Methodenartikel

Integration von Verhaltensbewertung bei Tieren und Convolutional Neural Network zur Untersuchung der Geschmacks-Geruchs-Interaktion zwischen Wasabi und Alkohol

DOI:

10.3791/66981

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16. August 2024

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1State Key Laboratory of Environmental and Biological Analysis, Department of Chemistry, Hong Kong Baptist University, 2Guangdong-Hong Kong-Macao Joint Laboratory for Contaminants Exposure and Health, School of Environmental Science and Engineering, Institute of Environmental Health and Pollution Control, Guangdong University of Technology, 3Guangdong Provincial Key Laboratory of Research and Development of Natural Drugs, and School of Pharmacy, Guangdong Medical University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieser Artikel beschreibt eine Reihe von Methoden zur Messung der Unterdrückungsfähigkeit des Schnupperns von alkoholischen Getränken auf das durch Wasabi ausgelöste Stechen.

Zusammenfassung

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Die handelsüblichen Wasabi-Pasten, die üblicherweise für die Zubereitung von Lebensmitteln verwendet werden, enthalten eine homologe Verbindung von chemosensorischen Isothiocyanaten (ITCs), die beim Verzehr ein irritierendes Gefühl hervorrufen. Die Auswirkungen des Schnupperns von alkoholischen Getränken auf das Gefühl der Wasabi-Schärfe wurden nie untersucht. Während sich die meisten sensorischen Bewertungsstudien auf einzelne Lebensmittel und Getränke getrennt konzentrieren, gibt es einen Mangel an Forschung über die olfaktorische Studie zum Schnüffeln von Alkohol während des Konsums von Wasabi. Hier wird eine Methodik entwickelt, die den Einsatz einer tierischen Verhaltensstudie und eines Convolutional Neural Networks kombiniert, um die Mimik von Mäusen zu analysieren, wenn sie gleichzeitig Alkohol schnuppern und Wasabi konsumieren. Die Ergebnisse zeigen, dass das trainierte und validierte Deep-Learning-Modell 29% der Bilder erkennt, die eine gleichzeitige Behandlung von Wasabi und Alkohol darstellen, die zur Klasse der Wasabi-negativen Alkohol-positiven Gruppe gehören, ohne dass eine vorherige Filterung der Trainingsmaterialien erforderlich ist. Die statistische Analyse der Grimassenskala-Werte, die aus den ausgewählten Videobildern erhalten wurden, zeigt einen signifikanten Unterschied (P < 0,01) zwischen dem Vorhandensein und Fehlen von Alkohol. Dieser Befund deutet darauf hin, dass diätetische alkoholische Getränke einen abnehmenden Effekt auf die Wasabi-ausgelösten Reaktionen bei Mäusen haben könnten. Diese kombinatorische Methodik birgt das Potenzial für das individuelle ITK-Screening von Verbindungen und sensorische Analysen von Spirituosenkomponenten in der Zukunft. Es sind jedoch weitere Studien erforderlich, um den zugrunde liegenden Mechanismus der alkoholinduzierten Unterdrückung der Wasabi-Schärfe zu untersuchen.

Einleitung

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Wasabia japonica, allgemein bekannt als Wasabi, hat sich in der Lebensmittelzubereitung einen Namen gemacht 1,2. Die intensive sensorische Erfahrung, die es beim Verzehr hervorruft, gekennzeichnet durch Tränen, Niesen oder Husten, ist bekannt. Diese ausgeprägte Schärfe von Wasabi kann auf eine homologe Verbindung von chemosensorischen Isothiocyanaten (ITCs) zurückgeführt werden. Es handelt sich um flüchtige schwefelorganische Pflanzenstoffe, die in ω-Alkenyl- und ω-Methylthioalkylisothiocyanate eingeteilt werden können 3. Unter diesen Verbindungen ist Allylisothiocyanat (AITC) das am weitesten verbreitete natürliche ITC-Produkt, das in Pflanzen der Familie der Kreuzblütler wie Meerrettich und Senf vorkommt4. Kommerzielle Wasabi-Pasten werden üblicherweise aus Meerrettich hergestellt, was AITC zu einem chemischen Marker macht, der für die Qualitätskontrolle dieser kommerziellen Produkte verwendet wird5.

Die Kombination von diätetischen alkoholischen Getränken mit Wasabi-infundierten Gerichten kann als Beispiel für kulturelle Disposition angesehen werden6. Subjektiv kann diese Kombination die Schärfe und Schärfe zwischen Wasabi und der Spirituose ergänzen und das kulinarische Gesamterlebnis verbessern. Die qualitative Verhaltensbewertung bei Tieren (QBA) ist ein umfassender methodischer Ansatz für ganze Tiere, der Verhaltensänderungen bei Probanden als Reaktion auf kurz- oder langfristige externe Reize anhand von Zahlenbegriffenuntersucht 7. Diese Methode umfasst Schmerztests, motorische Tests, Lern- und Gedächtnistests sowie Emotionstests, die speziell für Nagetiermodelle entwickelt wurden8. Studien, die sich mit der synergistischen sensorischen Bewertung von Trieb und Geruchssinn beschäftigen, sind in der Literatur jedoch bisher rargesät 9,10. Die meisten Studien zur chemischen Empfindung beschränken sich darauf, den individuellen Konsum von Lebensmitteln und Getränken getrennt zu untersuchen11. Folglich gibt es einen Mangel an Forschung über die Geschmacks-Geruchs-Wechselwirkung, die mit dem Schnüffeln von Alkohol während des Konsums von Wasabi verbunden ist.

