Methodenartikel

Verwendung modifizierter synthetischer Oligonukleotide zum Assay von Nukleinsäure-metabolisierenden Enzymen

DOI:

10.3791/66930

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5. Juli 2024

 ,  ,  ,  , 
1University of Waikato, 2ArcticZymes Technologies ASA

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier wird ein Protokoll zum Assay von Nukleinsäure-metabolisierenden Enzymen vorgestellt, wobei Beispiele von Ligasen-, Nuklease- und Polymerase-Enzymen verwendet werden. Der Assay verwendet fluoreszenzmarkierte und unmarkierte Oligonukleotide, die zu Duplexen kombiniert werden können, die RNA- und/oder DNA-Schäden oder Signalwegzwischenstufen nachahmen, was die Charakterisierung des Enzymverhaltens ermöglicht.

Zusammenfassung

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Die Verfügbarkeit einer Reihe von modifizierten synthetischen Oligonukleotiden von kommerziellen Anbietern hat die Entwicklung ausgefeilter Assays zur Charakterisierung verschiedener Eigenschaften von Nukleinsäure-metabolisierenden Enzymen ermöglicht, die in jedem Standardlabor für Molekularbiologie durchgeführt werden können. Die Verwendung von Fluoreszenzmarkierungen hat diese Methoden für Forscher mit Standard-PAGE-Elektrophoresegeräten und einem fluoreszenzfähigen Imager zugänglich gemacht, ohne dass radioaktive Materialien verwendet werden müssen oder ein Labor für die Lagerung und Aufbereitung von radioaktiven Materialien erforderlich ist, d. h. ein Hot Lab. Die optionale Hinzufügung von Standardmodifikationen wie Phosphorylierung kann den Assay-Aufbau vereinfachen, während der spezifische Einbau von modifizierten Nukleotiden, die DNA-Schäden oder Zwischenprodukte nachahmen, verwendet werden kann, um spezifische Aspekte des Enzymverhaltens zu untersuchen. Hier wird das Design und die Durchführung von Assays zur Untersuchung verschiedener Aspekte der DNA-Prozessierung durch Enzyme unter Verwendung kommerziell verfügbarer synthetischer Oligonukleotide demonstriert. Dazu gehören die Fähigkeit von Ligasen, sich zu verbinden, oder von Nukleasen, verschiedene DNA- und RNA-Hybridstrukturen abzubauen, die unterschiedliche Verwendung von Cofaktoren durch die DNA-Ligase und die Bewertung der DNA-Bindungskapazität von Enzymen. Faktoren, die bei der Entwicklung synthetischer Nukleotidsubstrate zu berücksichtigen sind, werden diskutiert, und es wird ein grundlegender Satz von Oligonukleotiden bereitgestellt, die für eine Reihe von Nukleinsäure-Ligasen-, Polymerase- und Nuklease-Enzym-Assays verwendet werden können.

Einleitung

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Alle Lebensformen benötigen Nukleinsäure-verarbeitende Enzyme, um grundlegende biologische Prozesse durchzuführen, einschließlich Replikation, Transkription und DNA-Reparatur. Wichtige enzymatische Funktionalitäten für diese Signalwege sind Polymerasen, die Kopien von RNA/DNA-Molekülen erzeugen, Ligasen, die Polynukleotidsubstrate verbinden, Nukleasen, die sie abbauen, sowie Helikasen und Topoisomerasen, die Nukleinsäure-Duplexe schmelzen oder ihre Topologie verändern 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Darüber hinaus bieten viele dieser Enzyme wichtige molekulare Werkzeuge für Anwendungen wie Klonierung, Diagnostik und Hochdurchsatz-Sequenzierung 11,12,13,14,15.

Die funktionellen Eigenschaften, die Kinetik und die Substratspezifitäten dieser Enzyme können unter Verwendung von markierten DNA/RNA-Substraten bestimmt werden, die durch Annealing-Oligonukleotide hergestellt werden. Die Verfolgung von Substraten und Produkten wurde traditionell durch Einbringen einer radioaktiven Markierung (32P) entweder am 5'-Strangende erreicht, die dann durch einen fotografischen Film oder mit einem Phosphorbildgebungssystem16,17 detektiert werden kann. Während radioaktiv markierte Substrate den Vorteil einer erhöhten experimentellen Empfindlichkeit bieten und die chemischen Eigenschaften eines Nukleotids nicht verändern, haben die potenziellen Gesundheitsgefahren durch die Arbeit mit Radioisotopen die Entwicklung der nicht-radioaktiven Nukleinsäuremarkierung gefördert, um eine sicherere Alternative für den DNA- und RNA-Nachweis zu bieten 18,19,20. Unter diesen sticht die Fluoreszenzdetektion, einschließlich der direkten Fluoreszenzdetektion, der zeitaufgelösten Fluoreszenz und der Energietransfer-/Fluoreszenzquench-Assays, als die vielseitigsten hervor 21,22,23,24. Das umfangreiche Array an Fluorophoren ermöglicht unterschiedliche Designs von DNA/RNA-Substraten mit einzigartigen Reportern auf jedem Oligonukleotid25. Darüber hinaus ermöglicht die Stabilität von Fluorophoren im Vergleich zu Radioisotopen den Anwendern, signifikante Mengen fluoreszenzmarkierter DNA-Substrate herzustellen und zu konservieren19. Diese Fluorophor-markierten Substrate können mit dem interessierenden Protein zusammen mit verschiedenen Kombinationen von Metall- und Nukleotid-Cofaktoren inkubiert werden, um die Bindungs- und/oder Enzymaktivität zu analysieren. Die Visualisierung der Bindung oder Aktivität kann unter Verwendung verschiedener Fluorophor-Farbstoffkanäle mit einem Gel-Imaging-System beobachtet werden. Da bei dieser Technik nur die fluoreszenzmarkierten Oligonukleotide sichtbar sind, ist jede Zunahme oder Abnahme der Größe des markierten Oligonukleotids leicht zu verfolgen. Gele können auch nachträglich mit Nukleinsäure-Färbefarbstoffen gefärbt werden, um alle auf dem Gel vorhandenen DNA-Banden sichtbar zu machen.

Polynukleinsäure-Ligasen sind Enzyme, die DNA/RNA-Fragmente verbinden und die Versiegelung von Brüchen durch die Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen 5'-phosphorylierten DNA-Termini und dem 3'-OH der DNA katalysieren. Sie können entsprechend ihrer Anforderung an das Nukleotidsubstrat in zwei Gruppen unterteilt werden. Die hochkonservierten NAD-abhängigen Ligasen kommen in allen Bakterienvor 26, während die strukturell vielfältigen ATP-abhängigen Enzyme in allen Lebensbereichen identifiziert werden können 8,27. DNA-Ligasen spielen eine wichtige Rolle bei der Verarbeitung von Okazaki-Fragmenten während der Replikation und sind an verschiedenen DNA-Reparaturwegen beteiligt, wie z. B. der Nukleotid- und Basenexzisionsreparatur, durch die Versiegelung von spontanen Kerben und Kerben, die nach der Reparatur übrig bleiben 8,10. Verschiedene DNA-Ligasen weisen unterschiedliche Fähigkeiten auf, verschiedene Konformationen von DNA-Brüchen zu verbinden, einschließlich Kerben in einem Duplex, doppelsträngige Brüche, Fehlanpassungen und Lücken sowie RNA- und DNA-Hybride 28,29,30. Eine Vielzahl von ligierbaren Substraten kann durch Glühen von Oligonukleotiden mit einem 5'-Phosphat zusammengesetzt werden, um nebeneinander liegende 5'- und 3'-Termini in einem Nukleinsäureduplex 31,32,33 zu erzeugen. Die gebräuchlichste Analysemethode ist die Auflösung durch Harnstoff-PAGE in einem Endpunkt-Assay-Format; Zu den jüngsten Innovationen gehören jedoch die Verwendung der Kapillargelelektrophorese, die einen hohen Durchsatz34 ermöglicht, die massenspektrometrische Profilierung35 sowie ein homogener molekularer Beacon-Assay, der eine zeitaufgelöste Überwachungermöglicht 36.

Der erste Schritt in einer Ligationsreaktion ist die Adenylierung des Ligase-Enzyms durch Adenosintriphosphat (ATP) oder Nicotinamid-Adenindinukleotid (NAD), wodurch ein kovalentes Enzymzwischenprodukt entsteht. Der zweite Schritt in der Reaktion ist die Adenylierung des Nukleinsäuresubstrats am 5'-Ende der Nickstelle, gefolgt von der Ligation der Nukleinsäure-Nick-Stränge. Viele Ligase-Enzyme, die in E. coli rekombinant exprimiert werden, werden in der adenylierten Form gereinigt und sind daher in der Lage, Nukleinsäuren ohne Zugabe eines Nukleotid-Cofaktors erfolgreich zu ligieren. Dies macht es schwierig zu bestimmen, welche Art von Nukleotid-Cofaktor sie für die Ligation von Nukleinsäuren benötigen. Neben der Beschreibung von Assays zur Bewertung der DNA-Ligase-Aktivität wird auch eine Methode zur zuverlässigen Bestimmung des Cofaktor-Einsatzes durch Deadenylierung des Enzyms unter Verwendung unmarkierter Substrate vorgestellt.

Nukleasen sind eine große und vielfältige Gruppe von DNA/RNA-modifizierenden Enzymen und katalytischen RNAs, die die Phosphodiesterbindungen zwischen Nukleinsäuren spalten37. Nuklease-Enzymfunktionalitäten sind für die DNA-Replikation, -Reparatur und -Verarbeitung erforderlich und können nach ihrer Zuckerspezifität für DNA, RNA oder beides klassifiziert werden. Endonukleasen hydrolysieren die Phosphodiesterbindungen innerhalb eines DNA/RNA-Strangs, während Exonukleasen DNA/RNA-Stränge jeweils ein Nukleotid vom 3'- oder 5'-Ende hydrolysieren und dies entweder vom 3'- bis 5'- oder vom 5'- bis 3'-Ende der DNA38 tun können.

