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Embryotransfer-Operation mittels Laparotomie bei Jungsauen

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DOI:

10.3791/66984

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18. Oktober 2024

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1Centro de Estudos sobre o Genoma Humano e Células-Tronco, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo, 2Instituto do Coração (Incor), Hospital das Clínicas HCFMUSP, Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, 3Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung der chirurgischen Technik, die beim Transfer von geklonten Schweineembryonen mittels Laparotomie bei Jungsauen verwendet wird.

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zielt darauf ab, die chirurgische Technik für den Transfer geklonter Schweineembryonen in den Eileiter zu demonstrieren, eine Methode, die bei der Herstellung von genetisch veränderten Schweinen für die biomedizinische Forschung weit verbreitet ist. Neun Jungsauen wurden einer hormonellen Synchronisation und Laparotomie unterzogen, um geklonte Embryonen, die durch somatischen Zellkerntransfer (SCNT) in Stadien von bis zu 4 Zellen am Tag 2 erzeugt wurden, in den Eileiter zu übertragen. Die Schwangerschaftsdiagnose wurde 30 Tage nach der Transferoperation durch Ultraschalluntersuchung durchgeführt. Sechs der neun operierten Jungsauen zeigten bei der Ultraschalluntersuchung Anzeichen einer Trächtigkeit. Da es jedoch keine Fortschritte in der Entwicklung des Fötus gab, die durch eine Ultraschalluntersuchung beurteilt wurden, wurden die Jungsauen nach 60 Tagen einer Autopsie unterzogen, um biologisches Material zu sammeln und das Fortpflanzungssystem zu beurteilen. Adhäsionen wurden in den Gebärmutterhörnern, Eierstöcken und Eileitern beobachtet. Aus dem Uteruslumen von zwei der euthanasierten Jungsauen wurden eine und vier embryonale Strukturen mit einem Gestationsalter zwischen 12 und 20 Tagen gewonnen. Trotz des Fehlens lebender Ferkel, was wahrscheinlich auf die geringe Effizienz des Transfers von geklonten Schweineembryonen zurückzuführen ist, die von verschiedenen Faktoren, einschließlich der Anzahl und Qualität der übertragenen Embryonen, beeinflusst wird, erwies sich die vorgestellte Operationstechnik als schnell und sicher.

Einleitung

Schweine sind aufgrund ihrer anatomischen, physiologischen und genetischen Ähnlichkeiten mit dem Menschen ein hervorragendes experimentelles Modell für die biomedizinische Forschung1. Diese Tiere wurden häufig in der Forschung im Zusammenhang mit der Xenotransplantation eingesetzt, mit der Absicht, Organe, Zellen oder Gewebe zu produzieren, die bei der Transplantation in den Menschen ein geringes Abstoßungsrisiko aufweisen. Die Xenotransplantationsforschung zielt darauf ab, die Organversorgung für die Transplantation beim Menschen zu erhöhen und so die Warteliste der Patienten zu verkürzen2.

Die Produktion von Schweinen für die Xenotransplantation umfasst mehrere Schritte, einschließlich der Herstellung von Klonen aus genetisch veränderten Schweinezellen. Nach der In-vitro-Produktion von genetisch veränderten geklonten Embryonen werden die Embryonen mit einem synchronisierten Östruszyklus in das Fortpflanzungssystem einer Sau übertragen, um die Uterusphysiologie für die Aufnahme und Trächtigkeit des neuen conceptus3 vorzubereiten.