Da angenommen wird, dass das Wasabi-induzierte Stechen eine Form der Nozizeption ist12, eignen sich Verhaltensbewertungen bei Tieren gut zur Bewertung der nozizeptiven sensorischen Reaktionen bei Nagetieren 8,13,14. Eine Methode zur Bewertung der Nozizeption bei Mäusen, die als Maus-Grimasse-Skala (MGS) bekannt ist, wurde von Langford et al.15,16 entwickelt. Bei dieser Verhaltensstudienmethode handelt es sich um einen schmerzbezogenen Bewertungsansatz, der sich auf die Analyse der Gesichtsausdrücke der Versuchsmäuse stützt. Der Versuchsaufbau ist einfach und umfasst einen transparenten Käfig und 2 Kameras für die Videoaufzeichnung. Durch die Einbeziehung fortschrittlicher Technologien 17,18,19 zur automatischen Datenerfassung können quantitative und qualitative Verhaltensmessungen erhalten werden, die den Tierschutz während der Verhaltensüberwachung verbessern 20. Folglich hat das MGS das Potenzial, die Auswirkungen verschiedener äußerer Reize auf Tiere ununterbrochen und ad libitum zu untersuchen. Der Bewertungsprozess umfasst jedoch nur die Auswahl einiger weniger (weniger als 10) Videobildbilder für die Bewertung durch die Diskussionsteilnehmer, und eine vorherige Schulung ist erforderlich. Das Scoring einer großen Anzahl von Beispielbildern kann arbeitsintensiv sein. Um diese zeitaufwändige Herausforderung zu meistern, haben mehrere Studien Techniken des maschinellen Lernens zur Vorhersage des MGS-Wertseingesetzt 21,22. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass es sich bei der MGS um eine kontinuierliche Messung handelt. Daher wäre ein Mehrklassen-Klassifikationsmodell besser geeignet, um ein logisches und kategorisches Problem zu bewerten, wie z. B. die Bestimmung, ob die Bilder von Mäusen, die gleichzeitig Wasabi einnehmen und Alkohol schnüffeln, denen normaler Mäuse ähneln.

In dieser Studie wurde eine Methodik zur Untersuchung der Geschmacks-Geruchs-Interaktion bei Mäusen vorgeschlagen. Diese Methodik kombiniert Verhaltensstudien von Tieren mit einem Convolutional Neural Network (CNN), um die Gesichtsausdrücke der Probanden zu analysieren. Zwei Mäuse wurden dreimal unter normalen Verhaltensbedingungen beobachtet, während der Erfahrung einer Wasabi-induzierten Nozizeption und beim Schnüffeln von Alkohol in einem speziell entwickelten Käfig. Die Gesichtsausdrücke der Mäuse wurden auf Video aufgezeichnet und die generierten Rahmenbilder wurden verwendet, um die Architektur eines Deep-Learning-Modells (DL) zu optimieren. Das Modell wurde dann anhand eines unabhängigen Bilddatensatzes validiert und zur Klassifizierung der von der experimentellen Gruppe aufgenommenen Bilder eingesetzt. Um das Ausmaß der Wasabi-Schärfeunterdrückung zu bestimmen, wenn die Mäuse während des Wasabi-Konsums gleichzeitig Alkohol schnüffelten, wurden die von der künstlichen Intelligenz gewonnenen Erkenntnisse durch eine Kreuzvalidierung mit einer anderen Datenanalysemethode, der MGS-Punktzahlvon 16, weiter bestätigt.

Protokoll

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In dieser Studie wurden zwei 7 Wochen alte männliche ICR-Mäuse mit einem Gewicht zwischen 17 und 25 g für die Verhaltensbewertung der Tiere verwendet. Alle Unterbringungs- und Versuchsverfahren wurden vom Komitee der Hong Kong Baptist University für die Verwendung von menschlichen und tierischen Probanden in Lehre und Forschung genehmigt. Der Tierraum wurde bei einer Temperatur von 25 °C und einer Raumfeuchtigkeit von 40%-70% in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus gehalten.

1. Käfig-Design

  1. Bereiten Sie Acrylnitril-Butadien-Styrolsteine in 3 verschiedenen Abmessungen für den Käfigbau vor: 8 mm x 8 mm x 2 mm, 16 mm x 16 mm x 6 mm und 32 mm x 16 mm x 6 mm.
  2. Bereiten Sie eine Acrylnitril-Butadien-Styrolplatte (312 mm x 147 mm x 2 mm) als Käfigboden vor.
  3. Bereiten Sie eine 239 mm x 107 mm große undurchsichtige Acrylplatte mit einer Dicke von 2 mm vor, die als Bodenplatte verwendet werden soll.
  4. Bereiten Sie eine transparente Acrylplatte von 239 mm x 107 mm mit einer Dicke von 5 mm vor, die als Deckplatte verwendet werden soll.
  5. Bereiten Sie eine transparente Acrylplatte von 107 mm x 50 mm mit einer Dicke von 7 mm vor, die als Anschlussplatte verwendet werden soll.
  6. Konstruieren Sie 2 undurchsichtige Seitenwände, indem Sie die Ziegel bis zu einer Höhe von 54 mm stapeln.
  7. Betten Sie die Acrylplatten in den Käfig auf Acrylnitril-Butadien-Styrolbasis ein, wie in Abbildung 1A dargestellt.
  8. Bereiten Sie eine Chows-Kammer vor, die aus fünf 90 mm x 50 mm großen transparenten Acrylplatten mit einer Dicke von 2 mm besteht, wie in Abbildung 1B dargestellt. Verwenden Sie unter den 5 transparenten Acrylplatten 2 Platten für die Seiten, 1 Platte für die Oberseite, 1 Platte für die Unterseite und 1 Platte für den Anschluss.
  9. Bereiten Sie eine 60 mm x 50 mm x 2 mm große transparente Acrylplatte als Chow-Einführungsplatte vor und legen Sie sie in die Kammer des Chows.

