Methodenartikel

Eine kostengünstige Adaption eines kommerziellen Mikrowellenreaktors für die Festphasen-Peptidsynthese

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DOI:

10.3791/66937

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22. November 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry & Biochemistry, Fairfield University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Eine einfache, kostengünstige und neuartige Vorrichtung zur Durchführung von Festphasenpeptidsynthesen in einem kommerziellen Mikrowellenreaktor wird vorgestellt.

Zusammenfassung

Vorgestellt wird eine selbstgebaute Apparatur zur Durchführung der Festphasenpeptidsynthese (SPPS), die durch Mikrowellenbestrahlung und Erwärmung unterstützt wird. Im Gegensatz zu herkömmlichen SPPS-Reaktionsgefäßen, die Lösungsmittel und Nebenprodukte über eine am Boden des Gefäßes befindliche Fritte ablassen, verwendet die vorgestellte Vorrichtung ein Gasdispersionsrohr unter Vakuum, um Lösungsmittel, Nebenprodukte und überschüssige Reagenzien zu entfernen. Das gleiche Gasdispersionsrohr sorgt für die Stickstoffgasbewegung der SPPS-Kügelchen während der Reaktionsschritte des Ankoppelns und Entschützens. Die Mikrowellenheizung ist vorteilhaft für SPPS-Kopplungen von sterisch gehinderten Resten, wie z. B. Alpha-Aminoisobuttersäure (Aib), einem alpha,alpha-dialkylierten Aminosäurerest. Diese selbstgebaute Apparatur wurde verwendet, um mit manuellen Fmoc SPPS-Methoden heptamere und oktamere Peptide herzustellen, die von dem Aib-Rest dominiert werden, der unter normalen Raumtemperaturbedingungen und Reagenzien notorisch schwer zu koppeln ist. Darüber hinaus sind typische kommerzielle Mikrowellen-SPPS-Reaktoren ausschließlich für die SPPS-Synthese bestimmt, was sie für Nicht-SPPS-Benutzer unzugänglich macht. Im Gegensatz dazu behält die vorgestellte Vorrichtung die Vielseitigkeit des Mikrowellenreaktors für die konventionelle Mikrowellenbeschleunigung chemischer Reaktionen bei, da die Vorrichtung trivial aus dem kommerziellen Mikrowellenreaktor entfernt ist.

Einleitung

Merrifields Einführung der Festphasen-Peptidsynthese SPPS in den 1960er Jahren revolutionierte die Peptid- und chemische Synthese und wurde zu Recht mit einem Nobelpreis für Chemiebelohnt 1,2. In den folgenden Jahrzehnten haben viele Forscher die ursprünglichen Techniken von Merrifield verfeinert, was zu zwei Alternativen führte, die die SPPS-Praktiken dominieren: auf Fluorenylmethoxycarbonyl (FMOC)-Basis versus auf tert-Butyloxycarbonyl (BOC)-Basis3. Die endgültige Spaltung des Peptids aus dem festen Harz in FMOC erfordert einen Cocktail mit Trifluoressigsäure im Vergleich zu HF für BOC-Techniken, was FMOC-basierte Methoden zur bevorzugten Wahl vieler Labore macht.

Modernste SPPS-Methoden werden gelegentlich durch gewünschte Sequenzen herausgefordert. In den letzten Jahren gab es Fortschritte, bei denen einige idiosynkratische Bedenken hinsichtlich der Aggregation4, der Diketopiperazinbildung5 und der N-methylierten Aminosäurereste6 überwunden wurden. Um die Kopplungsausbeute zu optimieren, wurden Tausende von Kupplungsreagenzien und Additiven untersucht7. Konkret wurde die Carbonsäureaktivierung über COMU 8,9 oder saure Fluoride 10,11,12 sowie Additive wie Oxyma13 und Hydroxybenzotriazol (HOBt) für besonders anspruchsvolle Kupplungen entwickelt, wie z. B. solche mit α,α-dialkylierten Resten.

