Methodenartikel

Identifizierung seltener antigenspezifischer T-Zellen aus der Lunge von Mäusen mit Peptid:Major-Histokompatibilitätskomplex-Tetrameren

DOI:

10.3791/66939

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19. Juli 2024

 ,  , 
1Center for Immunology and Inflammatory Diseases, Division of Rheumatology, Allergy, and Immunology, Massachusetts General Hospital, 2Division of Immunology, Boston Children's Hospital, 3Harvard Medical School, 4Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Massachusetts General Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir bieten ein detailliertes Protokoll für die Isolierung und Identifizierung seltener antigenspezifischer T-Zellpopulationen in der Lunge von Mäusen durch magnetische T-Zell-Anreicherung und Peptid:Major Histocompatibility Complex (MHC)-Tetramere.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Identifizierung und Charakterisierung antigenspezifischer T-Zellen während der Zeit von Gesundheit und Krankheit ist nach wie vor ein Schlüssel zur Verbesserung unseres Verständnisses der Immunpathophysiologie. Die technischen Herausforderungen bei der Verfolgung antigenspezifischer T-Zellpopulationen innerhalb des endogenen T-Zell-Repertoires wurden durch die Entwicklung von Peptid:MHC-Tetramerreagenzien erheblich vorangetrieben. Diese fluoreszenzmarkierten löslichen Multimere von MHC-Molekülen der Klasse I oder II, die an antigene Peptidepitope komplexiert sind, binden direkt an T-Zellen mit entsprechender T-Zell-Rezeptor (TCR)-Spezifität und können daher antigenspezifische T-Zellpopulationen in ihrem nativen Zustand identifizieren, ohne dass eine durch ex vivo induzierte funktionelle Reaktion erforderlich ist Anregung. Für äußerst seltene Populationen können tetramergebundene T-Zellen magnetisch angereichert werden, um die Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit des Nachweises zu erhöhen.

Da sich die Untersuchung der geweberesidenten T-Zell-Immunität vertieft, besteht ein dringender Bedarf, antigenspezifische T-Zellen zu identifizieren, die zu nicht-lymphoiden Geweben gelangen und sich dort aufhalten. In diesem Protokoll stellen wir eine detaillierte Reihe von Anweisungen für die Isolierung und Charakterisierung von antigenspezifischen T-Zellen vor, die in der Lunge von Mäusen vorhanden sind. Dies beinhaltet die Isolierung von T-Zellen aus verdautem Lungengewebe, gefolgt von einem allgemeinen Schritt der magnetischen Anreicherung von T-Zellen und einer Tetramerfärbung für die durchflusszytometrische Analyse und Sortierung. Die in diesem Protokoll hervorgehobenen Schritte verwenden gängige Techniken und leicht verfügbare Reagenzien, so dass es für nahezu jeden Forscher, der sich mit Maus-T-Zell-Immunologie beschäftigt, zugänglich ist, und sind hochgradig anpassbar für eine Vielzahl von nachgelagerten Analysen jeder niederfrequenten antigenspezifischen T-Zell-Population, die sich in der Lunge befindet.

Einleitung

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Das Herzstück des adaptiven Immunsystems ist die Fähigkeit einer T-Zelle, ein bestimmtes Antigen zu erkennen und darauf zu reagieren. Wann und wo eine T-Zelle auf ihr verwandtes Antigen reagiert, bestimmt das Gleichgewicht von Infektion und Autoimmunität, Homöostase und Krebs, Gesundheit und Krankheit1. Daraus folgt, dass sich die Untersuchung von T-Zellen in einem spezifischen Kontext der Immunität auf die Zellen konzentrieren sollte, die spezifisch für ein relevantes Antigen von Interesse sind. Zu den technologischen Fortschritten, die die Fähigkeit zur Charakterisierung antigenspezifischer T-Zellpopulationen erheblich verbessert haben, gehören fluoreszenzmarkierte lösliche Multimere (in der Regel Tetramere) von Molekülen der Klasse I oder II des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC), die an antigene Peptidepitope komplexiert sind, besser bekannt als "Peptid:MHC-Tetramere"2,3,4,5 . Indem sie die natürlichen Liganden von T-Zell-Antigenrezeptoren (TCRs) darstellen, bieten Peptid:MHC-Tetramere der Klassen I und II ein Mittel zur direkten Identifizierung von antigenspezifischen CD8+- bzw. CD4+-T-Zellen innerhalb des endogenen Repertoires von T-Zellen im Immunsystem, ohne dass eine Reaktion auf die Antigenstimulation in einem Assay erforderlich ist. Tetramere stellen einen eleganteren Ansatz für die Untersuchung antigenspezifischer T-Zellen dar als TCR-transgene T-Zell-Adoptionstransfermodelle6 und werden zunehmend zur Identifizierung fremder und selbstantigenspezifischer T-Zellpopulationen sowohl in experimentellen Mausmodellen als auch in menschlichen Krankheiten verwendet 4,5.

