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Methodenartikel

Eintierische, einröhrige RNA-Extraktion zum Vergleich der relativen Transkriptspiegel mittels qRT-PCR im Bärtierchen Hypsibius exemplaris

1.3K Aufrufe

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DOI:

10.3791/66935

⸱

3. Januar 2025

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Cellular and Developmental Biology, University of California, Santa Barbara, 2Neuroscience Research Institute, University of California, Santa Barbara

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In dieser Arbeit wird eine Methode zur schnellen RNA-Extraktion und zum Vergleich auf Transkriptebene zur Analyse der Genexpression im Bärtierchen Hypsibius exemplaris vorgestellt. Diese Hochdurchsatzmethode erfordert mittels physikalischer Lyse ein einzelnes Bärtierchen als Ausgangsmaterial und führt zu einer robusten Produktion von cDNA für die quantitative reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR).

Zusammenfassung

Das Bärtierchen Hypsibius exemplaris ist ein aufstrebender Modellorganismus, der für seine Fähigkeit bekannt ist, Umweltextreme zu überleben. Um die molekularen Mechanismen und genetischen Grundlagen einer solchen Extremotoleranz zu erforschen, stützen sich viele Studien auf die RNA-Sequenzierung (RNA-seq), die an Populationen durchgeführt werden kann, die von großen Kohorten bis hin zu einzelnen Tieren reichen. Die Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) und die RNA-Interferenz (RNAi) werden anschließend verwendet, um die RNA-seq-Befunde zu bestätigen bzw. die genetischen Anforderungen an Kandidatengene zu beurteilen. Solche Studien erfordern eine effiziente, genaue und kostengünstige Methode zur RNA-Extraktion und Messung der relativen Transkriptspiegel mittels quantitativer RT-PCR (qRT-PCR). In dieser Arbeit wird eine effiziente Single-tardigrade-RNA-Extraktionsmethode (STST) vorgestellt, die nicht nur RNA aus einzelnen Bärtierchen zuverlässig isoliert, sondern auch den Zeit- und Kostenaufwand für jede Extraktion reduziert. Diese RNA-Extraktionsmethode liefert Mengen an cDNA, die zur Amplifikation und zum Nachweis mehrerer Transkripte durch quantitative PCR (qRT-PCR) verwendet werden können. Die Methode wurde durch die Analyse dynamischer Veränderungen in der Expression von Genen validiert, die für zwei hitzeschockregulierte Proteine, das Hitzeschockprotein 70 β2 (HSP70 β2) und das Hitzeschockprotein 90α (HSP90α), kodieren, wodurch es möglich ist, ihre relativen Expressionsniveaus bei hitzeexponierten Personen mittels qRT-PCR zu bestimmen. STST ergänzt effektiv die bestehenden Extraktionsmethoden für Bulk- und Einzel-Bärtierchen-RNA und ermöglicht eine schnelle und kostengünstige Untersuchung einzelner Bärtierchen-Transkriptionsspiegel mittels qRT-PCR.

Einleitung

Bärtierchen sind kleine mehrzellige Tiere, die für ihre Fähigkeit bekannt sind, extreme Bedingungen zu überleben, die für die meisten anderen Lebensformen tödlich sind1. Zum Beispiel können diese Tiere fast das 1000-fache der Dosis ionisierender Strahlung überleben, die für den Menschen tödlich ist 2,3,4,5,6,7,8,9,10, fast vollständige Austrocknung 11,12,13,14,15 und Einfrieren ohne Zugabe Kryoprotektiva 16,17,18 und im ausgetrockneten Zustand sogar das Vakuum des Weltraums 19,20. Aufgrund ihrer einzigartigen Fähigkeit, in extremen Umgebungen zu überleben, sind diese Tiere zu grundlegenden Modellen für das Verständnis der Extremotoleranz bei komplexen, mehrzelligen Organismen geworden 1,21,22,23.