Andere nicht-reagenzienbasierte Methoden wurden eingesetzt, um die Ausbeute bei schwierigen Kopplungen zu erhöhen, einschließlich verlängerter Reaktionszeiten, "Doppelkupplung" und Erwärmung, insbesondere Mikrowellenerwärmung 14,15,16. In der Tat gehören kommerziell erhältliche automatisierte Peptidsynthesizer, die Mikrowellenheizung verwenden, zu den kommerziell erfolgreichsten Einheiten auf dem Markt, da sie die Reaktionsgeschwindigkeiten beschleunigen, die endgültige Reinheit von Peptiden zu verbessern scheinen und den Lösungsmittelabfall minimieren. Leider können diese Geräte teuer sein und in einigen Fällen über 100.000 US-Dollar kosten.

Unser Labor beschäftigt sich mit der Herstellung von Variationen von Peptiden, die den stark helikogenen Rückstand von Alpha-Aminoisobuttersäure (Aib) enthalten17,18,19. Aufgrund der sterischen Behinderung, die sich aus der Dialkylierung seines Alpha-Kohlenstoffs ergibt, ist Aib bekanntermaßen schwer zu koppeln. Die oben genannten Methoden (saure Fluoride, Mikrowellenheizung20) sowie die clevere "Dipeptid"-SPPS-Chemie21 wurden verwendet, um SPPS an die Kopplungsherausforderungen von AIB anzupassen. Die Herstellung von Aib-Dimeren außerhalb des Harzes verbessert zwar die Gesamtausbeute, erfordert aber zusätzliche Nasschemie und erhöhte Temperaturen (50 °C)21. Darüber hinaus haben wir den Einsatz von sauren Fluoriden von Aib aufgrund der toxischen Natur von Fluorierungsmitteln vermieden. Leider fehlt in unserem Labor ein spezieller mikrowellenbasierter automatisierter SPPS-Synthesizer mit speziellen Reaktionsgefäßen für die notwendige Entleerung von SPPS-Nebenprodukten. Nichtsdestotrotz hat uns ein kürzlich veröffentlichter Bericht aus Claydens Gruppe, der spektakuläre Erfolge bei der Herstellung von Aib-basierten Oligomeren unter Verwendung von SPPS und Mikrowellenbestrahlung22 zeigt, dazu angeregt, die CEM Discover SP-Mikrowelleneinheit unseres Labors für SPPS-Synthesen anzupassen.

Wir untersuchten zunächst das kommerziell erhältliche Zubehör von CEM, um den Mikrowellenreaktor in eine manuelle SPPS/Mikrowelleneinheit23 umzuwandeln. Abgesehen von den Kosten würde dieses Zubehör die Verpflichtung unseres Mikrowellengeräts erfordern, nur manuelles SPPS zu verwenden. Andere Laboranwender hätten keinen Zugang mehr zu den hervorragenden Fähigkeiten des Mikrowellengeräts. Daher wurde die Implementierung des kommerziellen Zubehörs in unserem Fall als inakzeptabel erachtet.

Stattdessen bauten wir mit vergleichsweise kostengünstigen Komponenten eine Apparatur zur Durchführung von mikrowellengestützten SPPS auf der Millimolaren Skala zusammen. Das folgende Protokoll beschreibt die Verwendung einfacher und vergleichsweise kostengünstiger Komponenten zur Durchführung einer manuellen, mikrowellengestützten SPPS.

Protokoll

1. Montieren Sie das Gerät (Abbildung 1)

HINWEIS: Alle Komponenten für den Zusammenbau des Gerätes finden Sie in der Werkstofftabelle.