Während Tetramere hochfrequente Populationen von T-Zellen, die sich als Reaktion auf Antigenstimulation vergrößert haben, leicht identifizieren können, ist ihre Verwendung für naive, selbstantigenspezifische oder Gedächtnis-T-Zellen durch die sehr niedrigen Frequenzen dieser Populationen begrenzt7. Unsere Gruppe und andere haben Tetramer-basierte magnetische Anreicherungsstrategien entwickelt und populär gemacht, die die Empfindlichkeit des Nachweises erhöhen, um Studien dieser Zellpopulationen in lymphatischen Geweben der Maus zu ermöglichen 8,9,10,11.

Das Auftauchen von geweberesidenten T-Zellen in diesem Feld hat einen verstärkten Schwerpunkt auf die Entwicklung neuer Wege zur Untersuchung von T-Zellen im nicht-lymphoiden Raum gelegt. Wie viele andere Schleimhautoberflächen treffen auch T-Zellen in der Lunge auf eine Reihe von eigenen und fremden Antigenen, die vom Wirtsepithel, kommensalen und infektiösen Mikroben und Umweltentitäten, einschließlich Allergenen, abgeleitet sind. Die transkriptionelle Analyse von T-Zellen, die aus nicht-lymphatischem Gewebe (NLT) gewonnen wurden, zeigt einen gedächtnisähnlichen Phänotyp, der ein einzigartiges gewebespezifisches Schicksal und eine einzigartige Funktion aufweist und oft auf den Transport und die Gewebehomöostase gerichtet ist12. Darüber hinaus neigen geweberesidente Gedächtnis-T-Zellen (Trms) dazu, klonal stärker eingeschränkt zu sein als solche, die sich im Blut befinden13. Die Bestimmung, wie und warum Antigene die T-Zell-Residenz bei NLT antreiben, ist entscheidend für das Verständnis, wie das Immunsystem vor Infektionen schützt, die Gewebehomöostase aufrechterhält und sich manchmal in Autoimmunität verwandelt. Es scheint jedoch eine größere Abnutzung bei geweberesidenten T-Zellen aus der Lunge im Vergleich zu anderen NLT14 zu geben. Dementsprechend ist die Fähigkeit, endogene T-Zellen der Lunge mit einer gegebenen Antigenspezifität zu identifizieren und zu charakterisieren, durch ihre inhärente Seltenheit begrenzt.

Durch die Kombination von magnetischen Kügelchen-basierten Zellanreicherungstechniken und Peptid:MHC-Tetramerfärbung ist es uns gelungen, expandierte, aber seltene selbstantigenspezifische T-Zellen in der Lunge von Mäusen nachzuweisen15,16. Hier präsentieren wir eine detaillierte Beschreibung eines Protokolls, das wir optimiert haben, um jede seltene antigenspezifische T-Zellpopulation in der Lunge von Mäusen zuverlässig zu isolieren und zu charakterisieren (Abbildung 1). Dieses Protokoll umfasst einen In-vivo-Antikörperfärbeschritt zur Unterscheidung von geweberesidenten von vaskulären T-Zellen17, gefolgt von zwei verschiedenen Verfahren zur Verarbeitung von Lungengewebe, um die Verfügbarkeit von Ressourcen zu berücksichtigen. Darauf folgt ein allgemeiner Schritt der magnetischen Anreicherung von T-Zellen, eine Tetramerfärbung und eine Analyse mittels Durchflusszytometrie. Die Lebensfähigkeit der Zellen und die Tetramerfärbung werden in diesem Protokoll durch die Zugabe von Aminoguanidin, das die induzierbare Stickstoffmonoxidsynthase (iNOS)-vermittelte T-Zell-Aktivierungs-induzierte Apoptose blockiert18, und Dasatinib, das die TCR-Herunterregulierung begrenzt19, weiter verbessert. Die in diesem Protokoll hervorgehobenen Schritte verwenden gängige Techniken und leicht verfügbare Reagenzien, so dass es für nahezu jeden Forscher zugänglich ist, der sich mit Maus-T-Zell-Immunologie beschäftigt, und sehr anpassungsfähig für eine Vielzahl von nachgelagerten Analysen ist. Obwohl naive T-Zellen wahrscheinlich nicht in der Lunge zu finden sind, glauben wir, dass dieses Protokoll besonders hilfreich für die Untersuchung von selbstantigenspezifischen T-Zellen und Trms in der Lunge sein wird.

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Abbildung 1: Überblick über den Protokoll-Workflow. Lungen werden von Mäusen entnommen und in einzelne Zellen dissoziiert. Die Proben werden anschließend für T-Zellen angereichert, bevor sie mit Peptid:MHC-Tetrameren und fluoreszenzmarkierten Antikörpern für die durchflusszytometrische Analyse gefärbt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Protokoll

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Die in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren sind in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Massachusetts General Hospital, einem von der American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) akkreditierten Tiermanagementprogramm, genehmigt und entwickelt. Die Experimente wurden an 8-12 Wochen alten männlichen und weiblichen Mäusen mit einem genetischen Hintergrund von C57BL/6 durchgeführt, die in der MGH-Tieranlage unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen gezüchtet und gehalten wurden.