Der Embryotransfer bei Schweinen kann mit nicht-invasiven oder invasiven Methoden durchgeführt werden4. Zu den nicht-invasiven Methoden gehört der transzervikale Transfer, der keinen chirurgischen Eingriff erfordert. Diese Methode ist jedoch auf den Transfer von Embryonen in späteren Entwicklungsstadien (d. h. Morula- oder Blastozystenstadien) beschränkt und ermöglicht keine genaue Bestimmung der Kathetereinführungsstelle oder der Embryoablagerung5. Laparoskopie und Laparotomie gelten als invasive Methoden des Embryotransfers. Die Laparoskopie ist weniger invasiv, erfordert aber eine spezielle und kostspielige Ausrüstung, und ihre Effizienz variiert erheblich (von weniger als 20 % bis über 80 %), was auf verschiedene Faktoren zurückzuführen ist, wie z. B. die Schwierigkeit bei der Manipulation der Fortpflanzungsstrukturen und die Art des verwendeten Katheters 4,6. Daher ist der Transfer über die Laparoskopie im Vergleich zu chirurgischen Transfermethoden über die Laparotomieimmer noch weniger effizient.

Der Embryotransfer bei Sauen mittels Laparotomie ist ein relativ einfacher und schneller Eingriff, der in der Regel etwa 30 Minuten dauert. Sie sollte jedoch in einem chirurgischen Zentrum durchgeführt werden, das mit einem Inhalationsanästhesiegerät und einem spezialisierten Team ausgestattet ist. Für kommerzielle Schweinestämme (wie z.B. Landrassen, Große Weiße oder deren Kreuzungen) sind aufgrund des hohen Gewichts der Tiere (ca. 130-150 kg) spezielle Geräte wie Hebezeuge zum Heben von Jungsauen und ein breiter, stabiler Operationstisch erforderlich.

Damit die Operation erfolgreich ist, müssen die Embryonen zuvor auf ihr Entwicklungsstadium hin untersucht werden. Es wird empfohlen, Embryonen von bis zu 4 Zellen in die Gebärmutterröhre zu übertragen. Embryonen in Stadien jenseits von 4 Zellen, wie Morulas und Blastozysten, sollten auf das Gebärmutterhorn übertragen werden 7,8.

Obwohl Forschungsgruppen weltweit die Produktion und den chirurgischen Transfer von genetisch veränderten geklonten Schweineembryonen durchführen, gibt es immer noch keine klar definierten Protokolle, die dieses Verfahren durch Videos demonstrieren. Dieser Ansatz ist entscheidend für den Erfolg der Schwangerschaft, da die Technik eine genaue Ablagerung der Embryonen an der genauen Stelle des Eileiters erfordert, was die Lokalisierung des Eileiterostiums und das Einführen der Pipette mit den Embryonen umfasst. Diese Technik kann durch Erklärungsvideos des gesamten Verfahrens besser verstanden werden. Daher zielt dieser Artikel darauf ab, die Laparotomie-Operation für den Transfer geklonter Embryonen in den Eileiter von Jungsauen zu demonstrieren, eine wesentliche Voraussetzung für die zukünftige Produktion von gentechnisch veränderten Schweinen, die für Xenotransplantationen oder andere verwandte Zwecke verwendet werden sollen.

Protokoll

Diese Studie wurde von der Ethikkommission für die Verwendung von Tieren in der Forschung des Instituts für Veterinärmedizin und Tierwissenschaften der Universität von São Paulo, Protokollnummer 6088030523, genehmigt. Neun sieben Monate alte Jungsauen aus der Kernschweinezucht Água Branca in der Stadt Itu im brasilianischen Bundesstaat São Paulo wurden direkt nach dem zweiten Brunstnachweis verwendet9. Die Einzelheiten zu den Reagenzien und der in der Studie verwendeten Ausrüstung sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung der Tiere

