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Retrovirales CRISPR/Cas9-vermitteltes Gen-Targeting zur Untersuchung der Th17-Differenzierung in vitro

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DOI:

10.3791/66966

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15. November 2024

 ,  ,  ,  , 
1Shanghai Immune Therapy Institute, Renji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Zhejiang University-University of Edinburgh Institute (ZJU-UoE Institute), Zhejiang University School of Medicine, Zhejiang University, 3Institute of Immunology and Department of Rheumatology, Sir Run Run Shaw Hospital, Zhejiang University School of Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir stellen ein Protokoll für die retrovirale Transduktion von Guide-RNA in primäre T-Zellen von Cas9-transgenen Mäusen vor, das eine effiziente Alternative für die Geneditierung bei der Untersuchung der Th17-Differenzierung darstellt.

Zusammenfassung

T-Helferzellen, die IL-17A produzieren, sogenannte Th17-Zellen, spielen eine entscheidende Rolle bei der Immunabwehr und sind an Autoimmunerkrankungen beteiligt. CD4-T-Zellen können in vitro mit Antigenen und gut definierten Zytokincocktails stimuliert werden, um die Differenzierung von Th17-Zellen in vivo nachzuahmen. Die Regulationsmechanismen der Th17-Differenzierung wurden mit Hilfe des in vitro Th17-Polarisationsassays umfassend erforscht.

Herkömmliche Th17-Polarisationsmethoden beinhalten in der Regel die Gewinnung naiver CD4-T-Zellen aus genetisch veränderten Mäusen, um die Auswirkungen bestimmter Gene auf die Th17-Differenzierung und -Funktion zu untersuchen. Diese Methoden können zeit- und kostenintensiv sein und durch zellextrinsische Faktoren der Knockout-Tiere beeinflusst werden. Daher stellt ein Protokoll, das retrovirale Transduktion von Guide-RNA zur Einführung von Gen-Knockout in CRISPR/Cas9-Knockin-Primär-Maus-T-Zellen verwendet, einen sehr nützlichen alternativen Ansatz dar. In diesem Artikel wird ein Protokoll zur Differenzierung naiver primärer T-Zellen in Th17-Zellen nach retroviralem Gen-Targeting vorgestellt, sowie die anschließenden durchflusszytometrischen Analysemethoden zur Untersuchung der Infektions- und Differenzierungseffizienz.

Einleitung

Th17-Zellen, eine einzigartige Untergruppe der CD4+ T-Helferzellen, sind für die Ausrottung extrazellulärer Bakterien und Pilze von entscheidender Bedeutung und spielen eine wichtige Rolle bei verschiedenen Autoimmunerkrankungen 1,2,3. Neue Erkenntnisse deuten darauf hin, dass Th17-Zellen eine Heterogenität aufweisen und sowohl unter pathogenen als auch unter nicht-pathogenen Bedingungen funktionieren, die von Umwelt- und genetischen Faktoren beeinflusst werden. Die Aufklärung der regulatorischen Prozesse, die die Differenzierung, Plastizität und Heterogenität von Th17-Zellen steuern, ist entscheidend für die Weiterentwicklung effektiverer immuntherapeutischer Strategien.

Genetisch veränderte Tiere wurden in großem Umfang verwendet, um die Schlüsselregulatoren der Differenzierung und Funktion der Th17-Zellen zu entschlüsseln. Die Verwendung genetisch veränderter Tiere erfordert eine vollständige Manipulation in vivo, um Authentizität und systematische Untersuchung ihrer Rolle unter physiologischen Bedingungen oder Krankheitsmodellen zu gewährleisten. Dennoch ist ein Hochdurchsatz-Screening mit diesem Ansatz weitgehend unpraktikabel. In vitro Polarisationsassays bieten eine Alternative zur Untersuchung der Th17-Zelldifferenzierung. Es wurde gezeigt, dass Interleukin 6 (IL-6) in Kombination mit dem transformierenden Wachstumsfaktor β1 (TGFβ1) die Entwicklung nicht-pathogener Th17-Zellen fördert, während IL-6, IL-1β und IL-23 an der Differenzierung pathogener Th17-Zellen beteiligt sind (pTh17)4,5.

Das Aufkommen der CRISPR/Cas9-Technologie hat eine präzise Genom-Editierung an bestimmten Basen ermöglicht. In Kombination mit retroviraler Transduktion bietet dieser Ansatz eine wirksame, effiziente und wirtschaftliche genetische Methode zum Screening und funktionellen Studium potenzieller Regulatoren in Th17-Zellen 6,7. In dieser Studie haben wir das Verfahren zur retroviralen Transduktion innerhalb des Th17-Polarisationssystems verbessert. Mit Hilfe eines retroviralen Systems infizierten wir bereits etablierte Cas9-exprimierende aktivierte naive T-Zellen von Mäusen. Die Zellen wurden mit Guide-RNA (gRNA)-Konstrukten transduziert, die vom U6-Promotor angetrieben werden, zusammen mit Genen, die für fluoreszierende Reporterproteine unter der Kontrolle des EF1a-Promotors kodieren, um den Knockout des Zielgens zu erleichtern. Anschließend wurden die transduzierten T-Zellen unter spezifischen Zytokinbedingungen kultiviert, um die Differenzierung in Th17-Zellen zu induzieren. Bemerkenswert ist, dass das Ausschalten von RoRγt die IL-17A-Produktion im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant reduzierte. Die Wirksamkeit dieses Systems hängt von optimierten Retrovirus-Produktions- und Transduktionsbedingungen für aktivierte primäre T-Zellen ab und bietet einen schnellen und praktischen Ansatz zur Untersuchung spezifischer Gene bei der Th17-Differenzierung und -Funktion.

Protokoll

Alle Verfahren wurden von der Experimental Animal Welfare Ethics Committee des Renji Hospital der Shanghai Jiao Tong University School of Medicine genehmigt und entsprechen den institutionellen Richtlinien.