  1. Montieren Sie den Vakuumauslass.
    1. Verbinden Sie 2" 1/8" Teflonschlauch mit der rechten Seite des "T-Stücks" (Abbildung 1, Teil mit der Bezeichnung "1") aus Ethylentetrafluorethylen (ETFE).
    2. Verbinden Sie den 1/8" Teflonschlauch mit einem Ventil (Abbildung 1, Teil mit der Bezeichnung "2") aus ETFE.
    3. Befestigen Sie 100 cm Teflonschlauch an der anderen Seite des Ventils (Abbildung 1, Teil mit der Bezeichnung "2").
    4. Führen Sie diesen Schlauch durch die 1/8"-Öffnung eines Gummikorkens und verwenden Sie diesen Korken, um einen seitlichen Erlenmeyerkolben (Abbildung 1A, Teil mit der Bezeichnung "8") zu verschließen, der an das Vakuum angeschlossen ist (Haus oder bescheidene Pumpe).
  2. Montieren Sie den Stickstoffgaseinlass.
    1. Verbinden Sie 2" 1/8" Teflonschlauch mit der linken Seite des ETFE-"T-Stücks" (Abbildung 1, Teil mit der Bezeichnung "1").
    2. Verbinden Sie den 1/8"-Teflonschlauch mit einem ETFE-Ventil (Abbildung 1, Teil mit der Bezeichnung "3").
    3. Befestigen Sie 100 cm 1/8" Teflonschlauch an der anderen Seite des EFTE-Ventils (Abbildung 1, Teil mit der Bezeichnung "3").
    4. Fädeln Sie das hintere Ende des 1/8" Teflonschlauchs durch einen Gummikorken und verwenden Sie diesen Korken, um ihn mit einem Tygonschlauch zu verbinden, der an einer Stickstoffflasche befestigt ist, die mit einem Regler ausgestattet ist (Abbildung 1A, Teil mit der Bezeichnung "7").
    5. Verwenden Sie bei geschlossenem Nadelventil des Reglers das Membranventil des Reglers (Abbildung 1A, Teil mit der Bezeichnung "7"). um einen Druck von 5-10 psi zu erreichen.
  3. Montieren Sie den Aspirator/Bubbler.
    1. Verbinden Sie den Schaft des "T-Stücks" (Abbildung 1, Teil mit der Bezeichnung "1") mit einem 100 cm langen Teflonschlauch mit einem Außendurchmesser von 1/8 Zoll.
    2. Führen Sie diesen Schlauch durch ein Mikroseptum (Abbildung 1, Teil mit der Bezeichnung "6"), das zuvor mit einer Nadel durchstochen wurde.
    3. Führen Sie den Schlauch vollständig in ein Gasdispersionsrohr ein. Verwenden Sie das Mikroseptum, um eine Dichtung zwischen dem Gasdispersionsrohr (Abbildung 1, Teil mit der Bezeichnung "4") und dem Teflonschlauch zu bilden.
    4. Setzen Sie das Gasdispersionsröhrchen in das Reagenzglas-Reaktionsgefäß ein (Abbildung 1, Teil mit der Bezeichnung "5"), und setzen Sie das Reagenzglas in seine Halterung (Abbildung 1B) ein, die sich außerhalb des Mikrowellenreaktors befindet.
      HINWEIS: Während chemischer Reaktionen wird das Reagenzglas in den Mikrowellenreaktor eingeführt. Während der Zugabe von Reaktionslösungen und Lösungsmittelwaschmitteln wird das Reagenzglas außerhalb des Mikrowellenreaktors gehalten.
  4. Befestigen Sie das Dämpfungsglied des offenen Gefäßes an den Mikrowellenreaktor. Das Gerät sollte nun einsatzbereit sein.

2. Reagenzien vorbereiten

  1. Bereiten Sie FMOC-Aminosäurelösungen vor. Für die 0,100-mmol-Skala 0,2 M FMOC-AA-OH in DMF vorbereiten. In jedem Kopplungszyklus werden 2,5 ml der Aminosäurelösungen verwendet.
  2. Bereiten Sie das Diisopropylcarbodiimid (DIC)-Kupplungsreagenz vor. Bereiten Sie 1,0 M DIC in DMF vor. Jede Kupplung verwendet 1,0 mL DIC-Lösung.
  3. Bereiten Sie die Oxyma Pure Additivlösung vor. Bereiten Sie 0,5 M Oxym in DMF vor. Für jede Kupplung werden 1,0 ml Oxymalösung verwendet.
  4. Bereiten Sie die Entschützungslösung vor. Bereiten Sie eine 20%ige v/v-Morpholin/DMF-Lösung vor. Für jeden Entschützungslauf sind 7 ml Lösung erforderlich. Führen Sie für jede Aufhebung des Schutzes von fmoc zwei Entschützungsläufe durch.