  1. Fasten Sie die Tiere 12 Stunden lang und schränken Sie den Wasserzugang für 4 Stunden vor dem chirurgischen Eingriff ein.
  2. Mit einer 40 mm x 12 mm großen Nadel werden 10 mg/kg Ketamin und 0,2 mg/kg Midazolam in dieselbe 50-ml-Spritze entnommen. Befestigen Sie die Spritze an einem Infusionsset, um die Verabreichung von Medikamenten zu erleichtern, einen Sicherheitsabstand zum Tier einzuhalten und ihm freie Bewegung zu ermöglichen.
  3. Verabreichen Sie das präanästhetische Medikament durch intramuskuläre Injektion in den Trapezmuskel, kaudal zum äußeren Gehörgang.
  4. Kanülieren Sie die Ohrvene mit einem 20 G Katheter und verbinden Sie sie mit einem Makrotropf-Verabreichungsset für die intraoperative Flüssigkeitstherapie mit 0,9% NaCl-Lösung in einer Menge von 10 ml/kg/h.
  5. Induzieren Sie die Anästhesie mit 4 mg/kg Propofol intravenös (gemäß den institutionell anerkannten Protokollen).
  6. Führen Sie eine orotracheale Intubation des Tieres mit einem Laryngoskop und einem Orotrachealtubus der Größe 9 mit einer Manschette10 durch.
  7. Halten Sie die Anästhesie mit 1,5 % bis 2 % Isofluran-Inhalation aufrecht. Überwachen Sie zusätzlich die Anästhesie, indem Sie physiologische Parameter wie Herzfrequenz, die zwischen 100 und 120 Schlägen pro Minute gehalten werden sollte, Sauerstoffsättigung, die zwischen 99 % und 100 % gehalten werden sollte, Muskelentspannung, Bewegungsfreiheit und Reflexbewertung bewerten.
    HINWEIS: Die Körpertemperatur sollte ebenfalls überwacht und kontrolliert werden und zwischen 37,5 und 38,5 °C liegen. Bei Bedarf kann zusätzlich zu Isofluran Propofol verwendet werden, um die Kontrolle über die Parameter aufrechtzuerhalten. Fentanylhydrochlorid sollte als Analgetikum in einer Dosis von 0,02 mg/kg alle 20 Minuten verabreicht werden. Alle Parameter sollten alle 5 min aufgezeichnet werden.
  8. Verabreichen Sie die perioperative Analgesie mit einer Einzeldosis von 0,002 mg/kg Fentanyl intravenös und 4 mg/kg Tramadolhydrochlorid intramuskulär in den Gesäß- oder Trapezmuskel.
  9. Platzieren Sie Herzelektroden im Brustbereich zur intraoperativen Überwachung der Herzfrequenz. Zeichnen Sie Herzfrequenz, Rektaltemperatur und Sauerstoffsättigung alle 5 Minuten auf.

