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Generierung und Charakterisierung von Organoiden der Gebärmutter von Ratten aus endometrialen epithelialen Stammzellen der Ratte

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DOI:

10.3791/66928

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2. August 2024

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1Meizhou Clinical Institute of Shantou University Medical College, 2Department of Pathology, Meizhou People's Hospital, 3Guangdong Engineering Technological Research Center of Clinical Molecular Diagnosis and Antibody Drugs, Meizhou Academy of Medical Sciences, Meizhou People's Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von endometriumen epithelialen Stammzellen (reESCs) von Ratten vor, um endometriale Organoide von Ratten zu erzeugen. Diese Methode ermöglicht In-vitro-Studien von Endometriumerkrankungen und ermöglicht die Genom-Editierung und andere zelluläre Manipulationen.

Zusammenfassung

Endometrium-Organoide bieten wertvolle Einblicke in die Entstehung und Pathophysiologie von Endometriumerkrankungen und dienen als Plattformen für die Erprobung von Medikamenten. Während Endometrium-Organoide für Mensch und Maus entwickelt wurden, ist die Forschung an Endometrium-Organoiden von Ratten nach wie vor begrenzt. Angesichts der Tatsache, dass Ratten bestimmte Endometriumpathologien, wie z. B. intrauterine Adhäsionen, besser simulieren können, zielte diese Studie darauf ab, endometriale Organoide von Ratten zu etablieren. Wir stellen ein detailliertes Protokoll für die Isolierung und Kultivierung von endometriumen epithelialen Stammzellen (reESCs) der Ratte und die Erzeugung von endometriumen Organoiden der Ratte vor. Unter Verwendung eines verfeinerten reES-Expansionsmediums haben wir erfolgreich reESCs isoliert und stabil expandiert und damit ihr langfristiges Kulturpotenzial unter Beweis gestellt. Die reESC-generierten Organoide wiesen typische strukturelle und funktionelle Merkmale des Endometriums auf, einschließlich der Hormonreaktionsfähigkeit. Unsere Ergebnisse zeigten, dass Endometrium-Organoide von Ratten über einen langen Zeitraum mit stabiler Proliferation kultiviert werden konnten, wobei die Drüsenstruktur, die Zellpolarität und die funktionellen Eigenschaften des Endometriumepithels erhalten blieben. Dieses neuartige, von Ratten abgeleitete Endometrium-Organoid-Modell bietet eine wertvolle Plattform für die Untersuchung von Endometriumerkrankungen und die Erprobung therapeutischer Interventionen mit potenziellen Anwendungen bei verschiedenen Säugetierarten.

Einleitung

Das Endometrium, ein vielseitiges und regeneratives Gewebe des menschlichen Körpers, erfährt unter dem Einfluss der Eierstockhormone periodische Ablösung, Regeneration und Differenzierung1. Anomalien im Endometrium sind mit verschiedenen Erkrankungen des weiblichen Fortpflanzungssystems wie Endometriose, Gebärmutterschleimhautkrebs und Unfruchtbarkeit verbunden2. Der Mangel an zuverlässigen Forschungsmodellen für das Endometrium behindert eingehende Studien zur Pathogenese, klinischen Diagnose und Behandlung dieser Krankheiten. Während Zelllinien und Tiermodelle häufig für die Endometriumforschung verwendet werden, erschweren Herausforderungen wie phänotypische Instabilität in Zelllinien, Unterschiede zwischen den Spezies in Tiermodellen und andere Einschränkungen die Replikation der komplexen physiologischen Struktur und der dynamischen funktionellen Veränderungen im menschlichen Endometrium3.

Organoide sind dreidimensionale Strukturen, die durch die Kultivierung von Stammzellen in einer extrazellulären Umgebung gebildet werden und über Selbsterneuerungs- und Selbstorganisationsfähigkeiten verfügen. Sie können die Struktur und Funktion physiologischer und pathologischer Gewebe nachahmen und gelten als präklinische Modelle menschlicher Krankheiten4. Im Jahr 2017 wurde die erfolgreiche Konstruktion von Endometrium-Organoiden von Mäusen und Menschen erreicht, indem fragmentiertes freies Endometriumgewebe, das durch enzymatische Verdauung gewonnen wurde, in ein extrazelluläres Matrixgerüst eingebettet und anschließend eine Mischung aus spezifischen Wachstumsfaktoren und Signalfaktoren für die Kultivierunghinzugefügt wurde 5. Die Ergebnisse zeigten, dass ex vivo Endometrium-Organoide eine langfristige und stabile proliferative Kapazität aufweisen und die Drüsenstruktur, die Zellpolarität und die funktionellen Eigenschaften des Endometriumepithels, einschließlich der Schleimsekretion und der Hormonreaktion, beibehalten6. Die ex vivo-Kultur adulter Stammzellen, die die Endometrium-Organoide bilden, erfordert jedoch eine drüsenartige strukturelle Unterstützung, was zu Herausforderungen wie dem Verlust der Stammzellen und Schwierigkeiten beim Passieren führt7.

Derzeit beruht die Kultivierung von endometrialen Organoiden auf der Methode der Gewebeblockverdauung. In einer früheren Studie kultivierte unser Forschungsteam humane Endometriumepithel-Stammzellen über einen längeren Zeitraum in vitro unter Verwendung eines primären Kulturmediums, das hauptsächlich aus Y27632 bestand und das wir zur Konstruktion von Endometrium-Organoiden verwendeten8. Aufbauend auf diesem Erfolg isolierten und kultivierten wir endometriale epitheliale Stammzellen aus Endometriumgewebe von Ratten unter Verwendung eines niedermolekularen Verbundkulturmediums und etablierten so ein langfristiges In-vitro-Kultursystem . Darüber hinaus verwendeten wir endometriale epitheliale Stammzellen (reESCs) von Ratten, um endometriumale Organoide von Ratten zu erzeugen. Die Entwicklung dieses Modells wird zukünftige in vitro und in vivo Studien zu endometriumbedingten Erkrankungen in Verbindung mit Rattenmodellen verbessern.