1. Retrovirale Produktion

  1. Vorbereitung eines retroviralen Konstrukts
    1. Verwenden Sie das CRISPick-Tool (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public), um die sgRNA für den RORγt-Knockout8 zu entwerfen. Geben Sie das Referenzgenom als Maus GRCm38 an und wählen Sie die PAM-Sequenz als NGG (für SpyoCas9, Hsu (2013) tracrRNA) basierend auf dem CRISPRko-Guide-System. Validieren Sie den Namen des Zielgens oder anderer Zielgenformate und reichen Sie die gültige Eingabe ein, um sgRNA-Kandidaten zu erhalten. Setzen Sie andere Parameter auf Standardwerte, setzen Sie das sgRNA-Ziel auf RORγt (Rorc, Gen-ID: 19885), um die Differenzierung von Th17 zu stören, und wählen Sie nicht-zielende sgRNA (abgekürzt sgNT, Sequenz: GCGAGGTATTCGGCTCCGCG) aus den GeCKO v2-Bibliotheken der Maus aus.
      HINWEIS: Dieses Tool bietet eine Reihe von anklickbaren Optionen zum Entwerfen von Leit-RNAs, die eine bequeme Anpassung an spezifische Anforderungen ermöglichen.
      1. Geben Sie den Namen des Zielgens in das Suchfeld in der Spalte Quick Gene Lookup ein. Das System zeigt die Gen-ID und den vollständigen Namen des Zielgens an, um eine genaue Auswahl zu gewährleisten.
        HINWEIS: Für die Validierung verschiedener Zielgenformate stehen zusätzliche Optionen zur Verfügung.
    2. Wählen Sie eine sgRNA, die auf die Rorc-Sequenz (abgekürzt sgRorc) abzielt, entsprechend der hohen kombinierten Rang- und Auswahlreihenfolge, um Off-Target-Übereinstimmungen zu vermeiden und die On-Target-Wirksamkeit zu erhöhen (sgRorc-Sequenz: GTCATCTCTGGGATCCACTACG). Synthetisieren Sie zwei Oligonukleotide für sgRorc und sgNT: Für das Vorwärts-Oligo hängen Sie die Sequenz "gttttagagctagaaatagcaagttaaaat" an das 5'-Ende jeder Leitsequenz an; Für das umgekehrte Oligo hängen Sie die Sequenz "tttcgtcctttccaagatatataaagc" an das 3'-Ende jeder Leitsequenz an.
      HINWEIS: In der Regel gibt es mehrere Optionen für sgRNA-Sequenzen. Es ist wichtig, 2 oder 3 sgRNA-Sequenzen auszuwählen, die auf denselben Genotyp abzielen, um ihre Knockout-Effizienz zu beurteilen. In unseren vorläufigen Experimenten wurden zwei gRNAs, die auf Rorc abzielen, zum Vergleich ausgewählt (sgRNA-Sequenz1: GTCATCTCTGGGATCCACTACG; sgRNA-Sequenz2: CTTGAGTATAGTCCAGAACG). Experimentelle Ergebnisse deuteten darauf hin, dass die in der aktuellen Methode präsentierte gRNA (sgRNA-Sequenz1) eine höhere Knockout-Effizienz zwischen den beiden aufweist.
    3. Amplifizieren Sie die sgRorc- und sgNT-kodierenden Sequenzen unter Verwendung von DNA-Polymerase in der PCR mit den oben genannten Primern und klonieren Sie sie in den pMX-U6-MCS-Vektor (zwischen den Regionen des U6-Promotors und dem gRNA-Gerüst) im Rahmen mit dem fluoreszierenden mCherry-Protein bzw.9. Stellen Sie das Reaktionssystem (50 μL) wie in Tabelle 1 ein. Diese Primer bestehen aus einer sgRNA-Sequenz (3'), die die sgRNA in den Vektor einfügen kann, und einem Segment der Vektorsequenz (5'), die das Vektorfragment in voller Länge amplifizieren kann. Darüber hinaus entwerfen Sie die Vorwärts- und Rückwärtsprimer mit einer Überlappung von etwa 18 bp innerhalb der sgRNA-Region (aber nicht vollständig überlappend), was die Assemblierung des linearisierten Klonierungsvektors während des Ligationsprozesses erleichtert.
      HINWEIS: Es sollte ein linearisiertes Vektorfragment an der Stelle der sgRNA-Sequenz mit Primern von ca. 5.551 kd durch PCR erhalten werden.
    4. Reinigen Sie das Konstrukt mit einem Gel-Extraktionskit und zirkulieren Sie es mit einem Klonierungskit. Verwenden Sie die Rekombinationsprodukte für Transformationsassays.
    5. Entnehmen Sie die einzelnen Klone von Platten und verifizieren Sie sgRorc- oder sgNT-kodierende Sequenzen mittels First-Generation-Sequencing unter Verwendung eines U6-Promotor-Primers (Sequenz: ATGGACTATCATATGCTTACCGTA).