Eine stabile genetische Manipulation dieser bemerkenswerten Tiere, einschließlich Transgenese und Genmodifikation in der Keimbahn, blieb bis vor kurzem schwer fassbar24,25. Daher werden die meisten Experimente zur Aufdeckung molekularer Mechanismen der Extremotoleranz durch transkriptionelles Profiling mittels RNA-Sequenzierung durchgeführt. Es existieren viele wertvolle und informative RNA-Sequenzierungsdatensätze für Bärtierchen unter verschiedenen extremen Bedingungen, die von Strahlung 8,9,26,27,28, Hitzestress 29, Froststress12 und Austrocknung 27,30,31,32,33 reichen. Einige dieser Studien haben Methoden zur Extraktion und Reinigung von Massen-RNA verwendet, um unser molekulares Verständnis von Extremotoleranz zu beleuchten. Die Massenextraktion von RNA-Transkripten aus vielen Tieren verhindert jedoch die Analyse der Variation der Genexpression zwischen Individuen, wodurch die potenzielle Fülle verfeinerter Datensätze übersehen wird. Wichtig ist, dass diese Studien oft heterogene Tierpopulationen analysieren, die sowohl Tiere umfassen, die Umweltstressoren überleben, als auch solche, die dies nicht tun. Daher werden diese Studien durch die Mittelung von Expressionsdaten aus mehreren und potenziell dramatisch unterschiedlichen Reaktionszuständen verwirrt. Um dieses Problem zu lösen, entwickelten Arakawa et al., 201634 eine elegante Low-Input-RNA-Seq-Pipeline, die ein RNA-Extraktionskit anwendet, gefolgt von einem linearen PCR-Amplifikationsschritt mit einzelnen 34,35,36 oder mehreren 30,37,38 Tieren als Input. Diese Studien waren grundlegend für unser Verständnis der Bärtierchen-Extremotoleranz22. Interessanterweise wurde dieses Protokoll auch auf die qRT-PCR angewendet, wobei sieben Tiere als Ausgangsmaterialverwendet wurden 24.

In den meisten Modellorganismen wird nach der Identifizierung potenzieller Ziele über RNA-seq eine qRT-PCR durchgeführt, um die durch RNA-seq identifizierten transkriptionellen Veränderungen zu bestätigen und den Expressionszeitverlauf von Kandidatengenen hochauflösend zu beurteilen. Um die Funktion identifizierter Gene zu testen, folgen auf solche Studien häufig der RNAi-vermittelte Knockdown molekularer Ziele39,40 und die Analyse der extremotoleranten Kapazität12,41. Die Wirksamkeit jedes RNAi-Knockdowns wird in der Regel durch qRT-PCR bestätigt, indem die Abnahme der Transkripthäufigkeit direkt überwacht wird. RNAi ist jedoch ein arbeitsintensiver Prozess bei Bärtierchen, da jede dsRNA durch manuelle Mikroinjektion von Individuen verabreicht werden muss 39,40. Aufgrund des geringen Durchsatzes dieser Strategie wäre eine schnelle, kostengünstige RNA-Extraktionsmethode, die für die qRT-PCR von Einzeltieren angepasst ist, für die Bärtierchenforschung sehr wertvoll. Obwohl frühere Methoden zur Extraktion von RNA aus einzelnen Bärtierchen entwickelt wurden, haben diese Protokolle ihre Extraktion nicht mit qRT-PCR kombiniert, sondern sich stattdessen auf auf optische Dichtebasierte Methoden gestützt 12,40,41. Motiviert durch diese Herausforderungen haben wir versucht, ein Protokoll zu entwickeln, das zuverlässig RNA in Quantität und Qualität liefert, die für die qRT-PCR aus einzelnen H. exemplaris verwendet werden kann.

STST basiert auf einem für Caenorhabditis elegans42 entwickelten Einzeltier-RNA-Extraktionsprotokoll und ist für H. exemplaris optimiert. Die Extraktionsmethode besteht aus sechs schnellen Gefrier-Auftau-Schritten, die die Nagelhaut physikalisch aufbrechen und die RNA-Extraktion und die anschließende cDNA-Synthese ermöglichen. Die STST-Methode verkürzt die Extraktionszeit um mehr als das 24-fache im Vergleich zu Bulk-RNA-Extraktionsmethoden, wie von Boothby, 201843 beschrieben, und um 30 % im Vergleich zu einzelnen Bärtierchen-RNA-Extraktionskits, wie von Arakawa et al., 201634 beschrieben. Darüber hinaus wird die Anzahl der Proben-Experimentator-Interaktionen im Vergleich zu RNA-Extraktionskit-Präparaten von 5 auf nur 1 reduziert, wodurch das Risiko einer Kontamination durch exogene Ribonukleasen verringert wird. Bei der Abfrage von hoch exprimierten Genen erzeugt die STST-Methode ausreichend cDNA für 25 quantitative RT-PCR-Reaktionen pro einzelnem Bärtierchen, wobei nur 1 μl des gesamten cDNA-Volumens von 25 μl pro Reaktion benötigt wird. Allerdings müssen die Template-Konzentrationen für Transkripte mit geringerer Abundanz empirisch bestimmt werden.