Protokoll

Für diese Arbeit wurden sechs 7/8 Wochen alte weibliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 200-250 g verwendet. Die Ratten wurden in einer klimatisierten Tierhaltung untergebracht, die ad libitum Zugang zu Futter und Wasser hatte. Alle Versuchsverfahren mit Tieren wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und vom institutionellen Prüfungsausschuss für Tierversuche der Forschungsethikkommission des Volkskrankenhauses Meizhou genehmigt.

Der folgende Abschnitt beschreibt den Prozess zum Isolieren, Passieren, Einfrieren und Auftauen von Endometriumepithel-Stammzellen von Ratten unter Verwendung eines verfeinerten reESCs-Expansionsmediums (REEM), das hauptsächlich aus Y27632, A8301 und CHIR990217 8,9 besteht. Die REEM-Formulierung basiert auf serumfreiem DMEM/F12, angereichert mit spezifischen Konzentrationen von Schlüsselkomponenten: 10 μM Y27632, 3 μM CHIR99021 und 0,5 μM A8301. Ausführliche Details zu den Komponenten finden Sie in der Werkstofftabelle. Nachdem die Ratten mit Isofluran-Inhalation betäubt wurden, sollten die in Abbildung 1 dargestellten nachfolgenden Verfahren durchgeführt werden.

1. Chirurgischer Eingriff

  1. Betäuben Sie die Ratte durch Isofluran-Inhalation.
    1. Setzen Sie die Ratten in eine Induktionskammer, die mit 3-5% Isofluran, gemischt mit Sauerstoff, gefüllt ist. Bestätigen Sie die ordnungsgemäße Betäubung durch das Fehlen einer Reaktion auf ein Zehenkneifen und den Verlust des Aufrichtreflexes.
    2. Halten Sie die Ratten nach der Betäubung während des Eingriffs über einen Nasenkegel unter 1-3% Isofluran. Tragen Sie Tierarztsalbe auf die Augen auf, um Trockenheit zu verhindern, während die Ratte unter Narkose steht.
  2. Machen Sie einen tiefen Schnitt in der Mittellinie, um die Gebärmutterhörner freizulegen.
    HINWEIS: Alle chirurgischen Instrumente müssen vor der Verwendung sterilisiert werden. Der Operationsbereich an der Ratte wird rasiert und mit einer antiseptischen Lösung desinfiziert. Der Chirurg trägt sterile Handschuhe, eine Maske und einen Kittel. Der chirurgische Eingriff wird auf einem sterilen Tuch durchgeführt.
  3. Führen Sie Längsschnitte auf beiden Seiten der Gebärmutter durch, um das innere Endometrium freizulegen. Verwenden Sie eine T10-Skalpellklinge, um das Endometrium abzukratzen, bis die Oberfläche rau ist.
  4. Nach dem chirurgischen Eingriff bringen Sie die Ratten in einen sterilen und warmen Erholungsbereich mit regulierter Temperatur und Luftfeuchtigkeit und überwachen Sie sie genau, bis sie wieder bei vollem Bewusstsein sind und sich in einer sternalen Liegeposition abstützen können. Gruppen von drei postoperativen Ratten getrennt in getrennten Käfigen unterbringen. Um postoperative Schmerzen zu lindern, verabreichen Sie Analgetika wie Buprenorphin (0,05-0,1 mg/kg, subkutan); Wiederholen Sie dies alle 8-12 h für je nach Bedarf bis zu 48-72 h.

2. Verarbeitung von Gewebe

  1. Legen Sie alle Fragmente des Gebärmutterendometriums in eine 3,5 cm große Schüssel und waschen Sie sie 3x mit PBS.
  2. Mischen Sie die Fragmente des uterinen Endometriums mit 3 ml 1 % Kollagenase Typ I (verdünnt in 0,25 % Trypsin/1 mM EDTA) bei 37 °C für 60 min. Filtern Sie das unverdaute Gewebe mit einem 100-μm-Zellsieb, um das Filtrat zu isolieren und für die weitere Kultivierung zu sammeln.
  3. Aussaat der gesammelten Zellen in 12-Well-Platten in REEM-Medium für die weitere Kultivierung. Berechnen Sie das Volumen der Zellsuspension, das benötigt wird, um die Zellen in jeder Vertiefung der 12-Well-Platte zu säen, um die gewünschte Zelldichte zu erreichen (typischerweise ~1-2 × 105 Zellen/Well in 1,5 ml REEM).
  4. Waschen Sie die in Schritt 2.2 gesammelten Zellen 3x mit PBS. Nach dem ersten Waschen zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 × g für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand; Resuspendieren Sie das Zellpellet in PBS mit 1% BSA (Rinderserumalbumin), um unspezifische Bindungen zu minimieren, und inkubieren Sie 15-30 Minuten auf Eis.
  5. Inkubieren Sie die Zellen mit primären Antikörpern, die für verschiedene Marker spezifisch sind (siehe Materialtabelle), für 30 min bis 1 h bei 4 °C. Verdünnen Sie die Antikörper in PBS mit 1 % BSA gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  6. Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation 2x mit PBS, um alle ungebundenen Antikörper zu entfernen. Nach der abschließenden Wäsche resuspendieren Sie die Zellen in 600 μl PBS mit 1 % BSA für die durchflusszytometrische Analyse.
  7. Konfigurieren Sie das Gerät mit Lasern und Filtern, die für die im Experiment verwendeten Fluorophore geeignet sind (z. B. FITC, PE, APC). Verwenden Sie die Einstellungen für Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC), um die lebende Einzelzellpopulation ohne Trümmer und Zellaggregate zu erfassen. Kalibrieren Sie das Durchflusszytometer mit einer unverfälschten Steuerung, um eine korrekte Ausrichtung sicherzustellen. Legen Sie spezifische Gates basierend auf der ungefärbten Kontrolle fest, um positive Populationen für jeden interessierenden Marker zu definieren (der Schwellenwert liegt bei 0,02 %).