3. Herstellung des Peptidharzes

  1. Messen Sie die entsprechende Masse des SPPS-Wang-Harzes, 100-200 mesh, Polystyrol vernetzt mit 1 % Divinylbenzol, und geben Sie das trockene Harz in das Reagenzglas-Reaktionsgefäß. Für eine Synthese im Maßstab von 0,100 mmol würde beispielsweise ein Harz mit einer Beladung von 0,500 mmol g-1 200 mg Harz benötigen.
  2. Geben Sie 3 mL DMF-Lösungsmittel zum Harz und quellen Sie das Harz 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Stellen Sie für diesen Schritt sicher, dass die Stickstoffgaszufuhr zum Rühren "ein/offen" ist und das Vakuumventil (Abbildung 1, mit "2" gekennzeichnet) "aus/geschlossen" ist. Verwenden Sie das Nadelventil der Stickstoffzufuhr (Abbildung 1A, Beschriftung 7), um ein sanftes Blasen in der Lösung zu erzielen.
    HINWEIS: Diese Einstellung sollte für alle weiteren Bewegungen durch das Stickstoffgas geeignet sein.
  3. Nach 15 Minuten des Quellens des Harzes das DMF-Lösungsmittel unter Vakuum ansaugen: Schließen Sie das Ventil N2 (Abbildung 1, mit "3" gekennzeichnet). Öffnen Sie das Ventil für Vakuum (Abbildung 1, mit "2" gekennzeichnet) und saugen Sie DMF-Lösungsmittel an. Wenn das Lösungsmittel fast entfernt ist, öffnen Sie das Ventil N2 (Abbildung 1, mit "3" gekennzeichnet).
  4. Wiederholen Sie die Schritte 3.2 und 3.3 2 Mal, um das Harz vollständig aufzuquellen.

4. FMOC-Entfernung

HINWEIS: Die Harze sind mit einer Vielzahl von FMOC-geschützten Aminosäuren vorgeladen, die als C-terminale Reste vorgeladen sind. Daher ist die FMOC-Entfernung in der Regel der erste Schritt nach dem Aufquellen des Harzes.

  1. Wenn sich das Reagenzglas-Reaktionsgefäß außerhalb des Mikrowellenreaktors befindet und das Vakuumventil (Abbildung 1, mit "2" gekennzeichnet) geschlossen ist, geben Sie 7 ml 20 % Piperidin/DMF oder 20 % Morpholin/DMF direkt in das Reagenzglas.
  2. Schalten Sie das Stickstoffventil ein (Abbildung 1, mit "3" gekennzeichnet), um die Kügelchen zu bewegen.
    HINWEIS: SPPS-Harze sind mit dem C-terminalen Rückstand vorgeladen, geschützt durch FMOC.
  3. Das Reagenzglas mit den Kügelchen wird über das Dämpfungsglied "offenes Gefäß" in den Mikrowellenreaktor eingeführt (Abbildung 1B, Metallanschluss des Reaktors).
  4. Erhitzen Sie die Mikrowelle 2 Minuten lang auf 90 °C, indem Sie sie im dynamischen Modus verwenden: Stellen Sie das Temperaturziel auf 90 °C ein, 50 W Leistung, Haltezeit = 2,0 min (siehe Zusatzdatei 1 für einen Bericht über die Entschützung in der Mikrowelle). Überwachen Sie die Temperatur über den Infrarotsensor der Mikrowelle; Die Mikrowelle reduziert die Leistung, um die Reaktionstemperatur aufrechtzuerhalten.
  5. Nehmen Sie das Reagenzglas mit den Kügelchen aus dem Mikrowellenreaktor.
  6. DMF-Lösung und Reaktionsnebenprodukte unter Vakuum ansaugen: Schließen Sie das N2-Ventil (Abbildung 1, mit "3" gekennzeichnet). Öffnen Sie das Ventil für Vakuum (Abbildung 1, beschriftet mit "2"). Wenn die Lösung fast entfernt ist, öffnen Sie das Ventil N2 (Abbildung 1, mit "3" gekennzeichnet).
  7. Schließen Sie das Vakuumventil (Abbildung 1, beschriftet mit "2"). Fügen Sie 3 mL DMF hinzu, um das Reagenzglas und das Gasdispersionsröhrchen zu spülen.
  8. Aspirate DMF Solvent Wash under vacuum: Schließen Sie das Ventil N2 (Abbildung 1, mit "3" gekennzeichnet). Öffnen Sie das Ventil für Vakuum (Abbildung 1, beschriftet mit "2"). Wenn die Lösung fast entfernt ist, öffnen Sie das Ventil N2 (Abbildung 1, mit "3" gekennzeichnet).
  9. Wiederholen Sie die Schritte 4.7 und 4.8 zweimal, für insgesamt drei Wäschen mit DMF-Lösungsmittel.
  10. Wiederholen Sie die FMOC-Entfernungsschritte 4.1 bis 4.9 für insgesamt zwei aufeinanderfolgende Entschützungsschritte.