2. Chirurgischer Eingriff

  1. Positionieren Sie die Jungsau in dorsaler Liege auf dem Operationstisch.
  2. Decken Sie die Beine des Tieres mit Verfahrenshandschuhen ab, um die Kontamination des Operationsfeldes zu minimieren.
  3. Führen Sie eine ventrale kaudale Bauchhaarentfernung zwischen dem vorletzten Paar Brustdrüsen mit einem chirurgischen Haarschneider durch.
  4. Führen Sie eine präoperative Hautantisepsis mit einer mit Chlorhexidin imprägnierten antiseptischen Bürste durch und führen Sie kreisende Bewegungen von der Nabelnarbenregion bis zum letzten Paar Brustdrüsen aus. Entfernen Sie Chlorhexidin mit einer sauberen, angefeuchteten Kompresse.
  5. Stellen Sie sicher, dass der Chirurg und der Assistent eine chirurgische Antisepsis durchführen und sterile OP-Mäntel und Handschuhe für die Operation tragen.
    HINWEIS: Das Tier sollte in einem von der Operationsstelle getrennten Vorbereitungsbereich auf die Operation vorbereitet werden.
  6. Bereiten Sie den Operationstisch mit den entsprechenden und zuvor sterilisierten Instrumenten vor, die in der Materialtabelle aufgeführt sind.
  7. Führen Sie die abschließende Antisepsis im Operationsfeld mit steriler Gaze und Chlorhexidin-Antiseptikum durch und reinigen Sie die Region in einem Fischgrätenmuster, beginnend an der Inzisionsstelle und lateral expandierend.
  8. Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal mit dem Antiseptikum Chlorhexidin und wiederholen Sie dann den Vorgang mit alkoholischem Chlorhexidin.
  9. Decken Sie das Tier vollständig mit einem sterilen OP-Tuch ab und schaffen Sie mit einer Schere eine rechteckige Öffnung in das OP-Tuch, ca. 10 x 20 cm², wenn das Tuch nicht gefenstert ist.
  10. Positionieren Sie das OP-Tuch über dem vorletzten Paar der Leistendrüsen. Platzieren Sie 4 Backhaus-Klemmen, um das OP-Tuch über der Haut des Tieres zu befestigen.
  11. Mit einem Skalpell die Haut einschneiden und einen etwa 10 cm langen Schnitt machen.
  12. Erreichen Sie die Blutstillung der subkutanen Gefäße mit einer hämostatischen Pinzette und/oder resorbierbarem Nahtmaterial Größe 2.
  13. Präparieren Sie das Unterhautgewebe mit den Fingern oder mit Hilfe einer fein spitzen Schere und vertiefen Sie den Schnitt bis zur Linea alba in der Bauchmuskulatur.
    HINWEIS: Palpieren Sie die Mittellinie des Bauches, um die Linea alba als einen steiferen und faserigeren Bereich zu empfinden; Beobachten Sie die Trennung der Musculus rectus abdominis und notieren Sie die Veränderung der Gewebekonsistenz während der Präparation, um die Linea alba genau zu identifizieren11.
  14. Fassen Sie mit einer Allis-Pinzette die Muskulatur und heben Sie sie an, um mit einem Skalpell einen Stichschnitt in die Linea alba zu machen.
  15. Führen Sie den Zeigefinger in den Schnitt ein, um das Vorhandensein von Adhäsionen zu beurteilen. Verlängern Sie den Schnitt über die Linea alba kaudal und kranial mit einer stumpfen/stumpfen oder feinen/stumpfen Schere vorsichtig, um Verletzungen anderer Organe und darunter liegender Strukturen zu vermeiden.
  16. Machen Sie einen Schnitt von ausreichender Länge, so dass die eine Hand des Chirurgen in die Bauchhöhle eingeführt werden kann, um die Gebärmutterhörner und/oder Eierstöcke zu lokalisieren und nach außen zu entfernen. Ein Gosset-Retraktor kann verwendet werden, um den Eintritt in die Bauchhöhle und das Nähen der Muskulatur in einer einzigen Schicht am Ende des Eingriffs zu erleichtern.
  17. Wenn sich eines der Gebärmutterhörner vor den Eierstöcken befindet, folgen Sie ihm vorsichtig bis zur Spitze des Gebärmutterhorns und des ipsilateralen Eierstocks. Beurteilen Sie während dieses Eingriffs das Vorhandensein von Flüssigkeit in der Gebärmutter, die die Schwangerschaft beeinträchtigen kann.
  18. Nachdem Sie den Eierstock lokalisiert haben, ziehen Sie vorsichtig daran und legen Sie ihn vorsichtig frei. Beurteilen Sie das Vorhandensein von präovulatorischen Follikeln, hämorrhagischen Corpora lutea, zyklischen Corpora lutea und Corpus albicans, um zu beurteilen, ob die Synchronisation der Jungsau wie erwartet verläuft.
  19. Entfernen Sie vorsichtig die Fimbrien des Gebärmutterschlauchs, der den Eierstock bedeckt, kehren Sie seine Schleimhaut um und lokalisieren Sie das Ostium des Gebärmutterschlauchs.
    HINWEIS: Wenn der Chirurg Schwierigkeiten hat, das Ostium der Fimbrien zu identifizieren, kann eine Tasche auf der Ampulle des Eileiters mit einer Nahtnadel mit rundem Körper gemacht werden, um Blutgefäße nicht zu punktieren, um den Tomcat-Katheter mit den Embryonen einzuführen.
  20. Führen Sie vorsichtig einen Tomcat-Katheter mit den Embryonen in das Ostium der Fimbrien ein, bis er die Ampullenregion des Uteruskanülenleiters erreicht.
  21. Setzen Sie eine 1-ml-Spritze auf den Tomcat-Katheter, um die embryonalhaltige Flüssigkeit in den Gebärmutterschlauch zu drücken. Bedecken Sie den Eierstock mit den Fimbrien und führen Sie sie in die Bauchhöhle zurück.
  22. Lokalisieren Sie das kontralaterale Uterushorn und den Eierstock und wiederholen Sie die Schritte 2.17-2.21.
  23. Positionieren Sie die Strukturen in der Bauchhöhle neu und fügen Sie 1 l Kochsalzlösung oder erwärmte Ringer-Laktatlösung (39 °C) hinzu, um Adhäsionen zu vermeiden, bevor Sie mit der Bauchmuskelentzündung beginnen.
  24. Die Bauchmuskulatur mit resorbierbarem Nahtmaterial Größe 2 in "X" Maschen (Sultan) unterbrechen.
  25. Nähern Sie sich dem Unterhautgewebe mit einer durchgehenden Matratzennaht mit resorbierbarem Nahtmaterial der Größe 2 an.
  26. Verschließen Sie die Haut mit Nylonnaht der Größe 2 in unterbrochenen einfachen Nähten, chirurgischen Klammern oder Ethyl-Cyanacrylat-Kleber. Bei diesem Verfahren haben wir uns für den Einsatz von Klebstoff entschieden.
  27. Reinigen Sie die Operationswunde mit in Wasserstoffperoxid getränkter Gaze und trocknen Sie sie mit einer Kompresse, um die Fixierung des chirurgischen Klebstoffs auf der Operationswunde zu verbessern. Tragen Sie Rifamycin oder Pearson-Salbe auf, bedecken Sie sie mit Gaze und tragen Sie schließlich chirurgischen Klebstoff auf.
    HINWEIS: Die Wunde sollte 5 Tage lang mit einem Verband verschlossen bleiben.