Die Wirksamkeit der STST-Methode zur Analyse dynamischer Veränderungen in der Genexpression wurde untersucht, indem die differentielle Expression der Gene, die für das Hitzeschockprotein 90α (HSP90α) und das Hitzeschockprotein 70β2 (HSP70β2) kodieren, als Reaktion auf einen kurzfristigen Hitzeschock bei 35 °C für 20 Minuten untersucht wurde. Sowohl HSP70β2 als auch HSP90α werden in den meisten eukaryotischen Organismen nach kurzfristiger Hitzeschockexposition (20 min) schnell hochreguliert42. Die Analyse in H. exemplaris zeigte, dass sowohl die HSP70β2- als auch die HSP90α-kodierende RNAs, die aus einzelnen wärmebehandelten Bärtierchen extrahiert wurden, nach kurzfristiger Hitzeexposition statistisch signifikante Steigerungen der Expression zeigten. Diese Ergebnisse zeigen, dass das STST-Protokoll verwendet werden kann, um dynamische Veränderungen der Genexpression bei einzelnen Tieren im Laufe der Zeit zu analysieren.

Die STST-Extraktionsmethode soll bestehende experimentelle Methoden wie RNA-seq ergänzen, indem sie eine schnelle und kostengünstige RNA-Extraktion und einen anschließenden Vergleich der Transkriptspiegel mittels qRT-PCR ermöglicht. Diese Methode wird auch wertvoll sein, um die Effizienz und Penetranz von RNAi bei manuell injizierten Personen quantitativ zu beurteilen als nur die optische Dichte. Schließlich ist es wahrscheinlich, dass diese Methode aufgrund ihrer ähnlichen kutikulären Strukturen und physikalischen Eigenschaften auch für die Analyse der Genexpression bei anderen Bärtierchenarten wirksam sein wird44.

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Protokoll

figure-protocol-1
Abbildung 1: Ein-Röhrchen-Pipeline für die RNA-Extraktion aus einem einzelnen Bärtierchen. (A) Schema, das das Protokoll für die RNA-Extraktion aus einem einzelnen Bärtierchen zeigt, einschließlich sechs Frost-Tau-Zyklen und anschließender cDNA-Synthese. Proben können anschließend für die RT-PCR und qRT-PCR verwendet werden. (B) Bild der Mikropipettenverjüngung, die zur Entfernung von Wasser verwendet wird. Maßstabsbalken: 2 mm. (C) Hellfeldbild eines Bärtierchens in einer kleinen Wassermenge (gestrichelte Linie). Die Entfernung des größten Teils des Wassers in der angegebenen Menge ist für eine erfolgreiche Extraktion erforderlich und verhindert eine Verdünnung des Lysepuffers. Maßstab: 50 μm. (D) Das Bild zeigt das Eintauchen von Proben in flüssigen Stickstoff mit einer langen Pinzette, um die Proben schnell und sicher einzufrieren und aufzutauen. Ein Teil der Inhalte wurde in BioRender erstellt. Kirk, M. (2022) BioRender.com/d93s511 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

HINWEIS: Abbildung 1A zeigt ein Schema des Verfahrens. Detaillierte Informationen zu den Kultivierungsverfahren für Bärtierchen und Algen finden Sie in den zuvor veröffentlichten Berichten 45,46,47.