3. Langzeitkultur von Stammzellen des Endometriumepithels der Ratte

  1. Assay zur Koloniebildung
    HINWEIS: Dieser Assay half bei der Bestimmung des optimalen Kulturmediums für reESCs.
    1. P0 wird in 6-Well-Platten mit einer Dichte von 1.000 Zellen/Well ausgeseedet und 14 Tage lang entweder in REEM oder REEM ohne A8301, Y27632 oder CHIR99021 kultiviert.
    2. Nach der Kulturzeit fixieren Sie die Zellen 20 min lang mit 4% Paraformaldehyd bei Raumtemperatur und färben Sie sie anschließend weitere 20 min mit kristallvioletter Lösung.
    3. Quantifizieren Sie die Anzahl der Zellcluster mit mehr als 50 Zellen. Wählen Sie das Kulturmedium aus, auf dessen Grundlage das Medium das Wachstum von Zellclustern unterstützt.
      HINWEIS: Das Weglassen spezifischer Faktoren aus dem REEM führte zu einer verminderten proliferativen Kapazität von reESCs (Abbildung 1B,C). Basierend auf diesen Erkenntnissen wurde REEM als bevorzugtes Medium für die Kultivierung von reESCs ausgewählt, um die Kultivierungsbedingungen zu optimieren.
  2. Wechseln Sie das REEM alle 2 Tage. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 80-90 % erreichen, verdauen Sie sie 5-6 Minuten lang mit 0,25 % Trypsin/1 mM EDTA.
  3. Passieren Sie die Zellen in einem Verhältnis von 1:3 in REEM.
  4. Proliferations-Assay
    1. Die P1-, P7- und P14-ReES-Zellen werden in 96-Well-Platten mit einer Dichte von 4 × 103 Zellen/Well in 150 μl REEM ausgebracht.
    2. Geben Sie 10 μl CCK-8-Reagenz in jede Vertiefung nach 24, 48, 72 und 96 Stunden Kultur, gefolgt von einer 2-stündigen Inkubation bei 37 °C.
    3. Bestimmen Sie die Proliferationsrate, indem Sie die Extinktion bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Reader messen.
  5. Aufbereitung und Verwendung von Tiefkühlbrühen
    1. Bereiten Sie die gefrorene Stammlösung mit REEM mit 10 % DMSO vor.
    2. Ernten Sie die reESCs mit 0,25 % Trypsin/1 mM EDTA.
    3. Das Zellpellet wird in einer Konzentration von 1 × 10 6 Zellen/ml in einer Konzentration von 16 Zellen/ml resuspendiert. Übertragen Sie die Zellsuspension in Röhrchen.
    4. Frieren Sie die Röhrchen zuerst bei -80 °C ein und überführen Sie sie dann innerhalb von 24 h in flüssigen Stickstoff.
      HINWEIS: Wenn Sie beabsichtigen, die Zellen bald aufzutauen, wird empfohlen, die gefrorenen Zellen maximal 6 Monate lang bei -80 °C zu lagern.
    5. Heizen Sie das REEM auf 37 °C vor.
    6. Holen Sie die gefrorenen reESCs heraus und tauchen Sie sie für 1-2 min in ein 37 °C heißes Wasserbad.
    7. Übertragen Sie die aufgetauten reESCs in 6-Well-Platten mit einer Seeding-Dichte von 1 × 105 Zellen/Well in REEM.
  6. Immunfluoreszenz-Färbung
    1. ReESCs in der logarithmischen Wachstumsphase werden mit einer Dichte von 2 × 103 Zellen pro Well auf u-Slide 8-Well-Platten gesät und in REEM kultiviert.
    2. Wenn die reESCs eine Konfluenz von 90 % erreichen, fixieren Sie sie 20 Minuten lang mit 4 % Paraformaldehyd. Waschen Sie die reESCs 2x vor und nach der Fixierung mit PBS.
    3. Permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,2% Triton X-100 für 10 min.
    4. Blockieren Sie die Zellen mit 30 % Ziegenserum, verdünnt in 5 % Rinderserumalbumin (BSA), für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die reESCs 2x vor und nach dem Blocken mit PBS.
    5. Inkubieren Sie die Zellen mit primären Antikörpern (Anti-SSEA-1 und Anti-Cytokeratin) für 12 h bei 4 °C. Waschen Sie die reESCs 2x nach der Inkubation mit PBS.
    6. Inkubieren Sie die Zellen mit Sekundärantikörpern für 1 h bei Raumtemperatur. Waschen Sie die reESCs 2x nach der Inkubation mit PBS.
    7. Färben Sie die Zellen mit 150 μl DAPI, um alle Zellkerne zu markieren.
    8. Nehmen Sie Bilder der gefärbten Zellen mit einem inversen Konfokalmikroskop auf.