Während viele Nukleaseproteine unspezifisch sind und an mehreren Prozessen beteiligt sein können, sind andere hochspezifisch für eine bestimmte Sequenz oder DNA-Schädigung 6,39,40. Sequenzspezifische Nukleasen werden in einer Vielzahl biotechnologischer Anwendungen eingesetzt, wie z. B. Klonierung, Mutagenese und Genome Editing. Beliebte Nukleasen für diese Anwendungen sind Restriktionsnukleasen41, Zinkfinger-Nukleasen42, transkriptionelle Aktivator-ähnliche Effektor-Nukleasen und zuletzt die RNA-gesteuerten technisch hergestellten CRISPR-Nukleasen43. In jüngster Zeit wurden schadensspezifische Nukleasen identifiziert, wie z. B. die EndoMS-Nuklease, die durch ihre Mismatch-spezifische RecB-ähnliche Nukleasedomäne Spezifität für Fehlanpassungen in der DNA aufweist 5,44. Nukleaseaktivitätsassays wurden in der Vergangenheit als diskontinuierliche Assays mit radioaktiv markierten Substraten durchgeführt; Zusätzlich zu ihren anderen Nachteilen erlauben diese jedoch nicht die Identifizierung der Stelle, die von einem Nukleaseprotein durchtrennt wird, was bei Verwendung fluoreszenzmarkierter Substrate möglich ist45,46. In jüngerer Zeit wurden kontinuierliche Nuklease-Assays entwickelt, bei denen verschiedene DNA-Farbstoffe verwendet werden, die mit DNA in unterschiedlichen Zuständen interagieren. zum Beispiel die Emission eines höheren Fluoreszenzsignals bei der Wechselwirkung mit dsDNA als in ihrem ungebundenen Zustand oder die spezifische Bindung an kurze RNAs47. Andere kontinuierliche Nuklease-Assays verwenden DNA-Haarnadeln mit einer Fluorophorgruppe am 5'-Ende und einem Quencher am 3'-Ende, so dass die Fluoreszenz zunimmt, wenn das Oligonukleotid aufgrund einer Trennung des Fluorophors und des Quenchers48 abgebaut wird. Diese Assays ermöglichen es zwar, die Kinetik von DNA-abbauenden Proteinen zu charakterisieren, sie erfordern jedoch Vorkenntnisse über die Funktion und das Substrat des Enzyms und sind auch auf Enzyme beschränkt, die die DNA-Konformation verändern, um einen Unterschied in der Farbstoffbindung zu verursachen. Aus diesem Grund sind Endpunkt-Assays, die einzelne Nukleaseprodukte auflösen, nach wie vor wünschenswert, um Einblicke in DNA-Modifikationen zu geben, die durch Proteinaktivität verursacht werden.

Hier wird ein detailliertes Verfahren für das Design von fluoreszenzmarkierten DNA/RNA-Oligonukleotiden vorgestellt, die gemischt und angepasst werden können, um Substrate zum Testen der Aktivität neuartiger Nuklease-, Polymerase- und Ligaseenzyme zu erzeugen. Die Validierung dieses Basissatzes von Oligonukleotidsequenzen vereinfacht das experimentelle Design und ermöglicht die wirtschaftliche Profilierung einer Vielzahl enzymatischer Funktionalitäten, ohne dass eine große Anzahl maßgeschneiderter Substrate gekauft werden muss. Es wird ein detailliertes Verfahren zum Durchführen eines Standard-DNA-prozessierenden Enzymassays mit diesen Substraten am Beispiel der DNA-Ligaseaktivität bereitgestellt und Modifikationen für das Assaying und die Analyse von Nuklease- und Polymeraseenzymen beschrieben. Darüber hinaus wird ein modifizierter Assay zur Bestimmung der Cofaktor-Spezifität des DNA-Ligase-Enzyms mit hoher Genauigkeit gegeben, und es werden dual-markierte Sonden verwendet, um die Assemblierung von Mehrkomponenten-Ligationen zu bewerten. Schließlich werden Modifikationen am Basis-Assay-Format diskutiert, um es zur Bestimmung von Protein-DNA-Wechselwirkungen mit denselben Substraten durch den electrophoretic mobility shift assay (EMSA) zu ermöglichen.

Protokoll

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1. Entwicklung und Kauf von Oligonukleotiden

HINWEIS: Entwerfen Sie einzelsträngige Oligonukleotide, die zu den gewünschten Duplexen zusammengebaut und geglüht werden sollen. Einer oder mehrere der Stränge in einem Duplex müssen eine fluoreszierende Einheit tragen, um die Oligonukleotidverarbeitung durch das interessierende Enzym zu verfolgen. Ein Basissatz von einzelsträngigen Sequenzen, die für eine Reihe von Aktivitäten assembliert werden können, ist in Tabelle 1 enthalten.

  1. Integrieren Sie die spezifischen Modifikationen, die für das interessierende Enzym erforderlich sind, wie unten beschrieben.
    1. Für DNA-Ligase-Substrate (Abbildung 1): Assemblieren Sie das einfachste Substrat aus drei Oligonukleotiden: einem 5' phosphorylierten Donorstrang (NL2), einem 5' FAM-markierten Akzeptorstrang (NL1) und einem Komplement, das die beiden verbindet (NL3).
      1. Stellen Sie sicher, dass die Stränge, die den 5'-Endpunkt des ligierbaren Kerbens bilden, phosphoryliert sind, bevor Sie den Substrat-Mastermix in Schritt 2 zusammensetzen. Bestellen Sie dies als Modifikation an NL2 (wie in Tabelle 1 angegeben) oder verwenden Sie eine enzymatische Phosphorylierung mit T4-Polynukleotidkinase nach Resuspendierung der Oligonukleotide.
      2. Eingeschlossen ist die 5'-terminale Phosphorylierung von NL6 und NL8, die das Komplement der in Abbildung 1A dargestellten doppelsträngigen Brüche (NL6/NL7 und NL8/NL9) umfasst, da dies dem natürlichen Substrat, das aus einer Restriktionsendonuklease hergestellt wird, am ehesten ähnelt. Verwenden Sie ein doppelt beschriftetes Substrat, um die relativen Ausdehnungen der Ligation für mehrteilige Baugruppen zu bestimmen (siehe Schritt 6).
      3. Verändern Sie den Komplementstrang, um Fehlanpassungen (NL10) und Lücken (NL11) zu erzeugen.
        HINWEIS: Variationen des einfachen gekerbten Substrats sind in Abbildung 1A dargestellt. Es ist möglich, andere Sequenzen zu verwenden, um eine noch größere Bandbreite an Fehlanpassungen oder längeren Lücken zu erzeugen, indem die unterstrichene Position variiert wird.
      4. Substituieren Sie RNA-Oligonukleotide durch DNA-Oligonukleotide.
        HINWEIS: Variationen des einfachen gekerbten Substrats sind in Abbildung 1B dargestellt. Ein breiterer Bereich von DNA/RNA-Duplexen kann durch zusätzliche Kombinationen des hier gegebenen Basissatzes erzeugt werden, um beispielsweise doppelsträngige Brüche zu erzeugen, die sowohl RNA als auch DNA enthalten. Ein Beispiel für diese Variation finden Sie in Schritt 6 unten, in dem eine Dual-Label-Strategie verwendet wird.
    2. Für DNA-Polymerase-Substrate: Assemblieren Sie die in Tabelle 1 aufgeführten Oligonukleotide NL1 und NL3, um einen einfachen Primer-Verlängerungs-Assay zu erhalten. Untersuchen Sie zusätzliche Aspekte der Polymerase-Aktivität, indem Sie Modifikationen entweder in die Stränge NL1 (Primer) oder NL3 (Template) einführen.
      1. Beschädigte Basenanaloga vor Position 20 in das NL3-Oligonukleotid einbauen, um die Fähigkeit zu bestimmen, beschädigte Läsionen auf dem Template-Strang zu umgehen.
      2. Bauen Sie beschädigte Basenanaloga in das NL1-Oligonukleotid an Position 20 ein, um die Fähigkeit zu bestimmen, einen beschädigten Primer zu verlängern.
      3. Verwenden Sie entweder RNL1 oder RNL3 im Duplex, um die Verlängerung eines RNA-Primers oder die Verwendung eines RNA-Templates zu untersuchen.
    3. Für Nukleasesubstrate (Abbildung 2): Assemblieren Sie Oligonukleotide, um einen nicht erschöpfenden Bereich von doppel- und einzelsträngigen Substraten (Abbildung 2Ai) sowie einen Bereich von geflatterten und gespreizten Übergängen (Abbildung 2Aii) und beschädigten Substraten (Abbildung 2B) zu erhalten.
      1. Um die Ribonuklease-Aktivitäten zu untersuchen, ersetzen Sie iterativ NL1, NL2 und NL3 durch RNL1, RNL2 und RNL3. Verwenden Sie zusätzliche RNA-Versionen von HJ5 und HJ6, um diesen Satz weiter zu erweitern.
      2. Verwenden Sie die Oligonukleotide MD5, MD6 und MD9 mit einer zentral platzierten Modifikation, die oxidative Schäden nachahmt, einem abbasischen Reparaturzwischenprodukt oder einem Desaminierungsprodukt (Abbildung 2B). Die Substrate erkennen die Spaltung des Strangs an dieser Position. Markieren Sie den Komplement-NL3-Strang mit einem orthogonalen Fluorophor wie TAMRA, um eine Doppelstrangspaltung zu erkennen (siehe Schritt 6).
      3. Verwenden Sie eine orthogonale Markierung des Komplementes, um doppelsträngige Schnitte an den nicht übereinstimmenden Stellen sowohl auf der Sonde (NL5 und ND9) als auch auf den Komplementsträngen (MD10 und NL10) zu erkennen.
  2. Bestellen Sie synthetische Oligonukleotide mit relevanten Fluorophoren und anderen Modifikationen bei einem kommerziellen Anbieter.
    HINWEIS: Für die beschriebenen Assays sind ein Synthesemaßstab von 100 nM und eine HPLC-Aufreinigung im Anschluss an die Synthese geeignet.