    6. Wählen Sie den gewünschten Einzelklon für die Amplifikation in der LB-Brühe aus. Extrahieren Sie hochwertige Plasmid-DNA aus Bakterienzellen mit einem endotoxinfreien Plasmid-Kit.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Plasmidlösung eine hohe Qualität aufweist. Wir empfehlen, dass die Konzentration der Plasmidlösung mindestens 1 μg/μl betragen sollte.
  2. Vorbereitung von Verpackungszellen
    1. Bereiten Sie Platin-E (Plat-E)-Zellen nach folgendem Verfahren vor: Kultivieren Sie Plat-E-Zellen mit Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM-Medium) mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 100 Einheiten/ml Penicillin und 0,1 mg/ml Streptomycin in einer 10-cm-Kulturschale. Im Folgenden wird es als Zellkulturmedium bezeichnet.
      HINWEIS: Um die richtige Transfektionseffizienz zu erzielen, empfehlen wir die Verwendung von Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase mit weniger als 15 Passagenzahlen.
    2. Teilen Sie eine volle Platte mit 10 cm großen Plat-E-Zellen (~2,6 × 107 Zellen) im richtigen Verhältnis in eine neue 10 cm große Schale 1 Tag vor der Transfektion, um am nächsten Tag eine Zellkonfluenz von ca. 80% zu erreichen, was die optimale Bedingung für die Transfektion ist. Führen Sie die Zellpassage für eine neue 10-cm-Schale im Verhältnis 1:3 durch (Seed ~8 × 106 Zellen in einer neuen 10-cm-Schale am Tag vor der Transfektion).
      HINWEIS: Das Split-Verhältnis hängt vom Wachstumszustand der Zellen ab, wobei bei Zellen mit robustem Wachstum eine höhere Transfektionseffizienz erreicht werden kann. Wir führen die Zellpassage für eine 10 cm Schale im Verhältnis 1:3 durch. Für verschiedene Zellkulturschalen, wie z.B. eine 6 cm Schale, empfehlen wir, dass 1,5 × 106 Plat-E Zellen am Tag vor der Transfektion ausgesät werden sollten.
  3. Transfektion
    1. Eine Stunde vor der Transfektion ist das Zellkulturmedium durch 8 ml reduziertes Serummedium ohne Phenolrot mit 5 % FBS, aber ohne Penicillin-Streptomycin zu ersetzen, da dies das Transfektionsreagenz beeinträchtigen kann. Erwärmen Sie das reduzierte Serummedium vor der Anwendung auf 37 °C.
    2. Bereiten Sie die Transfektionsmischung vor, die Mix 1 und Mix 2 enthält: Mix 1 enthält 18 μg Plasmid-DNA (pMXs-U6-MCS-sgNT-mCherry/pMXs-U6-MCS-sgRorc-mCherry) und 6 μg pCL-Ecotropic Retroviral Vector (pCL-Eco) in 1.000 μl reduziertem Serummedium. Mix 2 enthält 48 μl Transfektionsreagenz in 1.000 μl reduziertem Serummedium. Mix 2 Tropfen für Tropfen in Mix 1 geben und vorsichtig und gründlich mischen. Inkubieren Sie den Komplex für 15-20 Minuten bei 20-25 °C.
    3. Tropfen Sie die Mischung vorsichtig in die Plat-E-Zellen und schwenken Sie die Platte vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C unter 5 % CO2 für 6-12 h.
    4. Ersetzen Sie das Medium durch 10 mL frisches Zellkulturmedium und inkubieren Sie die Zellen 48 Stunden lang bei 37 °C, 5 % CO2 .
    5. Beurteilen Sie die Transfektionseffizienz in Plat-E-Zellen durch Detektion des retroviralen Vektor-Tags, der als Proxy dient, mittels Fluoreszenzmikroskopie oder Durchflusszytometrie.
      HINWEIS: Ein starkes mCherry-Fluoreszenzsignal (die positive Fluoreszenz übersteigt 80 %) wurde in einem beträchtlichen Teil der Plat-E-Zellen nachgewiesen, die mit dem pMX-U6-MCS-Vektor transfiziert wurden, was auf eine erfolgreiche Transfektion hinweist.
    6. Der virushaltige Kulturüberstand wird entnommen und 10 Minuten lang bei 1.500 × g zentrifugiert, um Zellfragmente zu entfernen. Der Virusüberstand wird 1 ml pro Durchstechflasche aliquotiert und bei -80 °C gelagert.
      HINWEIS: Die Filtration ist eine alternative Methode zur Entfernung von Zelltrümmern. Wir empfehlen die Verwendung eines Spritzenvorsatzfilters mit einer Porengröße von 0,45 μm und einer Polyethersulfon (PES)-Membran, um die Rückhaltung von Viruspartikeln auf der Filtermembran zu minimieren.