2. Bewertung des Verhaltens von Tieren

  1. Die Wurfgeschwister von 2 7 Wochen alten männlichen ICR-Mäusen leben zusammen in einem regulären Käfig.
  2. Geben Sie den Wurfgeschwistern von 2 Mäusen für eine 1-wöchige Eingewöhnungsphase freien Zugang zu Futterpellets und Leitungswasser.
  3. Nach 1 Woche die Wurfgeschwister von 2 Mäusen mit einer Flasche Ethanol (~40% v/v) einführen.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sie das bereitgestellte wässrige Ethanol nur ad libitum schnüffeln oder inhalieren dürfen, während der Alkoholkonsum eingeschränkt ist.
  4. Führen Sie Verhaltensexperimente mit dem 9 bis 10 Wochen alten Mausmodell und dem transparenten Liegeboxenkäfig durch, der in Abbildung 1A dargestellt ist.
  5. Zerlegen Sie alle Acrylplatten und Acrylnitril-Butadien-Styrolplatten und reinigen Sie sie gründlich. Spülen Sie sie zunächst mindestens 3 Mal mit Reinstwasser ab und trocknen Sie sie dann mit Küchenpapier ab. Besprühen Sie sie anschließend mit 75 % Ethanol und reinigen Sie sie anschließend mit Linsenpapier. Zum Schluss mindestens 15 Minuten an der Luft trocknen lassen.
  6. Wiegen Sie die Mäuse und notieren Sie ihr Körpergewicht vor jeder Wiederholung des Verhaltensexperiments.
  7. Bereiten Sie eine Mischung aus Wasabi und Erdnussbutter frisch zu, indem Sie 1 g handelsübliche Wasabi und 4,5 g Erdnussbutter abwiegen. Mischen Sie sie in einem Plastikbeutel mit Reißverschluss.
    HINWEIS: Aufgrund der Flüchtigkeit der Isothiocyanate im Wasabi ist es wichtig, den handelsüblichen Wasabi in einem -20 °C Gefrierschrank zu lagern.
  8. Wiegen Sie und geben Sie entweder zwei 0,5 g Pasten Erdnussbutter oder eine Mischung aus Wasabi und Erdnussbutter auf die Einführungsplatte, wie in Abbildung 1B, C dargestellt.
  9. Platzieren Sie die vorbereitete Chow-Einführungsplatte in der Kammer der Chows, wie in Abbildung 1B, C dargestellt, um den 2 Mäusen während jeder Videoaufzeichnungssitzung ad libitum Zugang zu Nahrung zu ermöglichen.
  10. Füllen Sie die darunter liegende Rille mit 30 mL Flüssigkeit, entweder reinem Wasser oder Liquor (~42 % v/v Ethanol), um die gleichzeitige Inhalation zu erleichtern, wie in Abbildung 1B, C gezeigt.
  11. Beginnen Sie die Aufnahme mit den Kameras von 2 Smartphones, die auf den Telefonständern an jedem Terminal platziert sind.
    HINWEIS: Die Spezifikationen der Videos lauten wie folgt: Bildbreite, 1920; Rahmenhöhe, 1080; Datenrate, 20745 kbit/s; Bildrate, 30,00 Bilder pro Sekunde (fps).
  12. Setzen Sie die 2 trainierten Wurfgeschwister von Mäusen vorsichtig von oben in die entworfene Plattform für Tierverhaltensstudien ein und sichern Sie den Käfig umgehend mit der oberen Platte.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass dieser Schritt innerhalb von 15 s abgeschlossen ist.
  13. Nehmen Sie jedes Video 2-3 Minuten lang auf.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die gesamte Dauer des Experiments, von der Zubereitung der Erdnussbutter-Wasabi-Mischung bis zum Abschluss der Videoaufzeichnung, auf 5 Minuten begrenzt ist.
  14. Wiederholen Sie das gesamte Experiment 3 Mal.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass jede Wiederholung des Experiments mindestens 6 Stunden lang getrennt ist.
  15. Ahmen Sie verschiedene Szenarien nach.
    HINWEIS: Zum Beispiel wurde in dieser Arbeit ein Paar Mäuse in 4 Gruppen mit 4 verschiedenen Szenarien verwendet, die unter Verwendung der oben beschriebenen Versuchsumgebung nachgeahmt wurden. Zu diesen Szenarien gehören Szenario A für die Hintergrundstudie, Szenario B für die Positivkontrollstudie, Szenario C für die Geschmacks-Geruchs-Interaktionsstudie zwischen Wasabi und Alkohol und Szenario D für die Negativkontrollstudie. Tabelle 1 enthält eine Zusammenfassung dieser Szenarien.

3. Bilderkennung

Ähnlich wie bei vielen Studien zur Bildverarbeitung 23,24,25 wurde ein Klassifikationsmodell durch das Training eines CNN erreicht. Das Skript für DL-Operationen wurde in Python v.3.10 auf Jupyter Notebook (anaconda3) geschrieben. Es ist im folgenden GitHub-Repository verfügbar: git@github.com:TommyNHL/imageRecognitionJove.git. Um das CNN zu erstellen und zu trainieren, wurden Open-Source-Bibliotheken verwendet, darunter numpy v.1.21.5, seaborn v.0.11.2, matplotlib v.3.5.2, cv2 v.4.6.0, sklearn v.1.0.2, tensorflow v.2.11.0 und keras v.2.11.0. Diese Bibliotheken stellten die notwendigen Werkzeuge und Funktionen bereit, um CNN für die Bilderkennung zu entwickeln und zu trainieren.