1. Sterilisation von Quellwasser

  1. Gießen Sie 2 l Quellwasser aus einem 5-Gallonen-Wasserkrug (siehe Materialtabelle für Einzelheiten) in eine autoklavensichere 2-Liter-Glasflasche.
  2. Setzen Sie den Verschluss auf die autoklavensichere Flasche und verschließen Sie ihn mit einer kleinen Menge Autoklavenband. Ziehen Sie die Flasche nicht fest; Setzen Sie die Kappe darauf.
  3. Autoklavieren Sie das Quellwasser 50 Minuten lang in einem Nasszyklus ohne Trocknungsschritt.
  4. Lassen Sie das Wasser auf Raumtemperatur (RT) kommen und verschließen Sie die Kappe fest, bevor Sie sie bei RT lagern.

2. Ziehen der Mikropipette aus Glas (mit einem Pipettenabzieher)

  1. Befestigen Sie eine Mikropipette aus Glas (AD: 1 mm, ID: 0,58 mm, Länge: 10 cm) an einem Mikropipettenabzieher. Vermeiden Sie den Kontakt mit dem Heizfaden, da dies die Form der Pipette verändert und den Faden beschädigt.
    1. Bestimmen Sie das Ziehen der Pipette empirisch für jedes Filament und jeden Pipettenzieher. Als Ausgangspunkt für die Optimierung dienen jedoch 78 °C und ein einzelner Zugschritt mit einem Zuggewicht von 182,2 g.
  2. Lassen Sie das Filament Hitze und Schwerkraft einwirken, um die Glasmikropipette in zwei Glasmikropipetten mit scharfen Spitzen zu trennen (Abbildung 1B).
  3. Bewahren Sie diese gezogenen Glasmikropipetten in einer geschlossenen 100-mm-Petrischale mit Wachs oder Ton auf, um sie an Ort und Stelle zu halten und ein Brechen der scharfen Spitzen zu verhindern.

3. Ziehen von Mikropipetten aus Glas (ohne Pipettenabzieher)

  1. Zünden Sie einen Bunsenbrenner oder eine andere kontrollierte Flammenquelle auf niedriger Stufe an.
  2. Nehmen Sie eine Mikropipette aus Glas mit einem Ende in jeder Hand.
  3. Halten Sie die Mitte der Glasmikropipette über die Flamme, bis das Glas zu schmelzen beginnt. Ziehe dann die beiden Enden schnell auseinander. Dadurch entstehen zwei sehr zarte, scharfe Spitzen.
  4. Brechen Sie die Spitze leicht mit einer sterilen feinen Pinzette.
  5. Bewahren Sie diese gezogenen Glasmikropipetten in einer geschlossenen 100-mm-Petrischale mit Wachs oder Ton auf, um sie an Ort und Stelle zu halten und ein Brechen der scharfen Spitzen zu verhindern.