2. Retrovirale Infektion von aktivierten CD4 + T-Zellen und Th17-Differenzierung

  1. Aufbereitung und Aktivierung primärer naiver CD4+ T-Zellen
    1. Beschichten Sie jede Vertiefung einer 24-Well-Zellkulturplatte mit 2 μg/ml Anti-CD3e und 4 μg/ml Anti-CD28 in sterilem 500 μl PBS, wickeln Sie die Platte mit Parafilm ein, um Verdunstung und Kontamination zu verhindern, und inkubieren Sie die Platte dann über Nacht bei 4 °C (oder 37 °C für 1-2 Stunden vor dem Plattieren von CD4+ T-Zellen) am Tag vor der Isolierung naiver CD4+ T-Zellen.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist erforderlich, um eine plattengebundene Stimulation für die T-Zellen der Maus durchzuführen, bevor eine virale Transduktion durchgeführt wird.
    2. Am nächsten Tag werden 6-8 Wochen alte Cas9-exprimierende Mäuse (R26-CAG-Cas9-Mäuse) durch CO2 -Erstickung eingeschläfert und mit 70% Ethanol sterilisiert.
    3. Entnehmen Sie die Milz der Maus und legen Sie sie in PBS mit 2% FBS und 100 μM EDTA (FACS-Puffer).
    4. Mahlen Sie die Milz mit sterilisiertem Mahlglas (matte Seite) im FACS-Puffer, homogenisieren Sie das Gewebe zu einer Einzelzellsuspension und filtrieren Sie die Zellsuspension durch ein 70 μm Zellsieb in ein 50 mL Röhrchen.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, das Taschentuch vorsichtig und gleichmäßig zu schleifen, um das Taschentuch feucht zu halten. Gewaltsames Zermahlen des Gewebes kann das Überleben der Zellen dramatisch beeinträchtigen.
    5. Die Milzzellensuspension bei 800 × g 5 min schleudern. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 2 ml Erythrozyten-Lysepuffer. Lassen Sie es 5 Minuten bei Raumtemperatur ruhen und fügen Sie dann FACS-Puffer hinzu, um ein Gesamtvolumen von 15 ml zu erreichen. Zentrifugieren Sie die Splenozyten bei 800 × g für 5 min.
    6. Resuspendieren Sie die Splenozyten und filtern Sie sie durch ein 40 μm Zellsieb. Stellen Sie das endgültige Volumen auf 1 mL für die CD4+ T-Zellisolierung ein.
    7. Isolieren Sie CD4+ T-Zellen mit kommerziellen Reagenzienkits, indem Sie den Anweisungen im Handbuch folgen.
    8. Markieren Sie die CD4+ T-Zellen mit einer fluoreszierenden Antikörpermischung (CD4, CD25, CD44 und CD62L) bei 4 °C für 30 Minuten, waschen Sie die Zellen mit FACS-Puffer und isolieren Sie die naiven CD4+ T-Zellen mit einem Durchflusszellensortierer. Dies führt zur Gewinnung von CD4+CD25-CD62L-Zellen mit hohemCD44-Gehalt und niedrigem naiven T-Wert.
    9. Entfernen Sie den plattengebundenen Stimulationsüberstand von der 24-Well-Zellkulturplatte (vorbereitet in Schritt 2.1.1) und spülen Sie jede Vertiefung zweimal mit 500 μl PBS. Platte: 1 x 106 naive CD4+ T-Zellen in 1 ml Lymphozyten-Kulturmedium in einer Vertiefung der 24-Well-Zellkulturplatte. Inkubieren Sie die Zellen im Zellinkubator.
      HINWEIS: Das Lymphozytenkulturmedium enthält 10 % FBS, 100 Einheiten/ml Penicillin und 0,1 mg/ml Streptomycin, 1 mM Natriumpyruvat, 10 mM HEPES und 50 μM β-ME in RPMI 1640 Medium.
  2. Retrovirale Infektion
    1. Nach 18-24 h sammeln Sie jede Vertiefung mit aktivierten Zellen in das 1,5-ml-Röhrchen. Bei 800 × g 5 min zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
    2. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml Infektionsgemisch (10 μg/ml Hexadimethrinbromid, 10 mM HEPES im Virusüberstand) und geben Sie 1 ml der Mischung in eine neue Vertiefung einer 48-Well-Zellkulturplatte. Speichern Sie in der Zwischenzeit genügend Zellen als negative (nicht transduzierte) Kontrolle.
      HINWEIS: Es ist möglich, weniger als 1 x 106 aktivierte naive CD4+ T-Zellen pro Vertiefung zu haben, aber es wird nicht empfohlen, weniger als 0,5 x 106 Zellen pro Vertiefung zu verwenden. Darüber hinaus sollten keine Zellen in die peripheren Vertiefungen der 48-Well-Kulturplatte ausgesät werden.
    3. Die Platte mit Parafilm umwickeln und bei 800 x g 90 min bei 32 °C zentrifugieren. Stellen Sie das Beschleunigen und Abbremsen auf 3 ein. Entfernen Sie nach der Zentrifugation den Parafilm, inkubieren Sie die Zellen 4 Stunden lang im Inkubator und fahren Sie mit den Differenzierungsschritten fort.
  3. Differenzierung von infizierten Zellen zu Th17-Zellen
    1. Bereiten Sie die Antigen-präsentierenden Zellen (APC) während einer retroviralen Infektion vor. Gewinnen Sie zunächst Milnozyten von Wildtyp-Mäusen gemäß den Anweisungen in den Schritten 2.1.2 bis 2.1.4. Resuspendieren Sie die Splenozyten mit 1 ml Lymphozytenkulturmedium mit 50 μg/ml Mitomycin in einem 15-ml-Röhrchen. Inkubieren Sie die Splenozyten bei 37 °C unter 5 % CO2 für 1 h.
    2. Eine Stunde später fügen Sie PBS bis zur 15-ml-Marke hinzu, um die Splenozyten zu waschen, zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 800 x g , verwerfen Sie den Überstand, resuspendieren Sie die Splenozyten mit 1 ml Lymphozytenkulturmedium und zählen Sie die Zellzahl. APC-Zellen wurden erfolgreich präpariert.
    3. Nach der 4-stündigen Zellinkubation (wie in Schritt 2.2.3) werden transduzierte CD4+ T-Zellen in 1,5-ml-Röhrchen gesammelt und 5 Minuten lang bei 800 x g zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie infizierte Zellen in 600 μl PBS, um ihn zu waschen. Bei 800 x g 5 min zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
    4. Platzieren Sie 0,5 × 106 transduzierte CD4+ T-Zellen in 1 ml Lymphozytenkulturmedium mit 1,5 x 106 APC-Zellen in einer Vertiefung einer 24-Well-Zellkulturplatte. Ergänzen Sie mit 2 μg/ml Anti-CD3e, 2 μg/ml anti-CD28 und Th17-Zelldifferenzierungscocktail, der 10 μg/ml anti-IFNγ, 10 μg/ml anti-IL-12/IL23 p40, 10 μg/ml anti-IL4, 2,5-3 ng/ml hTGF-β und 20-30 ng/ml IL-6 enthält. Zellen 2 Tage lang kultivieren.
    5. Jede Vertiefung der Zellen wird in die 1,5-ml-Röhrchen gegeben, 5 Minuten lang bei 800 x g zentrifugiert und der Überstand entsorgt. Frischen Sie 1 ml des Lymphozytenkulturmediums nur mit 3 ng/ml TGF-β und 30 ng/ml IL-6 auf. Legen Sie die Zellen für einen längeren Kulturzeitraum in eine neue Vertiefung oder 24-Well-Zellkulturplatte. Analysieren Sie die Zellen 2 Tage nach dem Mediumwechsel.