  1. Exportieren Sie eine Reihe von Videoframebildern aus den gesammelten Videoclips, um mithilfe des bereitgestellten Jupyter Notebook mit dem Namen Step1_ExtractingAndSavingVideoFrameImages.ipynb ein Dataset für das Modelltraining zu generieren.
  2. Wählen Sie die Bilder nur mit mindestens 1 Maus aus, die die bereitgestellte Paste verwendet. Beispiele für die ausgewählten Bilder finden Sie in der ergänzenden Abbildung 1, der ergänzenden Abbildung 2, der ergänzenden Abbildung 3, der ergänzenden Abbildung 4, der ergänzenden Abbildung 5, der ergänzenden Abbildung 6 und der ergänzenden Abbildung 7.
  3. Führen Sie eine Datenerweiterung durch, indem Sie die generierten Bilder horizontal spiegeln, indem Sie das im Jupyter Notebook bereitgestellte Skript mit dem Namen Step2_DataAugmentation.ipynb implementieren.
  4. Reservieren Sie die Bilddaten von jedem zweiten Replikat für die externe, unabhängige CNN-Modellvalidierung. Verwenden Sie die Bilder von jeder ersten und dritten Replizierung für internes Modelltraining und Tests.
  5. Verarbeiten Sie die in der CNN-Modellierung verwendeten Bilddaten vor, indem Sie das Skript im Jupyter Notebook mit dem Namen Step3_CNNmodeling_TrainTest.ipynb ausführen, einschließlich Bildgrößenänderung, Schwarztonkonvertierung und Normalisierung des Bildsignals.
  6. Teilen Sie die Schulungsunterlagen nach dem Zufallsprinzip in interne Schulungs- und Testdatensätze im Verhältnis 8:2 auf.
  7. Initialisieren Sie die Architektur für CNN. Entwerfen Sie die Anzahl der Ausgaben von CNN basierend auf der Anzahl der zu untersuchenden Szenarien.
    HINWEIS: In dieser Studie wurde beispielsweise das neuronale Netz zur Klassifizierung von 3 Klassen bestimmt. Stellen Sie sicher, dass das Skript für die Behandlung von Datenungleichgewichten bei der Klassengewichtung kompiliert ist.
  8. Finden Sie die Hyperparameterkombination, die bei den internen Testmustern für die CNN-Konstruktion zu minimalen Verlusten führt.
  9. Nehmen Sie die optimale Hyperparameterkombination für die Erstellung der CNN-Architektur an.
  10. Öffnen Sie die bereitgestellten Jupyter Notebooks-Step4_CNNmodel_ExternalValOriginal.ipynb und Step5_CNNmodel_ExternalValFlipped.ipynb. Validieren Sie das erhaltene Modell anhand der unabhängigen (ursprünglichen und gespiegelten) Bilder aus der zweiten Replik des Tierverhaltensexperiments.
  11. Stellen Sie das erreichte und validierte Modell zum Klassifizieren der Videoframebilder bereit, die aus der experimentellen Gruppe mit Jupyter Notebook Step6_CNNmodel_Application.ipynb generiert wurden.
    HINWEIS: Zum Beispiel ist es Szenario C in dieser Arbeit.

4. Manuelle Bewertung der Maus-Grimasse-Skala

HINWEIS: Um die Erkenntnisse aus der Vorhersage des CNN-Modells zu validieren, wurde eine andere Methode angewendet, die zuvor von Langford et al. entwickelt und validiert wurde16. Bei dieser Methode wird das MGS basierend auf den 5 spezifischen Maus-Gesichtsaktionseinheiten (AUs) bewertet: Orbitastraffung, Nasenwölbung, Wangenwölbung, nach außen zusammenziehende Ohren und Schnurrhaarveränderung. Jeder AU wird eine Punktzahl von 0, 1 oder 2 zugewiesen, die das Fehlen, das mäßige Vorhandensein bzw. das offensichtliche Vorhandensein des AU angibt. Dieses Bewertungssystem ermöglicht die Quantifizierung und Skalierung jeder AU, um das Ausmaß der Nozizeption oder des Unbehagens der Mäuse zu bewerten.

  1. Nehmen Sie 3 Videobilder auf, auf denen die Wurfgeschwister die Paste für jeden Videoclip aufnehmen. Stellen Sie sicher, dass jedes Bild mindestens 3 Sekunden voneinander entfernt ist.
  2. Blinden Sie Code und ordnen Sie Bilder aus verschiedenen Klassen von Szenarien nacheinander nach dem Zufallsprinzip neu an, indem Sie die bereitgestellte Vorlagendatei mit dem Namen "shuffleSlides.pptm" (Ergänzende Datei 1) verwenden und den eingebetteten Makrocode ausführen.
  3. Laden Sie mindestens 10 Diskussionsteilnehmer ein, die Beispielbilder zu bewerten.
  4. Trainieren Sie die Diskussionsteilnehmer darin, Bildbeispiele mit dem MGS zu bewerten. Stellen Sie den Diskussionsteilnehmern Schulungsmaterialien zur Verfügung, die den Originalartikel über MGS und sein Handbuch enthalten15,16.
  5. Berechnen Sie den MGS-Score jedes Tieres in einem aufgenommenen Frame, indem Sie alle Score-Punkte der entsprechenden 5 Gesichts-AUs mitteln. Stellen Sie den MGS-Score als Mittelwert ± Standardmessfehler (SEM) dar.
  6. Bestimmen Sie, ob statistisch signifikante Unterschiede zwischen verschiedenen Klassen von Szenarien bestehen, indem Sie eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) mit dem Post-hoc-Test des Mehrfachvergleichs von Bonferroni durchführen.
    HINWEIS: Ein Wert von P < 0,05 gilt als statistisch signifikant.

Ergebnisse

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Das Hauptziel dieser Studie ist es, einen robusten Rahmen für die Untersuchung der Geschmacks-Geruchs-Interaktion bei Mäusen zu schaffen. Dieses Framework beinhaltet den Einsatz von künstlicher Intelligenz und QBA, um ein prädiktives Klassifizierungsmodell zu entwickeln. Darüber hinaus werden die aus DL gewonnenen Erkenntnisse mit einer quantitativen MGS-Bewertung für eine interne unabhängige Analyse kreuzvalidiert. Die primäre Anwendung dieser Methodik besteht darin, das Ausmaß der Unterdrückung der durch Wasabi hervorgerufenen Nozizeption zu untersuchen, wenn Mäuse an diätetischen alkoholischen Getränken schnüffeln.

