Methodenartikel

System für fokale, geschlossene Verletzungen des Zentralnervensystems

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DOI:

10.3791/66948

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29. November 2024

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1Neuroscience Graduate Program, Vanderbilt University, 2Vanderbilt Eye Institute, Vanderbilt University Medical Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein kundenspezifisches Überdruck-Luftsystem, das entwickelt wurde, um Verletzungen des geschlossenen Zentralnervensystems (ZNS) bei Mäusen zu induzieren, einschließlich Augen-, Gehirn- und Rückenmarkstraumata. Das Ziel dieses Protokolls ist es, Forschern einen Rahmen zu bieten, mit dem sie das System für ihre einzigartigen ZNS-Traumastudien einfach anpassen und erweitern können.

Zusammenfassung

Die Prävalenz von Verletzungen des geschlossenen Systems des zentralen Nervensystems (ZNS) unterstreicht die Notwendigkeit eines besseren Verständnisses dieser Traumata, um schützende und therapeutische Interventionen zu verbessern. Entscheidend für diese Forschung sind Tiermodelle, die Verletzungen des geschlossenen Systems des ZNS nachbilden. In diesem Zusammenhang wurde ein spezielles Überdruck-Luftsystem entwickelt, um eine Reihe von geschlossenen ZNS-Verletzungen in Mausmodellen zu reproduzieren, einschließlich Augen-, Hirn- und Rückenmarkstraumata. Bisher wurde das System zur Verabreichung von Überdruckluft an Augen, Kopf oder Wirbelsäule verwendet, um die anteroposteriore Polverletzung im Auge, die indirekte traumatische Optikusneuropathie (ITON), die fokale traumatische Hirnverletzung und die Rückenmarksverletzung zu modellieren. Dieses Dokument enthält ein detailliertes Protokoll, das das Design und den Betrieb des Systems beschreibt, und enthält repräsentative Ergebnisse, die seine Wirksamkeit belegen. Der hier vorgestellte robuste Rahmen bietet eine solide Grundlage für die laufende Forschung im Bereich des ZNS-Traumas. Durch die Nutzung der flexiblen Attribute des Systems können Ermittler den Ort, die Schwere und den Zeitpunkt von Verletzungen ändern und sorgfältig kontrollieren. Dies ermöglicht einen umfassenden Vergleich der molekularen Mechanismen und der therapeutischen Wirksamkeit bei mehreren ZNS-Verletzungen im geschlossenen System.

Einleitung

Verletzungen des geschlossenen Systems des Zentralnervensystems (ZNS) sind Verletzungen, die durch eine Schädigung des Gehirns oder des Rückenmarks verursacht werden, ohne einen Bruch des Schädels oder der Wirbelsäule zu verursachen. Zu diesen Verletzungen gehören traumatische Hirnverletzungen (TBI) und Rückenmarksverletzungen (SCI) und können bei einer Vielzahl von Vorfällen auftreten, darunter Verletzungen durch stumpfe Gewalteinwirkung (z. B. Stürze, Sportverletzungen, Autounfälle) und explosive Explosionen. Geschlossene ZNS-Verletzungen gelten im Vergleich zu penetrierenden ZNS-Verletzungen im Allgemeinen als weniger schwer, treten jedoch häufiger auf. Ähnlich wie penetrierende Verletzungen können Verletzungen des geschlossenen ZNS jedoch zu langfristigen und fortschreitenden Gesundheitsproblemen führen, insbesondere nach wiederholten Auftreten 1,2,3,4,5,6. Besorgniserregend ist, dass sich neue Erkenntnisse daraus ergeben, dass sich selbst subklinische ZNS-Verletzungen im geschlossenen System, die nach einem einmaligen Auftreten unter die diagnostischen Kriterien für ein SHT oder eine Querschnittlähmung fallen 7,8,9,10,11,12,13, sich nach wiederholter Verletzung zu chronischen neurodegenerativen Erkrankungen entwickeln können 6,14,15,16. Dies unterstreicht die dringende Notwendigkeit eines besseren Verständnisses der Mechanismen und Folgen einzelner und wiederholter Verletzungen des geschlossenen ZNS.  Dieses Wissen ist für verbesserte Schutz- und Therapieansätze unerlässlich. Entscheidend für dieses Unterfangen sind Tiermodelle, die Verletzungen des geschlossenen ZNS nachbilden.

Aktuelle Tiermodelle für geschlossene ZNS-Verletzungen haben maßgeblich dazu beigetragen, unser Verständnis der Pathophysiologie und möglicher schützender und therapeutischer Interventionen für diese Traumata zu verbessern. Nagetiere sind aufgrund ihrer geringen Kosten, Verfügbarkeit, genetischen Manipulierbarkeit, einfachen Handhabung, gut etablierten Verhaltens- und physiologischen Assays und günstigerer ethischer Erwägungen besonders beliebt17. Zu den gebräuchlichen Verfahren zur Induktion eines SHT in geschlossenen Systemen bei Nagetieren gehören Gewichtsabwurfgeräte18, 19, Geräte mit kontrolliertem kortikalem Aufprall (CCI)20 und druckluftbetriebene Stoßdämpferrohre21. Bei einer Querschnittlähmung ist bei stumpfen Traumamodellen typischerweise eine Laminektomie22,23 oder andere chirurgische Techniken24 erforderlich, um direkten Zugang zum Rückenmark oder zum Epiduralraum zu erhalten. Es wurden jedoch Modelle für geschlossene Körper-SCI-Explosionsverletzungen entwickelt, die druckluftbetriebene Stoßdämpferrohre 25 verwenden. Obwohl jedes dieser Modelle wertvolle Erkenntnisse liefert, hat es einzigartige Einschränkungen. Gewichtsverlustmodelle können eine hohe Variabilität und eine begrenzte Kontrolle über den Ort und die Schwere der Verletzung aufweisen, was zu experimentellen und ethischen Bedenken hinsichtlich der Verursachung schwerer, unkontrollierter Verletzungen führt26. CCI-Geräte bieten Präzision, erfordern jedoch eine Schulung für die Bedienung, können eine Kraniotomie erfordern und können unter mechanischer Variabilität leiden, die sich auf die Reproduzierbarkeit auswirkt27. Stoßdämpfer sind im Allgemeinen weniger invasiv, können aber schwierig zu beschaffen sein, komplex einzurichten und zu betreiben sein und können aufgrund von Umweltfaktoren, Wellenreflexionen und komplexen Druckwechselwirkungen unrealistische und sehr variable Verletzungsbedingungen schaffen28.

Um die Mechanismen und Auswirkungen von Einzel- und Wiederholungsverletzungen des geschlossenen Systems und deren Behandlungen besser untersuchen zu können, wird in diesem Artikel eine modulare, benutzerfreundliche, kostengünstige und nicht-invasive Methode vorgestellt. Das Hauptziel dieses Ansatzes ist es, eine präzise Kontrolle und flexible Modifikation von Verletzungsparametern zu ermöglichen, einschließlich Ort, Schwere und Zeitpunkt. Um dieses Ziel zu unterstützen, bietet dieses Manuskript ein detailliertes Protokoll für die Konstruktion, Kalibrierung und Fehlerbehebung eines Überdruck-Luftsystems, das einige der Einschränkungen bestehender Geräte mit geschlossenem System für ZNS-Verletzungen berücksichtigt. Dieses System bietet nicht nur Kosteneffizienz und minimale Einrichtungszeit, sondern ist auch äußerst vielseitig und liefert konsistente und reproduzierbare Ergebnisse bei gleichzeitiger Minimierung ethischer Bedenken und Maximierung der klinischen Relevanz. Darüber hinaus wird die Fähigkeit des Systems beschrieben, eine Reihe von ZNS-Verletzungen im geschlossenen System in Mausmodellen zu erzeugen, sowie seine potenziellen Anwendungen in zukünftigen Studien. Das Ziel dieses Manuskripts ist es, einen Rahmen zu schaffen, der es den Untersuchern ermöglicht, dieses System einfach zu erwerben, anzupassen und für ihre spezifischen Bedürfnisse zu erweitern, um so die laufende Forschung im Bereich des ZNS-Traumas zu fördern. Repräsentative Ergebnisse, die die Wirksamkeit des Systems bei der Induktion axonaler Traumata belegen, werden ebenfalls vorgestellt.

Protokoll

Alle Verfahren wurden gemäß den Protokollen durchgeführt, die vom 29,30,31,32 Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Vanderbilt University genehmigt wurden, und gemäß den Richtlinien der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) und der Association for Research in Vision and Ophthalmology's (ARVO). Alle Mäuse wurden in Gruppen untergebracht und in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus gehalten und erhielten Futter und Wasser ad libitum. In diesem Protokoll wurden drei Monate alte 30,31,33 C57 Bl/6 Mäuse verwendet.