4. Etablierung von Endometrium-Organoiden der Ratte aus reESCs

  1. Erzeugung der Organoide
    1. Wenn die reES-Zellen eine Konfluenz von 70 % erreichen, verdauen Sie die Zellen 5-6 Minuten lang mit 0,25 % Trypsin/1 mM EDTA.
    2. 5 × 105 reESCs in 500 μl aufgetautem Matrigel resuspendieren und in 12-Well-Platten geben. Inkubieren Sie die Platten 20 Minuten lang bei 37 °C, um die Gelierung zu ermöglichen.
    3. Sobald sich das Zell-Matrigel-Gemisch verfestigt hat, fügen Sie 1,5 ml/Vertiefung REEM hinzu, um das Matrigel zu bedecken. Wechseln Sie das REEM alle 2-3 Tage.
  2. Immunfluoreszenz-Färbung
    1. Aspirieren Sie das REEM und geben Sie 1 ml/Vertiefung vorgekühlte Organoid-Erntelösung in die 12-Well-Platten. 40-60 min auf Eis inkubieren.
    2. Die Organoide mit einer Pasteurpipette auffangen und bei 300 × g für 3 min bei 4 °C zentrifugieren.
    3. Spülen Sie die Organoide 2-3x mit PBS aus.
    4. Fixieren Sie die Organoide 20 min lang mit 4 % Paraformaldehyd und blockieren Sie sie 60 min lang mit 5 % BSA.
      HINWEIS: Vor und nach jedem Schritt 2x mit PBS waschen.
    5. Die Organoide werden über Nacht bei 4 °C mit Primärantikörpern inkubiert, die in 1 % BSA verdünnt sind.
    6. Inkubieren Sie die Organoide mit Sekundärantikörpern für 1 h bei Raumtemperatur.
    7. Die Organoide mit 200 μl DAPI gegenfärben.
    8. Nehmen Sie Bilder mit einem inversen Konfokalmikroskop auf.
  3. HE-Färbung
    1. Dehydrieren Sie die Organoide durch eine abgestufte Ethanolreihe: 70% Ethanol für 30 Minuten; 80% Ethanol für 30 min; 95% Ethanol für 30 min; 100% Ethanol für 2 x 30 min. Reinigen Sie die Organoide, indem Sie sie 2 x 30 Minuten lang in Xylol eintauchen.
    2. Tauchen Sie die gereinigten Organoide 1 h lang bei 60 °C in geschmolzenes Paraffin. Übertragen Sie die paraffinfiltrierten Organoide in Einbettformen, füllen Sie die Formen mit geschmolzenem Paraffin und legen Sie die Formen in eine kalte Platte, damit sich das Paraffin verfestigen kann. Entfernen Sie die Paraffinblöcke aus den Formen, nachdem das Paraffin erstarrt ist, und schneiden Sie das überschüssige Paraffin ab.
    3. Montieren Sie die Paraffinblöcke auf das Mikrotom. Schneiden Sie 5 μm dicke Abschnitte ab und schwimmen Sie sie auf einem warmen Wasserbad (42-45 °C), um sie flach zu drücken. Übertragen Sie die Abschnitte vorsichtig auf Objektträger und trocknen Sie sie auf einem Objektträgerwärmer.
    4. Entparaffinieren Sie die Schnitte, indem Sie die Objektträger 2 x 5 min lang in Xylol tauchen. Rehydrieren Sie durch eine Reihe von abgestuftem Ethanol: 100% Ethanol für 2 x 3 min; 95% Ethanol für 3 min; 70% Ethanol für 3 min; In destilliertem Wasser abspülen.
    5. 5 Minuten lang mit Hämatoxylin färben; Anschließend 5 Minuten unter fließendem Leitungswasser abspülen. Differenzieren Sie einige Sekunden lang in 1% saurem Alkohol; 5 Minuten unter fließendem Leitungswasser abspülen; 30 s in blauem Wasser in 0,2 % Ammoniakwasser legen; 5 Minuten unter fließendem Leitungswasser abspülen; 2 Min. mit Eosin beizen. Dehydrieren durch abgestuftes Ethanol: 70% Ethanol für 1 min; 95% Ethanol für 1 min; 100% Ethanol für 2 x 1 min. 2 x 1 min in Xylol klären.
    6. Geben Sie einen Tropfen Eindeckmittel auf die befleckten Abschnitte. Legen Sie dann ein Deckglas über den Gewebeabschnitt, um Luftblasen zu vermeiden. Betrachten Sie die gefärbten Schnitte unter einem Lichtmikroskop.
  4. Fluoreszenz-Färbung
    1. Führen Sie die Entparaffinisierung und Rehydrierung durch, wie in den Schritten 4.3.1 beschrieben. bis 4.3.4.
    2. Die Antigen-Entnahmelösung in der Mikrowelle vorheizen. Legen Sie die Objektträger in die erhitzte Antigen-Rückgewinnungslösung und halten Sie sie 20 Minuten lang bei Unterkochtemperatur. Lassen Sie die Objektträger 40 min lang in der Antigen-Rückgewinnungslösung abkühlen. Spülen Sie die Objektträger 5 Minuten lang in entionisiertem Wasser.
    3. Inkubieren Sie die Objektträger 10 Minuten lang in 0,3 % Wasserstoffperoxid in Methanol, um die endogene Peroxidaseaktivität zu löschen. Die Objektträger 3 x 5 min in PBS spülen und 1 h bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer in einer Blockierlösung inkubieren. Klopfen Sie die überschüssige Blockierlösung ab, aber spülen Sie sie nicht aus.
    4. Verdünnen Sie den Primärantikörper in einer Blockierungslösung gemäß den Anweisungen des Herstellers. Der verdünnte Primärantikörper wird auf die Gewebeschnitte aufgetragen und über Nacht bei 4 °C in einer befeuchteten Kammer inkubiert.
    5. Waschen Sie die Objektträger 3 x 5 min in PBS. Verdünnen Sie den HRP-konjugierten Sekundärantikörper in einer Blockierungslösung gemäß den Anweisungen des Herstellers. Den verdünnten Sekundärantikörper auf die Gewebeschnitte auftragen und 1 h bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer inkubieren. Waschen Sie die Objektträger 3 x 5 min lang in PBS, um ungebundene Sekundärantikörper zu entfernen.
    6. Bereiten Sie die Fluorescein-Tyramid-Arbeitslösung gemäß den Anweisungen des Kits vor. Die Arbeitslösung auf die Gewebeschnitte auftragen und 15 min bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer inkubieren. Spülen Sie die Objektträger 3 x 5 min in PBS aus.
    7. Wiederholen Sie Schritt 4.4.1. bis 4.4.5, bis die Färbung mit allen drei Antikörpern abgeschlossen ist. Tragen Sie einen Tropfen fluoreszierendes Eindeckmedium mit DAPI auf jeden Gewebeschnitt auf. Legen Sie vorsichtig ein Deckglas über den Gewebeabschnitt, um Luftblasen zu vermeiden. Untersuchen Sie das inverse Konfokalmikroskop der Objektträger.
  5. Quantitative PCR
    1. Sammeln Sie die Organoide wie in den Schritten 4.2.1 beschrieben. bis 4.2.3. Aspirieren Sie das PBS und extrahieren Sie die Gesamt-RNAs aus den Organoiden gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    2. Verwenden Sie ein beliebiges kommerziell erhältliches reverses Transkriptionskit, um cDNA aus 1 μg Gesamt-RNA zu synthetisieren. Richten Sie eine q-PCR-Reaktion gemäß dem Protokoll des Kit-Herstellers ein. In der Materialtabelle finden Sie die für die q-PCR verwendeten Primersequenzen.