Erkennung von 29% der Bilder von Wasabi-Alkohol-Co-Behandlungen, die zur Klasse der Wasabi-negativen Alkohol-positiven Gruppe gehören, durch das Deep-Learning-Modell
Eine Überreaktion des Gesichts kann beim Menschen beim kommerziellen Verzehr von Wasabi-Paste auftreten. Eine ähnliche Erfahrung konnte auch bei Mäusen beobachtet werden (Ergänzendes Video 1). Da die sensorische Nozizeption gut mit der Mimik bei Nagetieren korreliert, wurde das Verhalten von 2 Wurfgeschwistern überwacht, um ihre Reaktion zu bestimmen, wenn sie mit Futter versorgt wurden, das kommerziellen Wasabi enthielt oder fehlte. In dieser Studie wurde ein CNN mit DL-Techniken trainiert. Da für jedes Szenario 3 Replikate durchgeführt wurden, wurden die Bildmaterialien aus dem 1. und 3. Replikat für die Optimierung der CNN-Modellhyperparameter und die Modellierung interner Schulungen und Tests verwendet. Die Entwicklung der CNN-Architektur in dieser Studie ist in Tabelle 2 detailliert beschrieben. Die optimierte Architektur des CNN bestand aus einer Eingabeschicht mit einer Auflösung von 268 x 268 Pixeln, gefolgt von 4 zweidimensionalen Faltungsschichten mit jeweils 8 Filtern. Zusätzlich wurden 2 Pooling-Schichten, 2 Dropout-Schichten, eine Abflachungsschicht und 2 dichte Schichten für die 3-Klassen-Klassifizierungsaufgabe integriert. Siehe Ergänzende Datei 2 für die CNN-Architektur.

Das Modell in dieser Studie wurde mit einem Datensatz von 35.486 Bildern trainiert und an 8.872 Bildern über 7 Epochen hinweg getestet. Die Leistung des trainierten Modells während des Trainings, einschließlich Metriken wie Verlust, Genauigkeits-Abrufverhältnis, Genauigkeit und Empfindlichkeit (oder Abruf), für die internen Trainings- und Testdatensätze ist in der ergänzenden Abbildung 8A-D zu sehen. Das Modell demonstrierte seine Genauigkeit, Präzision und Sensitivität von 1 sowohl für interne Trainings- als auch für Testsätze. Dies deutet darauf hin, dass die Vorhersagen des Modells mit den tatsächlichen Klassen der Bilder sowohl in internen Trainings- als auch in Testdatasets übereinstimmen. Nach dem Modelltraining wurden die Bilder aus dem 2. Replikat verwendet, um sicherzustellen und unabhängig voneinander zu validieren, dass die Überanpassung für das erreichte CNN-Modell kein Problem darstellte. Das Modell zeigte seine Robustheit der Vorhersage durch die Werte für Genauigkeit, Präzision und Sensitivität von 1 für 4.820 Bilder in der Hintergrundstudie (Szenario A), 3.900 Bilder in der Positivkontrollstudie (Szenario B) und 2.731 Bilder in der Negativkontrollstudie (Szenario D). Das erreichte Vorhersagemodell wurde eingesetzt, um die Videobilder von Mäusen, die Spiritus schnüffeln und Wasabi-haltige Erdnussbutter konsumieren (Szenario C), in verschiedene Studienszenarien zu klassifizieren, d.h. Szenarien A, B und D. Die Ergebnisse zeigen, dass 0 % bzw. 29 % der Bilder in die Klassen Hintergrundstudie (Szenario A, reines Wasser und Wasabi-freie Erdnussbutter vorhanden) bzw. Negativkontrollstudie (Szenario D, chinesische Spirituose und Wasabi-freie Erdnussbutter vorhanden) eingeteilt wurden, während 71 % der Bilder in die Klassen der Positivkontrollgruppe eingestuft wurden (Szenario C, in denen reines Wasser und Wasabi-Erdnussbutter-Mischung vorhanden waren). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Vorhandensein von diätetischem Alkohol die Wasabi-evozierte Nozizeption bei Mäusen reduzieren könnte. Um auszuwerten, was die Maschine aus den bereitgestellten Schulungsmaterialien gelernt hat, wurden für jede Faltungsschicht Feature-Maps erstellt. Wie in der ergänzenden Figur 9A-D dargestellt, wurde beobachtet, dass die Aufmerksamkeit der Maschine auf eine Vielzahl von Gesichtsmerkmalen wie Augenhöhlen, Nase, Wangen- und Körperränder, Ohren und auch auf die Kontaktfläche der Chows gerichtet war. Aufbauend auf diesen Beobachtungen wurde eine weitere Datenanalysemethode, die MGS, durchgeführt. Das MGS konzentriert sich auf die Gesichts-AUs von Mäusen und ermöglicht eine statistische Bewertung und weitere Validierung der Unterdrückungsfähigkeit von alkoholischen Getränken bei Wasabi-induzierter Nozizeption.