5. Kopplung von FMOC-Aminosäuren

  1. Stellen Sie das Reagenzglas-Reaktionsgefäß in seine Halterung außerhalb des Mikrowellenreaktors.
  2. Geben Sie manuell 2,5 ml 0,2 M FMOC-Aminosäure (5x molaren Überschuss), 1,0 ml 1,0 M DIC-Haftvermittlerlösung (10x molaren Überschuss) und 1,0 ml 0,5 M Oxyma-Additivlösung (5x molaren Überschuss) zum Harz im Reagenzglas.
  3. Öffnen Sie das Stickstoffventil (Abbildung 1, mit "3" gekennzeichnet), um eine Bewegung der Kügelchen zu erreichen.
  4. Das Reagenzglas mit den Kügelchen wird über das Dämpfungsglied des offenen Gefäßes in den Mikrowellenreaktor eingeführt (Abbildung 1B, Metallanschluss des Reaktors). Die Lösung 10 min lang auf 100 °C erhitzen. Wenn Sie die Mikrowelle im dynamischen Modus verwenden, stellen Sie das Temperaturziel auf 100 °C, 60 W Leistung, Haltezeit = 10,0 min ein (siehe Zusatzdatei 1 für einen Bericht über die Kopplung in der Mikrowelle). Überwachen Sie die Temperatur über den Infrarotsensor der Mikrowelle; Die Mikrowelle reduziert die Leistung, um die Reaktionstemperatur aufrechtzuerhalten.
  5. Nehmen Sie das Reagenzglas mit den Kügelchen aus dem Mikrowellenreaktor.
  6. Aspirieren Sie das DMF-Lösungsmittel und die Reaktionsnebenprodukte unter Vakuum: Schließen Sie das N2-Ventil (Abbildung 1, mit "3" gekennzeichnet). Öffnen Sie das Ventil für Vakuum (Abbildung 1, beschriftet mit "2"). Wenn die Lösung fast entfernt ist, öffnen Sie das Ventil N2 (Abbildung 1, mit "3" gekennzeichnet).
  7. Schließen Sie das Vakuumventil (Abbildung 1, beschriftet mit "2"). Fügen Sie 3 mL DMF hinzu, um das Reagenzglas und das Gasdispersionsröhrchen zu spülen.
  8. Aspirate DMF Solvent Wash under vacuum: Schließen Sie das Ventil N2 (Abbildung 1, mit "3" gekennzeichnet). Öffnen Sie das Ventil für Vakuum (Abbildung 1, beschriftet mit "2"). Wenn die Lösung fast entfernt ist, öffnen Sie das Ventil N2 (Abbildung 1, mit "3" gekennzeichnet).
  9. Wiederholen Sie die Schritte 5.7 und 5.8 2 Mal für insgesamt drei Wäschen mit DMF-Lösungsmittel.

6. Wiederholen Sie SPPS-Peptidzyklen

  1. Wiederholen Sie alle Schritte in den Abschnitten 4 (FMOC-Entfernung) und 5 (Kopplung von FMOC-Aminosäuren), bis ein Peptid der gewünschten Sequenz vorliegt.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, Reagenzlösungen außerhalb des Mikrowellenreaktors bei Raumtemperatur direkt in das Reagenzglas-Reaktionsgefäß zu geben. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Stickstoffbewegung eingeleitet wird, bevor Sie das Reagenzglas in den Mikrowellenreaktor stellen.