1. Herstellung von Stammlösungen

  1. Bereiten Sie HEPES-Puffer vor, indem Sie 10 mM HEPES, 5 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 150 mM NaCl und 1 mM MgCl2 auflösen und auf pH 7,4 einstellen.
  2. Bereiten Sie 10x Liberase Stammlösung her, indem Sie 700 μg/ml Liberase Thermolysin Medium (TM) (siehe Materialtabelle) in Hank's Balanced Salt Solution mit Ca++ und Mg++ (siehe Materialtabelle) lösen.
  3. Bereiten Sie 10x Aminoguanidin-Stammlösung her, indem Sie 100 mM Aminoguanidin-Hemisulfatsalz (siehe Materialtabelle) in Hank's Balanced Salt Solution mit Ca++ und Mg++ auflösen (siehe Materialtabelle).
  4. Bereiten Sie das komplette Eagle's Ham's Amino Acids (EHAA)-Medium vor, indem Sie EHAA-Medium (siehe Materialtabelle) mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 100 U/ml Penicillin/Streptomycin, 50 μg/ml Gentamycin, 2 mM L-Glutamin und 55 μM 2-Mercaptoethanol mischen.
    HINWEIS: Andere gängige T-Zell-Medien wie RPMI oder DMEM können ebenfalls verwendet werden.
  5. Bereiten Sie den Sortierpuffer vor, indem Sie 1x PBS mit 2 % FBS und 0,05 % Natriumazid mischen.
  6. Bereiten Sie den Fc-Block vor, indem Sie den gereinigten Anti-Maus-CD16/32-Antikörper (siehe Materialtabelle) bei 1:100 v/v in einem Sortierpuffer verdünnen.
  7. Bereiten Sie die Aufschlusslösung für Liberase TM/DNase vor, indem Sie 100 μg/ml Liberase TM und 50 μg/ml DNase I (siehe Materialtabelle) in RPMI 1640 Medium ohne L-Glutamin (siehe Materialtabelle) hinzufügen.
  8. Bereiten Sie eine Ketamin/Xylazin-Mischung vor, indem Sie 10 mg/ml Ketamin (siehe Materialtabelle) und 1 mg/ml Xylazin (siehe Materialtabelle) in normaler Kochsalzlösung (0,9 % NaCl) (siehe Materialtabelle) hinzufügen.

2. Erzeugung einer einzelligen Suspension aus Lungengewebe mittels automatisiertem Gewebedissoziator

  1. Bereiten Sie für jede Maus 4 ml eiskalten HEPES-Puffer in einem speziellen Gewebedissoziatorröhrchen vor (siehe Materialtabelle) und bewahren Sie es auf Eis auf.
  2. Betäuben Sie Mäuse durch intraperitoneale Injektion von 150-200 μl Ketamin/Xylazin-Gemisch. Injizieren Sie 1-3 μg Fluorophor-konjugierten Anti-Maus-CD45-Antikörper (siehe Materialtabelle), verdünnt in 100 μl normaler Kochsalzlösung, intravenös in jede anästhesierte Maus. Euthanasieren Sie die Maus 3 Minuten nach der Antikörperverabreichung mit einer intraperitonealen Injektion von 500-600 μl Ketamin/Xylazin-Gemisch.
  3. Die Lunge wird reseziert und in das entsprechende Gewebedissoziatorröhrchen gelegt, das auf Eis gekühlt wird. Legen Sie die Schläuche auf den automatisierten Gewebedissoziator (siehe Materialtabelle) und führen Sie das erste Programm (voreingestelltes Programm) für Lungengewebe aus.
  4. 500 μl Lichase-Stammlösung und 500 μl Aminoguanidin-Stammlösung werden in jedes Röhrchen gegeben, das das dissoziierte Lungengewebe enthält. Auf einem Nuktionsmischer 30 min bei 37 °C inkubieren.
  5. Setzen Sie die Schläuche wieder auf den Dissoziator und führen Sie das zweite Programm (voreingestelltes Programm) für Lungengewebe aus.
  6. Gießen Sie die Einzelzellsuspension aus dem Gewebedissoziatorröhrchen durch ein 100-μm-Zellsieb (siehe Materialtabelle) in ein konisches 50-ml-Röhrchen. Spülen Sie das Gewebedissoziatorröhrchen mit 5 mL vollständigem EHAA (oder einem gleichwertigen T-Zell-Medium) und geben Sie es durch das Sieb in das 50 ml-Röhrchen.
  7. Entfernen Sie das Sieb und erhöhen Sie das Volumen der Zellsuspension auf 50 mL mit vollständigem EHAA. Die Zellsuspension bei 400 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Saugen Sie den Überstand vorsichtig ab und lassen Sie etwa 100 μl Überstand und Zellpellet zurück.
  8. Fügen Sie ca. 100 μl Fc-Blocklösung hinzu, um das Gesamtvolumen auf 200 μl zu erhöhen, und wirbeln Sie kräftig vortexen, um das Pellet wieder zu suspendieren.