Die manuelle Bewertung der Maus-Grimasse-Skala validiert statistisch die Vorhersagen des maschinellen Lernens.
Die Intensität der Wasabi-evozierten Nozizeption wurde anhand des MGS-Scores bewertet, der Werte von 0 bis 2 zuweist, wobei Score 0 für die geringste und Score 2 für die schwerste Reaktion steht. In dieser Studie wurden MGS-Scores von 24 Mäusen (d.h. 2 Mäuse wurden in den 12 ausgewählten Bildern als Ergänzende Abbildung 10, Ergänzende Abbildung 11, Ergänzende Abbildung 12, Ergänzende Abbildung 13 gezeigt) von 22 geschulten Panelisten bewertet. Die Analyse des Wurfgeschwisters von 2 Mäusen mit dreifachen Experimenten zeigte, dass die Intra-Batch-Präzisionen und die Inter-Batch-Präzisionen eine relative Standardableitung von 0 % bis 25 % bzw. 9 % bis 33 % aufwiesen. Dies deutet auf eine gute Präzision und Konsistenz im MGS-Scoring-Prozess hin. Es wurde ein signifikanter Unterschied zwischen den MGS-Werten der Mäuse beobachtet, denen eine Paste aus Erdnussbutter verabreicht wurde (Abbildung 3A, 0,73 ± 0,04) und denen, die eine Mischung aus Wasabi und Erdnussbutter erhielten (Abbildung 3B, 1,59 ± 0,11). Dies bestätigt den Versuchsaufbau für die tierexperimentelle Verhaltensstudie und bestätigt die Wirksamkeit von Wasabi bei der Induktion nozizeptiver Reaktionen. Obwohl der Alkoholdampf, der aus dem darunter bereitgestellten alkoholischen Getränk freigesetzt wird (~42% v/v Alkohol), reizend sein könnte, zeigte der MGS-Score (Abbildung 3D, 0,86 ± 0,16) keinen signifikanten Unterschied im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abbildung 3A, 0,73 ± 0,04). Es wurde jedoch ein signifikanter Unterschied zwischen den MGS-Werten von Mäusen beobachtet, denen die Wasabi-Erdnussbutter-Mischung verabreicht wurde (Abbildung 3B, 1,59 ± 0,11) und denen, die während des Wasabi-Konsums Alkoholdampf ausgesetzt waren (Abbildung 3C, 0,95 ± 0,07) mit einem P-Wert von <0,05. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die gleichzeitige Anwendung von Wasabi und alkoholischen Getränken die Wasabi-induzierte Irritation möglicherweise verringern könnte, was mit der Perspektive der künstlichen Intelligenz übereinstimmt. Weitere Untersuchungen sind gerechtfertigt, um den wirksamen Inhaltsstoff in der bereitgestellten chinesischen Spirituose zu untersuchen, der zur Unterdrückung der Schärfe von Wasabi beiträgt, was wahrscheinlich auf das Vorhandensein von Ethanol zurückzuführen ist.

Beispiel für Code, der bereits verfügbar ist. Der gesamte Code zum Durchführen der Bilderkennung, der mit der aktuellen Übermittlung verknüpft ist, ist in einem öffentlichen GitHub-Repository verfügbar: git@github.com:TommyNHL/imageRecognitionJove.git. Alle Aktualisierungen werden auch im GitHub Repository mit einem Zitat des endgültigen DOI dieser Arbeit veröffentlicht.