7. Peptid-Spaltung

  1. Gib das Harz in eine gefrittene Plastikspritze.
  2. Bereiten Sie einen Spaltcocktail aus 95 % Trifluoressigsäure (TFA), 2,5 % Wasser und 2,5 % Triisopropylsilan (TIPS) mit einem Volumen von 1 ml/100 mg Harz vor.
  3. Spalten Sie das Peptid 2 h lang bei Raumtemperatur unter ständigem oder gelegentlichem Schütteln.
  4. Das Peptidprodukt wird in 10 mL eiskaltem Diethylether ausgefällt.
  5. Resuspendieren Sie das Pellet in einer minimalen Menge MeCN/0,1 % wässrigem TFA und lyophilisieren Sie es über Nacht.

Ergebnisse

Beispiele für Peptidsequenzen, die mit unserer Apparatur hergestellt wurden, sind in Abbildung 2 und Abbildung 3 dargestellt. Tabelle 1 fasst die Lösungen, Mikrowellenparameter und Waschgänge zusammen, die wir verwendet haben. Die Bestätigung der MALDI-TOF-Massenspektrometrie ist in den Abbildungen dargestellt. Die Massenrückgewinnung dieser Peptide lag bei über 80 %. Bezeichnenderweise weisen alle diese Sequenzen mehrere Kopplungen zwischen benachbarten alpha, alpha-dialkylierten Aminosäuren auf. Diese gehören zu den am schwierigsten zu koppelnden Resten über die Bildung von Peptidbindungen.

figure-results-1
Abbildung 1: Das selbstgebaute, mikrowellengestützte, manuelle SPPS-Gerät. (A) Schematische Darstellung 1) ETFE-"T-Stück"; 2) ETFE-Ventil zum Vakuumieren; 3) ETFE-Ventil für Stickstoffgas; 4) Gasdispersionsrohr, innerhalb 5) Reaktionsgefäß des Pyrex-Reagenzglases; 6) NMR-artiges Septum zum Verbinden des 1/8" Teflonschlauchs mit dem Gasdispersionsrohr; 7) Nadelventil zur Steuerung des Stickstoffgasflusses; 8) Seitenarmkolben zum Auffangen von Reaktionsabfällen. Siehe Materialtabelle für Hersteller und Katalognummern von Komponenten. (B) Foto des zusammengesetzten Bildes. Die Nummerierung ist identisch mit Abbildung 1A. Abkürzungen: SPSS = Festphasenpeptidsynthese; ETFE = Ethylentetrafluorethylen; NMR = Kernspinresonanz. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-2
Abbildung 2: Struktur von Peptid 1, synthetisiert mittels Mikrowellen-SPPS-Methoden und MALDI-TOF-Bestätigung. (A) CHCA wurde als Matrix verwendet. Der Peak bei m/z = 880,18 ist Kaliumaddukt, [MK+], berechnet m/z=880,45. (B) HPLC-Spur von rohem Peptid 1. Der Lösungsmittelgradient beträgt MeCN von 20 % bis 80 % über 0,1 % wässrigem TFA, 20 min. Wellenlänge der Beobachtung = 222 nm. Abkürzungen: SPSS = Festphasenpeptidsynthese; MALDI-TOF = matrixgestützte Laserdesorptionsionisations-Flugzeit; CHCA = alpha-Cyano-4-hydroxyzimtsäure, HPLC = Hochleistungsflüssigkeitschromatographie; MeCN = Acetonitril; TFA = Trifluoressigsäure. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-3
Abbildung 3: Struktur von Peptid 2, synthetisiert mit Mikrowellen-SPPS-Methoden und MALDI-TOF-Bestätigung. (A) CHCA wurde als Matrix verwendet. Der Peak bei m/z = 1022,7 wird dem Kaliumaddukt [MK+] zugeordnet, berechnet m/z=1023,5. Der Peak bei m/z = 966,5 wurde über den Wasserverlust24 vorläufig einem C-terminalen Oxazolon zugeordnet, berechnet m/z = 967,5. (B) HPLC-Spur von Rohpeptid 2. Der Lösungsmittelgradient beträgt MeCN von 20 % bis 80 % für 20 min über 0,1 % wässrigem TFA. Wellenlänge der Beobachtung = 222 nm. Abkürzungen: SPSS = Festphasenpeptidsynthese; MALDI-TOF = matrixgestützte Laserdesorptionsionisations-Flugzeit; CHCA = alpha-Cyano-4-hydroxyzimtsäure, HPLC = Hochleistungsflüssigkeitschromatographie; MeCN = Acetonitril; TFA = Trifluoressigsäure, Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