3. Alternatives Protokoll: Erzeugung einer einzelligen Suspension aus Lungengewebe durch manuelle Dissoziation

  1. Bereiten Sie für jede Maus 1 ml vollständiges EHAA in einem 1,5-ml-Mikrofuge-Röhrchen vor und bewahren Sie es auf Eis auf.
  2. Betäuben Sie Mäuse durch intraperitoneale Injektion von 150-200 μl Ketamin/Xylazin-Gemisch. Injizieren Sie 1-3 μg Fluorophor-konjugierten Anti-Maus-CD45-Antikörper, verdünnt in 100 μl normaler Kochsalzlösung, intravenös in jede anästhesierte Maus. Euthanasieren Sie die Maus 3 Minuten nach der Antikörperverabreichung mit einer intraperitonealen Injektion von 500-600 μl Ketamin/Xylazin-Gemisch.
  3. Resezieren Sie die Lunge und legen Sie sie in das entsprechende 1,5-ml-Mikrofuge-Röhrchen, das auf Eis gekühlt wird.
  4. Sobald alle Lungen entnommen wurden, übertragen Sie jede Lunge ohne Zellmedien in ein frisches Mikrofuge-Röhrchen.
  5. Schneiden Sie die Lunge mit einer Schere in das Mikrofuge-Röhrchen in kleine Fragmente (~2-3 mm große Stücke).
  6. Geben Sie 1 ml Liberase TM/DNase I Aufschlusscocktail in jedes Röhrchen.
  7. 30 min bei 37 °C im Wasserbad inkubieren. Legen Sie die Proben anschließend wieder auf Eis, um eine Überverdauung zu vermeiden.
  8. Gießen Sie die Probe über ein 100-μm-Zellsieb, das auf einem konischen 50-ml-Röhrchen platziert ist. Drücken Sie das Tuch mit dem Gummiende des Kolbens einer sterilen 1-ml-Spritze gegen das Netz.
  9. Spülen Sie das Sieb mit Kaltsortierpuffer und sammeln Sie ein Endvolumen von 7 mL im Röhrchen. Die Zellsuspension bei 400 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Der Überstand wird vorsichtig abgesaugt, wobei ca. 100 μl Überstand und Zellpellet übrig bleiben.
  10. Fügen Sie 100 μl Fc-Blocklösung hinzu, um das Gesamtvolumen auf 200 μl zu erhöhen, und wirbeln Sie kräftig vortexen, um das Pellet wieder zu suspendieren.

4. Anreicherung der Lungenprobe für T-Zellen mittels magnetischer Bead-Anreicherung

  1. Fügen Sie 50 μl Anti-Maus-CD90.2-Mikrokügelchen hinzu (siehe Materialtabelle). Vortexen und 10 min bei 4 °C inkubieren.
    HINWEIS: CD90.2 entspricht dem Allel, das von T-Zellen in C57BL/6-Mäusen exprimiert wird. Überprüfen Sie den Allelgenotyp, wenn andere Mäusestämme verwendet werden.
  2. Platzieren Sie in der Zwischenzeit eine paramagnetische Zelltrennsäule (siehe Materialtabelle) auf einen ein- oder vierstufigen Zelltrennmagneten (siehe Materialtabelle). Positionieren Sie ein offenes konisches 15-ml-Röhrchen unter jeder Säule, um den Durchfluss aufzufangen. Grundieren Sie die Säule mit 3 mL Kaltsortierpuffer, so dass die Säule durch die Schwerkraft in das darunter liegende konische Rohr abfließen kann.
  3. Sobald die Zellen 10 Minuten lang mit den Mikrokügelchen inkubiert haben, fügen Sie kalten Sortierpuffer zu einem Volumen von 1 ml hinzu und übertragen Sie ihn durch ein 100-μm-Zellsieb, das auf der Säule platziert ist. Sammeln Sie den Säulenfluss in ein frisches konisches 15-ml-Röhrchen, das sich unter der Säule befindet.
  4. Sobald die Zellsuspension durch die Schwerkraft vollständig durch die Säule abgeflossen ist, waschen Sie die Säule, indem Sie das Originalröhrchen mit zusätzlichen 3 mL Kaltsortierpuffer spülen und durch das Netz auf die Säule auftragen, wodurch das Sieb gespült wird. Entfernen Sie das Sieb.
  5. Wenn die Probe wieder vollständig in die Säule abgelassen ist und kein weiterer Durchfluss aus der Säule austritt, nehmen Sie die Säule aus dem Magneten und setzen Sie sie auf ein frisches konisches 15-ml-Röhrchen.
  6. Geben Sie 5 ml Kaltsortierpuffer in die Säule.
  7. Eluieren Sie sofort die an die Säule gebundenen Zellen, indem Sie den Säulenkolben in einer kontinuierlichen Bewegung nach oben schieben und den Sortierpuffer aus dem Boden der Säule in das neue Rohr drücken.
  8. Zentrifugieren Sie die eluierten Proben bei 400 x g für 5 min bei 4 °C. Saugen Sie den Überstand vorsichtig ab und lassen Sie etwa 100 μl Überstand und Zellpellet zurück.
  9. Fügen Sie 100 μl Kaltsortierpuffer hinzu, um das Gesamtvolumen auf 200 μl zu erhöhen, und wirbeln Sie kräftig vortexen, um das Pellet wieder zu suspendieren.
  10. Analysieren Sie bei Bedarf die Durchflussprobe, die die ungebundene Zellfraktion enthält.