4. RNA-Extraktion

  1. Beziehen Sie 0,5 l flüssigen Stickstoff in einem kryosicheren Behälter.
    ACHTUNG: Flüssiger Stickstoff ist kryogenisch und kann Verbrennungen verursachen, wenn er Haut oder Augen ausgesetzt wird. Verwenden Sie bei der Handhabung Schutzkleidung, eine Spritzschutzbrille, Nitrilhandschuhe, Kryohandschuhe, einen Laborkittel und geschlossene Schuhe. Vergewissern Sie sich, dass der Behälter für flüssigen Stickstoff geeignet ist, bevor Sie die Flüssigkeit transportieren. Für diesen Schritt kann auch die Verwendung eines Ethanol-Trockeneisbades möglich sein.
  2. Stellen Sie einen cDNA-Synthese-Mastermix her: eine 10-μl-Lösung, die 1 μl zufälliger Hexamer-Primer, 2 μl DNase, 4 μl 5x RT-Puffer, 1 μl Enzymmix, 1 μl H2O und 1 μl 10 mM dNTPs enthält. Lagern Sie diese Lösung auf Eis.
  3. Bereiten Sie den Bärtierchen-Lysepuffer (5 mM Tris (pH = 8), 0,5 % (v/v), Detergens 1, 0,5 % (v/v), Detergens 2, 0,25 mM EDTA in sterilem, nukleasefreiem Wasser vor.
    HINWEIS: Diese Lösung kann 6 Monate lang auf dem Labortisch gelagert werden. Bewahren Sie jedoch die Sterilität und vermeiden Sie potenzielle RNAse-kontaminierende Quellen.
  4. Aliquot genug Lysepuffer für Extraktionen (2 μL/ Bärtierchen).
  5. Geben Sie einen RNAse-Inhibitor in die Bärtierchen-Lysepufferlösung bis zu einer Endkonzentration von 4 U/μl.
  6. Die Lösung wird bei RT auf einer Tischzentrifuge bei einer Geschwindigkeit von 2000 x g 5 s lang vortext und geschleudert, bevor die Lösung auf Eis gelagert wird.
  7. Mit einer sterilen P1000-Pipette mit Filterspitze werden so viele Bärtierchen, wie für den Versuch benötigt werden, aus der Kultur entnommen und in eine sterile 35-mm-Petrischale gegeben.
    HINWEIS: Es können beliebig viele Bärtierchen auf diese Weise verarbeitet werden. In der Regel werden drei Bärtierchen pro Zustand für die Extraktion verarbeitet.
  8. Waschen Sie die Bärtierchen dreimal mit 1 ml autoklaviertem sterilem Quellwasser und einer sterilen P1000-Pipette mit Filterspitze. Das langsame Auf- und Abpipettieren hilft, Algenverunreinigungen zu entfernen.
  9. Mit einem Präpariermikroskop bei 25- bis 50-facher Vergrößerung wird ein einzelnes Bärtierchen aus dieser gewaschenen Kultur mit einer sterilen P10-Pipette mit Filterspitze in eine neue sterile 35-mm-Petrischale übertragen.
  10. Verwenden Sie eine sterile P200-Pipette mit Filterspitze, um das einzelne Bärtierchen in 100 μl sterilem nukleasefreiem Wasser zu waschen.
    HINWEIS: Dieser Waschschritt wird verwendet, um Verunreinigungen, einschließlich Ribonukleasen, weiter zu entfernen.
  11. Übertragen Sie das gewaschene Bärtierchen mit einer sterilen P10-Pipette mit Filterspitze in 1-2 μl sterilem nukleasefreiem Wasser auf den Boden eines sauberen, sterilen PCR-Röhrchens und achten Sie dabei sorgfältig darauf, dass das Bärtierchen nicht an der Seite der Spitze klebt.
  12. Visualisieren Sie das Bärtierchen unter einem Präpariermikroskop bei 25-facher Vergrößerung.
  13. Um die Wasserentnahme zu erleichtern, brechen Sie die Spitze der gezogenen Glasmikropipette leicht außerhalb des Röhrchens. Stellen Sie sicher, dass die Bohrung groß genug ist, um das Wasser hochzuziehen, aber nicht das Bärtierchen.
  14. Mit der Kapillarwirkung einer gezogenen Glasmikropipette wird das Wasser so lange entfernt, bis das Tier von einer kleinen Wasserblase mit einem Durchmesser von etwa zwei Bärtierchenlängen umgeben ist.
  15. Überwachen Sie den Wasserentnahmeprozess über das Präpariergerät, um sicherzustellen, dass der Wasserstand angemessen ist und das Bärtierchen hydratisiert bleibt.
    HINWEIS: Abbildung 1C zeigt ein Beispiel dafür, wie viel Wasser entfernt werden muss. Dies ist ein entscheidender Schritt. Eine kleine Wasserblase umgibt das Bärtierchen, um ein Austrocknen zu verhindern, aber so viel überschüssiges Wasser wie möglich sollte entfernt werden, um eine Verdünnung des Lysepuffers zu verhindern. Ein Beispiel für die verbleibenden Wasserstände finden Sie in Abbildung 1C.
  16. Unmittelbar nach dem Entfernen des Wassers 2 μl Bärtierchen-Lysepuffer auf den Boden des Röhrchens geben, kurz vortexen und das Röhrchen bei RT 5 s bei 2000 x g auf einer Tischzentrifuge zentrifugieren.
  17. Legen Sie die Proben, die die Bärtierchen enthalten, sofort in ein PCR-Röhrchengestell und stellen Sie sicher, dass sie vom Gestell fest gehalten werden.
  18. Fassen Sie das Gestell mit einer langen groben Pinzette an und tauchen Sie das Gestell mit den Proben vorsichtig in den flüssigen Stickstoff, bis es vollständig gefroren ist (Abbildung 1D).
  19. Nehmen Sie das Gestell vom flüssigen Stickstoff und legen Sie es sofort auf Eis. Lassen Sie die Probe auftauen (dauert ~45 s bis 1 min). Überwachen Sie die Probe alle 15 s, indem Sie sie aus dem Eis nehmen und sichtbar inspizieren. Sobald die Probe sichtbar transparent ist, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.
  20. Wiederholen Sie die Schritte 4.18-4.19 noch fünfmal. Für eine maximale Lyse und Extraktion sind insgesamt sechs Gefrier-Auftau-Zyklen erforderlich (Abbildung 2A,B).
  21. Sobald das Einfrieren und Auftauen abgeschlossen ist, legen Sie die Proben auf Eis und fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort. Frieren Sie die Proben zu diesem Zeitpunkt nicht zur Lagerung ein, da dies die verfügbare RNA für die cDNA-Präparation verringert.