3. Nachsorge

  1. Untersuchen Sie die Tiere mindestens an den nächsten 3 aufeinanderfolgenden Tagen auf Anzeichen charakteristischer klinischer Schmerzen, gemäß der von Luna et al.12 vorgeschlagenen Skala.
    HINWEIS: Diese Skala basiert auf unterschiedlichen Verhaltensweisen, die Schweine bei unterschiedlichen Schmerzstufen zeigen, wie z. B. Körperhaltung, Interaktion und Interesse an der Umgebung, Aktivität, Appetit und Aufmerksamkeit für den betroffenen Bereich. Die Punktzahl reicht von 0 bis 3, abhängig von der Art des gezeigten Verhaltens, für jeden ausgewerteten Parameter. Am Ende der Bewertung spiegelt die Summe aller Punktzahlen die Intensität des Schmerzes wider, den das Tier erlebt hat, wobei 0 für keinen Schmerz und 18 für sehr starke Schmerzensteht 12.
  2. Verabreichen Sie eine Einzeldosis von 15 mg/kg Amoxicillin und 0,4 mg/kg 2% Meloxicam intramuskulär (im Gesäß- oder Halsmuskel) einmal täglich für 3 Tage als postoperative Versorgung, um Schmerzen, Entzündungsprozesse und Infektionen zu verhindern.
    HINWEIS: Wenn der Schmerzwert auf der verwendeten Schmerzskala gleich oder größer als 6 ist (Wert von 0 bis 18), verabreichen Sie einmal täglich 5.000 mg/Tier Natriumdipyron intramuskulär (im Gesäß- oder Halsmuskel) zusätzlich zu den entzündungshemmenden Mitteln und dem Antibiotikum. Alternativ können Sie eine Analgesie durchführen, wie in den lokalen IACUC-Richtlinien beschrieben.
  3. Entfernen Sie am 6. Tag nach der Operation den chirurgischen Klebstoff für die Wundreinigung mit Gaze, die in 2%iger alkoholischer Chlorhexidinlösung getränkt ist, und tragen Sie die topische Pearson-Salbe bis zum 10. Tag auf, wenn eine Nahtentfernung oder die Entfernung von chirurgischen Klammern, falls verwendet, empfohlen wird.