5. Färbung der antigenspezifischen T-Zellen mit Peptid:MHC-Tetrameren

  1. 1 μl 10 μM Dasatinib (siehe Materialtabelle) zu jeder Probe geben, vortexen und 5 Minuten bei RT inkubieren.
  2. Fügen Sie PE- oder APC-konjugiertes Peptid:MHC-Tetramer bis zu einer Endkonzentration von 10 nM (oder einer empirisch optimierten Konzentration für ein gegebenes Tetramer) hinzu.
  3. Vortex und Inkubation im Dunkeln für 1 h bei RT (oder empirisch optimierter Zeit und Temperatur).

6. Analyse der Tetramer-markierten T-Zellen mittels Durchflusszytometrie

  1. Während die Probe mit Peptid:MHC-Tetrameren gefärbt wird, bereiten Sie einen Mastermix aus Antikörpern vor, um die Oberflächenmarker der Zellen zu färben (Tabelle 1).
    HINWEIS: Vermeiden Sie Fluorophore, die mit dem intravenös verabreichten CD45-Antikörper oder den Tetrameren in Konflikt stehen.
  2. Mit 15 Minuten verbleibender Inkubationszeit für die Tetramerfärbung geben Sie Oberflächenantikörper-Mastermix in 1:100 (oder empirisch optimierter Konzentration) zu jeder Probe.
  3. Die Inkubation im Dunkeln bei RT für den Rest der 1-stündigen Inkubationszeit fortsetzen.
  4. Fügen Sie 50.000 Durchflusszytometrie-Zählkügelchen hinzu (siehe Materialtabelle) und fügen Sie einen Kaltsortierpuffer zu einem Endvolumen von ca. 5 ml hinzu. Die gefärbte Probe wird bei 400 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird vorsichtig abgesaugt, wobei ca. 100 μl Überstand und Zell-/Kügelchenpellet zurückbleiben.
  5. Resuspendieren Sie die Probe mit zusätzlichen 200 μl Sortierpuffer und überführen Sie die Probe in ein 5-ml-Fluoreszenz-aktiviertes Zellsortierungsröhrchen (FACS).
  6. Analysieren Sie die Probe auf einem Durchflusszytometer. Sammeln Sie so viele Zellen wie möglich, bis zu einem Maximum von insgesamt 2.500.000 Ereignissen. Stellen Sie sicher, dass mindestens 20.000 Zähl-Bead-Ereignisse erfasst wurden. Halten Sie die Erfassungsrate bei oder unter 5.000 Ereignissen pro Sekunde.
  7. Speichern Sie alle Daten als FCS-Dateien.

  

FluorochromAntikörper
BUV395CD90.2
Pazifisches BlauCD45 (früher durch intravenöse Injektion hinzugefügt)
Pazifische OrangeCD8
Strahlendes Violett 785CD4
FITCCD3
PerCP-Cy5.5Dump (B220, CD11b, CD11c, F4/80)
PEpMHC-Tetramer oder phänotypischer Marker
PE-Cy7Phänotypischer Marker (z.B. CD44, PD-1, CD69, etc.)
APCpMHC-Tetramer oder phänotypischer Marker
AlexaFluor 700Phänotypischer Marker (z.B. CD44, PD-1, CD69, etc.)
APC-CY7Lebender/toter Fleck

Tabelle 1: Färbematrix der Probe. Ein typisches Panel von Fluorophor-konjugierten Durchflusszytometrie-Antikörpern, die zur Identifizierung und Charakterisierung antigenspezifischer T-Zellen verwendet werden.

7. Analysieren von Daten

  1. Analysieren Sie die FCS-Datendateien mit einer geeigneten Durchflusszytometrie-Software.
    1. Richten Sie eine Sequenz von aufeinanderfolgenden Einschlussgates ein, um 1) lymphozytenähnliche, 2) einzelne, 3) lebende, 4) extravaskuläre, 5) dump-negative und 6) CD90.2-positive Ereignisse zu identifizieren, die entweder CD4- oder CD8-positiv sind (Abbildung 2).
    2. Identifizieren Sie die tetramerpositiven T-Zellen innerhalb dieser Populationen.
  2. Bestimmen Sie die absolute Anzahl der tetramerpositiven Küvetten, indem Sie das Verhältnis der hinzugefügten Kügelchen (50.000) zur Anzahl der während des Probenlaufs gesammelten Kügelchen berechnen und den Wert mit der Gesamtzahl der gesammelten tetramerpositiven Zellen multiplizieren.
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Ergebnisse

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Abbildung 2 zeigt die repräsentative Gating-Strategie, die bei der Identifizierung seltener antigenspezifischer CD4+ T-Zellen in der Lunge mit Peptid:MHC-Klasse-II-Tetrameren verwendet wird. Das gleiche Verfahren kann für antigenspezifische CD8+ T-Zellen mit Peptid:MHC-Klasse-I-Tetrameren angewendet werden (Daten nicht gezeigt).