2. Assemblieren und Glühen von Nukleinsäure-Duplexen

  1. Resuspension und Verdünnung von Oligonukleotiden
    1. Zentrifugieren Sie vor dem Öffnen die lyophilisierten Oligonukleotide in ihren 2-ml-Röhrchen bei voller Geschwindigkeit in einer Tischzentrifuge für 2-5 Minuten, um sicherzustellen, dass sich die Nukleinsäure auf dem Boden des Röhrchens befindet.
    2. Bereiten Sie einen Masterstock von 100 μM vor, indem Sie die Oligonukleotide in TE-Puffer (10 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris), 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)) resuspendieren. Stellen Sie sicher, dass die Oligonukleotide durch wiederholtes sanftes Vortexen und kurzes Zentrifugieren bei voller Geschwindigkeit gründlich resuspendiert werden.
    3. Bereiten Sie ein 10-μM-Rohmaterial vor, indem ein Aliquot des Hauptmaterials mit TE-Puffer verdünnt wird. Das 10-μM-Rohmaterial wird mit Reinstwasser (MQ-Wasser) verdünnt, um Arbeitsmaterial mit Konzentrationen von 0,5 μM, 0,7 μM oder 2,5 μM gemäß Tabelle 2 herzustellen.
  2. Zusammenfügen und Glühen der Reaktions-Mastermixe
    1. Zur Herstellung der Reaktions-Mastermixe werden die Reaktions-Mastermixe unter Verwendung der in Tabelle 2 angegebenen Kombinationen und der in Tabelle 3 angegebenen Volumina verwendet. Für den Standard-DNA-Ligase-Assay und die meisten anderen hier beschriebenen Assays beträgt die endgültige Pufferzusammensetzung 50 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 10 mM Dithiothreitol (DTT) mit 10 mM Mg als zweiwertigem Kation.
    2. Die Oligonukleotide werden in einem PCR- oder Mikrozentrifugenröhrchen durch Erhitzen auf 95 °C für 5 Minuten mit einem Heizblock oder Thermocycler geglüht. 30 min (Volumen <1 mL) bis 1 h (Volumen >1 mL) auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Bei längeren Oligonukleotiden (>40 nt) ist eine langsamere Abkühlung mit einem Thermocycler mit einer Abwärtsrampe von 95 °C auf 25 °C über einen Zeitraum von 45 min durchzuführen oder das Röhrchen mit der Glühmischung in einem 1-Liter-Becherglas mit kochendem Wasser schwimmen zu lassen und über Nacht auf Raumtemperatur abkühlen zu lassen.
    3. Fügen Sie dem Mastermix nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur Nukleotid-Cofaktoren und andere wärmeempfindliche Pufferkomponenten hinzu. Das endgültige Reaktionsgemisch durch Zugabe von Enzym direkt für den Assay verwenden (siehe Schritt 3 unten) oder für die zukünftige Verwendung bei -20 °C lagern.

3. Standard-Assay-Aufbau

  1. Assemblierung und Initiierung der Assay-Reaktion
    1. Kombinieren Sie 22,5 μl des Substrat-Mastermixes von Interesse mit 2,5 μl der DNA-Ligase oder eines anderen Enzyms von Interesse in einem PCR-Röhrchen. Führen Sie Reaktionen doppelt oder dreifach aus, insbesondere wenn die Ergebnisse quantifiziert werden.
    2. Nehmen Sie eine proteinfreie Kontrolle (nur Puffer) in die Assay-Proben auf. Schließen Sie an dieser Stelle bei Bedarf keine Cofaktor-Steuerelemente ein.
      HINWEIS: Enzyme können bei -20 °C in 50 % v/v Glycerin gelagert werden, so dass sie direkt aus der Lösung pipettiert werden können. Stellen Sie sicher, dass die Enzymlösungen mit Glycerin vor der Zugabe gut gemischt werden, entweder durch Pipettieren zum Mischen oder durch sanftes Vortexen.
  2. Übertragen Sie die Reaktionen sofort bei 25 °C auf eine PCR-Maschine und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang. Variieren Sie die Temperatur und Dauer je nach den optimalen Bedingungen für die Enzymaktivität.
  3. Die Reaktionen werden durch Zugabe von 5 μl Ladefarbstoff (95 % Formamid, 0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Bromphenolblau) abgeschreckt und 5 min lang bei 95 °C inkubiert.

4. Analyse der Untersuchungsergebnisse

  1. Bereiten Sie Tris-Borat-EDTA (TBE)-Harnstoff-PAGE-Gele wie unten beschrieben vor.
    1. Bereiten Sie einen Vorrat von 20 % Acrylamid, 7 M Harnstoff und 1x FSME-Lösung vor. Verwenden Sie für das hier beschriebene Oligonukleotid-Set Acrylamid/Bis-Lösung in einem Verhältnis von 29:1, um eine optimale Auflösung zu erzielen.
    2. Kombinieren Sie für ein Gel 10 ml 20 % Acrylamid und 7 M Harnstofflösung mit 100 μl APS (10 %) und 3 μl Tetramethylethylendiamin (TMED) und gießen Sie es in einen Gelgießer.
  2. Nachdem das Gel fest geworden ist, lassen Sie die Proben auf dem FSME-Harnstoffgel bei 45 - 55 °C laufen.
    1. Lassen Sie das Gel in 1x FSME-Puffer für 30 min bei 10 mA pro Gel mit externer Erhitzung vorlaufen.
    2. Entfernen Sie überschüssigen Harnstoff in den Vertiefungen des Gels, indem Sie mit einer Weidepipette mit 1x FSME spülen.
    3. Laden Sie 10 μl jeder Reaktion und lassen Sie sie 1,0-1,5 h lang bei 10 mA mit externer Heizung laufen.
  3. Visualisieren Sie das Gel auf dem Imager mit den richtigen Einstellungen für das ausgewählte Fluorophor. Verwenden Sie für FAM ein Filterset, das Anregung/Emission bei 495/519 nm anzeigt und in den meisten Imagern als Voreinstellung gespeichert ist.
  4. Quantifizieren Sie die Bandenintensität des Produkts und des Substrats mit Hilfe einer Bildverarbeitungssoftware mit dem Imager oder einem externen Programm wie ImageJ49,50 und berechnen Sie den prozentualen Anteil des Produkts anhand der Formel
    Anteilsformel P/(P+S)×100, die zur Berechnung des Prozentsatzes bei der Datenanalyse verwendet wird.
    Dabei ist P der integrierte Wert des Produktbandes und S der integrierte Bereich des Substratbandes. Im Fall des Beispiels der DNA-Ligase-Reaktion verläuft die Produktbande bei 40 Nukleotiden (nt) und die Substratbande bei 20 nt.

5. Deadenylierung der DNA-Ligase zur Prüfung der Cofaktor-Spezifität

  1. Vorbereitung von Reaktions-Mastermixen
    1. Bereiten Sie einen Satz des Mastermixes vor, der das FAM-markierte NL1-Oligonukleotid enthält, wie in Tabelle 4 beschrieben. Bereiten Sie ein zweites Set vor, das das NL1-Oligonukleotid ohne FAM-Markierung enthält, wie in Tabelle 4 beschrieben.
    2. Erhitzen Sie beide DNA-Duplexe separat 5 Minuten lang auf 95 °C und kühlte sie 30 Minuten lang auf 1 Stunde bei 25 °C ab. Fügen Sie keinem der beiden Mastermixe einen Nukleotid-Cofaktor hinzu.
  2. Assemblierung und Initiierung der Deadenylierungsreaktion
    1. Bereiten Sie eine einzelne Deadenylierungsreaktion für jeden zu testenden Cofaktortyp/jede zu testende Konzentration vor, indem Sie 10 μl des unmarkierten Mastermixes mit 2,5 μl Ligaseenzym kombinieren.
    2. Bereiten Sie zusätzliche Röhrchen ohne Cofaktorenkontrolle und ohne Proteinkontrolle vor (2,5 μl Puffer anstelle des Enzyms hinzugefügt).
    3. Die Reaktionen werden 1-2 Stunden lang bei einer Temperatur inkubiert, die für die optimale Aktivität des Enzyms spezifisch ist. Die Inkubationszeit kann verlängert werden, wenn das Enzym noch adenyliert ist.
  3. Führen Sie die Ligationsreaktion mit dem Cofaktor durch.
    1. Geben Sie 10 μl des markierten Mastermixes und 2,5 μl der gewünschten Nukleotid-Cofaktoren (z. B. ATP, NAD, ADP oder GTP) direkt zur deadenylierten Reaktion (0,1-1 mM Endkonzentration).
    2. 2,5 μl Reaktionspuffer zur Kontrolle ohne Nukleotid-Cofaktor hinzufügen.
    3. Inkubieren Sie die Reaktionen für den gleichen Zeitraum und die gleiche Temperatur wie zuvor verwendet. Quenden und visualisieren Sie, wie in Schritt 4 beschrieben.

6. Verwendung von doppelt markierten Substraten für die geschiente Ligatur oder die mehrteilige Montage

  1. Entwicklung und Kauf eines Oligonukleotids mit einer fluoreszierenden Einheit, die ein anderes Anregungs-/Emissionsspektrum als das bereits verwendete Fluorophor aufweist.
    1. Verwenden Sie in dem hier beschriebenen Aufbau das Oligonukleotid NL2 (TAMRA) mit 5-Carboxytetramethylrhodamin (TAMRA) am 3'-Ende (Tabelle 1).
  2. Stellen Sie den Master-Mix wie unten beschrieben zusammen.
    1. Kombinieren Sie die Komponenten der in Schritt 2 beschriebenen Reaktion, einschließlich der äquimolaren Verhältnisse aller in der Assemblierung verwendeten Oligonukleotide sowie der Puffer- und zweiwertigen Kationen.
    2. Glühen durch Erhitzen bei 95 °C für 5 min und Abkühlen bei 25 °C für 30 min - 1 h. Fügen Sie den Cofaktor und das Enzym hinzu und inkubieren Sie wie in Schritt 3 beschrieben.
  3. Führen Sie die Proben wie in Schritt 4 beschrieben unter Verwendung der entsprechenden Kanäle für das Fluorophorpaar im Substrat durch und bilden Sie sie ab. Im Fall von FAM und TAMRA sind dies die Kanäle Fluorescein (FITC) und Tetramethylrhodamin (TRITC), die auf den meisten Imagern vorhanden sind.