5. cDNA-Synthese

  1. Geben Sie 2 μl cDNA-Synthese-Mastermix in das PCR-Röhrchen mit Bärtierchenlysat. Das Röhrchen kurz schnippen und mit einer Tischzentrifuge 5 s lang bei RT bei 2000 x g drehen, bevor die Proben wieder auf Eis gelegt werden.
  2. Die Proben werden in einen Thermocycler gegeben und 10 Minuten lang bei 25 °C zu Primern geglüht, 30 Minuten lang bei 55 °C zur reversen Transkription und schließlich Enzyme 5 Minuten lang bei 85 °C hitzeinaktiviert.
  3. Stellen Sie das Röhrchen nach der Inkubation sofort auf Eis und verdünnen Sie die Probe auf ein Gesamtvolumen von 25 μl, indem Sie 21 μl steriles nukleasefreies Wasser hinzufügen. Bei Transkripten mit niedriger Kopienzahl ist dieser Verdünnungsschritt wie empirisch bestimmt zu ändern.

6. qPCR

  1. Bestimmen Sie die Annealing-Temperatur des Primer-Sets unter Verwendung von Gesamt-RNA, die aus größeren Mengen von Bärtierchen hergestellt wurde, z. B. mit der in Boothby, 201843 vorgestellten Bulk-Extraktionsmethode.
  2. Führen Sie einen PCR-Temperaturgradienten durch, um die optimale Annealing-Temperatur zu bestimmen, bevor Sie die qRT-PCR ausführen (für alle in diesem Protokoll verwendeten PCR-Einstellungen siehe Tabelle 1 und Tabelle 2).
  3. Tauen Sie eine Tube des Indikatorfarbstoffs Super Mix auf Eis auf und isolieren Sie ihn vor Licht. Legen Sie eine 96-Well-qPCR-Platte auf Eis und geben Sie 5 μl Super Mix, 2 μl Wasser, 1 μl jedes Primers (10 μM) und 1 μl cDNA-Produkt in die gewünschte Anzahl von Wells.
  4. Versiegeln Sie die PCR-Platte mit einer Plattenversiegelung und führen Sie die qRT-PCR mit einer für das Primer-Set geeigneten Glühtemperatur durch (für alle in diesem Dokument verwendeten qRT-PCR-Einstellungen siehe Tabelle 3).

7. Quantifizierung und Interpretation der Ergebnisse

  1. Vergleichen Sie die Ergebnisse quantitativ mit einem oder mehreren Kontroll-Housekeeping-Genen, von denen erwartet wird, dass ihre Expression unter den auferlegten Bedingungen konstant ist. Für diese Studie wurde das Aktin-Gen verwendet.
  2. Ermitteln und vergleichen Sie die Ct-Werte oder den Zyklusschwellenwert für jede Vertiefung mit den Ct-Werten der Genreaktionen der Kontrollkontrolle. Berechnen Sie die Faltungsänderung in der Genexpression mit der folgenden Gleichung:
    figure-protocol-2
    figure-protocol-3
    figure-protocol-4
    HINWEIS: Die Faltengenexpression wird für jedes Transkript und jedes Bärtierchen als 2-(ΔΔCt)48 aufgetragen.
  3. Um eine grobe Schätzung der Transkriptnummer aus demC-t-Wert zu erhalten, verwenden Sie die folgende Gleichung:
    figure-protocol-5
    Dabei ist N die Anzahl der Transkripte und 2 die angenommene PCR-Effizienz oder die Faltzunahme der Fluoreszenz pro Zyklus von PCR48.