Aufgrund der hohen Anzahl nicht-lymphatischer Zellen in der Lunge erfordert der zuverlässige Nachweis seltener antigenspezifischer T-Zellen durch Tetramer eine Form der vorherigen Anreicherung für die interessierenden T-Zellen, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern. Abbildung 3 veranschaulicht die Wirksamkeit der CD90.2-Antikörper-basierten magnetischen Anreicherung von Gesamt-T-Zellen aus Lungengewebe, die wir in diesem Protokoll beschrieben haben. Im Durchschnitt gewinnen wir über diesen Anreicherungsprozess mehr als 99% aller CD90.2+ T-Zellen mit einer Reinheit von mehr als 90% aus der Lunge zurück. Abbildung 4 veranschaulicht die verbesserte Detektion seltener tetramerpositiver CD4+ T-Zellen, die sich aus dieser Anreicherung ergibt, im Vergleich zu keiner Anreicherung oder einer direkten Tetramer-basierten Zellanreicherungsstrategie.

Abbildung 5 veranschaulicht die verbesserte Tetramermarkierung von antigenspezifischen T-Zellen, die mit Dasatinib behandelt wurden, insbesondere in seltenen Populationen.

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Abbildung 2: Gating-Strategie für die Durchflusszytometrie-Analyse. Sequentielle Ein- und Ausschluss-Gates, die zur Identifizierung seltener selbstantigenspezifischer CD4+ T-Zellen verwendet werden, die sich nach einer akuten Gewebeverletzung in der Lunge ansammeln. Zählkügelchen können direkt anhand ihrer Fluoreszenz entlang des FITC-Kanals identifiziert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: CD90.2-Antikörper-basierte magnetische Anreicherung von Gesamt-T-Zellen in der Lunge. Repräsentative Durchflusszytometrie-Diagramme sind für die ungebundene (links) und die gebundene (rechts) Fraktion einer Lungenprobe nach der Anreicherung dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Vergleich von Zellanreicherungsstrategien zur Unterstützung des Nachweises seltener antigenspezifischer T-Zellen in der Lunge. Drei Mäuse, die ein Modell-Selbstantigen im Lungenepithel exprimierten, wurden subkutan mit einem Peptidepitop aus dem Selbstantigen immunisiert, das in Complete Freund's Adjuvans (CFA) emulgiert wurde. Nach 7 Tagen wurden die Lungen der Maus entnommen, kombiniert und in drei gleiche Proben aufgeteilt, um die Tetramerfärbung ohne Zellanreicherung (links), die CD90.2-Antikörper-basierte Zellanreicherung (Mitte) oder die Tetramer-basierte Zellanreicherung (rechts) durchzuführen. Die Proben wurden mittels Durchflusszytometrie auf nicht mehr als 1.500.000 Gesamtereignisse analysiert (CD4+ Gated Events gezeigt). Die Anzahl der Tetramer-positiven Ereignisse ist schwarz angegeben, während die berechnete Gesamtzahl der antigenspezifischen T-Zellen in den Lungenproben rot dargestellt ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Die Behandlung mit Dasatinib verstärkt die Tetramerfärbung. Wildtyp-Mäuse (links) oder Mäuse, die ein Modell-Selbstantigen im Lungenepithel exprimieren (rechts), wurden subkutan mit einem Peptidepitop aus dem in CFA emulgierten Selbstantigen immunisiert. Die Milz und lymphatischen Organe der Mäuse wurden entnommen, kombiniert und in zwei gleiche Proben aufgeteilt, um sie mit Peptid:MHC-Klasse-II-Tetrameren mit oder ohne Dasatinib-Vorbehandlung zu markieren. Histogramme der Tetramerfärbung werden überlagert, wobei Proben verglichen werden, die mit (rot) und ohne (blau) Dasatinib behandelt wurden. Die mediane Fluoreszenzintensität jeder Probe wird angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

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Frühere Charakterisierungen von antigenspezifischen T-Zellen aus der Lunge haben von der robusten Anzahl antigenspezifischer T-Zellen profitiert, die sich nach einem akuten Priming-Ereignis wie einer intranasalen Immunisierung oder Infektion vermehren 20,21,22. Seltenere T-Zellpopulationen in der Lunge, wie z. B. selbstantigenspezifische T-Zellen oder geweberesidente Gedächtnis-T-Zellen, sind jedoch ohne irgendeine Form der Probenanreicherung für die interessierenden T-Zellen schwer zu erkennen 15,16,23. Wir haben dieses Ziel erreicht, indem wir die zuvor beschriebenen Dissoziationstechniken des Lungengewebes kombiniert haben, um einen hohen Prozentsatz lebensfähiger Lymphozytenzu erhalten 24,25 mit einer Strategie zur Unterscheidung von intravaskulären von parenchymalen T-Zellen und einem allgemeinen T-Zell-basierten Anreicherungsprozess, gefolgt von einer Tetramerfärbung17. Mit Hilfe dieses Protokolls haben wir die Fähigkeit demonstriert, seltene T-Zellen zu identifizieren und zu charakterisieren, die spezifisch gegen Selbstantigene in der Lunge sind, die als Reaktion auf eine direkte Immunisierung mit exogenen Peptiden oder eine indirekte Aktivierung durch Antigenfreisetzung während einer Gewebeschädigung entstehen15,16. Bei der Entwicklung dieses Protokolls wurden mehrere Überlegungen angestellt.

