Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur intranasalen Verabreichung von α-Synuclein-Aggregaten. Diese Methode gibt Aufschluss über die α-Synuclein-Ausbreitung von der Riechschleimhaut zum Riechkolben bei der Parkinson-Krankheit.
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Methodenartikel
Technik zur intranasalen Verabreichung von α-Synuclein-Aggregaten
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Parkinson-Krankheit (PD) ist eine neurodegenerative Erkrankung, die durch das Vorhandensein von Lewy-Körperchen gekennzeichnet ist, bei denen es sich um Aggregate von α-Synuclein (α-Syn) handelt. Kürzlich wurde vorgeschlagen, dass sich die Krankheit durch die prionenartige Vermehrung von α-Syn-Aggregaten aus dem Riechkolben (OB) oder dem dorsalen Kern des Vagusnervs entwickelt und fortschreitet. Obwohl der Ursprung der α-Syn-Aggregate im OB unklar bleibt, wurde ihre Vermehrung aus der Riechschleimhaut in jüngster Zeit vermutet. Wir haben bereits gezeigt, dass die intranasale Verabreichung von α-Syn-Aggregaten in einem Mausmodell eine α-Syn-Pathologie im OB von Mäusen induziert. In dieser Arbeit stellen wir eine Methode zur intranasalen Verabreichung von α-Syn-Aggregaten vor, die eine α-Syn-Pathologie im OB von Mäusen induzierte. Die intranasale Verabreichung von α-Syn-Aggregaten ist eine sehr einfache und unkomplizierte Methode, und wir glauben, dass sie ein nützliches Werkzeug in der Forschung sein wird, um den Ursprung der α-Syn-Pathologie im OB und den Weg der α-Syn-Ausbreitung durch das olfaktorische System aufzuklären.
Einleitung
Die Parkinson-Krankheit (PD), die durch motorische Symptome wie Bradykinesie, Ruhezittern und Muskelsteifigkeit gekennzeichnet ist, ist die zweithäufigste neurodegenerative Erkrankung1. Parkinson zeigt auch nicht-motorische Symptome, einschließlich olfaktorischer Dysfunktion, kognitiver Beeinträchtigung, Depressionen, Halluzinationen, Verstopfung und orthostatischer Hypotonie. Seine pathologischen Kennzeichen sind der dopaminerge Zelltod in der Substantia nigra und das Vorhandensein von α-Synuclein (α-Syn)-Aggregaten, den sogenannten Lewy-Körperchen2.
Bemerken....
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Protokoll
Für diese Studie wurden männliche Mäuse von C57BL/6J im Alter von 2 Monaten verwendet. Alle experimentellen Verfahren wurden nach nationalen Richtlinien durchgeführt. Das Tierforschungskomitee der Universität Kyoto erteilte die ethische Genehmigung und Erlaubnis für diese Studie (MedKyo 23,544).
1. Intranasale Verabreichung von α-Syn-vorgeformten Fibrillen
- Bereiten Sie Maus-α-Syn-Fibrillenlösung in PBS (4 mg/ml) gemäß den zuvor berichteten Methoden11 vor. Wickeln Sie die Tube mit einer transparenten Folie ein, um eine Kontamination zu vermeiden.
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Ergebnisse
Abbildung 3 zeigt mehrere Beispiele für α-Syn-Aggregate im OB. In der vorliegenden Studie haben wir α-Syn-Aggregate in das einseitige Nasenloch verabreicht. Die beiden Nasenhöhlen sind durch die Nasenscheidewand getrennt, und jeder OB projiziert die olfaktorischen sensorischen Neuronen separat in jede Nasenhöhle. Daher kann der OB auf der kontralateralen Seite als Kontrolle verwendet werden.
Eine P-α-Syn-Pathologie wurde im OB auf der behandelten Seite nach 1 und .......