5. Langzeitkultur von Endometrium-Organoiden der Ratte

  1. Aspirieren Sie das REEM und fügen Sie 1 ml Organoid Harvesting Solution für 40 Minuten hinzu, um die Organoide zu dissoziieren. Auf Eis inkubieren, um die Integrität der Organoide zu erhalten.
  2. Nach der Inkubation werden die Organoide mit einer Pasteur-Pipette gesammelt und bei 300 × g für 3 min bei 4 °C zentrifugiert, um sie für die weitere Verarbeitung zu pelletieren.
    HINWEIS: Das Kürzen der Pipettenspitze kann hilfreich sein, um größere Organoide (über 500 μm) zu handhaben, ohne Schäden zu verursachen.
  3. Resuspendieren Sie die pelletierten Organoide in Matrigel in einem Verhältnis von 1:2 oder 1:3 für die Einbettung und anschließende Kultur in 12-Well-Platten.
  4. Bereiten Sie die gefrorene Stammlösung vor: REEM mit 10 % DMSO.
  5. Ernten Sie die Organoide, resuspendieren Sie sie in der gefrorenen Stammlösung und lagern Sie sie dann im Gefrierschrank bei -80 °C oder in flüssigem Stickstoff zur Langzeitkonservierung.
  6. Um die gefrorenen Organoide aufzutauen, erwärmen Sie das REEM in einem 37 °C warmen Wasserbad und tauchen Sie das gefrorene Brühröhrchen in das Wasserbad, um die Organoide vorsichtig aufzutauen.
  7. Nach dem Auftauen resuspendieren Sie die Organoide in 500 μl Matrigel, um sie wieder einzubetten und in einer 12-Well-Platte zu kultivieren. Führen Sie die Schritte 4.1.2 aus. bis 4.1.3.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, gefrorene Organoide kürzer bei -80 °C zu lagern oder für eine längerfristige Lagerung auf flüssigen Stickstoff umzufüllen.

6. Optional: Übergang von Organoiden zur adhärenten Kultur

HINWEIS: Das Protokoll erwähnt eine alternative Methode zur Gewinnung von flach kultivierten reESCs durch Übergang von Organoiden zu adhärenten Kulturen, die eine Umstrukturierung der Organoidmorphologie ermöglichen.

  1. Aspirieren Sie das REEM und fügen Sie 1 ml Organoid-Harvesting-Lösung hinzu, um die Organoide zu dissoziieren. Auf Eis inkubieren, um die Integrität der Organoide zu erhalten.
  2. Nach der Inkubation werden die Organoide mit einer Pasteurpipette und einer Zentrifuge gesammelt, um sie bei 300 × g für 3 min bei 4 °C zu pelletieren.
  3. Resuspendieren Sie die Organoide in 3 mL vorgewärmtem REEM und geben Sie die resuspendierten Organoide in eine 3,5 cm große Schale. Wechseln Sie das REEM-Medium alle 2 Tage.
  4. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 70 % erreichen, verdauen Sie sie 5-6 Minuten lang mit 0,25 % Trypsin/1 mM EDTA.
  5. Rekonstruieren Sie die Organoide mit reESCs, indem Sie die Schritte 4.1.1 bis 4.1.3 befolgen.

7. Sequentielle Kultivierung von Organoiden mit Östradiol (E2) und Progesteron (P4)

  1. Stammlösungen von E2 und P4 werden in DMSO hergestellt. Die Stammlösungen werden auf die gewünschten Arbeitskonzentrationen verdünnt (E2: 10 nM; P4: 1 μM) in REEM, wobei sichergestellt wird, dass die endgültige DMSO-Konzentration 0,1 % nicht überschreitet, um zytotoxische Wirkungen zu vermeiden.
  2. Kulturorganoide in REEM als Schritt 4.1.1. bis 4.1.3. für 4 Tage. Ersetzen Sie das Medium durch REEM, das mit E2 ergänzt ist, und kulturieren Sie es 7 Tage lang. Überwachen Sie das Wachstum und die Morphologie von Organoiden täglich. Wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage.
  3. Ersetzen Sie das Medium durch REEM, das mit E2 und P4 ergänzt wird. Überwachen Sie das Wachstum und die Morphologie von Organoiden täglich. Wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage. Kultivieren Sie die Organoide 7 Tage lang.