3. Bewertung der Transduktionseffizienz und der Differenzierungsergebnisse

  1. Nach zwei Tagen des Mediumwechsels werden die Zellen entnommen und 5 Minuten lang bei 800 × g zentrifugiert und der Überstand verworfen. Differenzierte Zellen werden mit 50 ng/ml Phorbol-12-Myristat-13-acetat (PMA), 500 ng/ml Ionomycin und 5 μg/ml Brefeldin A in 500 μl Lymphozytenkulturmedium in einer neuen Vertiefung mit 24-Well-Zellkulturplatte bei 37 °C Inkubator für 4 Stunden behandelt. Ernten Sie die Hälfte der Zellen für die Durchflusszytometrie-Analyse und lysieren Sie die andere Hälfte der Zellen mit RNA-Extraktionspuffer für die qPCR-Analyse.
  2. Für die Durchflusszytometrie-Analyse
    1. Sammeln Sie die Zellen in 1,5-ml-Röhrchen. Geben Sie 1 ml FACS-Puffer in Röhrchen und zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 800 × g , um die Zellen zu waschen.
    2. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit einer Mischung aus fluoreszierenden Antikörpern (CD4 und Fixable Viability Dye in 100 μl PBS) und färben Sie die Zellen 30 Minuten lang bei 4 °C.
    3. Waschen Sie die Zellen mit 300 μL PBS und fixieren Sie sie mit 300 μL 2% phosphatgepuffertem Formaldehyd (FA) bei 4 °C für mindestens 60 min.
    4. Eine Stunde später waschen Sie die Zellen mit PBS, resuspendieren Sie sie mit 600 μl 1x Permeabilisierungspuffer und zentrifugieren Sie sie bei 800 × g für 5 min.
    5. Entsorgen Sie den Überstand und färben Sie ihn mit Anti-IL-17A in 100 μl 1x Permeabilisierungspuffer für 60 min bei Raumtemperatur oder 4 °C über Nacht.
    6. Waschen Sie die Zellen am nächsten Tag mit 1x Permeabilisierungspuffer und resuspendieren Sie sie in 200 μl PBS. Analysieren Sie die Zellen mit der Durchflusszytometrie10. Weitere Informationen finden Sie im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse.
  3. Für die qPCR-Analyse extrahieren Sie die RNA gemäß den Anweisungen des RNA-Extraktionskits. Transkribieren Sie die RNA in cDNA für die Lagerung oder nachfolgende qPCR-Analyse. Das Design dieser Primer sollte den allgemeinen Designprinzipien von qPCR-Primern entsprechen und gleichzeitig speziell auf die Region abzielen, die die erwartete Indel-Stelle überspannt und in der eine gRNA-vermittelte Spaltung stattgefunden hat. Jede Verringerung der Verstärkungseffizienz oder ein Signalverlust an dieser Stelle kann als Indikator für einen erfolgreichen Knockout dienen. Die qPCR-Primer sind wie folgt:
    Rorc F: TCCACTACGGGGTTATCACCT; R: AGTAGGCCACATTACACTGCT.
    IL17a F: TCAGCGTGTCCAAACACTGAG; R: CGCCAAGGGAGTTAAAGACTT.

Ergebnisse

In der Studie klonierten wir das sgRNA-Ziel an Rorc und sgRNA-nicht-targeting-kodierende Sequenzen in einen pMX-U6-MCS-Vektor mit mCherry-Fluoreszenzprotein (Abbildung 1A,B). Die Retrovirusproduktion erfolgte gemäß dem in Abbildung 2 dargestellten Protokoll. Die Transfektion wurde an Tag 0 eingeleitet und die retrovirale Entnahme erfolgte an Tag 2. Die Transfektionseffizienz kann anhand der mCherry-Fluoreszenzintensität getestet werden (Abbildung 1C). Vor der Ernte des Virus wurden naive CD4+ T-Zellen sortiert und aktiviert. Diese aktivierten CD4+ T-Zellen wurden dann mittels Spin-Infektion infiziert, gefolgt von der Fortsetzung der Differenzierungsschritte wie beschrieben. Schließlich wurden die Effizienz der Transduktion und die Ergebnisse der Differenzierung mittels Durchflusszytometrie und qPCR-Analyse bewertet.

Abbildung 3 veranschaulicht die Gating-Strategie, die zur Sortierung naiver CD4+ T-Zellen angewendet wird. Nach der Auswahl der Hauptzellpopulation und der Singulettzellen (wie in den ersten beiden Gates von Abbildung 3 gezeigt) wurden FVD-CD4+-Zellen gegated, um CD4-T-Zellen in polarisierten mit Th17-Zellen von denen in APCs zu unterscheiden. Schließlich repräsentiert IL-17A, das von CD4-T-Zellen produziert wird, die Th17-Differenzierungseffizienz, was auf die Knockout-Effizienz hinweist. Der Prozentsatz der mCherry-positiven Zellen spiegelt die Effizienz der retroviralen Infektion wider, während die Knockout-Effizienz durch den Prozentsatz der IL-17A-positiven Zellen angegeben wird. Um die Lebensfähigkeit der Zellen zu verbessern und die Sortierdauer zu minimieren, wurden die Splenozyten mit einem CD4+ T-Zell-Isolationskit der Maus angereichert, was zu einer Anreicherungseffizienz von über 90 % führte.

Die Wirksamkeit einer Retrovirusinfektion, die durch das Vorhandensein von mCherry-positiven Zellen angezeigt wird, liegt in der Regel bei etwa 40 % (Abbildung 4A). Obwohl die Infektionseffizienz durch Viruskonzentration gesteigert werden kann, geht dieser Ansatz auf Kosten einer verlängerten Versuchsdauer und höherer Kosten. In unseren Experimenten dienten infizierte Zellen, die ohne den Th17-Zelldifferenzierungscocktail kultiviert wurden, als Th17-Differenzierungs-Negativkontrolle, die als Th0 bezeichnet wird. Als Positivkontrolle wurde eine nicht-zielgerichtete sgRNA verwendet, die als sgNT bezeichnet wird. Für die Geneditierung verwendeten wir gRNA, die auf das RORγt-Gen (sgRNA-Rorc) abzielte, was die Th17-Differenzierungseffizienz signifikant reduzierte (Abbildung 4A). Diese Intervention führte auch zu einer erheblichen Abnahme der Expressionsniveaus von Rorc und IL-17a (Abbildung 4B).