7. Bewertung der DNA-Bindung mittels Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) auf nativem Gel

  1. Bereiten Sie ein 10% natives TBE PAGE Gel wie unten beschrieben vor.
    1. Kombinieren Sie 2,5 ml 40 % Acrylamid, 1 ml 10x FSME, 100 μl 10 % APS, 3 μl TMED und 6,5 ml MQ-Wasser und gießen Sie es in einen Gelgießer.
  2. Assemblieren Sie die Bindungsreaktion wie unten beschrieben.
    1. Montieren Sie das EMSA-Substrat gemäß Tabelle 5 so, dass EDTA (10 mM) enthalten ist und Metallionen weggelassen werden.
    2. Kombinieren Sie 20 μL des EMSA-Substrat-Mastermixes mit 5 μL des Proteins in einem PCR-Röhrchen. Fügen Sie eine proteinfreie Kontrollprobe hinzu. 30 min bei 25 °C inkubieren.
  3. Analysieren Sie durch native Elektrophorese, wie unten beschrieben.
    1. Geben Sie 5 μl 5x nativen Ladefarbstoff (100 mM EDTA, 0,25 % Bromphenolblau, 25 % v/v Glycerin und MQ Wasser bis zu 1 mL) zu den Proben.
    2. Laden Sie das vorbereitete Gel auf und lassen Sie es bei 60 V für 2-3 h mit Kühlung durch Wasserzirkulation laufen, bis die Farbstofffront einige cm über dem Ende des Gels liegt.
    3. Visualisieren und analysieren Sie Gele, wie in Schritt 4 beschrieben.

Ergebnisse

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Ligation durch DNA-Ligase
Die enzymatische Aktivität der DNA-Ligase führt zu einer Vergrößerung des fluoreszenzmarkierten Oligonukleotids, wenn es auf einem Harnstoff-PAGE-Gel sichtbar gemacht wird. Bei den in Tabelle 2 aufgeführten Substraten sowohl für die DNA- als auch für die RNA-Ligation entspricht dies einer Verdopplung der Größe von 20 nt auf 40 nt (Abbildung 3A). Die optimale Enzymaktivität kann durch Änderung von Bedingungen wie Temperatur, Proteinkonzentration oder Inkubationszeit (Abbildung 3B) bestimmt werden. Nukleotid-Cofaktoren, Metall-Cofaktoren (Abbildung 3C). Die relativen Aktivitäten einer Ligase auf verschiedenen Substraten können parallel verglichen werden (Abbildung 3D).

Die Quantifizierung von Produkt- und Substratbanden wird als Prozentsatz des gesamten ligierten Substrats ausgedrückt und, wie in Abbildung 3 gezeigt, kann verwendet werden, um die spezifische Aktivität des Enzyms zu bewerten oder Aktivitätsoptima wie z. B. die Präferenz für zweiwertige Kationen, die Temperatur oder den pH-Wert zu bestimmen.

Die bakterielle DNA-Ligase DV-1-1-Lig (Abbildung 3) ist in der Lage, Nick- und Mismatch-DNA-Substrate zu ligieren und kann sowohl Magnesium als auch Mangan für die Ligationsaktivität verwenden, wobei Magnesium bevorzugt wird. Weitere Einzelheiten zu diesem Enzym sind inAbschnitt 51 enthalten.

Primerverlängerung durch DNA-Polymerase
Die DNA-Polymerase-Aktivität durch die Verlängerung des fluoreszenzmarkierten 20-nt-Primers führt zu einer Größenzunahme von bis zu 40 nt, wenn der hier vorgestellte Oligonukleotidsatz verwendet wird (Abbildung 4A). Teilweise erweiterte Produkte werden als Produktleiter bis zur Größe der Vorlage angezeigt (Abbildung 4B und Abbildung 4C). Der hier dargestellte Primer-Verlängerungs-Assay (Abbildung 4C) führte zur vollständigen Synthese des Primerstrangs.

Abbau durch Nuklease
Die Nukleaseaktivität führt zu einer Verringerung der Größe des fluoreszenzmarkierten Oligonukleotids, wenn es auf einem Harnstoff-PAGE-Gel sichtbar gemacht wird. Nukleasen mit spezifischer Endonuklease-Aktivität können zu einem einzigen 20-nt-Produkt führen (Abbildung 5A-C). Nukleasen mit Exonuklease-Aktivität führen zu fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden unterschiedlicher Größe (Abbildung 5D-F). Hier werden die Ergebnisse eines bakteriellen antarktischen Metagenom-Nukleaseproteins gezeigt, das eine spezifische Endonuklease-Aktivität auf dem doppelsträngigen Substrat der abbasischen Stelle und eine unspezifische Exonuklease-Aktivität auf dem einzelsträngigen Substrat aufweist (Abbildung 5C bzw. Abbildung 5F).

Ligase-Deadenylierung und Nukleotid-Cofaktor-Verwendungsassay
Viele rekombinant exprimierte Ligase-Enzyme werden in einem bereits adenylierten Zustand von ATP oder NAD gereinigt, das von ihrem Wirtabgefangen wurde 51,52,53,54,55. Die Entfernung dieses kovalenten AMP-Zwischenprodukts ist notwendig für die genaue Identifizierung des Bereichs der Nukleotid-Cofaktoren, den das Enzym für die Ligation von Nukleinsäuresubstraten51 verwenden kann. Der Umsatz des adenylierten Ligase-Enzyms mit unmarkiertem Substrat in Abwesenheit eines exogenen Nukleotid-Cofaktors führt zu einer Depletierung des Adenylierungszwischenprodukts. Durch die Verwendung von fluoreszenzmarkierten DNA-Substraten und die Zugabe von Nukleotid-Cofaktoren nur im zweiten Schritt ist jedes Ligationsprodukt, das bei Verwendung eines Fluoreszenzkanals (Fluorescein-FITC) auf dem Gel-Imager sichtbar ist, das Ergebnis einer Adenylierung mit dem Nukleotid-Cofaktor, der in diesem Schritt hinzugefügt wird.

Aktivitätsassays, die mit einer bakteriellen DNA-Ligase eingerichtet wurden, die in einem E. coli-System exprimiert wurde, zeigen, dass sie in einer präadenylierten Form gereinigt wurde und eine Hintergrundfähigkeit zeigte, die eingeschnittene DNA ohne zusätzlichen Cofaktor zu ligieren (Abbildung 6Ai-ii). Die Zugabe von ATP zur adenylierten Ligase erhöht zwar die Menge des in der Reaktion gebildeten ligierten Produkts, aber dies ist nicht immer zuverlässig, da diese basale Aktivität einen falschen Eindruck der Verwendung von Breitspektrum-Cofaktoren erwecken könnte oder weitere Zusätze von Nukleotid-Cofaktoren zu einer Reaktion die Ligation des Substrats hemmen könnten. Durch die erste Inkubation der Ligase mit einer unmarkierten Version des gekerbten DNA-Substrats wird das AMP umgedreht und es wird keine Ligation auf dem markierten DNA-Nick-Substrat beobachtet, es sei denn, ATP wird der Reaktion zugesetzt. Der zweite Aktivitätsassay (Abbildung 6B) zeigt, dass die deadenylierte DNA-Ligase durch die Zugabe von ATP und ADP eine verbesserte Ligationsaktivität auf dem Nick-DNA-Substrat aufweist. Es gibt auch eine gewisse Verbesserung der Ligation durch die Zugabe von GTP, die größer ist als die Hintergrundligation, die bei der No-Cofaktor-Kontrolle beobachtet wurde. Die Ligation, die bei Reaktionen mit NAD beobachtet wird, ist vergleichbar mit der Ligation, die bei den No-Cofaktor-Kontrollreaktionen beobachtet wird, was NAD als Cofaktor für die Ligation ausschließt.

Ergebnisse des dual-markierten Assays
Die orthogonalen Fluorophore können verwendet werden, um die Aktivität in verschiedenen Teilen eines komplexen Substrats zu etablieren. Das Beispiel in Abbildung 7 zeigt die Aktivität einer kürzlich beschriebenen DNA-Ligase R2D56 im Vergleich zu einer T4-DNA-Ligase auf einem geschienten DNA/RNA-Duplex. Die Ligation des DNA-Akzeptors an den RNA-Donorabschnitt des Substrats wurde mit 6-FAM nachgewiesen, während die Ligation des RNA-akzeptors an einen DNA-Donor mit 5-TAMRA nachgewiesen wurde (Abbildung 7A). Das relative Ausmaß der DNA-Ligation an beiden Enden des RNA-Substrats könnte durch das Vorhandensein einer Produktbande mit Fluoreszenz sowohl im 6-FAM- als auch im 5-TAMRA-Kanal bewertet werden, die im Kompositbild gelb erscheint, während die einzelnen 6-FAM und 5-TAMRA grün bzw. gelb sind (Abbildung 7B). Wie in einer früheren Veröffentlichung56 beschrieben, war nur die R2D-Ligase in der Lage, DNA an das 5'-Ende der RNA zu ligieren, während beide Ligasen in der Lage waren, DNA an das 3'-Ende der RNA zu ligieren. Bei der Ligation beider DNA-Moleküle an die RNA in Einzelreaktionsgemischen kann die R2D-Ligase die DNA-Oligos an beide Enden der RNA ligieren, da sich eine Bande nach oben verschiebt und eine Farbänderung zu Gelb beobachtet wird (Abbildung 7C).