Ergebnisse

Die reESCs und Uterusorganoide der Ratte wurden von sechs weiblichen Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht zwischen 200 g und 250 g gemäß dem in Abbildung 1 dargestellten Protokoll ermittelt. Aufbauend auf dem Erfolg der Langzeitkultur von humanen endometrialen epithelialen Stammzellen bestand die REEM-Formulierung überwiegend aus Y27632, A8301 und CHIR99021. Um die reESCs in vitro zu stabilisieren, isolierten wir zunächst Endometriumzellen aus dem Endometrium der Ratte mit enzymatischen und mechanischen Techniken. Die durchflusszytometrische Analyse in Abbildung 2A zeigte, dass die primären Endometriumzellen zu etwa 50 % aus Epithelzellen bestanden, die CD9 (49,8 %) exprimierten, mit niedrigen EpCAM- (4,49 %) und CD24-Spiegeln (2,64 %). Der SSEA-1-Marker für reESCs lag bei 6,58 %, während die endothelialen Marker CD31 (30,9 %) und CD45 (70,3 %) relativ hoch waren.

Die Kultivierung in REEM führte jedoch dazu, dass P1-reESCs eine einheitliche wirbelförmige oder polyedrische Morphologie aufwiesen und kompakte Klonstrukturen bildeten (Abbildung 2D). Die allmähliche Entfernung einzelner Faktoren aus REEM führte zu einer entsprechenden Abnahme der proliferativen Kapazität von reESCs. Der Klonbildungsassay unterstreicht die entscheidende Rolle von Y27632 in der stabilen Kultur von reESCs (Abbildung 2B, C). Bei der dritten Passage zeigten die reESCs eine konsistente Expression von SSEA-1 und Cytokeratin, was auf eine erfolgreiche Expansion der primären reESCs während der Kultur hinweist (Abbildung 2F). Darüber hinaus behielten reESCs auch bei späten Passagen eine robuste und stabile proliferative Kapazität bei (Abbildung 2E), was ihre erfolgreiche Isolierung und Expansion im aktuellen REEM-System zeigt.

Organoidkulturen wurden nach einem zuvor berichteten System etabliert, das aus menschlichen Endometriumstammzellen gewonnen wurde8. Innerhalb von 3 Tagen zeigten die reESCs eine schnelle Selbstorganisation zu organoidartigen Strukturen mit einem hohlen Zentrum, die anschließend an Größe und Dicke zunahmen (siehe Abbildung 3A). Die typischen HE-Färbeergebnisse, die die Bildung von Organoiden durch reESCs veranschaulichen, sind in Abbildung 3B dargestellt. Diese Organoidkulturen können durch Passage aufrechterhalten werden, wie die hohe Zellviabilität zeigt, die durch die Ki67-Färbung sowohl nach direkter Passage als auch nach Frost-Tau-Zyklen angezeigt wird. Darüber hinaus wurde eine HE-Färbung an der 10. Generation von Organoiden durchgeführt, und die Ergebnisse zeigten, dass die Organoidstruktur intakt gehalten werden konnte (siehe Abbildung 3E). Darüber hinaus zeigten die qPCR-Ergebnisse, dass Nanog, Sox2 und Oct4 in Konzentrationen exprimiert wurden, die mit denen der P1-Generation vergleichbar waren (Abbildung 3F). Dieser Befund deutet auf das Potenzial für eine langfristige Kultivierung von Organoiden innerhalb des aktuellen Systems hin.

In unserer Studie wurde eine Voruntersuchung zur Reaktion uterusähnlicher Strukturen von Ratten auf E2 und P4 durchgeführt. Die Immunfluoreszenzfärbung in Abbildung 4A zeigte das Vorhandensein von Östrogen- und Progesteronrezeptoren. Nach der Supplementierung mit E2 durchliefen diese Organoide einen Übergang von einer hohlen kugelförmigen Form zu einem dichter besiedelten internen Wachstumsmuster (Abbildung 4C). Die anschließende Exposition gegenüber P4 führte zu einer verminderten Permeabilität der dichten Strukturen, was schließlich zu deren Zerfall führte (Abbildung 4B). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass E2 möglicherweise die weitere Differenzierung uterusähnlicher Strukturen der Ratte vorantreibt, während P4 apoptotische Signalwege auslösen kann.

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Abbildung 1: Verfahren zur Etablierung von Stammzellen des Endometriumepithels von Ratten und Uterusorganoiden von Ratten. Abkürzung: SD = Sprague-Dawley. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Erzeugung und Langzeitkultur von Stammzellen des Endometriumepithels der Ratte in vitro. (A) Durchflusszytometrische Analyse, die den Anteil positiver Zellen im Endometrium der Ratte zeigt. (B) Kristallviolett-Färbung von Klonen in REEM mit oder ohne A8301, Y27632 bzw. CHIR99021. Maßstabsbalken = 1 cm. (C) Die Klonnummern in REEM mit oder ohne Faktoren. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. n = 3 Spender (***, p<0,001). (D) Lichtmikroskopische Aufnahmen von P1-Endometriumepithel-Stammzellen der Ratte mit und ohne Kristallviolett-Färbung. (E) CCK-8-Analysen von endometriumen epithelialen Stammzellen der Ratte an Passage 1, Passage 7 und Passage 14. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar, n = 3. (F) Immunfluoreszenzanalysen, die die Expression von Cytokeratin und SSEA-1 nachweisen. Abkürzung: REEM = reESCs Expansion Medium. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Erzeugung und Langzeitkultur von Endometrium-Organoiden der Ratte in vitro. (A) Lichtmikroskopische Bilder von P1-Endometrium-Organoiden von Ratten. (B) H&E-Färbung für P1-Organoide aus endometrialen epithelialen Stammzellen der Ratte. (C) Immunfluoreszenzanalysen, die die Expression von Cytokeratin und SSEA-1 nachweisen. (D) Immunfluoreszenzanalysen, die die Expression von Ki67 und SSEA-1 nachweisen. (E) H&E-Färbung für P 10-Organoide der Ratte. (F) qPCR-Analysen zur Expression von Nanog, Sox2 und Oct-4 in P1- und P10-Endometriumorganoiden der Ratte. Die Expression wurde auf GAPDH normiert (n = 3, zweiseitiger ungepaarter t-Test, n.s. = nicht signifikant). Abkürzung: H&E = Hämatoxylin und Eosin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Sequentielle Kultivierung von Organoiden mit E2 und P4. (A) Immunfluoreszenzanalysen, die die Expression von Östrogenrezeptor, Gestagenrezeptor und SSEA-1 zeigen. (B) Überblick über lichtmikroskopische Aufnahmen von Ratten-Organoiden, die in E2 und P4 kultiviert wurden. (C) Lichtmikroskopische Aufnahmen zeigen die Umwandlung einer Hohlkugel in eine dichte Kugel im inneren Hohlraum von Organoiden, nachdem sie 7 Tage in E2 kultiviert wurde. Abkürzungen: ER = Östrogenrezeptor; PR = Gestagen-Rezeptor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