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Ergebnisse

Entwicklung und Optimierung der Extraktion von Single-Tardigrade-RNA
Durch die Anpassung des Protokolls von Ly et al., 201542 für die RNA-Extraktion bei Bärtierchen wird das STST-System optimiert, um die Quantität und Qualität des Präparats zu maximieren (Abbildung 1A). Die RT-PCR wurde für Aktin-Transkripte durchgeführt, wobei die Transkriptausbeute durch Amplifikation einer 527 bp-Region, die die Exons 1 und 2 umfasste, quantifiziert wurde (Seque...

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Diskussion

Diese Studie stellt eine effiziente Methode zur Extraktion von RNA für die single-tardigrade qRT-PCR vor. Der direkte Vergleich der STST-Methodik mit einem bestehenden Extraktionskit für bärtierchene RNA zeigte, dass die STST-RNA-Extraktion >200-mal höhere Mengen an Aktin-RNA-Transkripten liefert, die Kosten auf weniger als einen Dollar pro Probe reduziert und die für die Extraktion erforderliche Zeit um 30 % reduziert. Um STST auf eine relevante biologische Fragestellung anzuwenden, unt...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte offengelegt werden müssen.

Danksagungen

Wir möchten uns bei dem NIH Ruth Kirschstein Fellowship # 5F32AG081056-02 und dem Errett Fisher Post-Doctoral Fellowship bedanken, das Dr. Molly J. Kirk unterstützte, dem Crowe Family Fellowship, das Chaoming Xu unterstützte, und einem Stipendium der University of California, Santa Barbara Academic Senate und NIH Grants #R01GM143771 und #2R01HD081266, die diese Forschungsbemühungen unterstützten. Die Autoren würdigen auch die Nutzung des Biological Nanostructures Laboratory innerhalb des California NanoSystems Institute, das von der University of California, Santa Barbara, und der University of California, Office of the President, unterstützt wird.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10 & Mikro; L Premium-Barrierespitzen SterilGenesee Scientific23-401als P 10-Pipette mit Sterilfilter  Spitzen
1000 µ L  Premium-Pipettenspitzen, geringe Bindung, steril im RackGenesee Scientific23-165RSbezeichnet als sterile P 1000-Pipette mit Filterspitze  Tipps
200 µ L  Premium-Barrierespitzen SterilGenesee Scientific23-412als P 200-Pipette mit Sterilfilterspitze  Tipps
4 Sterne Gerade Starke Medium Point Pinzette Excelta 00-SA-DCbezeichnet als Long Pinzette
96-Well PCR Rack mit Deckel sortiert, 5 Racks/EinheitGenesee Scientific27-202Awird als PCR Rack
bezeichnet Andwin Scientific  3M BLEIFREIES AUTOKLAVENBAND 1"Thermo Fisher Scientific NC0802040wird als Autoklavenband bezeichnet 
AutoklavenbandThermo Fisher ScientificAB1170bezeichnet als PCR Plattendichtungen
Benchling v8BenchlingN/Abezeichnet als Benchling 
BioRadHard-Shell 96-Well-PCR-PlatteBioRad HSS9641wird als PCR-Platte bezeichnet 
BULWARK FR Laborkittel: Grainger 26CF64wird als Lab Coat
C1000 Touch Bio-rad Thermocycler bezeichnet BioRad1851148Thermocycler bezeichnet 
C1000 Touch Bio-rad Thermocycler mit CFX Optikmodul BioRad1845097als qPCR-Thermocycler bezeichnet 
Chloroccoccum hypnosporum.   Carolina152091Algae