Das zweite Beispiel in Abbildung 8 verwendet einen dualen Markierungsansatz, um die Ligation mehrerer Oligonukleotide bei unterschiedlichen pH-Werten zu demonstrieren. Das Substrat, das aus einer Mischung von sieben Oligonukleotiden zusammengesetzt ist, wurde verwendet, um die Fähigkeit der R2D-Ligase zu zeigen, kurze Fragmente zusammenzusetzen. Der 5'-Strang weist einen FAM-Fluorophor-markierten 14-nt-Strang auf, während der Komplementstrang ein TAMRA-Fluorophor am 3'-Ende des 16-nt-Oligonukleotids aufweist. Eine erfolgreiche Ligation ist an zusätzlichen höheren Banden für das FAM-Oligo (grün) und das TAMRA-Oligo (rot) zu erkennen. Die Überlappung beider Fluorophore ergibt die Nukleotidbande in Gelb als vollständig ligierte Stränge gleicher Größe.

Ergebnisse der DNA-Bindung von einem DNA-Ligase-Enzym mittels EMSA
Die Bindung des DNA-Ligase-Enzyms an eine phosphorylierte gekerbte DNA führt zu einem Komplex, der mit einem höheren Molekulargewicht als das Oligonukleotid allein abläuft (Abbildung 9A). Hier wird die Bindung einer bakteriellen ATP-abhängigen DNA-Ligase an das Nick-DNA-Substrat gezeigt. Bei hohen Proteinkonzentrationen wird der Großteil des markierten DNA-Substrats gebunden und in den höheren Molekulargewichtsbanden angezeigt. Bei niedrigeren Proteinkonzentrationen überwiegt das freie DNA-Substrat (Abbildung 9B).

Diagramm der DNA/RNA-Ligase-Substrate; Nick, stumpf, kohäsiv, Diskrepanz, Lücke; RNA-DNA-Hybridstränge.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der verschiedenen Nukleinsäuresubstrate, die für die Prüfung der enzymatischen Aktivität der Ligase entwickelt wurden. Sterne stellen die Markierung mit dem 6-Carboxyfluorescein am 5'-Ende (5' FAM) dar. Markierte Stränge werden durch eine schwarze oder dunkelblau/rote (im Falle von DNA/RNA-Duplexen) Linie angezeigt, während unmarkierte Teile von Substratduplexen durch eine graue oder hellblaue/rote (im Fall von DNA/RNA-Duplexen) Linie gekennzeichnet sind. Markierte Stränge sind 20 nt, und wenn Stränge ligiert sind, bilden sie ein 40 nt Produkt. 5'-phosphorylierte Stellen sind durch ein P in einem Kreis gekennzeichnet. Oligonukleotidstränge sind markiert, und die Namen sind in Tabelle 1 und Tabelle 2 aufgeführt. (A) Design von doppelsträngigen DNA-Substraten mit verschiedenen Arten von Brüchen, die zum Testen der enzymatischen Aktivität von DNA-Ligasen verwendet werden. (B) Design von RNA- und RNA/DNA-Doppelstrangsubstraten, die DNA- und RNA-Oligonukleotide enthalten. Die Substrate enthalten eine einzelne Nick-Stelle und werden verwendet, um die Fähigkeit von Ligasen zu testen, Nick-Brüche von RNA/DNA-Duplexen abzudichten. Die rote Linie stellt RNA-Oligonukleotide dar, und die blauen Linien stellen DNA-Oligonukleotide dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

DNA-Substrat-Diagramm: Nuklease, modifiziert, beschädigt. Typen: Ds, Ss, Schwanz, Klappe, Spreizung. Base-Diskrepanzen.
Abbildung 2: Schematische Darstellung der verschiedenen Nukleinsäuresubstrate, die für den Test der enzymatischen Aktivität von Nukleasen entwickelt wurden. Die Sterne stellen die Markierung mit dem 6-Carboxyfluorescein am 5'-Terminal (5' FAM) dar. Beschriftete Stränge sind durch eine schwarze Linie gekennzeichnet, während unbeschriftete Teile von Substratduplexen durch eine graue Linie gekennzeichnet sind. 5'-phosphorylierte Stellen sind durch ein P in einem Kreis gekennzeichnet. Oligonukleotidstränge sind markiert, und die Namen sind in Tabelle 1 und Tabelle 2 aufgeführt. (A) Gestaltung von Substraten mit doppel- und einzelsträngigen Anteilen. (B) Das Design von doppelsträngigen DNA-Substraten wird modifiziert, um einzelsträngige Lappen am 3'- oder 5'-Ende zu erzeugen (Flapped 3', flapped 5' oder flapped both ends (sspreized)). (C) Gestaltung von doppelsträngigen Substraten mit beschädigten Basen oder Fehlanpassungen an einer zentralen Position. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

DNA-Ligationsprozess, PAGE-Gel-Analyse; Enzym-Substrat-Interaktion, Ergebnisse der Elektrophorese.
Abbildung 3: Test der Ligationsaktivität einer bakteriellen ATP-abhängigen DNA-Ligase DV-1-1-Lig. (A) Schematische Darstellung von Enzymassays zur Ligaseaktivität auf DNA-Substraten mit Ergebnissen, die an einem FSME-Harnstoff-PAGE-Gel analysiert wurden. Sterne stellen die Markierung mit dem 6-Carboxyfluorescein am 5'-Terminal (5' FAM) dar. Markierte Stränge sind durch eine schwarze Linie gekennzeichnet, während unbeschriftete Teile von Substrat-Duplexen, die während der Analyse nicht sichtbar sind, durch graue Linien gekennzeichnet sind. (B) Quantifizierung der Ligation durch DV-1-1-Lig an gekerbter DNA zu verschiedenen Zeitpunkten. Die Aktivität gegen jedes Substrat wurde doppelt durchgeführt. Die Reaktionen wurden für verschiedene Zeiträume (0,5 h, 1 h, 2 h, 3 h und 4 h) bei 25 °C inkubiert, mit einer finalen Proteinkonzentration von 4 μM, einer finalen ATP-Endkonzentration von 1 mM und einer finalen Magnesiumionenkonzentration von 10 mM. (C) Ligation des eingekerbten DNA-Substrats mit Magnesium (Mg) oder Mangan (Mn). Die Reaktionen wurden 3 Stunden lang bei 25 °C mit einer ATP-Endkonzentration von 1 mM und einer Endkonzentration von Metallionen von 10 mM durchgeführt. (D) Ergebnisse der Ligation auf verschiedenen DNA-Substraten. Die Reaktionen wurden 8 h lang bei 20 °C mit einer Endproteinkonzentration von 2 μM, einer Endkonzentration von ATP von 1 mM und einer Endkonzentration von Magnesium von 10 mM durchgeführt. Die Zugabe von Protein zur Reaktion wird durch ein Pluszeichen (+) angezeigt. Kontrollreaktionen werden durch C und das Fehlen des enthaltenen Proteins durch ein Minuszeichen (-) gekennzeichnet. Produkt (40 nt) und Substrat (20 nt) sind durch rote Pfeile gekennzeichnet. Die Ergebnisse der Aktivitätsassays wurden mit Hilfe eines bildgebenden Systems visualisiert. Die Banden wurden durch Integration der Intensität mit der ImageJ-Software49 quantifiziert und die Diagramme wurden mit einer Grafiksoftware erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

DNA-Polymerase-Reaktionsdiagramm; denaturierendes PAGE-Gel; Produktanalyse, DNA-Erweiterungsprozess.
Abbildung 4: DNA-Polymerase-Assay. (A) Schematische Darstellung des Primer-Verlängerungsassays auf einem DNA-Substrat. Sterne stellen die Markierung mit dem 6-Carboxyfluorescein am 5'-Terminal (5' FAM) dar. Markierte Stränge sind durch eine schwarze Linie gekennzeichnet, während unbeschriftete Teile von Substrat-Duplexen, die während der Analyse nicht sichtbar sind, durch graue Linien gekennzeichnet sind. (B) Schematische Darstellung der Ergebnisse eines erwarteten FSME-Harnstoff-PAGE-Gels, das eine Zunahme der Länge des markierten Primers durch Zugabe von Nukleotiden zeigt. (C) Beispiel für eine Primerverlängerung mit dem DNA-Polymerase-Enzym E. coli Klenow-Fragment. Die Zugabe von Protein zur Reaktion wird durch ein Pluszeichen (+) angezeigt. Spur 1, 12,5 HE; Spur 2, 2,5 HE; Spur 3, 1,25 HE. Kontrollreaktionen werden durch ein C gekennzeichnet, und das Fehlen des enthaltenen Proteins wird durch ein Minuszeichen (-) angezeigt. Die Reaktionen wurden 15 Minuten lang bei 25 °C durchgeführt und enthielten 5 mM MgCl2, 50 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl2, 1 mM DTT und 0,25 mM dNTPs. Produkt (40 nt) und Substrat (20 nt) sind durch rote Pfeile gekennzeichnet. Die Ergebnisse der Aktivitätsassays wurden mit Hilfe eines bildgebenden Systems visualisiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