1. Anlagenbau

  1. Besorgen Sie sich eine handelsübliche Paintball-Pistole (siehe Materialtabelle), die über einen integrierten Luftdruckregler verfügt.
  2. Modifizieren Sie bei Bedarf den Zylinder (Abbildung 1A).
    1. Wenn der Originallauf mit Öffnungen oder Perforationen entlang seiner Länge gefenstert ist, kann die Druckluft entweichen und in die Luft abgegeben werden, wodurch der maximale Ausgangsdruck reduziert wird. Ersetzen Sie es durch den Kauf eines soliden, nicht gefensterten Zylinders, um den Ausgangsdruckbereich zu erhöhen (Abbildung 1, I).
    2. Wenn der Originallauf lang und unhandlich ist, kürzen Sie ihn, indem Sie einen kürzeren Lauf mit benutzerdefinierter Länge kaufen oder einen Rohrschneider oder eine Säge verwenden.
    3. Wenn der Originalzylinder nicht den gewünschten Ausgangsdruck erzeugt, ändern Sie den Innendurchmesser (Bohrungsgröße) des Zylinders, indem Sie einen Zylinder mit einem benutzerdefinierten Bohrungsdurchmesser kaufen. Wenn Sie den Durchmesser der ursprünglichen Bohrung verringern, wird der Bereich des Ausgangsdrucks vergrößert und umgekehrt.
  3. Ändern Sie bei Bedarf den Regler (Abbildung 1B).
    1. Entfernen Sie die Führungskappe, um direkten Zugang zur Einstellschraube zu erhalten (Abbildung 1, II), wenn der Originalregler mit einer Führungskappe geliefert wird.
    2. Tauschen Sie die Innensechskantschraube gegen eine Innensechskantschraube mit Schlitz aus, wenn die Original-Einstellschraube mit einer Innensechskantschraube geliefert wird.
  4. Entfernen Sie den Standard-Schwerkraftlader (d. h. das Reservoir zum Halten und Zuführen von Paintballs in die Pistole) und verschließen Sie das vertikale Zuführrohr (Abbildung 1, III), um Druckleckagen zu vermeiden.
    1. Stellen Sie sicher, dass die Paintball-Pistole entladen und die Luftquelle (CO2 oder Druckluftbehälter) getrennt ist, bevor Sie den Schwerkraftlader entfernen.
    2. Positionieren Sie den Einzugshals (Abbildung 1C), an dem der Schwerkraftlader befestigt ist. Lösen Sie die Vorschubhalsklemme mit dem entsprechenden Werkzeug.
    3. Entfernen Sie den Standard-Schwerkraftlader, indem Sie ihn nach oben ziehen.
    4. Setzen Sie eine Abdeckung oder einen Stopfen ein, um die Öffnung abzudichten. Diese sind in der Regel in Paintball-Läden oder online erhältlich und so konzipiert, dass sie eng in den Zuführhals passen und ihn abdichten.
  5. Bauen Sie eine Plattform (Abbildung 1D) für die Paintball-Pistole und einen x-y-Tierpositionierungstisch zusammen.
    1. Konstruieren Sie die Plattformbasis, indem Sie zwei Stücke mitteldichte Faserplatten zuschneiden.
      HINWEIS: Je nach Materialverfügbarkeit und -präferenz können auch alternative Materialien (z. B. Sperrholz) verwendet werden.
    2. Schneide ein kleineres, quadratisches Stück auf die Maße 1,5 x 1,5 Fuß zu.
    3. Schneiden Sie ein größeres rechteckiges Stück auf die Maße 2,5 x 1,5 Fuß zu.
    4. Heben Sie die kleinere Plattform mit zwei parallelen 2 x 4 s 3,5 Zoll über die größere Plattform an und sichern Sie sie.
  6. Befestigen Sie die modifizierte Paintball-Pistole auf der Plattform.
    1. Lege die Paintball-Pistole auf die Seite auf die kleinere Plattform, so dass das Ende des Laufs einen halben Zentimeter über den Rand hinausragt.
    2. Befestigen Sie die Paintball-Pistole mit Befestigungswinkeln oder Klemmen, die auf den Lauf und den Schaft der Paintball-Pistole passen.
    3. Befestigen Sie einen Druckluftbehälter (Abbildung 1E; siehe Materialtabelle) an den Regler der Paintball-Pistole. Alternativ können Sie eine direkte Druckleitung von einem komprimierten Stickstofftank anschließen, um den Bereich der zuverlässigen Ausgangsdruckniveaus zu erhöhen.
    4. Wenn Sie einen Druckluftbehälter verwenden, befestigen Sie ihn mit einem strapazierfähigen Stoffband an der Faserplatte. Befestigen Sie das Armband mit Schrauben oder Bolzen und verfügen Sie über einen Einstellmechanismus zum einfachen Festziehen und Lösen.
  7. Befestigen Sie einen x-y-Positioniertisch mit Schrauben oder Bolzen an dem größeren Stück rechteckiger Faserplatte gegenüber dem Lauf der Paintball-Pistole (Abbildung 1F).
    HINWEIS: Ein x-y-Positioniertisch (siehe Materialtabelle), auch bekannt als x-y-Tisch, kann von verschiedenen Anbietern erworben werden, darunter Online-Händler, industrielle Zulieferer und Lieferanten von wissenschaftlichen Geräten. Berücksichtigen Sie beim Kauf eines x-y-Positioniertisches den Verfahrbereich, die Tragfähigkeit, die Präzision und die Wahl zwischen manueller oder motorischer Steuerung. Dieser x-y-Positionierungstisch ermöglicht eine präzise Bewegung und Positionierung des Tieres entlang von zwei Achsen: der x-Achse (horizontal zum Fass hin oder vom Fass weg) und der y-Achse (vertikal nach oben oder unten vom Fass weg).
  8. Modifizieren Sie den x-y-Positioniertisch, indem Sie drei PVC-Klemmen installieren.
    1. Befestigen Sie zwei 1 cm dicke PVC-Klemmen auf beiden Seiten der Vorderseite des Zylinders mit Schrauben oder Bolzen. Stellen Sie sicher, dass die Klemmen breit genug sind, um den Tierhalter aus den Schritten 1.9 und 1.10 aufzunehmen (z. B. 1,5 Zoll).
    2. Befestigen Sie eine dickere (4 cm) PVC-Klemme senkrecht und gegenüber den beiden 1 cm dicken Klemmen mit Schrauben oder Bolzen. Stellen Sie sicher, dass die Klemme breit genug ist, um den Druckmessumformer aus Schritt 2.4 aufzunehmen (z. B. 1,5 Zoll).
    3. Bohren Sie zwei Löcher an der Oberseite der dritten Klemme und setzen Sie zwei Kunststoffschrauben zur zusätzlichen Stabilisierung des Druckmessumformers während der Systemkalibrierung in Schritt 2 ein.
  9. Passen Sie das Innere des Tierhalters an (Abbildung 2A).
    1. Kaufen und schneiden Sie ein Stück PVC-Rohr (35 mm Außendurchmesser, 26 mm Innendurchmesser, 6,75 Zoll lang) für die innere Auffangkammer für die Maus.
    2. Erstellen Sie ein rechteckiges Loch (3 x 5 cm) 1 Zoll vom Ende des Rohrs entfernt, um den Kopf und die oberen hinteren Schultern der Maus freizulegen, während der Rest des Körpers abgeschirmt bleibt.
      HINWEIS: Wenn sich die ZNS-Verletzungsstelle tiefer auf dem Rücken der Maus befindet (z. B. an der Brust- oder Lendenwirbelsäule), vergrößern Sie das rechteckige Loch.
  10. Passen Sie die Außenseite des Tierhalters an (Abbildung 2B).
    1. Kaufen und schneiden Sie ein Stück PVC-Rohr (44 mm Außendurchmesser, 35 mm Innendurchmesser, 6 Zoll lang) für die äußere Auffangkammer für die Maus ab.
    2. Konstruieren Sie eine Belichtungsöffnung (Abbildung 2C) in der äußeren Sicherheitskammer für eine präzise Kontrolle der ZNS-Verletzungsstelle.
    3. Erstellen Sie auf der gegenüberliegenden Seite eine reziproke Apertur, um den Zylinder des Druckmessumformers während der Systemkalibrierung in Schritt 2 einzusetzen (z. B. ein 9-mm-Loch).
  11. Modifizieren Sie die Außenseite des Tierhalters, um die Gasanästhesieabgabe aufzunehmen. Wenn stattdessen ein injizierbares Anästhetikum verwendet wird, überspringen Sie diesen Schritt.
    1. Verschließen Sie ein Ende der Außenseite des Tierhalters mit Klebeband. Stellen Sie sicher, dass es eng anliegt, um ein Austreten von Gas zu verhindern.
    2. Machen Sie ein kleines Loch in die Dichtung, um den Anästhesieschlauch einzuführen.
    3. Positionieren Sie die Anästhesieleitung so, dass Isofluran ohne direkten Kontakt mit dem Tier in die Umgebung des Schlauchs eingeführt wird.

