der Pflanzenheilkunde spielt.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass die Forschung in Abwesenheit von kommerziellen oder finanziellen Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Förderprojekt der Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (030040015).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
CTAB Rapid Plant Genomic DNA Extraction KitShanghai Huiling Biotechnology Co.NG411MGeeignet für die schnelle Extraktion hochwertiger genomischer DNA aus verschiedenen Geweben einer Vielzahl von Pflanzen
DL5000DNA-Marker Nanjing vazyme Bio-technology Co.MD102-02Gebrauchsfertiges Produkt, nehmen Sie eine angemessene Menge dieses Produkts direkt zur Elektrophorese ein, wenn Sie das Gel laufen lassen.
ElektrophoreseBeijing Liuyi Biotechnologie Co.DYY-6CNehmen Sie ein Touchscreen-Design an, können die eingestellte Spannung anzeigen, gleichzeitig den Strom einstellen, parallelen Ausgang
EthylendiamintetraessigsäureBeijingpsaitongBiotechnologyCo., LtdE70015-100GNuclear Isolation Buffer Formulation Reagenzien.
Goldview Nukleinsäure-Gel-Färbung (10.000 & mal;)Yisheng Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd10201ES03Bei der Verwendung der Agarose-Gelelektrophorese zum Nachweis von DNA bindet sie an die DNA und erzeugt ein starkes Fluoreszenzsignal.
Hochgeschwindigkeits-TischzentrifugeChangsha High-Tech-Industrieentwicklungszone Xiangyi Centrifuge Instrument Co.H1650Für die schnelle und effiziente Trennung von Proben bietet diese kompakte und leichte Zentrifuge zuverlässige Sicherheit
Hochdurchsatz-Tissue-ZerkleinererShanghai Jingxin Industrial Development Co.Tiss-48Ein Hochfrequenz-Vibrationsinstrument zum Mahlen von Proben
http://www.gpgenome.com/Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences-HerbGenomics-Datenbankumfasst Genomsequenzen, Gensätze, Organellengenome, Genomdaten mit geringer Abdeckung und DNA-Barcode-Sequenzen.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/U.S. National Library of Medicine-Das National Center for Biotechnology Information fördert Wissenschaft und Gesundheit, indem es Zugang zu biomedizinischen und genomischen Informationen bietet.
Kylin-BellHaimen Qilinbel Instrument Manufacturing Co.VORTEX-5Schnelles Mischen in Form eines Hochgeschwindigkeits-Vortex, Mischgeschwindigkeit, Gleichmäßigkeit, Gründlichkeit
LifeTouchHangzhou BORI Technology Co.TC-96/G/H(b)BEinführung einer fortschrittlichen thermoelektrischen Kältetechnologie und einer neu entwickelten TAS-Technologie zur Verbesserung der Gesamtleistung
Multifunktionales Gel-BildanalysesystemSouthwest Operation Center von Shanghai Tianneng Life Science Co.Tanon-Mini Space 2000Führt schnelle Genamplifikationsexperimente mit einer Gradientenfunktion zur Kartierung von Amplifikationsbedingungen und einem Gradiententemperaturbereich von bis zu 30° durch; C
NaClBeijing Solarbio Science& Verifizierter Lieferant - Technology Co., Ltd.S8210-100Formulierungsreagenzien für nukleare Isolationspuffer.
Nanodrop OneGenes GmbHND ONEQuantifizieren Sie DNA-, RNA- und Proteinproben in Sekundenschnelle mit nur 1-2 & Mikro; L der Probe
PolyvinylpyrrolidonShanghai Yuanye Bio-Technology Co., LtdS30268-500gNuclear Isolation Buffer Formulation Reagenzien.
Schneeflocken-EismaschineShanghai Zhixin Experimental Instrument Technology Co.ZX-60XÜbernahme der Rotationsextrusions-Eisherstellungsmethode, schnelle Eisherstellungsgeschwindigkeit und hohe Effizienz der Eisproduktion
Edelstahlperlen für den GewebehomogenisatorBeyotime Biotechnology.F6623Ausrüstung zum Mahlen und Mischen von Gewebe- und anderen Proben durch Vibration
Trisacetat-EDTA-PufferBeyotime Biotech IncST716TAE ist ein häufig verwendeter Puffer für die DNA-Elektrophorese, der häufig in der Agarose-Gelelektrophorese eingesetzt wird.
Tris-HClBeijing Solarbio Science& Verifizierter Lieferant - Technology Co., Ltd.T8230Reagenzien für die Formulierung von Kernisolationspuffern.