4. Ultraschalluntersuchung der Schwangerschaft

  1. Führen Sie 30 Tage nach der Embryotransferoperation eine transabdominale Ultraschalluntersuchung der Schwangerschaft mit einem Ultraschallgerät (Frequenzbereich 4,5 bis 8,5 MHz) durch.
  2. Tragen Sie Ultraschallgel auf die Sonde auf und positionieren Sie sie in der Nähe der leistenden Bauchregion, nach medial gerichtet.
    HINWEIS: Die Visualisierung von abgerundeten reflexionsarmen embryonalen Vesikeln aufgrund von Flüssigkeit im Uteruslumen deutet auf eine Schwangerschaft hin. Die Nichtsichtbarkeit von intrauteriner Flüssigkeit oder das Vorhandensein von intrauteriner Flüssigkeit ohne Abgrenzung der embryonalen Vesikel deutet auf das Fehlen einer Schwangerschaft hin.

5. Euthanasie der Tiere

HINWEIS: Euthanasieren Sie die Jungsauen, die bei der sonographischen Untersuchung keine Föten in Größe und Aussehen zeigten, die dem Gestationsalter entsprachen.

  1. Ziehen Sie mit einer 40 mm x 12 mm großen Nadel 15 mg/kg Ketamin und 2 mg/kg Midazolam in dieselbe 50-ml-Spritze auf, die an einem intravenösen Verabreichungsset befestigt ist, und verabreichen Sie es intramuskulär in den Trapezmuskel im zervikalen Bereich kaudal zum äußeren Gehörgang als präanästhetisches Medikament.
  2. Kanülieren Sie die Ohrvene mit einem 20 g Katheter und leiten Sie eine Anästhesie mit 4 mg/kg Propofol intravenös in einem Bolus ein, bis eine Bradykardie auftritt (nach institutionell anerkannten Protokollen).
  3. Verabreichen Sie anschließend 10 bis 20 ml 19,1% Kaliumchlorid intravenös. Bestätigen Sie den Herz-Lungen-Stillstand, indem Sie das Fehlen von Atembewegungen, blasse Schleimhäute, den Verlust des Hornhautreflexes und das Fehlen von Herzschlägen beobachten, indem Sie ein Stethoskop über die Herzregion legen.
  4. Jegliche Art von intrauterinem Inhalt (embryonales Gewebe, Flüssigkeit oder Schleimsekrete) von sezierten Weibchen13 zu sammeln und zur mikrobiologischen Analyse zum Nachweis möglicher Krankheitserreger und auch zur genotypischen Charakterisierung der Klone (falls erforderlich) weiterzuleiten. Überprüfen Sie visuell das Vorhandensein oder Fehlen von Corpora lutea, Ovarialzysten, abnormalen Sekreten und das Auftreten von Adhäsionen in der Gebärmutter, den Eierstöcken und den Eileitern14.

Ergebnisse

In diesem Artikel soll die Laparotomie-Operation für den Transfer geklonter Embryonen in den Eileiter von Jungsauen demonstriert werden. Alle Tiere blieben in einer adäquaten Anästhesieebene, ohne dass es zu intraoperativen Zwischenfällen oder Komplikationen während der Narkoseerholung kam. Die Jungsauen brauchten im Durchschnitt 2-3 Stunden, um nach Beendigung der Operation wieder aufzustehen.

Alle chirurgischen Eingriffe dauerten im Durchschnitt 44 Minuten. Neun Jungsauen wurden operiert, wobei durchschnittlich 185 geklonte Embryonen pro Jungsaue übertragen wurden, was insgesamt 1.664 bilateralen Embryonen entspricht (Tabelle 1). Die Lokalisation der Eierstöcke, ihre Exteriorisation und das Einführen des Tomcat-Katheters mit den Embryonen in das Ostium des Eileiters entsprachen den heikelsten Momenten der Operation. Die Eierstöcke aller Jungsauen wurden während der Operation inspiziert, und alle wiesen kürzlich ovulierte hämorrhagische Follikel auf, was mit den Erwartungen des durchgeführten Brunstsynchronisationsprotokolls übereinstimmte, das darauf abzielte, Embryotransfers kurz nach dem Eisprung durchzuführen. Alle Eingriffe verliefen ohne intraoperative Zwischenfälle.