In dieser Studie haben wir eine einfache Methode zur Isolierung und Kultivierung von endometriumen epithelialen Stammzellen (reESCs) von Ratten beschrieben und das zuvor etablierte ex vivo-System für humane endometriume epitheliale Stammzellen verfeinert8. Unser Ansatz verwendet ein niedermolekulares Kulturmedium, das Y27632, A8301 und CHIR99021 als Kernkomponenten enthält, um eine stabile und langfristige ex vivo-Kultur zu ermöglichen. Darüber hinaus ist es uns gelungen, Endometrium-Organoide von Ratten in Echtzeit mit reESCs zu erzeugen. Dieses neuartige System vereinfacht die derzeitigen Kultivierungsmethoden von Endometriumorganoiden, die typischerweise auf Gewebeblöcken beruhen, und schafft dadurch mehr Klarheit über die Zelllinie10. Wichtig ist, dass unser System die Genomeditierung und andere Manipulationen auf zellulärer Ebene erleichtert, um Organoide zu erzeugen, die bestimmte Gene exprimieren. Darüber hinaus ermöglicht dieses Organoidsystem den gezielten Knockout oder die Überexpression spezifischer Gene im Endometrium der Ratte, was das Screening und die Kultivierung von endometriumepithelialen Stammzellen zur Produktion von Endometrium-Organoiden ermöglicht. Dieser umfassende Forschungsansatz klärt spezifische Genfunktionen sowohl aus in-vivo - als auch aus ex vivo-Perspektiven auf und ebnet den Weg für die Erforschung von Krankheiten, die mit dem Endometriumepithel zusammenhängen.

Das Wirkstoffscreening ist eine wichtige Anwendung von Organoiden. Die derzeitigen Quellen und Zubereitungsmethoden von Organoiden sind jedoch komplex, was zu einer erheblichen Variabilität zwischen den Chargen führt, die sich auf die Ergebnisse von Wirkstoffscreening-Studien auswirken kann11,12. Unser System zeigt, dass Organoide, die aus stabilen ex vivo kultivierten Zelllinien stammen, Unterschiede zwischen gebildeten Organoiden effektiv minimieren und so die Einheitlichkeit in den Versuchsaufbauten verbessern können. Darüber hinaus haben Ratten-Organoide, die aus reES-Zellen gebildet werden, die Fähigkeit gezeigt, auf Östrogenstimulation in vitro zu reagieren, was zu morphologischen Veränderungen führt, was darauf hindeutet, dass sie als Werkzeug für das Wirkstoffscreening ex vivo verwendet werden können. Die reESCs können leicht aus Endometriumgewebe isoliert und ex vivo mit weniger kleinen Molekülen im Vergleich zu humanen endometrialen epithelialen Stammzellen erweitert werden. Diese Eigenschaft ist besonders wertvoll für die Untersuchung von Stammzelleigenschaften, Vorläuferzellen, Differenzierungsprozessen und Wechselwirkungen in der Mikroumgebung. Wichtig ist, dass dieser Ansatz auf andere Säugetierarten wie Affen, Schweine und Hunde extrapoliert werden kann, was die Etablierung von endometrialen Organoid-Kultursystemen ermöglicht, die als physiologisch relevantere Modelle für die Untersuchung der Biologie, Funktion, Krankheiten und Arzneimittelreaktionen des Endometriums dienen. Trotz ihrer Vorteile hat diese Technik ihre Grenzen. Eine große Einschränkung ist die Abhängigkeit von Matrigel, einer komplexen und variablen extrazellulären Matrix, die zu Inkonsistenzen zwischen den Experimenten führen kann. Darüber hinaus liefern Rattenmodelle zwar wertvolle Erkenntnisse, aber es gibt immer noch Unterschiede zwischen den Arten, und die Ergebnisse lassen sich möglicherweise nicht vollständig auf die Physiologie und Pathologien des menschlichen Endometriums übertragen. Zukünftige Studien sollten darauf abzielen, diese Einschränkungen zu beheben, möglicherweise durch die Entwicklung definierterer und konsistenterer extrazellulärer Matrizen und durch die Erforschung der Anwendbarkeit dieses Modells auf andere Spezies.

Trotz ihrer Vorteile hat diese Technik ihre Grenzen. Eine große Einschränkung ist die Abhängigkeit von Matrigel, einer komplexen und variablen extrazellulären Matrix, die zu Inkonsistenzen zwischen den Experimenten führen kann. Daher ist eine Schlüsseltechnik in dieser Studie die Entfernung von Matrigel. Die Verwendung eines schonenden Matrix-Gel-Digestivmittels, die Sicherstellung des Betriebs auf Eis und eine ausreichende Verdauungszeit sind entscheidend für den Erfolg. Aufgrund des größeren Durchmessers der Pasteur-Pipette kann die Verwendung der Pasteur-Pipettenaspiration die Schädigung von Organoiden reduzieren und den Verdau des Matrixgels beschleunigen. In der anschließenden Forschung können verschiedene Methoden der extrazellulären Matrix-Gelkultur verglichen werden, um die Kultur- und Verdauungssysteme von Organoiden weiter zu optimieren. Zukünftige Studien sollten darauf abzielen, diese Einschränkungen zu beheben, möglicherweise durch die Entwicklung definierterer und konsistenterer extrazellulärer Matrizen und durch die Erforschung der Anwendbarkeit dieses Modells auf andere Spezies.