Corning bezeichnet  PYREX Mehrweg-AufbewahrungsflaschenThermo Fisher Scientific06-414-1EBezeichnet als autoklavensicherer 2-Liter-Glasflaschen-Daigger
& Unternehmen Vortex-Genie 2 Labormischer Thermo Fisher Scientific 3030A, wird als Vortexer bezeichnet 
Direkt-zol-Mikrovorbereitung  Zymo Forschung R2060wird als RNA-Extraktionskit bezeichnet 
Dumont 5 Biologie PinzetteFeine Wissenschaft Werkzeuge 11254-20wird als feine Pinzette
EDTA bezeichnet;Fisher ScientificS311-500 Bezeichnet als EDTA 
FIJI v 2.14.0/1.54f ImageJ,N/ABezeichnet als FIJI/ImageJ
Filament für Pippette Puller Tritech ResearchPC-10Hwird als Filament
Fisherbrand Economy Impact GogglesFisher Scientific19-181-501als Splash Goggles bezeichnet 
Glas-Mikropipette AD 1mm ID 0,58, Länge 10 cmTriTech ResearchGD-1 Bezeichnet als Mikropipette aus Glas
Hypsibius exemplaris Z151 Stamm Carolina133960Bezeichnet als Bärtierchen  oder H. exemplaris 
Flüssiger Stickstoff Dewar 1 LAgar WissenschaftlichAGB7475wird als kryosicherer Behälter bezeichnet 
Maxima H Minus Erststrang-cDNA-Synthesekit Thermo FisherScientific K1651wird als cDNA-Synthese-Mastermix bezeichnet.
Narishige Zweistufiger Mikropipettenabzieher aus Glas Tritech Forschung  PC-10wird als Mikropipettenzieher bezeichnet 
NitrilhandschuheFisher Scientific17-000-314wird als Nitrilhandschuhe bezeichnet 
PETRISCHALE, PS, 35/10 mm, MIT ÖFFNUNGENGrenier627102Bezeichnet als 35 mm Petrischale 
PIPETMAN P10, 1– 10 & Mikro; L, MetallauswerferGilsonF144055MP 10 Pipette
bezeichnet PIPETMAN P1000, 100– 1000 &Mikro; L, MetallauswerferGilsonF144059MP 1000 Pipette
bezeichnet PIPETMAN P200, 20– 200 & Mikro; L, Metall-AuswerferGilson F144058Mals P 200 bezeichnet
Sie diese 4-Farben-Modelliermasse Amerikanischer Wissenschaftsüberschuss 96517P001bezeichnet als Clay 
Prisma v10.0 GraphPadN/Abezogen auf ein Prisma 
RNAse-frei, 8 Streifen 0,2 mL PCR-Röhrchen mit Kappen InvitrogenAM12230als steriles PCR-Röhrchen
bezeichnet RNasin Ribonuklease-InhibitorPromega N2111wird als RNAse Inhibitor bezeichnet 
Quellwasser Nestlé Pure Life44221229als Quellwasser
SsoAdvanced Universal SYBR Green SupermixBIO RAD1725271als Indikatorfarbstoff Super Mix 
Stereomikroskop-System mit Optik und BeleuchtungTriTech ResearchSMT1wird als Präpariermikroskop
bezeichnet Supertek Scientific  Tirrill-BrennerThermo Fisher ScientificS09572BBunsenbrenner bezeichnet 
TischzentrifugeQualitron  DW-41-115-NEWwird als Tischzentrifuge bezeichnet 
Tempshield  Kryo-HandschuheFisher Scientific11-394-305auch bekannt als Kryo-Handschuhe 
Thermo Scientific  Nunc PetrischalenThermo Fisher Scientific08-757-099Bezeichnet als 100 mm Petrischale 
Tris-BasisFisher ScientificT395-500 Wird als Tris oder Tris Base bezeichnet 
Triton X-100Fluka 93443wird bezeichnet als Waschmittel 1 
TWEEN 20Sigma aldrichP1379-500 Bezeichnet als Detergent 2
Wasser - PCR/RT-PCR-zertifiziertes, nukleasefreiesGrowcellsPCPW-0500wird als steriles nukleasefreies Wasser bezeichnet
mit geringer Bindung, bezeichnet , mit geringer Bindung, auch bekannt als wird als bezeichnet wird als als , klopfen bezeichnet bezeichnet auch als ,

Referenzen

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