SchrittLösung/LösungsmittelVolumen (ml)Zeit (min)Temperatur (°C)
1Entschützung20% Morpholin7290
2WäschtZMS4, 4, 4-RT
3Entschützung20% Morpholin7290
4WäschtZMS4, 4, 4-RT
5KupplungFmoc-AA-OH, OXYMA, DIC5, 2, 210100
6WäschtZMS4, 4, 4-RT
7Wiederholen
EndeSpaltungTFA/TIPS/H2Ω1>120

Tabelle 1: Schritte für einen Zyklus von mikrowellenunterstützten SPPS im 0,1-mmol-Maßstab: FMOC-Entschützung, Waschungen und FMOC-Aminosäure-Kopplung. 0,2 M FMOC-AA-OH, 0,5 M OXYMA, 1,0 M DIC. Lösungen, die bei jedem Schritt manuell mit einer Mikropipette direkt in das Reagenzglas gegeben werden. Abkürzungen: SPSS = Festphasenpeptidsynthese; FMOC = Fluorenylmethoxycarbonyl; DIC = Diisopropylcarbodiimid.

Ergänzende Datei 1: CEM Discover SP Microwave Reactor Report zur Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe und CEM Discover SP Microwave Reactor Report zur Kopplung einer Fmoc-geschützten Aminosäure. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Die hier vorgestellte Vorrichtung ruft ein einfaches, neuartiges und kostengünstiges Verfahren zur Entfernung von Lösungsmittel, überschüssigen Reagenzien und Abfallprodukten sowie zur Zugabe von Stickstoffgasbewegung während der mikrowellengestützten SPPS auf. Im Gegensatz zu herkömmlichen SPPS-Gefäßen, die eine Fritte am Boden des Gefäßes hervorrufen, ruft die vorgestellte Vorrichtung ein Gasdispersionsrohr unter Vakuum auf, um das Gefäß anzusaugen. Bei dem Reaktionsgefäß handelt es sich also um ein gewöhnliches Reagenzglas, das an der vom Hersteller des Mikrowellenreaktors empfohlenen Stelle innerhalb des "offenen Gefäßabschwächers" erhitzt wird.

Unsere wichtigste Innovation besteht darin, Lösungsmittel und Reaktionsnebenprodukte aus dem Reagenzglas über ein "Gasdispersionsröhrchen" unter Vakuum zu entfernen. Bei chemischen Umwandlungen unter Mikrowellenbestrahlung sowie beim Waschen mit Lösungsmittel (N,N-Dimethylformamid (DMF) oder N-Methylpyrrolidinon, NMP) werden die SPPS-Kügelchen durch Stickstoffgas, das durch das Rohr dispergiert wird, gerührt. Das Vakuum und das Stickstoffgas werden durch ETFE-Ventile gesteuert, um die Beständigkeit gegen Lösungsmittel zu optimieren. Die SPPS-Abfälle werden in einem Erlenmeyerkolben mit Seitenarm gesammelt. Alle Komponenten sind über einen 1/8" Teflonschlauch verbunden. Während wir "Haus"-Vakuum verwenden, würde auch eine mechanische Vakuumpumpe helfen. Abbildung 1 oben ist ein Schema unseres Apparates.

Für ein erfolgreiches SPPS ist nicht nur ein Gerät erforderlich, sondern auch chemische Protokolle für Temperatur, Zeit und chemische Reagenzien. Unter Verwendung des Protokolls von Clayden et al.22 haben wir mehrere Peptide hergestellt, die mit herkömmlichen SPPS-Methoden bei Raumtemperatur schwierig, wenn nicht gar unmöglich herzustellen wären. Für die Kopplung von Aminosäuren verwenden wir Diisopropylcarbodiimid (DIC) und Oxym als Kopplungscocktail und bestrahlen 10 min lang auf 100 °C. Es wird angenommen, dass Oxym die Racemisierung von Rückständen während des Kopplungsprozesses unterdrückt13. Für die FMOC-Entschützung verwenden wir 20 % Morpholin in DMF, das 2 Minuten lang bei 90 °C bestrahlt wird, und wiederholen dies erneut. Zwischen den Reaktionen verwenden wir DMF, um die SPPS-Kügelchen (Wang-Harz) wiederholt (3x) zu spülen.