Wasserkocher für WasserbadShanghai Senxin Experimental Instrument Co.DK-8DPräzise Thermostat- und Temperaturregelung, genaue und zuverlässige Temperaturregelung
β-mercaptoethanolShanghai Eon Chemical Technology Co.R054186-100ml   Reagenzien für die Formulierung von Nuklearisolationspuffern.

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chen, S. L., et al. Conservation and sustainable use of medicinal plants: Problems, progress, and prospects. Chin Med. 11, 37(2016).
  2. Han, J., et al. An authenticity survey of herbal medicines from markets in China using DNA barcoding. Sci Rep. 6, 18723(2016).
  3. Zhang, W., et al. Integration of high-throughput omics technologies in medicinal plant research: The new era of natural drug discovery. Front Plant Sci. 14, 1073848(2023).
  4. Ji, C., et al. Determination of the authenticity and origin of panax notoginseng: A review. J AOAC Int. 105 (6), 1708-1718 (2022).
  5. Parveen, I., Techen, N., Khan, I. A. Identification of species in the aromatic spice family apiaceae using DNA mini-barcodes. Planta Med. 85 (2), 139-144 (2019).
  6. Techen, N., Parveen, I., Pan, Z., Khan, I. A. DNA barcoding of medicinal plant material for identification. Curr Opin Biotechnol. 25, 103-110 (2014).
  7. Xiong, Y., et al. Market access for Chinese herbal medicinal products in Europe-a ten-year review of relevant products, policies, and challenges. Phytomedicine. 103, 154237(2022).
  8. Virk, J. K., Gupta, V., Kumar, S., Singh, R., Bansal, P. Ashtawarga plants - suffering a triple standardization syndrome. J Tradit Complement Med. 7 (4), 392-399 (2017).
  9. An, Y. L., Wei, W. L., Guo, D. A. Application of analytical technologies in the discrimination and authentication of herbs from fritillaria: A review. Crit Rev Anal Chem. 54 (6), 1775-1796 (2024).
  10. Li, M., Cao, H., But, P. P. H., Shaw, P. C. Identification of herbal medicinal materials using DNA barcodes. J Systemat Evolut. 49 (3), 271-283 (2011).
  11. Khan, A., et al. Herbal spices as food and medicine: Microscopic authentication of commercial herbal spices. Plants (Basel). 13 (8), 1067(2024).
  12. Techen, N., Crockett, S. L., Khan, I. A., Scheffler, B. E. Authentication of medicinal plants using molecular biology techniques to compliment conventional methods. Curr Med Chem. 11 (11), 1391-1401 (2004).
  13. Sasidharan, S., Chen, Y., Saravanan, D., Sundram, K. M., Yoga Latha, L. Extraction, isolation and characterization of bioactive compounds from plants' extracts. Afr J Tradit Complement Altern Med. 8 (1), 1-10 (2011).
  14. Wei, Y., et al. Identification techniques and detection methods of edible fungi species. Food Chem. 374, 131803(2022).
  15. Mehle, N., Trdan, S. Traditional and modern methods for the identification of thrips (thysanoptera) species. J Pest Sci. 85 (2), 179-190 (2012).
  16. Hebert, P. D., Cywinska, A., Ball, S. L., Dewaard, J. R. Biological identifications through DNA barcodes. Proc Biol Sci. 270 (1512), 313-321 (2003).
  17. Chen, S., et al. Validation of the its2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species. PLoS One. 5 (1), e8613(2010).
  18. Li, D. Z., et al. Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer (its) should be incorporated into the core barcode for seed plants. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (49), 19641-19646 (2011).
  19. Raskoti, B. B., Ale, R. DNA barcoding of medicinal orchids in asia. Sci Rep. 11 (1), 23651(2021).
  20. Chen, S., et al. DNA barcoding in herbal medicine: Retrospective and prospective. J Pharm Anal. 13 (5), 431-441 (2023).
  21. Pei, Y., et al. Whole-genome sequencing in medicinal plants: Current progress and prospect. Sci China Life Sci. 67 (2), 258-273 (2024).
  22. Zhu, S., Liu, Q., Qiu, S., Dai, J., Gao, X. DNA barcoding: An efficient technology to authenticate plant species of traditional chinese medicine and recent advances. Chin Med. 17 (1), 112(2022).
  23. Pang, X., Shi, L., Song, J., Chen, X., Chen, S. Use of the potential DNA barcode its2 to identify herbal materials. J Nat Med. 67 (3), 571-575 (2013).
  24. Ajmal Ali, M., et al. The changing epitome of species identification - DNA barcoding. Saudi J Biol Sci. 21 (3), 204-231 (2014).