2. Systemkalibrierung

  1. Schließen Sie einen Druckmessumformer (Abbildung 2D; siehe Materialtabelle für Optionen) an ein Datenerfassungssystem (DAQ) und einen Computer an, um physikalische Druckmesswerte in digitale Daten umzuwandeln.
    1. Schließen Sie den Druckmessumformer an das Messmodul an (siehe Materialtabelle) an, um die richtige Polarität und sichere Verbindungen zu gewährleisten.
    2. Setzen Sie das Datenerfassungsmodul in ein Datenerfassungsgehäuse ein (siehe Materialtabelle), damit es Strom empfangen und mit dem Computer kommunizieren kann.
    3. Verwenden Sie ein USB-Kabel, um das Datenerfassungsgehäuse mit dem Computer zu verbinden.
    4. Stellen Sie sicher, dass auf dem Computer die erforderliche Software und Treiber für die Verbindung mit der Datenerfassungshardware und die Datenerfassung installiert sind (Optionen finden Sie in der Materialtabelle ).
  2. Konfigurieren Sie die Einstellungen des Datenerfassungssystems.
    1. Öffnen Sie die installierte Datenerfassungssoftware.
    2. Stellen Sie sicher, dass das Datenerfassungssystem vom Computer erkannt wird.
    3. Konsultieren Sie die Spezifikations- und Kalibrierungsdatenblätter für Ihr spezifisches Datenerfassungsmodul/Chassis und Druckmessumformer und konfigurieren Sie die Einstellungen des Datenerfassungssystems:
      HINWEIS: Die Datenerfassungseinstellungen für die in diesem Manuskript verwendete Datenerfassungshardware sind auf GitHub öffentlich verfügbar. Interessierte Leserinnen und Leser können das Repositorium unter https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON aufrufen.
      1. Analoger Eingang: Wählen Sie den physikalischen Eingangskanal am Datenerfassungsmodul, an den der Druckmessumformer angeschlossen ist.
      2. Erregerquelle (Vex-Quelle): Geben Sie die Erregerquelle des Datenerfassungsmoduls an (z. B. intern oder extern).
      3. Erregerspannung (Vex-Wert): Stellen Sie den Vex-Wert auf den vom Hersteller des Druckmessumformers angegebenen Wert ein (z. B. 5 oder 10 V).
      4. Bridge-Typ: Wählen Sie den geeigneten Bridge-Typ Ihres Datenerfassungsmoduls aus (z. B. Full Bridge, Half Bridge oder Quarter Bridge).
      5. Brückenwiderstand: Stellen Sie den Brückenwiderstand auf den vom Hersteller des Druckmessumformers angegebenen Wert ein (z. B. 350 ).
      6. Kalibrierfaktor/Benutzerdefinierte Skalierung: Konfigurieren Sie die Skalierung basierend auf dem Kalibrierungsdatenblatt, das vom Hersteller des Druckmessumformers bereitgestellt wird. Der Hersteller kalibriert den Druckmessumformer, indem er eine bekannte physikalische Einheit (psi) anlegt und die resultierenden elektrischen Einheiten (mV/V) misst. Erstellen Sie eine Kalibrierkurve, indem Sie die bekannten physikalischen Einheiten gegen die erhaltenen elektrischen Einheiten darstellen.
      7. Abtastrate (Hz): Stellen Sie die Abtastrate hoch genug ein, um die Dynamik der Druckänderungen ohne Aliasing zu erfassen (z. B. 1 oder 10 kHz, abhängig von der Geschwindigkeit der Druckänderungen in Ihrem Experiment).
        HINWEIS: Je schmaler Ihre Überdruck-Luftwellenform ist (d. h. je schneller sie den Druck ändert), desto breiter ist der Frequenzbereich, den sie anregt, und desto höher muss die Abtastrate sein. Dies ist besonders wichtig in Experimenten mit ZNS-Verletzungsmodellen, bei denen Druckänderungen schnell auftreten können.
  3. Erstellen Sie in der Datenerfassungssoftware ein digitales Werkzeug für die Datenerfassung.
    HINWEIS: Dieses digitale Tool wird verwendet, um die Ausgangsdrücke des Systems genau zu messen, aufzuzeichnen, anzuzeigen und zu analysieren. Das digitale Werkzeug, das in diesem Manuskript verwendet wird, ist auf GitHub öffentlich zugänglich. Interessierte Leserinnen und Leser können das Repositorium unter https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON.x
    1. Implementieren Sie Signalverarbeitungsalgorithmen, um die Rohdaten vom Wandler zu filtern, zu verstärken oder anderweitig zu verarbeiten.
    2. Fügen Sie Analysewerkzeuge hinzu, um Metriken wie Spitzendruck, Durchschnittsdruck und Dauer von Druckereignissen zu berechnen.
    3. Integrieren Sie visuelle Elemente (z. B. Diagramme), um Druckdaten in Echtzeit anzuzeigen, und Steuerelementelemente zum Starten, Stoppen und Zurücksetzen der Datenerfassung.
    4. Speichern Sie das digitale Tool.
  4. Messen Sie den Ausgangsdruck des Systems
    1. Führen Sie den Druckmessumformer in die dicke Klemme am x-y-Tisch und dessen Zylinder durch das Loch des Tierhalters ein (erstellt in Schritt 1.10.3).
    2. Stellen Sie den Lauf des Druckmessumformers so ein, dass sich die Spitze genau an der Stelle der ZNS-Verletzungsstelle befindet.
    3. Befestigen Sie den Druckmessumformer mit zwei Kunststoffschrauben (eingebaut in Schritt 1.8.3).
  5. Führen Sie das digitale Tool in der Datenerfassungssoftware aus, während Sie den Abzug der Paintball-Pistole loslassen, um den Ausgangsdruck des Systems zu erfassen, zu analysieren und zu visualisieren.
  6. Stellen Sie die Einstellschraube ein, bis der Ausgangsdruck des Systems den gewünschten Wert erreicht.
    HINWEIS: Nach dem Modifizieren des Laufs der Paintball-Pistole in einen unfenestratierten Lauf mit einer Länge von 1,5 Zoll und einem Durchmesser von 6,5 mm ist das System in der Lage, zuverlässig Überdruckluftniveaus im Bereich von 15-50 psi bei 5 mm von der Vorderseite des Laufs34 zu liefern. Überdruckluftwerte unter 15 psi und über 50 psi weisen eine große Variabilität in der Intensität auf. Für eine umfassende Darstellung des Ausgangsdrucks (psi) des Systems in Abhängigkeit vom Eingangsdruck (psi), dem Abstand zum Zylinder (cm) und der Zeit (ms) siehe Abbildung 2 von Hines-Beard et al.34. Verwenden Sie komprimierten Stickstoff anstelle von Druckluft, um mit diesem System zuverlässig Überdruckluftwerte von über 50 psi zu erzielen.