Wir haben zwei verschiedene Protokolle zur Verarbeitung von Lungengewebe beschrieben, die gut funktioniert haben. Bei dem einen wird ein automatisiertes Instrument zur Dissoziation des Gewebes verwendet, während bei dem anderen ein manueller Prozess durchgeführt wird. Wichtig ist, dass beide Methoden Liberase TM verwenden, eine Mischung aus Kollagenase I und II, die auch ein Metalloprotease-Thermolysin enthält. Es wurde gezeigt, dass diese Enzymmischung die Verdauungsaktivität gegenüber einem einzigen Kollagenase-Cocktail erhöht und sich gut bei der Rückgewinnung von Leukozyten aus dem Lungengewebe bewährt26.

Das automatisierte Gewebedissoziationsprotokoll erfordert hohe Vorabkosten für die Maschine und spezielle Gewebedissoziationsröhrchen, aber die Röhrchen können zusammen mit Zellsieben, die im Allgemeinen auch wiederverwendbar sind, gewaschen und wiederverwendet werden. Das manuelle Dissoziationsprotokoll verursacht nicht die Vorabkosten für Spezialgeräte, ist jedoch arbeitsintensiv und verlängert die Ernte, da jede Probe einzeln zerkleinert wird. Es gibt weitere Unterschiede zwischen den Protokollen in Bezug auf die Verwendung von Aminoguanidin oder DNase I zur Begrenzung des Zelltods und der Zellverklumpung, aber wir haben die Auswirkungen dieser Zusatzstoffe nicht sorgfältig verglichen. Die Entscheidung, eines der beiden Protokolle zu verwenden, sollte von der persönlichen Erfahrung mit der Art der durchgeführten Studie sowie von der Verfügbarkeit eines automatisierten Gewebedissoziationsinstruments abhängen, was den größten Kostenfaktor darstellen würde. In der Tat können Elemente der beiden Protokolle gemischt und aufeinander abgestimmt werden, um die beste Leistung für die spezifischen Anforderungen der Studie zu erzielen.

Das oben erwähnte Protokoll schließt insbesondere die Verwendung eines Dichtegradienten zur Isolierung von Lymphozyten aus der Einzelzellsuspension aus, die aus der Gewebedissoziation hergestellt wurde. Wir haben festgestellt, dass der magnetische T-Zell-Anreicherungsschritt, der für die Identifizierung seltener antigenspezifischer T-Zellen erforderlich ist, diesen Schritt überflüssig macht. In Fällen, in denen die antigenspezifischen T-Zellfrequenzen hoch genug sind, um die Notwendigkeit eines T-Zell-Anreicherungsschritts vollständig zu eliminieren, wird jedoch ein Dichtegradient empfohlen, da er eine beträchtliche Menge an Zielzellanreicherung ermöglicht, indem eine große Anzahl nicht-lymphoider Zellen entfernt wird. Wenn die Einzelzellpräparate der Lunge besonders groß und/oder unordentlich sind, kann vor der magnetischen Anreicherung ein Dichtegradientenschritt verwendet werden, um überschüssige Zelltrümmer zu entfernen, die später die Säulen verstopfen könnten (Schritte 4.4-4.7).

Wir entschieden uns für eine generelle Anreicherung aller T-Zellen auf Basis des CD90 pan T-Zell-Markers (CD90.2 für das Allel, das in C57BL/6-Mäusen exprimiert wird) anstelle einer direkteren Tetramer-basierten Zellanreicherungsstrategie. Dies bietet mehrere Vorteile. (1) Die CD90-basierte Anreicherung führt zu einer höheren Anzahl von antigenspezifischen Ereignissen, die in der Durchflusszytometrie nachgewiesen werden als unangereicherte oder Tetramer-basierte Anreicherungsproben (Abbildung 4). Dies trägt zu einer besseren Abschätzung der seltenen antigenspezifischen T-Zell-Frequenzen bei, ohne dass eine übermäßige Anzahl von Gesamtereignissen (>2.500.000) erfasst werden muss, was die Probenentnahmezeiten verlängert und die Signal-Rausch-Auflösung verschlechtert. (2) Im Gegensatz zur Tetramer-basierten Anreicherung ermöglicht die CD90-basierte Anreicherung die Bewertung des gesamten T-Zell-Kompartiments der Lunge, einschließlich CD4+ - und CD8+ -T-Zellen, intravaskulärer vs. extravaskulärer T-Zellen sowie antigenspezifischer vs. antigen-unspezifischer, alles in einer Probe (Abbildung 2). (3) Da der CD90-basierte Anreicherungsschritt vor der Tetramerfärbung erfolgt, minimiert er die Zeit, bevor Tetramer-markierte Zellen auf dem Durchflusszytometer analysiert werden, wodurch der potenzielle Signalverlust durch die Tetramerablösung begrenzt wird.