DNA-Spaltungsanalyse, PAGE-Geldiagramm; Temperatureffekt, Ioneneinfluss; Visualisierung der Enzymaktivität.
Abbildung 5: Testaktivität einer bakteriellen antarktischen Metagenom-Nuklease unter Verwendung verschiedener Substrate, Metalle und Inkubationstemperaturen. (A) Schematisch-spezifische Endonuklease-Aktivität eines Nukleaseproteins auf dem Substrat der abbasischen Stelle (gekennzeichnet durch ein x). Sterne stellen die Markierung mit dem 6-Carboxyfluorescein am 5'-Terminal (5' FAM) dar. Schwarze Linien stellen die markierten Stränge dar, und graue Linien stellen die unmarkierten DNA-Stränge dar. Spezifisches Schneiden durch die Nuklease ist auf der rechten Seite der Abbasenstelle dargestellt, kann aber auch auf der linken Seite auftreten. (B) Schematische Darstellung eines denaturierenden Harnstoff-PAGE-Gels mit ungeschnittenem Substrat (40 nt) in Abwesenheit eines Proteins, das durch ein Minuszeichen (-) gekennzeichnet ist, und des geschnittenen Produkts (20 nt) in Gegenwart einer Nuklease, die durch ein Pluszeichen (+) gekennzeichnet ist. (C) Ein Beispiel für ein FSME-Harnstoff-PAGE-Gel, das Ergebnisse der spezifischen Endonuklease-Nuklease-Aktivität auf einem doppelsträngigen DNA-Substrat mit einer abbasischen Stelle zeigt. Der Assay wurde mit einer Proteinkonzentration von 1,0 μM und 1 mM MgCl2 durchgeführt. Es wurden zwei Kontrollreaktionen bei 20 °C durchgeführt, eine ohne Protein (Vertiefung 1) und eine ohne Metall (Vertiefung 2). Die Reaktionen wurden 5 h lang bei steigenden Temperaturen von 1 °C auf 50 °C inkubiert, wie oben im Gelbild gezeigt. Die Zugabe des Proteins wird durch ein Pluszeichen (+) und das Fehlen des Proteins durch ein Minuszeichen (-) angezeigt. Der Untergrund und das Produkt sind durch rote Pfeile gekennzeichnet. (D) Schematische Darstellung der unspezifischen Exonuklease-Aktivität eines Nukleaseproteins auf einem einzelsträngigen Substrat. Sterne stellen die Markierung mit dem 6-Carboxyfluorescein am 5'-Terminus (5'FAM) dar. Schwarze Linien stellen die beschrifteten Strähnen dar. Das unspezifische Schneiden der Nuklease führt zu markierten Strängen unterschiedlicher Länge (<39 nt). (E) Schematische Darstellung eines denaturierenden Harnstoff-PAGE-Gels, das ein ungeschnittenes Substrat (40 nt) zeigt, bei dem kein Protein hinzugefügt wurde (-), und ein geschnittenes Substrat unterschiedlicher Länge, bei dem das Protein hinzugefügt wurde (+), das aus der Aktivität einer unspezifischen Exonuklease resultieren kann. (F) FSME-Harnstoff-PAGE-Gele zeigen ein Beispiel für die unspezifische Exonuklease-Aktivität derselben antarktischen Metagenom-Nuklease mit einem einzelsträngigen Substrat. Der Assay wurde bei 20 °C für 4 h mit einem Protein in einer Endkonzentration von 1,5 μM und einer Endkonzentration des Metallions bei 10 mM durchgeführt. Das verwendete Metallion ist oberhalb des Bildes angegeben. Die Zugabe des Proteins wird durch ein Pluszeichen (+) und das Fehlen des Proteins durch ein Minuszeichen (-) angezeigt. Das Substrat (40 nt) ist durch den roten Pfeil gekennzeichnet, die unterschiedlich langen Produkte sind durch die rote Klemme gekennzeichnet. Die Ergebnisse aller Nukleasereaktionen wurden mit Hilfe eines bildgebenden Systems visualisiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ligationseffizienzdiagramm und Gelanalyse, Einfluss von ATP und Cofaktoren, Ergebnisse der DNA-Ligase-Aktivität.
Abbildung 6: Ligationsergebnisse von gekerbtem DNA-Substrat durch adenylierte und deadenylierte Versionen einer bakteriellen DNA-Ligase. (A) i) Quantifizierung der Ligation durch adenyliertes und deadenyliertes Ligase-Enzym, mit und ohne ATP. Die Punkte im Diagramm stellen die Durchschnittswerte jeder Reaktionsreplik dar. Standard-Fehlerbalken sind im Lieferumfang enthalten. ii) FSME-Harnstoff-PAGE-Gel, das die Ergebnisse der Ligation auf dem Nick-DNA-Substrat durch adenyliertes und deadenyliertes Ligase-Enzym mit und ohne ATP zeigt. Die Reaktionen wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt. Das deadenylierte Enzym wurde für 2 h bei 25 °C mit unmarkiertem Nick-DNA-Substrat und 0,1 μM Enzym vorinkubiert, gefolgt von einer 1-stündigen Inkubation mit markiertem Nick-DNA-Substrat. Das adenylierte Enzym wurde nicht mit dem unmarkierten Substrat vorinkubiert. ATP (1 mM) wurde den Reaktionen zusammen mit der Zugabe von markiertem DNA-Substrat zugesetzt. (B) i) Quantifizierung der Ligation durch die deadenylierte Ligase auf Nick-DNA mit verschiedenen Cofaktoren (ATP, NAD, ADP und GTP). Die Punkte in der Grafik stellen die Durchschnittswerte der einzelnen Konzentrationen dar. Fehlerbalken mit Standardabweichung sind enthalten. ii) FSME-Harnstoff-PAGE mit den Ergebnissen der Ligation durch die Ligase, mit und ohne Zusatz verschiedener Cofaktoren. Die Aktivität gegen jedes Substrat wurde doppelt durchgeführt. Die Reaktionen wurden 2 Stunden lang bei 25 °C mit unmarkiertem gekerbtem DNA-Substrat, 4 μM Protein und 5 mM Magnesiumion vorinkubiert, gefolgt von einer 4-stündigen Inkubation mit Zugabe von markiertem gekerbtem DNA-Substrat, 5 mM Magnesium und verschiedenen Cofaktoren bei einer Endkonzentration von 1 mM. Die Zugabe von Protein zur Reaktion wird durch ein Pluszeichen (+) angezeigt. Es wurden Kontrollreaktionen verwendet, die kein Protein (Kontrollen, C) oder Cofaktor (kein Cofaktor) enthielten. Produkt (40 nt) und Substrat (20 nt) sind durch rote Pfeile gekennzeichnet. Die Ergebnisse der Aktivitätsassays wurden mit Hilfe eines bildgebenden Systems visualisiert. Die Banden wurden durch Integration der Intensität mit der ImageJ-Software49 quantifiziert. Die Diagramme wurden mit einer Grafiksoftware erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

DNA-Ligationsanalyse mit FAM/TAMRA-Markierungen: Diagramm, Gelergebnisse, PAGE-Geldiagramm, Ligaseaktivität.
Abbildung 7: Ligation von kurzen fluoreszenzmarkierten DNA-Oligonukleotiden an beide Enden eines 5' phosphorylierten RNA-Oligos, positioniert durch DNA-Templates. (A) Schematische Darstellung einer DNA-geschienten DNA-RNA-Ligation, die zeigt, wie mögliche Ligationsprodukte mit einer Dual-Labeling-Strategie visualisiert werden können. (B) Schematische Darstellung möglicher Produkte, die auf einem Harnstoff-PAGE-Gel erwartet werden, das in zwei Kanälen abgebildet wird. (C) Experimentelle Ergebnisse aus der dualen Fluorophor-Ligatur. Die Ligationsreaktionen wurden mit T4-DNA-Ligase und R2D-Ligase getestet, beide in isolierten Reaktionen, bei denen die DNA entweder an das 5'-Ende (Spur 2-4) oder an das 3'-Ende (Spur 5-7) der RNA ligiert wurde, oder in einer einzigen Reaktion, bei der beide DNA-Oligonukleotide in derselben Reaktionsmischung (Spur 8-10) ligiert wurden. Bei keiner Proteinkontrolle (NPC) wurde kein Enzym hinzugefügt. Die Reaktionsbedingungen und die spezifischen Oligonukleotide, die in diesem Beispiel verwendet werden, sind die gleichen wie in56 gegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