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Abbildung 1: Beispiel für eine subklonierte sgRNA in einen retroviralen Vektor und Transfektionseffizienz. Als Ausgangskonstrukt wurde der pMX-U6-MCS-Vektor verwendet. Das gRNA-Gerüst wurde zusammen mit den sgRNA-Sequenzen (der orangefarbene Teil), die auf die (A) Scramble-Stelle und (B) Ronc abzielen, stromabwärts des U6-Promotors eingefügt (der grüne Teil als Schnitt für die Sequenzierung mit U6-Primern). Die Positionen der sgRNA-haltigen Primer und der Sequenzierungsprimerstellen sind unterhalb des zirkulären Vektors angegeben. Die vollständigen Namen der Abkürzungen auf dem Plasmid lauten wie folgt. Abkürzungen: AmpR = Resistenz gegen Ampicillin, Carbenicillin und verwandte Antibiotika; LTR = langer Terminal-Repeat; MMLVψ = Verpackungssignal des moloney murinen Leukämievirus; gag = verkürztes Moloney-Maus-Leukämievirus (MMLV) Gag-Gen , dem das Startcodon fehlt. (C) Mikroskopische Bildgebung von mCherry in Plasmid-DNA-transfizierten Plat-E-Zellen. Maßstabsleiste: 500 px. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Schematische Darstellung des Protokolls. Am Tag vor der Transfektion muss die Dichte der Plat-E-Zellen auf einen geeigneten Bereich eingestellt werden. Führen Sie am nächsten Tag (Tag 0) eine Transfektion durch und ersetzen Sie das Medium 12 h später. An Tag 1 werden die naiven T-Zellen von Cas9-exprimierenden Mäusen sortiert und aktiviert. Anschließend (Tag 2) wird der virushaltige Kulturüberstand entnommen und mit den aktivierten T-Zellen für die retrovirale Transduktion kombiniert. Die infizierten Zellen werden dann für 3-4 Tage in Th17-Zellen differenziert und mit FACS analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Gating-Strategie zur Sortierung der CD4-naiven T-Zellen. Die angereicherten CD4-T-Zellen wurden oberflächengefärbt, um CD4, CD25, CD44 und CD62L zu markieren. Die angewandte Gating-Strategie war wie folgt: Zunächst wurden die Lymphozyten auf der Grundlage von Vorwärtsstreu- und Seitenstreuparametern gegated. Anschließend wurden Einzelzellen mittels FSC-H und FSC-W identifiziert. CD4+CD25-Zellen wurden dann so gegated, dass regulatorische T-Zellen (Tregs) ausgeschlossen wurden. Schließlich wurden CD44-niedrige CD62L-Zellen mithohem naiven T-Wert identifiziert. Die isolierten CD4+ naiven T-Zellen wurden für nachfolgende Experimente gesammelt. Abkürzungen: FSC = Vorwärtsstreuung; SSC = seitliche Streuung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Beispiel für eine erfolgreiche Transduktion von aktivierten T-Zellen und Th17-Differenzierung. (A) Die Differenzierungseffizienz von Th17 ist signifikant reduziert, was durch RORγt gRNA (Gating auf mCherry+ IL-17a+Population) editiert wird. (B) Rorγt- und IL-17a-relative mRNA-Expression in Th0 (infizierte Zellen, die ohne Th17-Zelldifferenzierungscocktail kultiviert wurden), sgNT (nicht-targeting-sgRNA) und sgRNA-Rorc (sgRNA, die auf das RORγt-Gen abzielt). p < 0,001 (t-Test eines ungepaarten zweiseitigen Studenten; die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Komponenten der PCR-ReaktionPCR-Programm
BestandteilVolumen (μL)SchrittAushilfe.ZeitZyklus
2 × Phanta Mix (Farbstoff Plus)25195 ºC3 Minuten1
ddH2020295 ºC15 Sek.
Primer-F (10 μM)2356 ºC15 Sek.
Primer-R (10 μM)2472 ºC5 min 30 sGehen Sie zu Schritt 2
35 ×
Vorlage (~30 ng)1572 ºC5 Minuten1
612 ºC∞

Tabelle 1: PCR-Reaktionskomponenten und PCR-Programm für die Konstruktion von gRNA-Vektoren.

Diskussion

Die CRISPR/Cas9-Genom-Editierung mittels retroviraler Verabreichung ist eine robuste Methode, um die Rolle von T-Helferzellen zu erforschen. Dieses Protokoll bietet einen schnellen und effektiven Ansatz zur Untersuchung spezifischer Gene, die an der Differenzierung und Funktion von Th17 beteiligt sind. Mehrere kritische Schritte müssen sorgfältig befolgt werden, um optimale Ergebnisse zu erzielen. Erstens sollten gRNAs für eine verbesserte Gen-Knockout-Effizienz sorgfältig ausgewählt werden. Angesichts des Risikos von Off-Target-Effekten bei der CRISPR/Cas9-Geneditierung ist es ratsam, 2-3 gRNAs mit hohen Punktzahlen, wie im Protokollabschnitt 1.1.1 identifiziert, für weitere Experimentezu wählen 11,12. Zweitens ist ein hoher Virustiter für eine erfolgreiche Infektion unerlässlich. Die ordnungsgemäße Wartung der Plat-E-Verpackungszellenlinie ist von entscheidender Bedeutung. Die Zellen sollten am Tag der Transfektion eine Konfluenz von etwa 80 % erreichen, da sowohl eine unzureichende als auch eine übermäßige Zellzahl die Virustiter beeinträchtigen. Wenn Plat-E-Zellen nicht verfügbar sind, kann die Co-Transfizierung von 293T-Zellen der menschlichen embryonalen Niere mit dem pCL-Eco-Vektor ebenfalls hohe virale Titer erzeugen 13,14. Die Aufrechterhaltung einer hohen Plasmidkonzentration von mindestens 1 μg/μl ist wichtig, um einen hohen Virustiter zu erreichen. Es ist wichtig, die Virussuspension zu ernten, bevor sie zitronengelb wird, da das Virus empfindlich auf pH-Veränderungen reagiert. Daher sollte der pH-Wert des Nährmediums sorgfältig in einem angemessenen Bereich reguliert werden. Das Virus sollte bei -80 °C gelagert werden, um seine Unversehrtheit zu erhalten, und vor wiederholten Frost-Tau-Zyklen geschützt werden15.