  25. Peng, H., Chen, G., Ou, L. L., Luo, M., Zhang, C. Development of a new efficient scar marker for authentication of Angelica sinensis, an important traditional Chinese medicine. Scienceasia. 47 (6), 751-757 (2021).
  26. He, Y., et al. Authentication of Angelica anomala avé-lall cultivars through DNA barcodes. Mitochondrial DNA. 23 (2), 100-105 (2012).
  27. Yuan, Q. J., et al. Identification of species and materia medica within Angelica l. (umbelliferae) based on phylogeny inferred from DNA barcodes. Mol Ecol Resour. 15 (2), 358-371 (2015).
  28. Xie, P. J., Ke, Y. T., Kuo, L. Y. Modified ctab protocols for high-molecular-weight DNA extractions from ferns. Appl Plant Sci. 11 (3), e11526(2023).
  29. Stefanova, P., Taseva, M., Georgieva, T., Gotcheva, V., Angelov, A. A modified ctab method for DNA extraction from soybean and meat products. Biotech Biotechnol Equipment. 27 (3), 3803-3810 (2013).
  30. Li, Z., Parris, S., Saski, C. A. A simple plant high-molecular-weight DNA extraction method suitable for single-molecule technologies. Plant Meth. 16, 38(2020).
  31. Keller, A., et al. 5.8s-28s rrna interaction and hmm-based its2 annotation. Gene. 430 (1-2), 50-57 (2009).
  32. Morgulis, A., et al. Database indexing for production megablast searches. Bioinformatics. 24 (16), 1757-1764 (2008).
  33. Liao, B., et al. Global pharmacopoeia genome database is an integrated and mineable genomic database for traditional medicines derived from eight international pharmacopoeias. Sci China Life Sci. 65 (4), 809-817 (2022).
  34. Ghahramanlu, A., Rezaei, M., Heidari, P., Balandari, A. Species survey of iranian barberry genotypes using ITS2 sequences and basic local alignment search tools. Erwerbs-Obstbau. 65, 2491-2499 (2023).
  35. Han, K., Wang, M., Zhang, L., Wang, C. Application of molecular methods in the identification of ingredients in Chinese herbal medicines. Molecules. 23 (10), 2728(2018).
  36. Wang, X., Liu, Y., Wang, L., Han, J., Chen, S. A nucleotide signature for the identification of Angelicae sinensis radix (danggui) and its products. Sci Rep. 6, 34940(2016).
  37. Chen, R., et al. DNA based identification of medicinal materials in Chinese patent medicines. Sci Rep. 2, 958(2012).
  38. Hou, D. Y., et al. Molecular identification of corni fructus and its adulterants by ITS/ITS2 sequences. Chin J Nat Med. 11 (2), 121-127 (2013).
  39. Han, J., et al. The short ITS2 sequence serves as an efficient taxonomic sequence tag in comparison with the full-length its. Biomed Res Int. 2013, 741476(2013).
  40. Trujillo-Argueta, S., Del Castillo, R. F., Velasco-Murguía, A. Testing the effectiveness of rbcla DNA-barcoding for species discrimination in tropical montane cloud forest vascular plants (oaxaca, mexico) using blast, genetic distance, and tree-based methods. PeerJ. 10, e13771(2022).
  41. Marizzi, C., et al. DNA barcoding brooklyn (new york): A first assessment of biodiversity in marine park by citizen scientists. PLoS One. 13 (7), e0199015(2018).
  42. Antil, S., et al. DNA barcoding, an effective tool for species identification: A review. Mol Biol Rep. 50 (1), 761-775 (2023).
  43. Pang, X., et al. Utility of the trnh-psba intergenic spacer region and its combinations as plant DNA barcodes: A meta-analysis. PLoS One. 7 (11), e48833(2012).
  44. Tripathi, A. M., et al. The internal transcribed spacer (its) region and trnh-psba [corrected] are suitable candidate loci for DNA barcoding of tropical tree species of India. PLoS One. 8 (2), e57934(2013).
  45. Zheng, X. S., An, W. L., Yao, H., Xu, J., Chen, S. L. Rapid authentication of the poisonous plant Gelsemium elegans by combining filter-paper-based DNA extraction and rpa-lfd detection. Engineering. 7 (1), 14-16 (2021).
  46. Jiang, C., et al. Barcoding melting curve analysis for rapid, sensitive, and discriminating authentication of saffron (Crocus sativus l.) from its adulterants. Biomed Res Int. 2014, 809037(2014).

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Identifizierung von ArzneipflanzenArtbestimmungDNA ExtraktionITS2 AmplifikationSanger SequenzierungGelelektrophoreseBLAST Suchephylogenetischer BaumUniversalprimer

Verwandte Artikel