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Diskussion
In einer früheren Studie führte die Verabreichung von α-Syn-Aggregaten in die Nasenhöhle von Makaken zum Absterben dopaminerger Zellen und zur Eisenablagerung in der Substantia nigra, obwohl keine α-Syn-Aggregate beobachtet wurden21. Es wurde berichtet, dass die tägliche Verabreichung von humanen A53T-α-Syn-Aggregaten in die Nasenhöhle von transgenen Mäusen mit Prionen-Promotor α-Syn (M83-Mäusen) über einen Zeitraum von 28 Tagen eine α-Syn-Pathologie im Gehirn und.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Danksagungen
Alle Experimente wurden von Rie Hikawa unterstützt. Wir danken Yasuko Matsuzawa für den Papierkram. Diese Studie wurde unterstützt von JSPS KAKENHI (M.S., No. JP19K23779, JP20K16493 und JP20H00663).
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| All-in-One-Fluoreszenzmikroskop BZ-X710 | KEYENCE | N/A | All-in-One-Mikroskop |
| Ampicillin-Natriumsalz | Nacalai tesque | 02739-32 | |
| Bioruptor II | Sonicbio | BR2006A | Wasserbad-Ultraschallgerät. |
| Butorphanoltartrat | Meiji Seika Pharma | WAK-52850 | |
| Zellulosetube | MISUMI | UC20-32-100 | |
| DeepWellMaximizer | TAITEC | MBR-022UP | Shaker |
| DynaCompetent Cells Zip BL21(DE3) | BioDynamics Laboratory Inc. | DS255 | Kompetente Zelle |
| Entellan | Sigma-Aldrich | 107961 | Einbettmedium für die Mikroskopie |
| Graefe Extra feine Pinzette gebogen gezahnt | FST | 11152-10 | Zange |
| Gehärtete Feinschere | FST | 14090-09 | Schere |
| Histofine Einfache Färbung Maus MAX-PO (R) | Nichirei Bioscience 414341 | Universal Immunperoxidase Polymer, Anti-Kaninchen | |
| ImageJ ver 1.52p | NA | NA https://imagej.net/ | |
| innova4200 | New Brunswick wissenschaftliche | 9105085 | Inkubator |
| Schüttler Isopropyl-β- D-Thiogalactopyranosid | Nacalai tesque | 19742-94 | |
| LB Brühe, Lennox | Nacalai tesque | 20066-24 | |
| Leica EG 1150 H | Leica | 14 0388 86 108 | Modulares Gewebeeinbettungszentrum |
| Leica TP 1020 | Leica | 14 0422 85108 | Automatischer Gewebeprozessor |
| Medetomidin | Fuji Film | 135-17473 | |
| Microm HM325 Rotationsmikrotom | Thermo Scientific | 902100 | |
| Midazolam | Maruishi Seiyaku | 4987-211-76210-0 | |
| Neues Hämatoxylin Typ G | Muto | 65-9197-38 | Hämatoxylinlösung |
| Normale Flügelnadel für Vene Typ D, 25G | TERUMO | NN2332R | 25G Nadel |
| Optima TLX Ultrazentrifuge | Beckman Couler | 8043-30-1197 | Ultrazentrifuge |
| P10 Pipette | Gilson | FA10002P | |
| Paraffin | Leica | 39601095 | |
| Paraformaldehyd | Nacalai tesque | 30525-89-4 | |
| Peroxidase Stain DAB Kit | Nacalai tesque | 25985-50 | |
| Pirece BCA Protein Assay Kits | Thermo Scientific | 23225 | BCA Assay |
| pRK172 | Addgen | #134504 | Plasmid |
| Q-Sepharose Fast Flow. | cytiva | 17051001 | Ionenaustauscherharz |
Referenzen
- Tysnes, O. B., Storstein, A. Epidemiology of Parkinson's disease. J Neural Transm (Vienna). 124 (8), 901-905 (2017).
- Goedert, M. Alpha-synuclein and neurodegenerative diseases. Nature Rev Neurosci. 2, 492-501 (2001).
- Conway, K. A., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