DNA-Ligationsdiagramm mit Elektrophoreseergebnissen, die die Ligationseffizienz über alle pH-Werte zeigen.
Abbildung 8: Ligation mehrerer kurzer Oligonukleotidsegmente mit drei R2D-Varianten bei unterschiedlichem pH-Wert. (A) Schematische Darstellung der mehrteiligen Ligationsstrategie. (B) Repräsentatives Gel, das die pH-Abhängigkeit einer mehrteiligen Anordnung zeigt, abgebildet sowohl mit FAM- als auch mit TAMRA-Kanälen. Spur C keine Enzymkontrolle, Spur 1-3 pH 6,0, Spur 4-6 pH 6,5, Spur 7-9 pH 7 und Spur 10-12 pH 7,5. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Das Elektrophoresediagramm und das Gelergebnis zeigen eine Variation der Protein-Substrat-Bindung mit abnehmender Proteinkonzentration.
Abbildung 9: EMSA-Ergebnisse. Schematisches und natives TBE PAGE-Gel eines elektrophoretischen Mobilitäts-Shift-Assays (EMSA), das die Bindungsaktivität einer ATP-abhängigen DNA-Ligase (aus Metagenomdaten aus den McMurdo Dry Valleys, Antarktis) auf einem DNA-Substrat visualisiert. (A) Schematische Darstellung der EMSA/DNA-Bindungsaktivität durch eine DNA-Ligase auf Nick-DNA-Substrat. Die Bindungsergebnisse werden auf einem nicht denaturierenden TBE PAGE Gel visualisiert. DNA-Substrate, die an das Ligase-Enzym gebunden sind, wandern langsamer durch das Gel, während enzymfreie Substrate schneller wandern, was zu einer Verschiebung der Bandengröße (gelbe Kästchen) führt, die auf dem Gel sichtbar ist. Während die Substrate auf einem nicht denaturierenden Gel sichtbar gemacht werden, bleiben die Oligonukleotide geglüht, so dass der FAM-markierte Strang (gelber Stern) sowohl auf freien als auch auf gebundenen Substraten vorhanden sein kann. Ein Proteinkonzentrationsgradient kann verwendet werden, um die Proteinkonzentration für eine optimale Bindung zu bestimmen. (B) Visualisierung eines EMSA auf einem nativen TBE PAGE-Gel, das die Bindungsfähigkeit einer ATP-abhängigen DNA-Ligase an ein Nick-DNA-Substrat bei unterschiedlichen Proteinkonzentrationen zeigt. Das Enzym wurde mit gekerbtem DNA-Substrat für 30 min bei 25 °C inkubiert, mit 1 mM ATP-Endkonzentration und 40 mM EDTA. Es wurden drei verschiedene Proteinkonzentrationen verwendet (5,5 μM, 2,3 μM und 1,5 μM). Die Reaktionen wurden mit einem 10 % nativen FSME-Gel durchgeführt, wobei die Reaktionen mit nativem Beladungsfarbstoff beladen waren. Proteinhaltige Proben wurden in dreifacher Ausfertigung für unterschiedliche Proteinkonzentrationen durchgeführt. Die Kontrolllanen enthalten genicktes DNA-Substrat mit 1 mM, endgültigem ATP und EDTA, aber kein Protein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: DNA-Substrat-Oligonukleotidsequenzen, die zur Konstruktion von Assay-Substraten verwendet werden. Schäden sind fett und unterstrichen gekennzeichnet. Positionen von Diskrepanzen und Lücken im endgültigen Duplex sind unterstrichen. Abkürzungen: 5' 6-Carboxyfluorescien (5' FAM), 8-Oxo-Desoxyguanosin (8OxodG), abasisches Tetrohydrofuran (dSpacer). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Kombinationen von Oligonukleotiden, die zur Zusammenstellung von Mastermixen für verschiedene Enzymassays verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 3: Aufbau von Assay-Mastermixen mit bis zu vier Oligonukleotiden. Siehe Tabelle 2 für Oligonukleotidkombinationen, die für verschiedene Assay-Substrate verwendet werden können, und Text für Details zu den Reaktionsbedingungen. Mindestens ist ein markiertes Oligonukleotid erforderlich - zusätzliche Teile des Duplex sind durch Klammern gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 4: Komponenten für einen markierten und unmarkierten Mastermix zur Herstellung von Nick-DNA-Duplex. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 5: Aufbau von EMSA-Mastermixen für verschiedene Kombinationen von Duplexen. Siehe Tabelle 3 für Oligonukleotidkombinationen, die für verschiedene EMSA-Substrate verwendet werden können, und Text für Details zu den Reaktionsbedingungen. Die EMSA-Substrate werden unter Verwendung der gleichen Oligonukleotide wie die für die Aktivitätsassays entwickelt. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kritische Schritte im Protokoll
Oligonukleotiddesign und -kauf: Beim Kauf von Oligonukleotiden für die Duplexbildung ist es wichtig, das Sequenzdesign zu berücksichtigen. Es wird empfohlen, vor der Bestellung ein Oligo-Analysewerkzeug zu verwenden, um die Eigenschaften der Nukleotidsequenz wie GC-Gehalt, Schmelztemperatur, Sekundärstruktur und Dimerisierungspotenzial vorherzusagen57.

Assemblierung und Annealing von Nukleinsäure-Duplexen: Bei der Herstellung von RNA/RNA-DNA-Duplexen sollte darauf geachtet werden, eine RNase-Kontamination zu vermeiden, indem Reagenzien und Wasser verwendet werden, die RNase-frei sind, oder ein RNAsse-Inhibitor hinzugefügt wird (solange das zu untersuchende Enzym nicht selbst eine RNAse ist). Ausrüstung, Handschuhe und Platz auf dem Labortisch sollten vor dem Zusammenbau der Mastermixe mit einer RNase-Dekontaminationslösung behandelt werden, um einen Abbau der Oligonukleotide58 zu vermeiden. Masterbestände der RNA-Oligonukleotide können im Falle einer Kontamination in kleineren Chargen aufgefüllt werden.

DNA-Ligasen benötigen immer einen Nukleotid-Cofaktor, entweder ATP oder NAD, in einer Endkonzentration zwischen 0,1 und 1 mM. DNA-Polymerasen benötigen dNTPs für die Strangsynthese, und diese werden in der Regel in äquimolaren Verhältnissen von jeweils 50 μM zugegeben. Bei der Herstellung von Mastermixen für Ligase- und Polymerase-Duplexe müssen Nukleotid-Cofaktoren wie ATP, NAD und dNTPs dem Mastermix zugesetzt werden, nachdem die Mischung erhitzt und auf Raumtemperatur abgekühlt wurde, da sie wärmeempfindlich sind.

Der 10x-Puffer zum Glühen der Oligonukleotide erfordert die Zugabe von DTT, das eine kurze Halbwertszeit hat und idealerweise vor der Verwendung frisch oder gefroren zubereitet werden muss. Kleinere Aliquots des 10x-Puffers können im Voraus vorbereitet und bei 4 °C gelagert werden, wobei vor der Verwendung DVB-T hinzugefügt wird.

Oligonukleotidbestände und Mastermixe sollten für den Langzeitgebrauch bei -20 °C gelagert und fluoreszenzmarkierte Oligonukleotide oder Mischungen in Folie eingewickelt werden, um ein Photobleichen des Fluorophors zu verhindern. Um wiederholte Gefrier-Auftau-Zyklen zu vermeiden, die die Integrität des Oligonukleotids beeinträchtigen können, ist es ratsam, kleinere Volumina (>1 ml) vorzubereiten und zu verwenden.

Aufbau des Assays und Analyse der Ergebnisse: Die Einbeziehung von Kontrollen ist für die korrekte Interpretation der Assay-Ergebnisse unerlässlich. Es sollte eine proteinfreie Kontrolle (DNA-Substrat mit Pufferlösung) verwendet werden, um sicherzustellen, dass die offensichtliche Aktivität auf dem Substrat das Ergebnis des Enzyms ist. Im Falle der Nuklease führt der exogene Substratabbau zu Banden mit niedrigem Molekulargewicht oder Laddering in der Kontrolle, während im Fall von Ligase oder Polymerase eine unvollständige Duplexdenaturierung zu einer Bande mit hohem Molekulargewicht in der Kontrolle führt. Eine Positivkontrolle der Größe des erwarteten Produkts ist in Tabelle 2 enthalten und sollte einbezogen werden, um die korrekte Produktgröße zu überprüfen.

Wichtige Parameter für eine erfolgreiche Elektrophorese des Assay-Produkts wurden in einem früheren Protokollbeschrieben 59. Dazu gehören die Sicherstellung, dass der Acrylamidanteil für die Substratgröße geeignet ist, und die Verwendung eines geeigneten Ladefarbstoffs in Abhängigkeit von der Größe des Substrats und der Art des Gels, das für die Visualisierung der Ergebnisse erforderlich ist. Der Tracking-Farbstoff Bromphenolblau läuft in der ungefähren Größe eines 10-Basen-Oligonukleotids und ist daher für den hier beschriebenen Oligonukleotidsatz geeignet; Wenn jedoch bei der Verwendung kürzerer Nukleotide ein Farbstoffband mit dem Fluoreszenzprodukt oder den Substratbanden überlappt, kann der Tracking-Farbstoff gegen Xylolcyanol ausgetauscht werden, das langsamer läuft60.

Um eine gute Auflösung der Substrat-/Produktbanden zu gewährleisten, sollte der Geltank entweder extern mit einem Wasserbad beheizt werden oder mit einer hohen Spannung (z. B. 180 V) betrieben werden. Es ist wichtig, Harnstoff-PAGE-Gele mindestens 30 Minuten lang vorlaufen zu lassen und die Vertiefungen mit einer Pipette zu spülen, um überschüssigen Harnstoff zu entfernen, um scharfe, gerade Banden zu erhalten, die für die Quantifizierung geeignet sind.

Für die Quantifizierung von Substraten und Produkten sollte ein Bereich von 20 % bis 80 % des Gesamtmaterials in Produkt umgewandelt werden, um eine genaue Integration der fluoreszierenden Gelbanden zu ermöglichen. Bei der Untersuchung eines neuen Enzyms wird empfohlen, einen Gradienten der Proteinkonzentrationen durchzuführen, um nachfolgende Messungen in diesem Bereich zu ermöglichen. Viele Fluoreszenz-Imager verfügen über integrierte Bandintegrationsfunktionen, die zu diesem Zweck verwendet werden können. Wenn Sie ein externes Programm wie ImageJ49 verwenden, stellen Sie sicher, dass das Gelbild in hoher Qualität im tiff-Format exportiert wird.

Modifikationen und Fehlerbehebung der Technik
Oligonukleotiddesign und -kauf: Die in diesem Protokoll angegebenen Oligonukleotide sind nützliche Ausgangspunkte und können, wie im Methodenabschnitt vorgeschlagen, durch Änderung der Oligonukleotidsequenzen und Einbeziehung von Modifikationen erweitert werden.

Standard-Assay-Aufbau und Analyse der Ergebnisse: Pilotversuche sind unerlässlich, um die Aktivität eines neuen Enzyms zu testen, da die optimalen Reaktionsbedingungen zwischen verschiedenen Proteinen variieren. Die in diesem Protokoll angegebenen Parameter dienen nur als Ausgangspunkt. Faktoren wie Enzymkonzentration, Reaktionstemperatur, Inkubationsdauer, Cofaktor und Pufferzusammensetzung/pH-Wert können während des Mastermix- und Assay-Reaktionsaufbaus variiert werden. Die Cofaktorenkonzentrationen sind besonders wichtig, da ein Überschuss an Nukleotid-Cofaktoren oder Metallionen hemmend sein kann, und es ist ratsam, eine Reihe von Konzentrationen von jedem zu testen. Für DNA-Polymerasen liegen die empfohlenen dNTP-Konzentrationen zwischen 20 und 200 μM insgesamt, hohe dNTP-Konzentrationen verringern jedoch die Genauigkeit61. Ebenso werden Polynukleotid-Ligasen typischerweise mit 0,1-1,0 mM Nukleotid-Cofaktor untersucht, aber übermäßige Konzentrationen führen zu Adenylat und Reaktionshemmung der akkumulierten DNA62.