3. Vorbereitung der Tiere und Lufteinwirkung mit Überdruck

  1. Betäuben Sie die Maus mit Isofluran in einer Induktionskammer mit 1,5-3%30,31,32,33 Isofluran in Sauerstoff, bis sie vollständig sediert ist.
    1. Bestätigen Sie die Anästhesie, indem Sie beurteilen, ob keine Reaktion auf ein Zehenklemmen vorliegt.
    2. Befestigen Sie die Maus in der inneren Tierhalterung, wobei der Kopf und die oberen hinteren Schultern durch die rechteckige Öffnung freiliegen, während der Rücken und die unteren Hintergliedmaßen geschützt bleiben.
    3. Stützen Sie den Kopf der Maus mit einem Kissen ab, das am intakten unteren Segment des inneren Tierhalters befestigt ist.
    4. Sichern Sie die Maus, indem Sie chirurgisches Klebeband über die oberen hinteren Schultern legen.
    5. Setzen Sie den inneren Tierhalter in den äußeren Tierhalter ein.
    6. Öffnen Sie die sekundäre Anästhesieleitung zur Isofluranabgabe im Tierhalter.
    7. Platzieren Sie ein zusätzliches Kissen am Ende des Tierhalters, um zu verhindern, dass das Narkosemittel aus dem Schlauch austritt und sich die Maus während der Einwirkung von Überdruckluft bewegt.
  2. Überdruck-Luftzufuhr
    1. Richten Sie die kreisförmige 4-mm-Öffnung des äußeren Tierhalters direkt über dem linken Auge der Maus aus.
    2. Positionieren Sie den Tierhalter mit den Bedienknöpfen auf dem x-y-Tisch so, dass seine Öffnung mit dem Lauf der Paintball-Pistole ausgerichtet ist und die Außenfläche 5 mm vom Ende des Laufs entfernt ist.
      HINWEIS: Passen Sie den Abstand des Tieres zum Ende des Fasses an, um den Überdruckluftstand (psi) und die Form zu ändern. Bewegen Sie das Tier weiter vom Fass weg, um den Überdruckluftstand zu senken und eine diffusere Überdruckluftwelle zu erzeugen.
    3. Initiieren Sie die Überdruckluftsequenz, um ITON zu induzieren:
      1. Geben Sie zwei Stöße mit 15 psi Überdruckluft im Intervall von 0,5 s ab, die 3 Tage lang täglich wiederholtwerden 29,30,31,32.
        HINWEIS: Eine ähnliche ITON kann durch die Abgabe von drei aufeinanderfolgenden Stößen von 15 psi Überdruckluft induziert werden, die durch 0,5 s-Intervalle23 getrennt sind. Der Grad der ITON, der sich nach der Abgabe von sechs aufeinanderfolgenden Stößen von 15 psi Überdruckluft im Abstand von 0,5 s ergibt, ist hier in den repräsentativen Ergebnissen dargestellt.
      2. Setzen Sie Scheinmäuse dem Lärm der Überdruckluft aus, nicht aber der Überdruckluft selbst, indem Sie den Tierhalter so drehen, dass die Öffnung nicht mehr zum Fass zeigt, und die Luft mit einem Pappschild blockieren.
  3. Wiederherstellung der Maus
    1. Lassen Sie die Mäuse sich von der Narkose erholen.
      1. Verabreichen Sie Gleitaugentropfen (siehe Materialtabelle), um ein Austrocknen der Augen durch die Narkose zu verhindern.
      2. Sorgen Sie für Wärme mit einer geregelten Heizunterstützung (siehe Materialtabelle).
    2. Überwachen Sie die Mäuse visuell, bis sie eine aufrechte Haltung einnehmen und normal gehen. Erlauben Sie ihnen, in Gesellschaft ihrer Käfiggenossen zu sein.
    3. Versorgen Sie alle Mäuse, die Überdruckluft ausgesetzt sind, in den ersten 3 Tagen nach der Verletzung mit Gel-Regenerationsfutter (siehe Materialtabelle), um Gewichtsverlust zu vermeiden.

4. Gewebeentnahme und -verarbeitung

  1. Die Mäuse werden durch intraperitoneale Injektion von Avertin Working Solution eingeschläfert.
    1. Zur Herstellung von Avertin Stock wird 10 g 2,2,2,-Tribromethanol (siehe Materialtabelle) mit 10 ml 1-Pentanol (siehe Materialtabelle) gemischt. Im Dunkeln bei 4 °C lagern.
    2. Stellen Sie eine Avetin-Arbeitslösung her, indem Sie 1,25 ml Avertin-Brühe, 45 ml doppelt destilliertes Wasser und 5 ml 10x PBS (siehe Materialtabelle) in einem 50-ml-Röhrchen kombinieren. Die Mischung mit einem Filter sterilisieren und im Dunkeln bei 4 °C lagern.
  2. Die Mäuse wurden transkardial mit 4% Paraformaldehyd (siehe Materialtabelle) in 1x PBS perfundiert (siehe Materialtabelle).
  3. Entkernen Sie das Auge, das dem Überdruck ausgesetzt ist, mit einer feinen Pinzette (siehe Materialtabelle) und einer Schere (siehe Materialtabelle), wobei Sie darauf achten, dass der Sehnerv (ON) erhalten bleibt.
  4. Entnehmen Sie das ON zusammen mit dem enukleierten Augengewebe für die weitere Analyse.
  5. Osmikat AUF Gewebe.
    1. Postfix ON Gewebe über Nacht in 4% Paraformaldehyd und 2% Glutaraldehyd (siehe Materialtabelle) in 1x PBS. Wenn Sie mit Gewebe arbeiten, das nicht durchblutet wurde (wie in Schritt 4.2), postfixieren Sie es für 5 Tage statt über Nacht.
    2. ON Gewebe mit 1x PBS mit einem Pinsel (siehe Materialtabelle) oder einem scharfen Holzstäbchen auf eine 12- oder 24-Well-Platte (siehe Materialtabelle) übertragen.
    3. Ersetzen Sie in einem Abzug 1xPBS durch 2% Osmiumtetroxid (siehe Materialtabelle) in 0,2 M Cacodylatpuffer (Rezept ist auf GitHub öffentlich verfügbar. Interessierte Leserinnen und Leser können unter https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON) mit einer Transferpipette auf das Repositorium zugreifen. 2 Stunden auf Eis inkubieren.
    4. Führen Sie drei Wäschen mit 1x PBS durch
      1. Osmiumabfälle angemessen entsorgen.
      2. Lassen Sie die Platte nach der dritten PBS-Wäsche zwei Nächte lang im Abzug.
  6. Dehydrieren Sie ON-Gewebe in einer abgestuften Ethanolserie.
    1. Übertragen Sie die Nerven auf eine neue Platte mit 50% Ethanol und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang.
    2. 30 min lang durch 70%iges Ethanol ersetzen.
    3. 30 min lang durch 95%iges Ethanol ersetzen.
    4. 30 min lang durch 100% Ethanol ersetzen.
  7. Einbetten von On-Gewebe in epon.
    HINWEIS: Das Epon-Rezept ist auf GitHub öffentlich verfügbar. Interessierte Leserinnen und Leser können das Repositorium unter https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON; siehe Materialtabelle für die im Rezept aufgeführten Materialien.
    1. Tag 1: Übertragen Sie das Gewebe in ein 2-ml-Fläschchen mit Propylenoxid (siehe Materialtabelle)/100 % Ethanol (1:1) und schütteln Sie es 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Ersetzen Sie es durch reines Propylenoxid und schütteln Sie es 15 Minuten lang, wobei es einmal wiederholt wird. Durch Propylenoxid/Epon (1:1) ersetzen und über Nacht im Kühlraum schütteln.
    2. Tag 2: Übertragen Sie das Gewebe auf eine 12- oder 24-Well-Platte mit 100 % Epon und schütteln Sie es 4 Stunden lang bei Raumtemperatur. Durch frisches 100%iges Epon ersetzen und über Nacht bei Raumtemperatur im Vakuum inkubieren.
    3. Tag 3: Wiederholen Sie die Epon-Inkubation wie an Tag 2.
    4. Tag 4: Übertragen Sie das Gewebe in eine flache Form mit 100% Epon, richten Sie das Gewebe neu aus und stellen Sie es für 48 Stunden in einen 60 °C Ofen.
  8. Schnitt ON Gewebe.
    1. Der Trimm formt sich unter einem Präparierfernrohr zu einer Doppelpyramide, wobei sich der Nerv in der Mitte befindet.
    2. Erfassen Sie 700 nm dicke Querschnitte mit einem Ultramikrotom und einem Diamantmesser (siehe Materialtabelle).
    3. Sammeln Sie Schnitte auf geladenen Weißglas-Objektträgern mit destilliertem Wasser.
    4. Die Objektträger im 60 °C heißen Ofen trocknen, bis das Wasser verdampft ist. Bei Raumtemperatur abkühlen lassen.
  9. Fleck auf dem Gewebe.
    1. Tauchen Sie die Objektträger 28 min lang in 1% Paraphenylendiamin (PPD) (siehe Materialtabelle) in ein 1:1-Gemisch aus Methanol und 2-Propanol.
    2. Spülen Sie die Objektträger in zwei aufeinanderfolgenden Mischungen von 1:1 Methanol (siehe Materialtabelle) und 2-Propanol (siehe Materialtabelle) für jeweils 1 min.
    3. Die Objektträger 1 min lang in 100% Ethanol spülen und an der Luft trocknen lassen.
    4. Legen Sie die Objektträger in eine feuchte Box und decken Sie die Abschnitte mit einer Transferpipette mit 1 % Toluidinblau ab (siehe Materialtabelle).
    5. Im 60 °C Ofen 20 min inkubieren.
    6. Spülen Sie die Objektträger mit doppelt destilliertem Wasser ab und lassen Sie sie an der Luft trocknen.
  10. Montieren und abbilden AUF Gewebe.
    1. Deckglas mit Eindeckmaterial unter Verwendung von Eindeckmedien (siehe Methodentabelle), wobei überschüssiges Medium entfernt wird.
    2. Lassen Sie die Objektträger über Nacht trocknen.
    3. Bildquerschnitte mittels Hellfeldmikroskopie mit einem 100-fachen Ölimmersionsobjektiv.
  11. Einbetten, Schneiden und immunhistochemisches Färben von Netzhautgewebe.
    1. Ganzes Augengewebe in 4% Paraformaldehyd für 2-4 h postfixieren.
    2. Kryoproduzieren Sie das gesamte Augengewebe mit 30% Saccharose (siehe Materialtabelle in 1x PBS über Nacht bei 4 °C.
    3. Einbetten Sie das Augengewebe in ein Gefriermedium (siehe Materialtabelle).
    4. Sammeln Sie 10 μm dicke Netzhautquerschnitte auf einem Kryostaten und montieren Sie die Schnitte auf geladene Weißglas-Objektträger (siehe Materialtabelle).
    5. Objektträger in 1x PBS waschen und in einem Blockierungspuffer (5% Triton X-100 und 2% Rinderserumalbumin (BSA) (siehe Materialtabelle) in 1x PBS) mit 5% normalem Eselserum (NDS) (siehe Materialtabelle) bei Raumtemperatur für 30 min inkubieren.
    6. Inkubieren Sie die Objektträger über Nacht bei 4 °C (oder 4 h bei Raumtemperatur) in Primärantikörper (siehe Materialtabelle) in 0,5 % Triton X-100 (siehe Materialtabelle) in 1xPBS (PBT).
    7. Objektträger in PBT waschen und in Sekundärantikörpern (siehe Materialtabelle) in Blockpuffer mit 5 % NDS inkubieren.
    8. Objektträger in PBT waschen, Eindeckmedium mit DAPI auftragen (siehe Materialtabelle), Deckglas abdecken und mit Nagellack versiegeln.
    9. Bilddias auf einem Epifluoreszenzmikroskop.
    10. Wenn Sie die Fluoreszenzintensität quantifizieren, stellen Sie sicher, dass Bilder aus derselben Netzhautregion mit identischen Vergrößerungs-, Verstärkungs- und Belichtungseinstellungen aufgenommen wurden.
  12. Verlassen Sie sich auf Axone.
    1. Zählen Sie die Anzahl der Axone manuell mit Hilfe einer Bildanalysesoftware (siehe Materialtabelle), indem Sie 20 % der gesamten Nervenquerschnittsfläche mit einer festen Gitterüberlagerung abtasten, um die Axondichte (Axone/mm 2) zu schätzen.
    2. Messen Sie die Fläche des ON-Querschnitts.
      1. Verwenden Sie die Funktion "Maßstab einstellen ", um Pixel/Mikrometer für das Objektiv festzulegen, das für das Bild verwendet wird.
      2. Verwenden Sie das Polygonauswahlwerkzeug , um entlang der Myelinscheide des Sehnervs zu zeichnen, mit Ausnahme des Gefäßsystems.
      3. Messen Sie die Fläche des ON mit der Funktion Messen .
      4. Ermitteln Sie 20 % der Gesamtfläche, indem Sie die gemessene Fläche mit 0,2 multiplizieren.
    3. Überlagern Sie das feste Raster mit dem ON-Querschnitt.
      1. Laden Sie das Plug-In "Counting Array" herunter.
        HINWEIS: Dieses Plug-in ist auf GitHub öffentlich verfügbar. Interessierte Leserinnen und Leser können das Repositorium unter https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON aufrufen.
      2. Öffnen Sie das Plug-In "Zählmatrix", um ein festes Raster über den Querschnitt zu legen, das aus 9 gleichmäßig verteilten quadratischen Elementen besteht, die ein Pluszeichen bilden.
      3. Bearbeiten Sie die Fläche für jede der 9 Regionen, indem Sie 20 % der Gesamtfläche des ON-Querschnitts (berechnet in Schritt 4.6.2.4) durch 9 dividieren.
      4. Zentrieren Sie das feste Raster so, dass die Mitte des Pluszeichens in der Mitte des ON-Querschnitts zentriert ist.
    4. Zählen Sie lebende und degenerierende Axone getrennt.
      1. Laden Sie das Plug-In "Zellzähler" herunter und öffnen Sie es.
        HINWEIS: Dieses Plug-in ist auf GitHub öffentlich verfügbar. Interessierte Leserinnen und Leser können das Repositorium unter https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON aufrufen.
      2. Zählen Sie für jede der 9 Regionen die Anzahl der lebenden und degenerierenden Axonprofile separat, indem Sie den Zustand der Myelinscheide visualisieren. Stellen Sie sicher, dass die Axonquantifizierung durchgeführt wird, während Sie für die Versuchsgruppe des Tieres verblindet sind, um Verzerrungen zu vermeiden.
      3. Suchen Sie bei lebenden Axonen nach solchen, bei denen die Myelinscheide intakt, gleichmäßig gefärbt und glatt und gleichmäßig um das Axon herum umgeben erscheint.
      4. Suchen Sie bei degenerierenden Axonen nach solchen mit einer Verdickung, Zwiebelbildung oder einem Kollaps der Myelinscheide.
      5. Wenn das Axon durch das überlagerte Gitter teilweise abgeschnitten ist, wird es nur dann in die Axonzählung einbezogen, wenn das Lumen zu sehen ist.
      6. Stellen Sie sicher, dass längliche Axone nicht versehentlich mehr als einmal gezählt werden, und verwechseln Sie Schmutz oder Staub nicht mit einem degenerierenden Axonprofil.
    5. Führen Sie statistische Analysen durch, um signifikante Unterschiede in der durchschnittlichen Axonzahl zwischen den Gruppen zu testen. Stellen Sie sicher, dass mindestens vier ONs in jeder Gruppe enthalten sind, um die normale Variabilität zu berücksichtigen, die in früheren Analysen beobachtet wurde.
      1. Führen Sie einen t-Test für unabhängige Stichproben (auch als Student-t-Test für unabhängige Stichproben bezeichnet) durch, um signifikante Unterschiede zwischen den Mittelwerten zweier unabhängiger Gruppen zu ermitteln.
      2. Führen Sie die nicht-parametrische Alternative, den Mann-Whitney-U-Test, durch, wenn die Bedingungen für einen t-Test für unabhängige Stichproben nicht erfüllt werden können (d. h. wenn die Daten nicht normalverteilt sind oder die Stichprobengrößen zu klein sind).