Drittens, um eine hohe Infektionseffizienz zu erreichen, müssen Primärzellen adäquat aktiviert werden. Eine unzureichende zelluläre Aktivierung beeinträchtigt die Effizienz von Virusinfektionen erheblich16. Vor einer Virusinfektion sollte der Aktivierungsstatus von T-Zellen mikroskopisch bestätigt werden, da aktivierte Zellen eine deutlich größere Größe aufweisen als inaktivierte Zellen. Es ist erwähnenswert, dass unser Th17-Differenzierungsprotokoll speziell für C57BL/6-Mäuse optimiert wurde, so dass Anpassungen für andere Mausstämme erforderlich sein können. Viertens ist die Aufrechterhaltung optimaler zellulärer Bedingungen entscheidend, um die gewünschten Th17-Differenzierungsergebnisse zu erzielen. Während einer Spin-Infektion ist es wichtig, die Zellen in den Vertiefungen in der Nähe des Zentrums zu platzieren, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten. Nach einer Spin-Infektion ist die Inkubation der Zellen für 4 Stunden (Protokollschritt 2.2.4) entscheidend für ihre Genesung. Darüber hinaus ist beim Transfer von Zellen ein schonendes Pipettieren wichtig, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten. Unterschiedliche Stimulationsbedingungen können die Th17-Differenzierung beeinflussen. In diesem Experiment verbesserte die Integration von Antigen-präsentierenden Zellen in das Differenzierungssystem die Differenzierungseffizienz im Vergleich zur plattengebundenen Stimulation von Anti-CD3e und Anti-CD28 signifikant. Schließlich ist es entscheidend sicherzustellen, dass alle verwendeten Zytokine während des Transports und der Lagerung funktionsfähig bleiben. Zytokine können bei wiederholten Gefrier-Tau-Zyklen oder ungeeigneten Rekonstitutionslösungen schnell an Stabilität verlieren. Eine Kältebehandlung und gleiche Aliquoten sind notwendig, damit die Zytokine ihre Funktionen während des gesamten Eingriffs beibehalten können.

Dieses Protokoll zur Erzeugung spezifischer Gen-Knockout-Th17-Zellen weist mehrere Einschränkungen auf. Erstens ist es schwierig, eine vollständige Transduktionseffizienz in primären Maus-T-Zellen zu erreichen. Einige Zellen durchlaufen möglicherweise nicht den beabsichtigten Gen-Knockout während der Th17-Differenzierung. Zweitens haben primäre T-Zellen in vitro eine begrenzte Lebensdauer. Nach etwa einer Woche neigen diese Zellen zum Absterben, was eine Herausforderung für nachfolgende Experimente darstellt. Drittens stützt sich unser Protokoll auf Cas9-transgene Mäuse, und als wir versuchten, die Cas9-Sequenz in das Kernplasmid einzubauen, führte dies zu einer signifikanten Verringerung der viralen Titer. Schließlich stellen wir fest, dass dieses Protokoll nicht geeignet ist, um Funktionen von Genen zu analysieren, die an den frühen Stadien der naiven CD4+ T-Zellaktivierung beteiligt sind, da diese Zellen vor der retroviralen Transduktion aktiviert werden müssen.

Trotz seiner Einschränkungen wurde dieses Protokoll in verschiedenen Studien erfolgreich angewendet, was die Erforschung wichtiger genetischer Regulatoren, die an der Th17-Differenzierung beteiligt sind, erleichtert. Es ermöglicht die Beurteilung von Veränderungen in der Th17-Differenzierungseffizienz nach dem Knockout von Zielgenen in aktivierten T-Zellen. Darüber hinaus eignet sich dieses Protokoll zur Bewertung anderer Aspekte der Th17-Zellfunktion, einschließlich Zellproliferation, Überleben, Stabilität des Transkriptionsfaktors, Zytokinsekretion und Immunreaktionen. Darüber hinaus hat unser Labor seine Wirksamkeit bei der retroviralen Transduktion und Differenzierung von induzierten regulatorischen T-Zellen (iTregs) nachgewiesen. Obwohl nicht alle Arten von T-Zellen getestet wurden, kann dieses Protokoll auch auf andere Untergruppen anwendbar sein, z. B. auf Th1-, Th2- und CD8+ -T-Zellen. Insgesamt dient diese Technik als wertvolles Werkzeug für die Durchführung von Gen-Knockouts in Immunzellen und bietet ein erhebliches Potenzial für die Aufdeckung kritischer genetischer Signale, die die Immunfunktionen regulieren.

Offenlegungen

Die Autoren geben an, dass es keine Interessenkonflikte gibt.