Mit dieser manuellen Apparatur stellten wir schwer zu synthetisierende Peptide mit einer Geschwindigkeit von etwa 40 Minuten pro Rückstand her. Mögliche Optimierungen dieser Rate haben wir noch nicht untersucht. Zum Beispiel glauben wir, dass die Zeit im Mikrowellenreaktor wahrscheinlich auf die "Gesamtreaktionszeit" begrenzt werden könnte, im Gegensatz zur "Zeit bei Zieltemperatur", ohne die Ergebnisse zu beeinträchtigen. Dies ist auf die Zeit zurückzuführen, die asymptotisch mit der Annäherung an die Zieltemperatur verbracht wird (siehe Zusatzdatei 1 für Details). Darüber hinaus könnte man prinzipiell alle Reagenzien und Lösungsmittel hinzufügen, ohne das Reaktionsgefäß aus der Mikrowelle zu nehmen. Wir ziehen es jedoch vor, das Harz bei allen Schritten inspizieren zu können.

Obwohl unser Anwendungsfall in SPPS liegt, sollte beachtet werden, dass Festphasenmethoden zunehmend auf eine Vielzahl von Synthesen angewendet werden, wie z. B. Dendrimer25, RNA26 und elektrochemische Synthesen27. Eine Vielzahl von Anwendungsfällen könnte von der Mikrowellenunterstützung profitieren, für die dieses Gerät geeignet wäre. Obwohl die Vorrichtung für die Durchführung von mikrowellengestützten SPPS konstruiert wurde, ist ihr grundlegendes Reaktionsgefäß ein Reagenzglas. Daher kann die Vorrichtung sowohl in herkömmlichen SPPS bei Raumtemperatur als auch in SPPS eingesetzt werden, die bei erhöhten Temperaturen geleitet werden, beispielsweise in einem Ölbad.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren sind dankbar für die Unterstützung durch die INSPIRE-Stipendien der Fairfield University, die Unterstützung des Department of Chemistry & Biochemistry an der Fairfield University und die Unterstützung von Dr. Dorothy Szobcynski für ihre Expertise bei der Leitung des Labors. Darüber hinaus danken die Autoren den Professoren Jillian Smith-Carpenter und Aaron Van Dyke für die Diskussionen über Peptid- und organische Synthese. Die Autoren danken der Autoren für die Unterstützung durch den Publication Fund des College of Arts & Sciences der Fairfield University.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
CEM Discover SP-MikrowellenreaktorCEMEingestellt.  Kürzlich wurde er in der Produktlinie durch den Discover 2.0 ersetzt.
Diisopropylcarbodiimid (DCC)TCI Amerika
Dimethylformamid (DMF)Thermowissenschaftliche Chemikalien
Gasdispersionsrohr, Mikro,  ChemglasCG-207-02Mittlere Porosität
MikroseptumChemGlassCG-3022-20"NMR-Röhrchen"-Septum
MorpholineThermowissenschaftliche Chemikalien
N-Fmoc-geschützte Aminosäuren
Oyxma PureTCI Amerika
Seitenwaffen-Ehrlenmeyer-KolbeVerschiedene AnbieterAbfallsammlung
"Tee"IdexP-713ETFE
Teflonrohr 1/8", Restek25306OD x 0,063" ID, 3 m
Reagenzglas (Halter für das Reaktionsgefäß außerhalb der Mikrowelle) Verschiedene Anbieter(30 x 175)
Reagenzglas (Reaktionsgefäß)Corning Glass9820-25XPyrex 25 x 200 mm, randlos 
RöhreIdexP-721ETFE (2x)
Wang SPPS Harz, 1 % vernetztes Divinylbenzol, 100-200 MeshAdvanced ChemTech

Referenzen

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