Während in der vorhandenen Literatur Techniken für die ex vivo-Kultivierung von epithelialen Organoiden beschrieben wurden, wird in dieser Studie ein neuartiges, unkompliziertes und leicht reproduzierbares System zur Kultivierung und Expansion von Endometrium-Organoiden der Ratte vorgestellt, die aus klaren Zellen gewonnen werden. Dieser Fortschritt ist bereit, das Tempo der Forschung im Bereich der Reproduktionsbiologie von Frauen zu erhöhen.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der GuangDong Basic and Applied Basic Research Foundation (2023A1515110760) unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Anti-CD15 (SSEA-1)Abcamab135377Kaninchen, 1:200 (IHC)
Anti-Östrogenrezeptor alphaAbcamab32063Kaninchen, 1:200 (IHC)
Anti-Pan CytokeratinAbcamab7753Maus, 1:250 (IHC)
Anti-ProgesteronrezeptorAbcamab101688Kaninchen, 1:200 (IHC)
Anti-Ki67Abcamab279653Maus, 1:250 (IHC)
A8301TargetMol909910-43-6
β-EstradiolMerckE8875
Zellzähl-Kit-8BeyotimeC0038
CD9BioLegend1098191:20 (FC), Pacific Blue
CD24BioLegend1018061:20 (FC), FITC
CD31BioLegend3031201:20 (FC), APC
CD45BioLegend3017031:20 (FC), PE
CHIR99021TargetMolCT99021
Cultrex Organoid Harvesting SolutionR& D Systems3700-100-01
Cy3 TSA Fluoreszenzsystem KitAPExBIOK1051
Cy5 TSA Fluoreszenz System KitAPExBIOK1052
DAPISigmaD95421 μ g/mL
DMEM/F-12Invitrogen11330032
EpCAMBioLegend3698031:20 (FC), PerCP
Fluorescein TSA Fluoreszenz System KitAPExBIOK1050
Ziege Anti-Kaninchen IgG, Alexa Fluor 488InvitrogenA-110081:500
Ziege Anti-Maus IgG, Alexa Fluor 555InvitrogenA-214221:500
Ziege Anti-Kaninchen IgG/HRP AntikörperAPExBIObs-0295G-HRP
Knockout SerumersatzInvitrogen10828028
MatrigelCorning356234
PrimeScript RT Master MixTakaraRR063A
ProgesteronMerck57-83-0
Sprague-Dawley RatteShanghai JieSiJie Laboratory Animals Co., LTD, China
SSEA-1BioLegend3230471:20 (FC), APC
TB Green Fast qPCR MixTakaraRR820A
TriZOLInvitrogen15596026CNRNA-Extraktion
u-Slide 8-Well-PlattenIbidi80827
Y27632TargetMol146986-50-7
qPCR-Primer von Zielgenen 
GeneCompany<strong>Sequences
rat GAPDH FSangon BiotechGACATGCCGCCTGGAGAAAC
Ratte GAPDH RSangon BiotechAGCCCAGGATGCCCTTTAGT
Ratte Nanog FSangon BiotechGACTAGCAACGGCCTGACTCA
Ratte Nanog R Sangon BiotechCTGCAATGGATGCTGGGATA
Ratte Sox2 FSangon BiotechATTACCCGCAGCAAAATGAC
Ratte Sox2R Sangon BiotechATCGCCGGAGTCTAGTTCT
Ratte Okt4 FSangon BiotechCCCAGCGCCGTGAAGTTGGA
Ratte Okt4 RSangon BiotechACCTTTCCAAAGAGAACGCCCA
GG

Referenzen

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  2. Garcia-Alonso, L., et al. Mapping the temporal and spatial dynamics of the human endometrium in vivo and in vitro. Nat Genet. 53 (12), 1698-1711 (2021).
  3. Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. Organoids - preclinical models of human disease. N Engl J Med. 380 (6), 569-579 (2019).
  4. Mulaudzi, P. E., Abrahamse, H., Crous, A. Insights on three dimensional organoid studies for stem cell therapy in regenerative medicine. Stem Cell Rev Rep. 20 (2), 509-523 (2024).
  5. Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).
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  7. Tempest, N., Maclean, A., Hapangama, D. K. Endometrial stem cell markers: current concepts and unresolved questions. Int J Mol Sci. 19 (10), 3240(2018).
  8. He, W., et al. Long-term maintenance of human endometrial epithelial stem cells and their therapeutic effects on intrauterine adhesion. Cell Biosci. 12 (1), 175(2022).
  9. Katsuda, T., et al. Conversion of terminally committed hepatocytes to culturable bipotent progenitor cells with regenerative capacity. Cell Stem Cell. 20 (1), 41-55 (2017).
  10. Murphy, A. R., Campo, H., Kim, J. J. Strategies for modelling endometrial diseases. Nat Rev Endocrinol. 18 (12), 727-743 (2022).
  11. Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nat Cell Biol. 21 (8), 1041-1051 (2019).
  12. Esfandiari, F., et al. Endometriosis organoids: prospects and challenges. Reprod Biomed Online. 45 (1), 5-9 (2022).

Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

Endometrium OrganoideOrganoidkulturOrganoidcharakterisierungEndometriumkrankheitenWirkstoffpr fung an OrganoidenGeneditierung an OrganoidenZellisolationMatrigel Einbettung
Generierung und Charakterisierung von Organoiden der Gebärmutter von Ratten aus endometrialen epithelialen Stammzellen der Ratte
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