Danksagungen

Wir danken Dou Liu, Dongliang Xu und Pinpin Hou von der Core Facility des Shanghai Immune Therapy Institute für ihre Unterstützung bei der Nutzung der Instrumente. Diese Arbeit wurde unterstützt von der National Natural Science Foundation of China Grants 31930038, U21A20199, 32100718 und 32350007 (an Linrong Lu); 32100718 (an Xuexiao Jin); Innovatives Forschungsteam von hochrangigen lokalen Universitäten in Shanghai SHSMU-ZLCX 20211600 (nach Linrong Lu); Internes Inkubationsprogramm RJTJ24-QN-076 (an Zejin Cui). Abbildung 2 wurde mit Figdraw erstellt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,5 M EDTA (pH 8,0)SolarbioE1170
100 mm Zell- und GewebekulturschaleBIOFILTCD010100
1 M Hepes (Freie Säure, steril)SolarbioH1090
24-Well-Zell- und GewebekulturplatteNEST702002
48-Well-Zell- und GewebekulturplatteNEST748002
Brefeldin A Solution (1.000x)BioLegend420601
Brilliant Violet 650 Anti-Maus CD4 Antikörper (RM4-5)BioLegend100546
CD3e Monoklonaler Antikörper (145-2C11), Functional Grade, eBioscienceInvitrogen16-0031-82
CD44 Monoklonaler Antikörper (IM7), PE, eBioscienceInvitrogen12-0441-83
CD62L (L-Selectin) Monoklonaler Antikörper (MEL-14), APC, eBioscienceInvitrogen17-0621-82 
ZellzählerNexcelom BioscienceCellometer Auto 2000
Zellsieb (40 μ m)biosharpBS-40-CS
Zellsieb (70 μ m)BiosharpBS-70-CS
Zentrifuge Eppendorf5425  R
Zentrifuge eppendorf5810 R
ChamQ SYBR Color qPCR Master MixVazymeQ411-02
ClonExpress II One Step Cloning KitVazymeC112
DH5α Kompetente ZellenSangon BiotechB528413
Direct-zol RNA MiniprepZYMO RESEARCHR2050
DMEM MediumBasalMediaL110KJ
EasySep Maus CD4+ T-Zell-IsolationskitSTEMCELL19852
eBioscience Fixierbarer Viabilitätsfarbstoff eFluor 660Invitrogen65-0864-18
EndoFree Mini-Plasmid-Kit IITIANGENDP118-02
ExFect TransfektionsreagenzVazymeT101-01
Fötales Rinderserum, Premium PlusGibcoA5669701
FITC Anti-Maus IL-17A Antikörper (TC11-18H10.1)BioLegend506907
FormaldehydlösungMacklinF864792
HiScript IV RT SuperMix für qPCR?+gDNA-Wischer?VazymeR423-01
IonomycinBeyotimeS1672
Mitomycin CMaokang Biotechnologie07.07.1950
Maus GRCm38NCBIRefSeq v.108.20200622
OPTI-MEM Reduziertes SerummediumGibco31985070reduziertes Serummedium
Pacific Blue Anti-Maus CD4 Antikörper (RM4-5)BioLegend
PE/Cyanin7 Anti-Maus CD25 Antikörper (PC61)BioLegend102015
PE/Cyanin7 Anti-Maus CD4 Antikörper (GK1.5)BioLegend100422
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)Gibco15140122
PMA/TPA BeyotimeS1819
R26-CAG-Cas9 Mäuse Shanghai Model Organisms CenterKat.-Nr. NM-KI-00120
Rekombinantes humanes TGF-beta 1 (CHO-exprimiert) Protein, CFR& D Systems11409-BH
Rekombinante Maus IL-6PeproTech216-16
ForschungszellanalysatorBD BiosciencesBD LSRFortessa
ForschungszellsortiererSONYMA900
RPMI 1640 MediumBasalMediaL210KJ
SimpliAmp Thermocycler PCR-SystemAngewandte BiosystemeA24811
Natriumpyruvatlösung (100 mM)Sigma-AldrichS8636
Ultra-LEAF Aufgereinigter Anti-Maus-CD28-Antikörper (37.51)BioLegend102121
Ultra-LEAF Aufgereinigter Anti-Maus-IFN-& Gamma; Antikörper (XMG1.2)BioLegend505847
Ultra-LEAF Aufgereinigter Anti-Maus-Antikörper IL-4 Antikörper (11B11)BioLegend504135
Ultra-LEAF Aufgereinigter Anti-Maus-Antikörper IL-12/IL-23 p40 Antikörper (C17.8)BioLegend505309
β-Mercaptoethanol (50 mM)SolarbioM8211
100531

Referenzen

  1. Wu, B., Wan, Y. Molecular control of pathogenic th17 cells in autoimmune diseases. Int Immunopharmacol. 80, 106187(2020).
  2. Dong, C. Th 17 cells in development:: An updated view of their molecular identity and genetic programming. Nat Rev Immunol. 8 (5), 337-348 (2008).
  3. Patel, D. D., Kuchroo, V. K. Th17 cell pathway in human immunity: Lessons from genetics and therapeutic interventions. Immunity. 43 (6), 1040-1051 (2015).
  4. Ghoreschi, K., et al. Generation of pathogenic Th17 cells in the absence of TGF-β signalling. Nature. 467 (7318), 967-U144 (2010).
  5. Lee, Y., et al. Induction and molecular signature of pathogenic th17 cells. Nat Immunol. 13 (10), 991-999 (2012).
  6. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
  7. Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nat Protoc. 9 (8), 1956-1968 (2014).
  8. Doench, J. G., et al. Optimized sgrna design to maximize activity and minimize off-target effects of crispr-cas9. Nat Biotechnol. 34 (2), 184-191 (2016).
  9. Holst, J., et al. Generation of t-cell receptor retrogenic mice. Nat Protoc. 1 (1), 406-417 (2006).
  10. Ordonez, P., Bishop, K. N., Stoye, J. P., Groom, H. C. T. Analysis of SAMHD1 restriction by flow cytometry in human myeloid U937 cells. J Vis Exp. (172), (2021).
  11. Akcakaya, P., et al. In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations. Nature. 561 (7723), 416-419 (2018).
  12. Bae, S., Park, J., Kim, J. -S. Cas-OFFinder: A fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of cas9 rna-guided endonucleases. Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).
  13. Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. Retroviral transduction of helper T cells as a genetic approach to study mechanisms controlling their differentiation and function. J Vis Exp. (117), e54698(2016).
  14. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).
  15. Cante-Barrett, K., et al. Lentiviral gene transfer into human and murine hematopoietic stem cells: Size matters. BMC Res Notes. 9, 312-312 (2016).
  16. Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells. J Vis Exp. (44), 2307(2010).

Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

Retrovirale TransduktionCD4 T ZellenDurchflusszytometrieIn vitro PolarisationROR Gamma TSingle Guide RNAImmunregulation
Retrovirales CRISPR/Cas9-vermitteltes Gen-Targeting zur Untersuchung der Th17-Differenzierung in vitro
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