Ergebnisse

Unter Verwendung des hier beschriebenen Überdruck-Luft-produzierenden Systems wurde eine indirekte traumatische Optikusneuropathie (ITON) hervorgerufen, indem das linke Auge von erwachsenen (3 Monate alten) männlichen C57Bl/6-Mäusen (n = 4) sechs aufeinanderfolgenden Ausbrüchen von 15 psi Überdruckluft im Abstand von 0,5 s ausgesetzt wurde. Scheintiere (n = 8; Daten von Vest et al.33) wurden betäubt, in den Tierhalter gelegt und dem Schall, aber nicht der Überdruckluft ausgesetzt.

Die proximalen Sehnerven von Scheintieren (Abbildung 3A) schienen gesund zu sein, mit dicht gepackten und gleichmäßig großen Axonen, die von Gliazellen mit normaler Morphologie und Verteilung umgeben waren. Im Vergleich dazu schienen die proximalen Sehnerven von Mäusen, die ITON ausgesetzt waren (d. h. 6 aufeinanderfolgende Ausbrüche von 15 psi Überdruckluft im Abstand von 0,5 s) (Abbildung 3B) degeneriert zu sein mit Anzeichen von Axonverlust, wie z. B. vergrößerter Abstand zwischen den verbleibenden Axonen, Anzeichen von Axondegeneration, einschließlich Schwellungen, Unregelmäßigkeiten in der Axonform und Abbau der Myelinscheide der Axone. und Anzeichen von Gliose, einschließlich Hypertrophie und Hyperplasie von Gliazellen. Mann-Whitney U-Tests bestätigten einen signifikanten Unterschied in der Gesamtzahl der Axone (p = 0,0040) (Abbildung 3C) und der degenerativen Profile (p = 0,0028) (Abbildung 3D) zwischen ITON und Scheinmäusen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ITON die Gesamtzahl der Axone signifikant verringert und die degenerativen Profile signifikant erhöht. Mann-Whitney U-Tests wurden durchgeführt, da die Daten für die ITON-Gruppe nicht groß genug für einen t-Test mit unabhängigen Stichproben waren.

Die immunhistochemische Färbung von Netzhautquerschnitten mit anti-Iba1 (siehe Materialtabelle), einem Marker für Mikroglia (die primären Immunzellen des Zentralnervensystems), wurde sowohl an Scheinmäusen (Abbildung 4A) als auch an ITON-Mäusen (Abbildung 4B) durchgeführt. Die Färbung zeigte, dass sich die Mikroglia bei allen Mäusen im Ruhezustand befanden, der durch kleine Zellkörper mit langen, dünnen und stark verzweigten Fortsätzen gekennzeichnet ist. Bemerkenswert ist, dass bei ITON-Mäusen eine erhöhte Anzahl von Mikroglia festgestellt wurde (Abbildung 4B), was auf eine Mikrogliaproliferation als Reaktion auf eine Verletzung hindeutet. Darüber hinaus wurde bei ITON-Mäusen beobachtet, dass sich Mikroglia abnormal in die äußere Kernschicht (ONL) ausdehnen, in der sich die Photorezeptorzellkörper befinden (Abbildung 4B). Dies steht im Gegensatz zu den Scheintieren (Abbildung 4A), bei denen Mikroglia in der Ganglienzellschicht (GCL), der inneren Plexiformschicht (IPL), der inneren Kernschicht (INL) und der äußeren plexiformen Schicht (OPL) lokalisiert waren - den Schichten, in denen sich Mikroglia typischerweise in einer gesunden, unverletzten Netzhaut befinden.