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Abbildung 1: Versuchsaufbau für die schmerzbezogene Verhaltensstudie an Tieren. (A) Der gesamte Aufbau für die Videoaufzeichnung der Gesichtsausdrücke von 2 Mäusen mit Hilfe der Kameras von 2 Smartphones, die auf dem Telefon platziert sind, steht an jedem Terminal. (B) Die Kammer der Chows, in der zwei 0,5 g Pasten Erdnussbutter oder eine Mischung aus Wasabi und Erdnussbutter an 2 Mäuse ad libitum verabreicht wurden, und 30 ml Flüssigkeit (Wasser oder ~42 % v/v Likör) wurden in die Rille unter den Pasten für die gleichzeitige Inhalation gefüllt. (C) Ein genauerer Blick auf die Rille, die mit 30 mL Flüssigkeit gefüllt war und 2 Pasten Wasabi-Erdnussbutter-Mischung enthielt. Die Mischung wurde hergestellt, indem 1 g handelsüblicher Wasabi mit 4,5 g Erdnussbutter gemischt wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Die Architektur des Convolutional Neural Network-Modells und seine Ein- und Ausgabe. Für das Training wurden Bilder aus 3 verschiedenen Szenarien verwendet, darunter Szenario A für die Hintergrundstudie, Szenario B für die Positiv-Kontroll-Studie und Szenario D für die Negativ-Kontroll-Studie. Die Bilder von Szenario C für die Wasabi-Alkohol-Geschmacks-Geruchs-Interaktionsstudie wurden nach dem Modelltraining in die Szenarien A, B oder D eingeteilt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Die Maus-Grimasse-Skala (MGS) der Mäuse, denen unterschiedliche Chows zur Verfügung gestellt wurden. Der MGS-Score liegt zwischen 0 und 2, wobei der Score 0 für den geringsten und der Score 2 für den schwersten Wert steht. Die Referenz-MGS-Skala wurde von Langford et al. (2010)16 übernommen. Die Grimasse von Mäusen, denen (A) Erdnussbutter zum Verzehr zur Verfügung gestellt wurde, erzielte 0,73 ± 0,04; (B) eine Mischung aus Wasabi und Erdnussbutter (1 g handelsüblicher Wasabi in 4,5 g Erdnussbutter) zur Einnahme erzielte 1,59 ± 0,11; (C) eine Mischung aus Wasabi und Erdnussbutter zum Einnehmen, während die Inhalation von Alkohol aus dem darunter bereitgestellten Alkohol (~42% v/v Alkohol) verfügbar war, erzielte 0,95 ± 0,07; (D) Erdnussbutter zum Verzehr während der Inhalation von Alkohol aus der unten angegebenen Spirituose erzielte einen Wert von 0,86 ± 0,16. *, P < 0,05; **, P < 0,01; ns, kein signifikanter Unterschied über eine unidirektionale Varianzanalyse mit dem Mehrfachvergleichs-Post-hoc-Test von Bonferroni unter einem Konfidenzintervall von 95 %. Fehlerbalken stellten den Standardmessfehler (SEM) dar. Dreifache Messungen wurden an 2 Mäusen in jedem Szenario durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Zusammenfassung der vier Szenarien, die in der Verhaltensbewertung von Tieren nachgeahmt wurden. Anmerkungen: a Die Mischung wurde hergestellt, indem 1 g handelsüblicher Wasabi mit 4,5 g Erdnussbutter gemischt wurde. b Chinesische Spirituose, die ~42% v/v Alkohol enthält. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Zusammenfassung der Modellleistung. Die Hyperparameter einer Batchgröße von 64, die Filternummer der 1. 2D-Faltungsschicht von 8 ohne folgenden Dropout, die Filternummer der 2. 2D-Faltungsschicht von 8, die Filternummer der 3. 2D-Faltungsschicht von 8 mit 0,1 Dropout, die Filternummer der 4. 2D-Faltungsschicht von 8, und die Filterzahl der dichten Schicht von 64 mit 0,5 Dropout ergab den geringsten Verlust für das interne Split-Testset. Diese Hyperparameter wurden dann verwendet, um ein 3-Gruppen-Klassifikationsmodell (Szenario A, B und D) zur Vorhersage der Bilder von Szenario C zu trainieren. Szenario A war für die Hintergrundstudie. Szenario B galt für die Positiv-Kontroll-Studie. Szenario D bezog sich auf die Negativkontrollstudie. Szenario C bezog sich auf die Wasabi-Alkohol-Geschmacks-Geruchs-Interaktionsstudie. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 1: Beispielhafte Trainingsmaterialien für Deep Learning der Klasse von Szenario A (Hintergrundstudie). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Beispielhafte Trainingsmaterialien für Deep Learning der Klasse von Szenario B (Positiv-Kontroll-Studie). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Beispielhafte Trainingsmaterialien für Deep Learning der Klasse von Szenario D (Negativ-Kontroll-Studie). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 4: Vorhersagen und beispielhaftes unabhängiges Material der Klasse des Szenarios A (Hintergrundstudie) zur Modellvalidierung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 5: Vorhersagen und beispielhaftes unabhängiges Material der Klasse des Szenarios B (Positiv-Kontroll-Studie) zur Modellvalidierung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 6: Vorhersagen und beispielhafte unabhängige Materialien der Klasse des Szenarios D (Negativkontrollstudie) zur Modellvalidierung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 7: Vorhersagen und Beispielmaterialien der Klasse des Szenarios C (Wasabi-Alkohol-Geschmacks-Geruchs-Interaktionsstudie) für die Modellanwendung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 8: Vorhersageleistung des optimalen Deep-Learning-Modells. (A) Ausbildungsverlust und Verlust der internen Validierung entlang von 7 Epochen; (B) Präzisions-Abrufkurven, (C) Präzision und (D) Abruf von Training und interner Validierung entlang von 7 Epochen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 9: Merkmalskarten der einzelnen Faltungsschichten. Feature-Karten der (A) ersten, (B) zweiten, (C) dritten und (D) letzten Faltungsschicht in den Szenarien A, B und D, sortiert von oben nach unten. Szenario A war für die Hintergrundstudie. Szenario B galt für die Positiv-Kontroll-Studie. Szenario D bezog sich auf die Negativkontrollstudie. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 10: Ausgewählte Bilder für die manuelle Bewertung der Mausgrimasse-Skala für Szenario A (Hintergrundstudie). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 11: Ausgewählte Bilder für die manuelle Bewertung der Maus-Grimasse-Skala für Szenario B (Positiv-Kontroll-Studie). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 12: Ausgewählte Bilder für die manuelle Bewertung der Maus-Grimasse-Skala für Szenario C (Wasabi-Alkohol-Geschmacks-Geruchs-Interaktionsstudie). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 13: Ausgewählte Bilder für die manuelle Bewertung der Maus-Grimasse-Skala für Szenario D (Negativ-Kontroll-Studie). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzendes Video 1: Grimassen von Mäusen nach dem Verzehr von Wasabi mit dem Vorhandensein oder Fehlen von darunter bereitgestellten alkoholischen Getränken. Von 0 s bis 8 s zeigte der Videoclip die normalen Gesichtsausdrücke von Mäusen beim Verzehr von Erdnussbutter. Von 8 s bis 17 s zeigte es die Grimassen von Mäusen bei der Einnahme von Wasabi. Die Mäuse zeigten eine Engereizung der Augenhöhle, eine Vorwölbung der Nase, eine Vorwölbung der Wangen, eine Zusammenziehung der Ohren nach außen und eine Veränderung der Schnurrhaare. Von 17 s bis 29 s zeigte sich, dass die Wasabi-induzierte Nozizeption unterdrückt werden konnte, wenn der Geist darunter verfügbar war. Von 29 s bis zum Ende zeigte es eine Ansammlung von Grimassen in verschiedenen Szenarien, die oben beschrieben wurden. Bitte beachten Sie, dass das bereitgestellte Video nur zur Veranschaulichung verwendet wird. Seine Qualität unterscheidet sich von der beschriebenen Qualitätsanforderung für die Bilderkennung und -modellierung. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Ergänzende Datei 1: shuffleSlides.pptm. Ergänzende Präsentation mit Makros für Microsoft PowerPoint mit dem Namen "shuffleSlides.pptm". Diese Datei wurde für das Mischen von Bildern für den Blindtest zur Bewertung der Maus-Grimasse-Skala vorbereitet. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 2: Die CNN-Architektur. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

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Die in dieser Arbeit vorgeschlagene Methode zur Untersuchung der Geschmacks-Geruchs-Interaktion basiert auf der ursprünglichen Methode der Verhaltenskodierung für den Gesichtsausdruck von Schmerzen bei Mäusen, die von Langford et al.16 entwickelt wurde. Mehrere kürzlich veröffentlichte Artikel haben CNN für die automatische Mausgesichtsverfolgung und die anschließende MGS-Bewertung von 21,26,27,28 eingeführt. Die Anwendung von CNNs bietet einen Vorteil gegenüber der rein ursprünglichen Methode, da sie für die Generierung einer Reihe von Video-Frame-Bildern gilt, die zum Trainieren eines Vorhersagemodells verwendet werden können. Im Gegensatz dazu wurde bei der ursprünglichen Methode eine begrenzte Anzahl von Bildern für MGS vorausgewählt, was zu Subjektivität und Verzerrung führen kann.