Das Standardprotokoll verwendet hier Mg als zweiwertiges Kationen; Einige Enzyme sind jedoch mit Mangan (Mn) oder Zink (Zn) aktiver. Mastermixe, die Mn oder Zn enthalten, sollten mit einem Puffer mit niedrigerem pH-Wert (<7,5) hergestellt werden, und Metalle sollten nach dem Erhitzen hinzugefügt werden. Mastermixe sollten am selben Tag verwendet werden, um eine Ausfällung und Hemmung der Enzymaktivität zu vermeiden.

Zusatzstoffe, einschließlich Crowding-Mittel wie Polyethylenglykol (PEG) oder Stabilisatoren wie Rinderserumalbumin, können verwendet werden, um die Aktivität einiger Enzyme zu erhöhen63,64. Diese sollten aufgrund ihrer Thermolierbarkeit nach dem Glühschritt zugegeben werden. Alle biologisch gewonnenen Reagenzien sollten molekularbiologisch sein, um die Einführung kontaminierender Nukleasen zu vermeiden.

Das Volumen des Formamid-Quench-Puffers, das in diesem Protokoll verwendet wird, ist für den Basissatz von Oligonukleotiden geeignet. Bei längeren Oligonukleotiden sollte das Formamidvolumen jedoch auf 10 μl bis 20 μl erhöht werden, um eine vollständige Strangtrennung zu gewährleisten, und abgeschreckte Reaktionen können auf Eis abgekühlt und bis zur Elektrophorese bei 4 °C gelagert werden.

Bei einigen Enzymen kann eine enge Bindung des Proteins an das Substrat/Produkt eine Migration der Oligonukleotide in das Gel während der Elektrophorese ausschließen, insbesondere wenn das Enzym in hohen Konzentrationen verwendet wird. Dies äußert sich als ein Mangel an Produkt-/Substratbanden auf dem Gel und oft als Ansammlung von fluoreszierendem Material (Produkt und/oder Substrat, das mit Protein komplexiert ist) in den Vertiefungen. Um diese Komplexe aufzubrechen, kann das Assay-Gemisch vor der Zugabe von Quench-Puffer mit Proteinase K behandelt werden, oder es kann Natriumdodecylsulfat (SDS) während des Quenchings hinzugefügt werden.

Die Aktivität der DNA-Ligase erzeugt zwei diskrete Banden, die einfach zu quantifizieren sind. Es ist möglich, die gleiche Methode zur Quantifizierung der Endonuklease-Aktivität auf DNA-Schadenssubstrat zu verwenden, wenn ein einzelnes 20-Nukleotid-Produkt erwartet wird, oder EMSA-Assays, bei denen die gebundenen/ungebundenen Zustände klar unterschieden werden. Eine genaue Quantifizierung der Polymerase- und Prozessnukleaseaktivität ist durch Bandenintegration schwierig, und im Allgemeinen wird empfohlen, einen Echtzeit-Assay mit Sonden oder Beacons zu verwenden, wie in der Einleitung beschrieben.

Deadenylierung und Cofaktor-Spezifität der DNA-Ligase: Eine gewisse Optimierung dieses Protokolls kann erforderlich sein, um alle Hintergrundaktivitäten zu entfernen, die dann durch die Zugabe des/der Nukleotid-Cofaktor(en) wiederhergestellt werden. Wenn die Hintergrundligaseaktivität nach der Deadenylierung (in der No-Cofaktor-Kontrolle als Ligation gesehen) bestehen bleibt, kann die Inkubationszeit des Deadenylierungsschritts verlängert oder die Ligasekonzentration verringert werden. Stellen Sie sicher, dass der DNA-Nick-Duplex ohne Markierung konzentrierter ist als das Protein (> 4:1::Substrat: Protein). Wenn die Zugabe eines Cofaktors in Gegenwart von markierter DNA die Ligation für keinen der getesteten Cofaktoren wiederherstellt, ist es möglich, dass das Enzym denaturiert ist, und der Deadenylierungsschritt sollte verkürzt werden. Für eine neue Ligase oder eine neue Charge eines rekombinanten Enzyms ist es nützlich, das Ausmaß der Hintergrundligation mit dem adenylierten Enzym in Abwesenheit zusätzlicher Nukleotid-Cofaktoren zu bestimmen. Dazu wird eine weitere Reaktion aufgebaut, bei der 10 μl unmarkierter Mastermix, 10 μl markierter Mastermix und 2,5 μl eines frischen Enzyms, das nicht deadenyliert wurde, gleichzeitig inkubiert werden.

Verwenden Sie doppelt markierte Substrate: Dieses Protokoll erfordert das Design und den Kauf eines Oligonukleotids mit einer fluoreszierenden Einheit, die ein anderes Anregungs-/Emissionsspektrum als das ursprünglich verwendete Fluorophor aufweist, und dann die Assemblierung dieses zu einem Duplex, so dass die beiden orthogonalen Fluorophore unterschiedliche Abschnitte des Substrats markieren. Im Zweifelsfall stehen eine Reihe von Online-Spektralbetrachtern zur Überprüfung von Anregungs- und Emissionsspektren zur Verfügung, z. B. FPbase Spectra Viewer und BD Spectrum Viewer, mit denen sowohl die Kompatibilität des Fluorophorpaares als auch die am besten geeigneten Imager-Einstellungen überprüft werden können. Die spezifischen Einstellungen, die für die Visualisierung des Gels verwendet werden, hängen vom Modell des Imagers und den verwendeten Fluorophoren ab. Das Kompositbild zeichnet das Signal beider Kanäle auf dem einzelnen Gel auf, und die Bande, an der beide Fluorophore an dasselbe Produkt gebunden sind, wird als Zwischenfarbe angezeigt. Separate Bilder von einzelnen Kanälen können analysiert werden, um das Ausmaß der Ligation oder des Abbaus an differentiell markierten Strängen zu quantifizieren.

Grenzen der Technik
Die Arbeit mit fluoreszenzmarkierten Substraten hat zwar viele Vorteile, wie z. B. geringe Gesundheitsgefahren, aber es gibt einige Einschränkungen, die bei der Arbeit mit dieser Art von markierten Substraten zu beachten sind. Eine davon sind die relativ hohen Kosten für die Bestellung dieser Oligonukleotide mit Fluorophormarkierungen oder Modifikationen, wie z. B. die Zugabe beschädigter Basen, im Vergleich zur hauseigenen Radiomarkierung. Ein weiterer Grund ist, dass für die Erkennung von markierten Strängen spezielle Bildgebungsgeräte und -software erforderlich sind. Diese Funktionen sind jedoch jetzt in den meisten neuen Gel-Imagining-Systemen enthalten. Man sollte auch das Potenzial der Fluorophore in Betracht ziehen, die Bindungseigenschaften der Zielinteraktionsproteine zu verändern. Fluorescein und sein Derivat FAM werden häufig zur Markierung von Oligonukleotiden verwendet und reagieren empfindlich auf Änderungen des pH-Werts und des Nukleobasen-Quenchings65. Diese Einschränkungen sollten bei der Entscheidung über die Art und Platzierung von Fluorophoren auf dem Oligonukleotid für das Duplex-Design sorgfältig berücksichtigt werden.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SEG und UR sind Mitarbeiter von ArcticZymes Technologies AS, die die R2D-Ligase vertreibt. AW, ER-S und RS haben keine konkurrierenden Interessen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AW wird durch ein Rutherford Discovery Fellowship (20-UOW-004) unterstützt. RS ist Empfänger eines neuseeländischen Postantarktis-Stipendiums. SG und UR danken dem Chemischen Institut an der Universität Tromsø - der Norwegischen Arktis-Universität - für die technische Unterstützung.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
30% Acrylamid/Bis-Lösung (29:1)BioRad1610156
Adenosintriphosphat (ATP)Viele Lieferanten
Ammoniumpersulfat (APS)Viele Lieferanten
TischzentrifugeViele Lieferanten
BoratViele Lieferanten
Lieferanten
Dithiothreitol (DTT)Viele Anbieter
Elektrophoresesystem mit zirkulierendem WasserbadViele Anbieter
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)Viele Anbieter
Fluoresnence Imager, z.B. iBright FL1000Thermo Fisher ScientificA32752
FormamidViele Anbieter Lieferanten
Gel-GießsystemViele Lieferanten
HeizblockViele Lieferanten
MagnesiumchloridViele LieferantenAndere Metallionen können je nach untersuchtem Protein bevorzugt werden
Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 mL)Viele Lieferanten
Mikropipetten und SpitzenViele Lieferanten1 mL, 0,2 mL, 0,02 mL, 0,002 mL
Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD+)Viele Lieferanten
OligonukleotideIntegrated DNA TechnologiesNAThermo Fisher, Sigma-Aldrich,  Genscript und andere liefern auch diese
WeidepipetteViele Lieferanten
PCR-ThermocyclerViele Lieferanten
PCR-RöhrchenViele Lieferanten
RNAse awayThermoFisher7002PKNur bei der Arbeit mit RNA-Oligos
benötigt RNase AWAYMerck83931-250MLTensid zur Entfernung von RNAse Kontamination auf Oberflächen
RNAsefreies WasserNew England BiolabsB1500LNur bei der Arbeit mit RNA-Oligos
erforderlich NatriumchloridViele Lieferanten
SUPERase IN RNase-InhibitorThermo Fisher ScientificAM2694Breitspektrum-RNAse-Inhibitir (proteinbasiert)
SYBR GoldThermo Fisher ScientificS11494Dies kann verwendet werden, um Gele nach der Färbung zu färben und unmarkierte Oligonukleotide
. Tetramethylethylendiamin (TMED)Viele Lieferanten
Tris oder Tris(hydroxymethyl)aminomethanViele Lieferanten
Reinstwasser (Milli-Q)Merck
HarnstoffViele Lieferanten
VortexViele Lieferanten
Bromphenolblau Viele Lieferanten sichtbar zu machen

Referenzen

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Nukleins ureenzymeDNA Ligase AssayRNA Ligase AssayFluoreszenzmarkierungPAGE ElektrophoreseDNA ReparaturenzymeNukleaseaktivit tDNA RNA HybrideDesign von Enzymsubstraten

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