Der T-Zell-Anreicherungsprozess in diesem Protokoll basiert auf positiver Selektion mit CD90.2-Magnetbeads, aber ähnliche Ergebnisse können mit negativen Selektionsstrategien erzielt werden, die von CD4-, CD8- oder pan-T-Zell-Isolationskits bereitgestellt werden. Wir beschreiben die Verwendung einer bestimmten Marke von Mikrokügelchen, Säulen und Magneten, aber auch andere magnetische Anreicherungssysteme sollten funktionieren. Auch hier sollten Entscheidungen auf der Leistung in der jeweiligen Studie sowie auf den Gesamtkosten basieren, die erheblich sein können. Nach unserer Erfahrung mit Anreicherungsprotokollen gibt es einen generellen Kompromiss zwischen Zielzellausbeute und Reinheit, und für den Nachweis einer extrem begrenzten Anzahl von antigenspezifischen T-Zellen hat die Ausbeute Vorrang.

Während die repräsentativen Ergebnisse Experimente mit CD4+ T-Zellen und Peptid:MHC-Klasse-II-Tetrameren abbilden, ist dieses Protokoll für CD8+ -T-Zellen und Peptid:MHC-Klasse-I-Tetramere genauso effektiv. In solchen Fällen sollten die möglicherweise unterschiedlichen Bedingungen für die Tetramerfärbung der Klasse I (Konzentration, Zeit, Temperatur) berücksichtigt werden. Darüber hinaus sehen wir keine Gründe, die gegen die Verwendung für antigenspezifische B-Zell-Studien mit geeigneten Fluorochrom-markierten B-Zell-Antigen-Reagenzien sprechen27.

Schließlich schließt das hier beschriebene Protokoll die Zugabe des Proteinkinase-Inhibitors Dasatinib zu der Probe vor der Tetramerfärbung ein. Dasatinib blockiert die TCR-Signalgebung und -Internalisierung, was die Tetramermarkierung von T-Zellen verbessert und gleichzeitig den Tetramer-induzierten T-Zelltod möglicherweise reduziert19. Wir fanden den Nutzen der Behandlung mit Dasatinib vor allem in der Detektion der selteneren selbstantigenspezifischen Population. Dies ist wahrscheinlich auf die Tatsache zurückzuführen, dass selbstantigenspezifische T-Zellen aufgrund der Auswirkungen negativer Selektion während der zentralen Toleranz eine geringere Affinitäts-TCR exprimieren 28,29,30,31.

Das hier verwendete Protokoll wurde erfolgreich mit intrazellulären Färbeprotokollen kombiniert, um die Expression von Transkriptionsfaktoren und Zytokinen in seltenen lungenresidenten antigenspezifischen T-Zellen zu analysieren. Wir haben diese seltenen Populationen auch erfolgreich für nachgelagerte Analysen sortiert, einschließlich Einzelzell-Transkriptomik und TCR-Sequenzierung. Die fortgesetzte Anwendung und Entwicklung dieses Protokolls sollte Studien zur adaptiven Immunität in der Lungenpathophysiologie sehr zugute kommen.

Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Konflikte offenzulegen.

Danksagungen

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Wir danken L. Kuhn für die technische Unterstützung bei der Gewebeverarbeitung und der Tetramerproduktion. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (R01 AI107020 und P01 AI165072 an J.J.M., T32 AI007512 an D.S.S.), dem Massachusetts Consortium on Pathogen Readiness (J.J.M.) und dem Massachusetts General Hospital Executive Committee on Research (J.J.M.) finanziert.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
100 mm ZellensiebFisher Scientific22-363-549
10x PBS ohne Ca++ oder Mg++Corning46-013-CM
1x PBS ohne Ca++ oder Mg++Corning21-031-CV
AccuCheck ZählperlenInvitrogenPCB100
Aminoguanidin-Hemisulfat-SalzSigma-AldrichA7009
CD90.2 Mikrokügelchen, MausMiltenyi130-121-278
Zelltrennmagnet (MidiMACS-Separator)Miltenyi130-042-302Hält eine einzelne LS-Säule
Zelltrennmagnet (QuadroMACS-Separator)Miltenyi130-090-976Hält 4 LS-Säulen
DasatinibSigma-AldrichCDS023389
DNase IRoche10104159001
Eagle' s Schinken" s Aminosäuren mediumSigma-AldrichC5572
gentleMACSMiltenyi130-093-235Automatisierter Gewebedissoziator
gentleMACS C TubesMiltenyi130-093-237Automatisierte Gewebedissoziatorröhrchen
Hank's Balanced Salt Solution mit Ca++ oder Mg++Corning21-020-CM
HEPESGibco15630080
KetaminVedcoNDC 50989-996-06
Liberase TMRoche5401119001
Pacific Blue Anti-Maus CD45 Antikörper (Klon: 30-F11)Biolegend103126
Paramagnetische Zelltrennsäulen (LS Säulen)Miltenyi130-042-401Kommt mit Kolben
Gereinigter Anti-Maus CD16/32 Antikörper (Klon: 93)Biolegend101302
RPMI 1640 Medium ohne L-GlutaminCorning15-040-CM
Natriumchlorid 0,9% (normale Kochsalzlösung)CytivaZ1376
XylazinPivetalNDC 466066-750-02

Referenzen

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Peptid MHC TetramereImmunologie der Lunge von M usengewebest ndige T Zellenmagnetische AnreicherungDurchflusszytometrieDissoziation von LungengewebeGed chtnis T ZellenZelloberfl chenmarkerT Zell Isolierung

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