Nachfolgende immunhistochemische Färbungen mit Anti-PKC-α (siehe Materialtabelle) und Anti-Synaptophysin (siehe Materialtabelle), Markern für Stäbchen-Bipolarzellen bzw. Photorezeptorband-Synapsen zeigten intakte synaptische Verbindungen sowohl bei Schein- (Abbildung 5A) als auch bei ITON-Mäusen (Abbildung 5B). Insbesondere wurde beobachtet, dass sich die Dendriten von bipolaren Stäbchenzellen mit den synaptischen Enden der Stäbchen-Photorezeptoren ausdehnen und überlappen. Dieser Befund steht im Gegensatz zu einer frühen Studie35, die vier Wochen nach ITON einen Rückzug von Stäbchen-Dendriten in Richtung ihrer Zellkörper zeigte, nachdem sie 3 Tage lang zwei aufeinanderfolgende 15-psi-Ausbrüche von Überdruckluft (0,5 s voneinander entfernt) einmal täglich ausgesetzt waren. Diese Diskrepanz kann auf die unterschiedlichen Zeitpunkte der Gewebeentnahme zwischen den beiden Studien zurückgeführt werden. Die aktuellen Proben wurden 2 Wochen nach der ITON entnommen, verglichen mit 4 Wochen nach der ITON in der früheren Studie. Obwohl in der aktuellen Analyse keine Synaptopathie festgestellt wurde, stellten wir die Ausweitung der Mikroglia-Prozesse in das ONL fest (Abbildung 4B), wo sich die Photorezeptorzellkörper befinden. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass die Störung der synaptischen Verbindungen zwischen bipolaren Zellen und Photorezeptoren als sekundäre Folge der Verletzung auftreten kann, während Axonverlust, Axondegeneration und Gliose primäre Auswirkungen der Schädigung darstellen.

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Abbildung 1: System für fokale, geschlossene Verletzungen des Zentralnervensystems. Gestrichelte Rechtecke im oberen Bild werden vergrößert und in den beiden Bildern unten als B, C und A angezeigt (wie durch weiße Pfeile gekennzeichnet). (A) Kundenspezifischer 1,5-Zoll-Lauf ohne Fenster (I) am Ende der Paintball-Pistole. (B) Druckregler mit entfernter Führungskappe, um die Einstellschraube (II) freizulegen. (C) Einzugshals, bei dem der Schwerkraft-Einzugslader entfernt und eine Abdeckung des Einzugshalses eingebaut ist (III). (D) Basisplattform, bestehend aus einem 1,5 Fuß x 1,5 Fuß großen Stück Faserplatte, das über einem größeren 2,5 Fuß x 1,5 Fuß großen Stück Faserplatte liegt. (E) Druckluftbehälter, der mit dem Druckregler der Paintball-Pistole verbunden und mit einem haltbaren Gurt an der Faserplattenplattform befestigt ist. (F)x-y Tier-Positionierungstisch. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Kundenspezifischer Tierhalter für die fokale Abgabe von Überdruckluft. (A) Die Innenseite des Tierhalters, bestehend aus einem schmalen PVC-Rohr mit einem rechteckigen Loch (3 x 5 cm), um den Kopf und die oberen Hinterschultern des Tieres freizulegen. (B) Außerhalb des Tierhalters, bestehend aus einem breiteren PVC-Rohr, in das das schmalere PVC-Rohr geschoben wird und das den gesamten Körper des Tieres abschirmt, abgesehen von dem freiliegenden Gewebe innerhalb der Expositionsöffnung. (C) Expositionsblende für die fokale Abgabe von Überdruckluft an die interessierende ZNS-Verletzungsstelle. (D) Druckmessumformer zur Kalibrierung des Ausgangsdrucks des Systems. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: ITON aufgrund der fokalen Abgabe von Überdruckluft. (A,B) Repräsentative Hellfeld-Mikroskopaufnahmen von Querschnitten des proximalen Sehnervs von (A) Schein und (B) ITON. (C) Quantifizierung der Gesamtaxonzahl. (D) Quantifizierung degenerativer Axonprofile. n = 4 für ITON. n = 9 für Schein. Die Axon-Zähldaten für die Scheingruppe stammen von Vest et al.33. **p < 0,005. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. Maßstabsleisten = 20 μm. Abkürzung: ITON = indirekte traumatische Optikusneuropathie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Abnorme Proliferation und Migration von Mikroglia in das ONL aufgrund von systeminduziertem ITON. (A,B) Repräsentative fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von Netzhautquerschnitten mit Anti-Iba1-Markierung von Mikroglia (rot) von (A) Schein- und (B) ITON-Tieren. Maßstabsleisten = 100 μm. Abkürzungen: ITON = indirekte traumatische Optikusneuropathie; GCL = Ganglienzellschicht, INL = innere Kernschicht, ONL = äußere Kernschicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Frühe Persistenz synaptischer Verbindungen zwischen Stäbchen-Bipolarzellen und Photorezeptoren aufgrund von systeminduziertem ITON, trotz des Potenzials für eine verzögerte Synaptopathie. (A,B) Repräsentative fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von Netzhautquerschnitten mit Anti-Synaptophysin-Markierung von Photorezeptorband-Synapsen (rot) und Anti-PKC-α-Markierung von Stäbchen-Bipolarzellen (grün) aus (A) Schein und (B) ITON-Tiere. Maßstabsleisten = 100 μm. Abkürzungen: ITON = indirekte traumatische Optikusneuropathie; PKC = Proteinkinase C. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Dieses kundenspezifische Überdruck-Luftsystem ist ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung von ZNS-Verletzungen im geschlossenen System in Mausmodellen. Die repräsentativen Ergebnisse des Beispielexperiments zeigen, dass die fokale Abgabe von Überdruckluft mit diesem System effektiv ITON induzieren kann, was zu einem signifikanten Axonverlust und einer Degeneration führt. Dies unterstreicht die Fähigkeit des Systems, präzise und reproduzierbare ZNS-Verletzungen zu erzeugen.

Eine der größten Stärken dieses Systems ist seine Anpassungsfähigkeit, um eine Reihe von ZNS-Verletzungen auszulösen. Die Schwere der Verletzung kann durch Modifikation des Gesamtausgangsdrucks des Systems, des Abstands des Tieres vom Ende des Fasses unter Verwendung des x-y-Positionierungstisches, der Größe und Form der Expositionsöffnung, der Anzahl der Expositionen mit Überdruckluft und des Intervalls zwischen den Expositionen angepasst werden. Zusätzlich kann die Lokalisation der ZNS-Verletzung angepasst werden, indem die Position der Belichtungsblende innerhalb des Tierhalters geändert wird. Diese Vielseitigkeit hat es dem System ermöglicht, ein Spektrum von ZNS-Verletzungen mit geschlossenem System in Mausmodellen zu erzeugen. Ursprünglich wurde das System zur Modellierung von Closed-Globe-Verletzungen verwendet, wobei der Schwerpunkt auf der Schädigung des vorderen und hinteren Pols und den damit verbundenen Defizitenlag 34,36, einschließlich der Auswirkungen der Reaktion des Immunsystems37, der stammspezifischen Ergebnisse38 und der Wirksamkeit neuroprotektiver Wirkstoffe39. Schließlich wurde diese Anwendung erweitert, um die Folgen wiederholter augengerichteter Expositionen zu bewerten, um die indirekte traumatische Optikusneuropathie (ITON)30 zu modellieren und die Wirkung der Anzahl und des Intervalls zwischen wiederholten Expositionenzu untersuchen 33. Seitdem hat sich die Anwendung des Systems auf die Modellierung von leichten Schädel-Hirn-Traumata (mTBI) mit geschlossenem Kopf durch kopfgerichtete Expositionen40,41 und geschlossener Rückenmarksverletzungen (SCI) durch dorsumgerichtete Expositionen42 ausgeweitet, was die Anpassungsfähigkeit und Vielseitigkeit des Geräts bei der Untersuchung verschiedener ZNS-Verletzungsbereiche unterstreicht.