Von den zuvor veröffentlichten CNN-basierten Methoden wurden alle zur Beurteilung des Grades der Belastung oder des Unbehagens bei einer direkten Injektion eines schmerzverursachenden Mittels in den Blutkreislauf entwickelt 26,28. Ein Nachteil dieses Ansatzes zur Einführung von Medikamenten besteht darin, dass ein erheblicher Aufwand erforderlich ist, um Video-Frame-Bilder herauszufiltern, die das Gesichtsprofil der Maus nicht erfassen. In dieser Studie wird das Nozizeptionsmittel kommerzieller Wasabi ad libitum zur Verfügung gestellt. Erdnussbutter maskiert nicht nur den flüchtigen Inhaltsstoff AITC, sondern ist auch in der Lage, Mausmotive anzulocken, um eine klare Geste in der Vorderansicht zu zeigen, was die Erfassung ihrer Gesichtsprofile während der Videoaufnahme erleichtert. Darüber hinaus eliminiert dieser Ansatz mögliche Interferenzen durch Schmerzen, die durch das Einführen der Nadel verursacht werden. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass die Aufnahmebewegung der Mäuse die MGS-Bewertung für Nasenwölbung und Wangenwölbung beeinträchtigen kann. Um dies zu beheben, muss ein Basiskontrollexperiment durchgeführt werden, bei dem die Mäuse mit reiner Erdnussbutter versorgt werden.

In bestimmten CNN-basierten Algorithmen für Verhaltensstudien an Tieren wird nur eine Teilmenge der Gesichtsaktionseinheiten von Mäusen aus Trainingsbildern ausgewählt und so programmiert, dass sie erfasst werdenkann 21,22. Diese Berechnungsmethoden stützen sich auf vordefinierte Merkmale, die mit der Nozizeption verbunden sind, während sie möglicherweise andere wichtige Merkmale vernachlässigen, die für einzelne Mausprobanden spezifisch sind. Infolgedessen kann es zu Informationsverlusten kommen. Im Gegensatz dazu verfolgt diese Studie einen anderen Ansatz, indem sie das gesamte Mausgesichtsbild verwendet, um ein CNN-Modell zu trainieren. Es hat sich gezeigt, dass diese auf der reinen Bildverwendung (IOU) basierende Methode für die Bildklassifizierung effizienter ist25. Daher ähnelt der in der vorliegenden Studie vorgeschlagene CNN-Modellierungsansatz einigen vorgeschlagenen Methoden, die zunächst ein CNN-Modell trainieren, indem das gesamte Bild ohne Bereichsannotation verwendet wird, und dann das Modell durch manuelle menschliche Bewertung validieren27,29. Dieser Ansatz kann dazu führen, dass mehr Informationen in den Bildern erhalten bleiben und die Einführung von Subjektivität verhindert wird.

Eine Einschränkung des Versuchsaufbaus in dieser Arbeit besteht jedoch darin, dass Mausproben als Wurfgeschwister von 2 und nicht in einzelnen Habitaten untergebracht wurden. Diese Entscheidung war beabsichtigt, wenn man bedenkt, dass Mäuse soziale Tiere sind und typischerweise in Gruppen gedeihen. Eine interessante Erkenntnis ist, dass während der Trainingszeit der Tiere nur 2 Wurfgeschwister in 1 von 3 Käfigen trainiert wurden, um an die Anwesenheit des chinesischen Geistes angepasst zu sein. Infolgedessen wurden nur dreifache Experimente ausschließlich an diesen 2 Wurfgeschwistern durchgeführt. Für die Schulungsmaterialien für die CNN-Modellierung wurde auch ein Einzelbild, das beide 2 Wurfgeschwister enthält, als Einzelstichprobe genommen, ohne dass eine Segmentierung durchgeführt wurde. Dieser Ansatz ermöglichte es uns, die Interaktion zwischen den Wurfgeschwistern zu erfassen und ihr Verhalten zusammen mit der Mimik kollektiv zu analysieren.

Ähnlich wie bei der bildbasierten MGS-Scoring-Methode wird erwartet, dass die in dieser Studie vorgeschlagene Methode auf andere Tierarten wie Katzen und Pferde übertragbar ist30,31. Durch die Anwendung der vorgeschlagenen Methodik könnte eine nahrungsinduzierende Methode zur Einführung von Chows unter Anwendung von Computer Vision ein Ansatz zur Erleichterung von Verhaltensstudien bei Tieren sein, insbesondere für die Geschmacks-Geruchs-Interaktion bei verschiedenen Tieren.

Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Z. Cai bedankt sich für die finanzielle Unterstützung durch den Kwok Chung Bo Fun Charitable Fund für die Einrichtung des Kwok Yat Wai Stiftungslehrstuhls für Umwelt- und biologische Analyse.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Absolutes Ethanol (EtOH)VWR Chemicals BDHCAS# 64-17-5
Acrylnitril-Butadien-Styrol-SteineJiahuifeng Flagship Storehttps://shop.paizi10.com/jiahuifeng/chanpin.html
Acrylnitril-Butadien-StyrolplattenJiahuifeng Flagship Storehttps://shop.paizi10.com/jiahuifeng/chanpin.html
Allylisothiocyanat (AITC)Sigma-AldrichCAS# 57-06-7
Wasserfreies DimethylsulfoxidSigma-AldrichCAS# 67-68-5
Chinesische SpirituoseYanghe Qingcihttps://www.chinayanghe.com/article/45551.html
Kommerzieller WasabiS& B FOODS INC.
Ameisensäure (FA)VWR Chemicals BDHCAS# 64-18-6
GraphPad Prism 5GraphPadhttps://www.graphpad.com
Acetonitril in HPLC-Qualität (ACN)VWR Chemicals BDHCAS# 75-05-8
Methanol in HPLC-Qualität (MeOH)VWR Chemicals BDHCAS# 67-56-1
Microsoft Excel 2016Microsofthttps://www.microsoft.com 
Microsoft PowerPoint 2016Microsofthttps://www.microsoft.com
Milli-Q WassersystemMilliporehttps://www.merckmillipore.com
Maus: ICRLaboratory Animal Services Centre (The Chinese University of Hong Kong, Hong Kong, China)N/A
ErdnussbutterSkippyhttps://www.peanutbutter.com/peanut-butter/creamy
Python v.3.10Python Software Stiftunghttps://www.python.org 
Transparente AcrylplattenTaobao Storehttps://item.taobao.com/item.htm?_u=32l3b7k63381&id=60996545797
0& spm=a1z09.2.0.0.77572e8dFPM
EHU
https://www.sbfoods-worldwide.com

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