Bei der Verwendung dieses Systems ist es wichtig, Maßnahmen zu ergreifen, um die Variabilität der Verletzungsergebnisse zu minimieren und die Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit der Versuchsergebnisse zu gewährleisten. Zu den wichtigsten Maßnahmen gehört die Kalibrierung des Ausgangsdrucks des Systems vor und nach jeder Serie von drei Expositionen, um eine gleichmäßige Druckabgabe zu gewährleisten. Obwohl die Variabilität gering ist, wenn das System zwischen 15 psi und 50 psi betrieben wird, wenn Druckluft34 verwendet wird, hilft eine konsistente Kalibrierung, unerwartete Fehler zu erkennen, wie z. B. schwache Batterie oder schwache Luft. Positionieren Sie außerdem jedes Tier im gleichen Abstand vom Ende des Fasses, um eine gleichmäßige Überdruckstärke zu gewährleisten, da die Intensität der Druckwelle mit zunehmender Entfernung abnimmt. Die gleichmäßige Positionierung stellt außerdem sicher, dass jedes Tier vom gleichen Teil des Äthers betroffen ist. Darüber hinaus wird durch die gleichmäßige Sicherung der Tiere im Halter sichergestellt, dass das Gewebe von Interesse konsistent anvisiert wird, insbesondere bei Modellen mit wiederholter Exposition, bei denen die Gefahr einer Bewegung besteht. Schließlich ist die Einheitlichkeit des Alters, des Geschlechts und des genetischen Hintergrunds der Tiere von entscheidender Bedeutung, da diese Faktoren die Reaktion auf Verletzungen beeinflussen. Zum Beispiel verglichen frühere Studien mit diesem System die Auswirkungen von augengerichteter Überdruckluft auf verschiedene Mausstämme und zeigten signifikante Unterschiede in der Verletzungsreaktion zwischen C57Bl/6J36, DBA/2J37 und Balb/c38 Mäusen. Die DBA/2J- und Balb/c-Mäuse zeigten schwerere Pathologien des vorderen Pols, größere Netzhautschäden, höheren oxidativen Stress und ausgeprägtere neuroinflammatorische Reaktionen im Vergleich zu den C57Bl/6J-Mäusen, wobei Balb/c-Mäuse besonders robuste und dauerhafte Verletzungsprofile zeigten38.

Fehlerbehebung bei Systemen
Wenn die Druckwerte für eine bestimmte Manometereinstellung ungewöhnlich niedrig sind, betätigen Sie den Auslöser 5-10x, damit Luft durch das System strömen kann und der Regler sich auf eine neue Einstellung einstellt. Es dürfen keine Lecks im Luftbehälter vorhanden sein. Der O-Ring am Lufttank darf nicht beschädigt oder abgenutzt sein, der Lufttank sollte genügend Luft enthalten und der Akku der Waffe sollte nicht entladen sein. Der x-y-Tisch sollte sich nicht von seiner üblichen Position vom Ende des Laufs weg verschoben haben, und die Überdruck-Lufteinwirkungsöffnung sollte mit dem Lauf der Waffe ausgerichtet sein und ihn nicht verschließen. Der Regler sollte fest am Griff der Pistole befestigt sein. Wenn die Druckwerte trotz Verwendung der höchsten Einstellung am Manometer zu niedrig sind, darf das Manometer nicht über 200 psi erhöht werden, und die Geschwindigkeitseinstellung an der Pistole sollte auf die maximale Einstellung eingestellt werden. Wenn die Druckeinstellungen inkonsistent sind (z. B. hoch dann niedrig), stellen Sie sicher, dass der Luftbehälter über genügend Luft verfügt, der Regler fest am Griff der Pistole befestigt ist, dass der Luftbehälter keine Undichtigkeiten aufweist und dass er fest verschraubt ist und dass der O-Ring am Luftbehälter nicht beschädigt oder abgenutzt ist.

Um die vollen Fähigkeiten dieses Systems umfassend zu verstehen, ist es wichtig, seine Grenzen zu erkennen. Die Nachahmung realer Szenarien in einer Laborumgebung ist nach wie vor eine Herausforderung. Obwohl dieses System Überdruckluft erzeugt, repliziert es nicht die komplexe Dynamik eines explosiven Ereignisses, wie z. B. die unterschiedlichen Druck- und Temperaturgradienten, das Vorhandensein von Trümmern und reflektierten Wellen sowie eine mehrphasige Natur. Darüber hinaus ahmt es keine Friedlander-Wellenform ("primäre Druckwelle") nach, die durch eine scharfe, nahezu augenblickliche Druckspitze gekennzeichnet ist, gefolgt von einem schnellen exponentiellen Zerfall, der unter den Umgebungsdruck fällt, bevor er zur Ausgangslinie43 zurückkehrt. Vielmehr stellt die von diesem System erzeugte Wellenform ein einfacheres, symmetrischeres Profil dar, in dem es einen allmählicheren Anstieg und Abfall des Drucks ohne ausgeprägte negative Phase gibt (siehe Abbildung 2C in Hines-Beard et al.34). Etwas vorteilhaft ist, dass diese Wellenform Elemente von Explosions- und stumpfen Verletzungen kombiniert. Der glockenförmige "Druckimpuls" sorgt für einen gleichmäßigen Überdruckaufprall, ähnlich einer "Wand aus Luft", die auf das Motiv trifft. Aber auch die von der Welle abgegebene Überdruckluft ist ein wichtiger charakteristischer Aspekt von Explosionsverletzungen. Einige mögen argumentieren, dass diese Wellenform zwar Aspekte beider Verletzungsarten umfasst, aber die Komplexität einer der beiden nicht vollständig erfasst. Dieser konsistente und reproduzierbare "Druckimpuls" ist jedoch ideal für kontrollierte Experimente in einer Laborumgebung, um fokale ZNS-Verletzungen im geschlossenen System zu untersuchen. Wir haben bereits gezeigt, dass die Verletzung fokal ist. Zum Beispiel führt die Exposition gegenüber einem Auge nicht zu einer Schädigung des primären Nasenepithels oder des Gehirns44. Wenn es auf die Seite des Mauskopfes gerichtet wird, ist auch ein kleiner Bereich des Gehirns betroffen45. Schließlich wirkte sich die Energie aus der Überdruckluft aus diesem System bei dem für ITON verwendeten Druckniveau nicht auf die Maus aus, es sei denn, sie wurde mit einem kurzen Zeitintervall33 wiederholt. Somit ist der Druck nicht schädlich und repliziert daher keine Strahlendkraft. Darüber hinaus gab es selbst bei wiederholter Überdrucklufteinwirkung auf das Auge keine Auswirkungen auf die vorderen Augenstrukturen33. Eine signifikante Degeneration des Sehnervs und ein Verlust des Sehvermögens traten nur bei wiederholter Exposition mit einem Intervall zwischen der Exposition von weniger als 1 minauf 33.

Im Vergleich zu anderen Laborgeräten zur Erzeugung von geschlossenen ZNS-Verletzungen bietet dieses System einzigartige Vorteile. Er ist in der Lage, aufeinanderfolgende Überdruckluftstöße in schneller Folge (0,5 s-Intervalle)33 abzugeben und damit die Bedingungen in Arbeitsumgebungen mit hohem Risiko nachzuahmen, in denen eine schnelle Explosionsexposition eine häufige Gefahr darstellt. Zum Beispiel verwenden Militärangehörige sowohl in Trainings- als auch in Kampfszenarien eine Vielzahl von automatischen Schusswaffen, die in der Lage sind, schnell wiederholt zu schießen, darunter automatische Gewehre (z. B. M16, AK-47), Maschinengewehre (z. B. M2 Kaliber .50), Gatling-Gewehre und Miniguns. Andere langsamere, aber sich wiederholende Waffen, die von Militärangehörigen verwendet werden, sind Artillerie, Mörser, Granaten und improvisierte Sprengsätze (IEDs). Abbrucharbeiter, die an kontrollierten Abbrucharbeiten beteiligt sind, und Bergleute, die an Sprengarbeiten zum Aufbrechen von Gestein und zur Gewinnung von Mineralien beteiligt sind, erleben ebenfalls aufeinanderfolgende Sprengungen in schneller Folge. Schließlich können Bauarbeiter, die pneumatische Werkzeuge, Rammen oder andere schwere Geräte verwenden, die starke Schlagkräfte erzeugen, schnellen, sich wiederholenden Stößen ausgesetzt sein, die Explosionsbelastungen nachahmen. Insbesondere ist eine schnelle Abgabe von Überdruckluft mit Geräten wie Stoßdämpferrohren nicht möglich, die zwischen den einzelnen Ereignissen eine umfangreiche Neukonfiguration oder Druckneubeaufschlagung erfordern. Stoßdämpferrohre verwenden Membranen, die platzen, um Stoßwellen zu erzeugen, und nach jedem Platzen muss die Membran ausgetauscht werden. Dieser Vorgang braucht Zeit, da das Stoßdämpferrohr geöffnet, die verbrauchte Membran entfernt, eine neue Membran installiert und dem System Zeit zum Zurücksetzen und erneuten Druck gelassen werden muss. Daher ist insbesondere für Studien, die ZNS-Verletzungen nach schneller wiederholter Blastenexposition untersuchen, ein System ideal, das keine umfangreiche Rekonfiguration oder Druckneubeaufschlagung zwischen den einzelnen Ereignissen erfordert.

Zukünftige Anwendungen dieses modulatorischen, benutzerfreundlichen und kostengünstigen Systems sind vielversprechend. Durch die Nutzung seiner anpassungsfähigen und einzigartigen Eigenschaften eröffnet dieses System mehrere vielversprechende Wege für zukünftige präklinische therapeutische Studien. Seine Fähigkeit, schnelle, aufeinanderfolgende Überdruckluftstöße abzugeben, kann genutzt werden, um die kumulativen Auswirkungen wiederholter Explosionsexpositionen zu untersuchen, was für das Verständnis der chronischen traumatischen Enzephalopathie und anderer langfristiger neurodegenerativer Erkrankungen relevant ist. Darüber hinaus kann dieses System verwendet werden, um die Wirksamkeit verschiedener pharmakologischer Interventionen zur Milderung von ZNS-Verletzungen im geschlossenen System zu untersuchen, einschließlich des Zeitpunkts und der Dosierung von neuroprotektiven Medikamenten, um optimale Behandlungsfenster zu bestimmen. Darüber hinaus ermöglicht die Präzision des Systems bei der Nachahmung von Aspekten sowohl von stumpfen als auch von Explosionsverletzungsmechanismen die Entwicklung umfassender Verletzungsmodelle, die das komplexe Trauma widerspiegeln, das Individuen in realen Szenarien erleben. Dies kann die Erprobung multimodaler Therapien erleichtern, die sich mit allgemeinen globalen Aspekten von Verletzungen befassen, wie z. B. Entzündungen, oxidativer Stress und neuronaler Tod. Insgesamt bietet dieses Gerät eine vielseitige und leistungsstarke Plattform, um unser Verständnis von ZNS-Verletzungen im geschlossenen System zu verbessern und effektive therapeutische Interventionen zu entwickeln.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Mittel des NIH NEI P30 EY008126, des Potocsnak Discovery Grant in Regenerative Medicine, des Ret. Maj. General Stephen L. Jones, MD Fund und der Research Prevent Blindness, Inc Unrestricted Funds (VEI) unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1-PentanolFisher ScientificAC160600250Wird zur Herstellung von Avetin-Lösung verwendet 
2,2,2-TribomoethanolSigma AldrichNr. T48402Wird zur Herstellung von Avetin-Lösung verwendet 
24-Well-Platten mit DeckelVWR76520-63424-Well-Platte
2-Propanol Fisher ScientificNr. A451-1 
50 kS/s/Kanal Brücken-Analogeingangsmodul Nationale InstrumenteNI-9237Datenerfassungsmodul
Albumin-Rinderfraktion V (BSA)Forschungsprodukte International Nr. A30075BSA
Anti-Iba1 Primärer Antikörper (polyklonal Ziege) Abcam AB5076Marker für Mikroglia, wird in einer Konzentration von 1:500 verwendet 
Anti-Synaptophysin-Primärantikörper (monoklonaler Maus-Antikörper)Abcam AB8049Marker für Photorezeptorband-Synapsen, wird in einer Konzentration von 1:20 verwendet
Araldite GY 502 Elektronenmikroskopie10900
Cacodylat-PufferElektronenmikroskopie11652
Aktivkohlefilter-KanisterE-Z SystemeEZ-258Sammlung von Anästhesieabfällen
Klar H20 DietGel 76AKlar H2O 72-07-5022Wird nach der Explosion verwendet, um die Genesung der Tiere zu unterstützen
CompactDAQ-ChassisNationale InstrumenteUSB-9162DAQ-Chassis
DruckluftA-L GasGSMCA300 Wird zum Nachfüllen von Druckluftbehältern verwendet
DAPI Fluormount-G Südliche BiotechnologieEinhängemedien mit DAPI
Diamant-MesserMicro Star Technologies, Gruppe von Bruker Nano, Inc. Zum Durchtrennen von Sehnerven, 3 mm/45 Grad/Style H 
Donkey Anti-Goat IgG (H+L) High Cross Adsorbierter Sekundärantikörper, Alex Fluor 594Invitrogen (Lieferant: Fisher Scientific)Nr. A-11058Sekundärantikörper gegen Mikroglia, wird in einer Konzentration von 1:200 verwendet
Esel-Anti-Maus-IgG (H+L) hoher kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alex Fluor 594Invitrogen (Lieferant: Fisher Scientific)Nr. A-21203Sekundärer Antikörper für Photorezeptorband-Synapsen, verwendet in einer Konzentration von 1:200
Donkey Anti-Kaninchen IgG (H+L) hoher kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alex Fluor 488Invitrogen (Lieferant: Fisher Scientific)Nr. A-21206Sekundärantikörper für bipolare Stäbchenzellen, verwendet in einer Konzentration von 1:200 
Esel-Serum Sigma Aldrich Nr. D9662NDS
Dumont #3 PinzetteWerkzeuge für die Feinwissenschaft11231-30Feine Pinzette für die Enukleation des ganzen Auges 
Ethanol (200 Proof)  KOPTEC (Lieferant: VWR) 89125-188Ethanol 
Fluormount-G Invitrogen (Lieferant: Fisher Scientific)00-4958-02Einhängemedien
Genteal Tears Ophthalmic GelCovetrus72359Augengleitmittel zur Verhinderung des Austrocknens der Augen während/nach der Narkose 
GlutaraldehydElektronenmikroskopie16200
Messzylinder 1000 mLFisher Scientific08-572G
Messzylinder 250 mLFisher Scientific08-572E
Messzylinder 500 mLFisher Scientific08-572F
Heizkissen Braintree WissenschaftlichAP-R 26EGeregelte Heizungsunterstützung
Hochdruck-AbfüllstationNinja PaintballHPFSV2Wird zum Nachfüllen von Druckluftbehältern verwendet
BildJNationale Institute für Gesundheit Bildanalyse-Software
Mini umkehrenImperium PaintballPaintball-Pistole
IsofluranCovetrus29405Inhalations-Anästhetikum
Isofluran-VerdampferVetEquip901806Tieranästhesie
Masterflex PumpeCole-ParmerWird für die Durchblutung von Tieren verwendet
Methanol Sigma Aldrich322415-2L 
ObjektträgerGlobus Wissenschaftlich1358WMikroskopische Objektträger aus weißem Glas
NI Measurement and Automation Explorer (NI MAX) Nationale InstrumenteSoftware zur Konfiguration der Einstellungen des Datenerfassungssystems
NI-DAQmx-Treiber Nationale InstrumenteTreiber für die Interaktion mit dem Datenerfassungssystem 
Nikon Eclipse Ni-E MikroskopNikon Instrumente
Osmiumtetroxid 2%Elektronenmikroskopie19152
Paraformaldehyd 32%Elektronenmikroskopie15714-SPFA auf 4 % verdünnt
Paraphenylendiamin Sigma AldrichNr. P6001
PBS (10x), pH 7,4Thermo Fisher Scientific70011044PBS auf 1x verdünnt
Propylenoxid Elektronenmikroskopie20401
PROV3 48 L, 48 in3 Aluminium 3000 psi NenntankNinja PaintballDruckluftbehälter
Pyrex Mehrweg-Aufbewahrungsflasche 1000 mLFisher Scientific06-414-1D
Pyrex Mehrweg-Aufbewahrungsflasche 500 mLFisher Scientific06-414-1C
Pyrex Mehrweg-Aufbewahrungsflaschen 250 mLFisher ScientificTel.: 06-414-1B
Rekombinanter Anti-PKC-a-Primärantikörper (Kaninchen monoklonal) Abcam AB32376Marker für bipolare Stäbchenzellen, wird in einer Konzentration von 1:500 verwendet 
Harz 812Elektronenmikroskopie14900
Serie TJE Druckmessumformer, 100 psi Honeywell Tel.: 060-0708-10TJGBerücksichtigen Sie den Bereich bei der Auswahl des Druckmessumformers, um die Auflösung der Messungen zu optimieren 
SaccharoseSigma AldrichNr. S5016
Super TJE Druckmessumformer, 7500 psi Honeywell Berücksichtigen Sie den Bereich bei der Auswahl des Druckmessumformers, um die Auflösung der Messungen zu optimieren 
Kombination aus Spritze und NadelCovetrus 60728Spritze/Nadel zur Durchführung von IP-Injektionen
Tissue-Plus OCT-VerbindungFisher Scientific23-730-571 Medium zum Gefrieren
Toluidin-BlauFisher ScientificNr. BP107-10
Triton X-100Sigma AldrichNr. T8787
UniSlide XY-TischVelmex AXY40-SerieXY-Positioniertisch 
Universitätspinsel - Serie 233- Rund, Größe 000Winsor und Newton Pinsel
Vannas Federschere - 2,5mm SchneideWerkzeuge für die Feinwissenschaft15000-08Schere für die Enukleation des ganzen Auges
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Referenzen

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