Kein Tier zeigte nach der Operation Anzeichen von starken Schmerzen, mit einem durchschnittlichen Schmerzwert von 0,33, 0,33, 3,67, 1,33, 0,33, 1,33, 4,67, 2,00 und 0,33 auf der Schmerzskala (von 0 bis 18), die über die 3 postoperativen Tage für jede der operierten Jungsauen durchgeführt wurde (Tabelle 2). Nur 1 der operierten Jungsauen zeigte am 12. Tag nach der Operation eine subkutane Flüssigkeitsansammlung (Serom), mit Anzeichen einer Infektion und Entzündung in der Nähe der Operationswunde. Nach dem Ablassen der Flüssigkeit mit einer ultraschallgesteuerten Nadel von 40 mm x 1,6 mm, dem Auftragen von kalten Kompressen auf die entzündete Stelle für 30 Minuten täglich, 7 Tage lang, der Verabreichung von Ceftiofur (3 intramuskuläre Injektionen, mit einem Abstand von 72 h zwischen den Injektionen) und 2% Meloxicam (0,4 mg/kg SID, intramuskulär, für 3 Tage), fistulierte die Wunde und entleerte den restlichen mukopurulenten Inhalt. was zu einer vollständigen Verbesserung des Tieres führt. Die anderen operierten Jungsauen blieben 5 Tage lang mit dem chirurgischen Verband, ohne dass er für die Wundreinigung gewechselt oder entfernt werden musste, die nur vom 6. bis zum 10. Tag nach der Operation durchgeführt wurde.

Bei den Jungsauen 2, 8 und 9 wurden keine Flüssigkeitsakkumulation und embryonale Vesikelbildung im Uteruslumen beobachtet (Abbildung 1A). Daher wurde die Schwangerschaftsdiagnose dieser Tiere als negativ eingestuft. Die anderen Jungsauen zeigten eine intrauterine Flüssigkeitsakkumulation und die Bildung embryonaler Vesikel, die als gut definierte, reflexionsarme, abgerundete Strukturen sichtbar waren (Abbildung 1B-D). Es war möglich, bei zwei der Empfängersauen eine echoarme Region relativ zur embryonalen Struktur in der frühen Entwicklungsphase innerhalb der embryonalen Vesikel am 32. Tag der Trächtigkeit zu identifizieren (Abbildung 1E,F).

Nach einer negativen Schwangerschaftsdiagnose oder einem Nichtfortschreiten der Trächtigkeit wurden die Jungsauen euthanasiert und das Fortpflanzungssystem analysiert. Adhäsionen in Regionen der Eierstöcke, Eileiter und Uterushörner in mehr oder weniger starkem Ausmaß wurden bei den Jungsauen 1, 2, 3 und 4 und Ovarialzysten bei den Jungsauen 8 beobachtet (Abbildung 2). Vier embryonale Strukturen mit einem Gestationsalter, das mit etwa 12 bis 20 Tagen der Trächtigkeit vereinbar ist, wurden aus dem Uterus von Jungsau 3 und eine Struktur aus Jungsau 7 gewonnen (Abbildung 3). Die Analyse embryonaler Gewebefragmente ergab ein negatives Ergebnis für den Nachweis von Parvovirus, Leptospira sp., Erysipelothrix rhusiopathiae und Porzinem Circovirus Typ 2 und 3 (PCV2/PCV3), die zum Tod oder zu Aborten führen können.

Ultraschallsequenz, Analyse der Nierenstruktur, medizinische Bildgebung, diagnostisches Verfahren, Nierenuntersuchung.
Abbildung 1: Ultraschallbilder der Gebärmutter von embryonalen Jungsauen 30 Tage nach dem chirurgischen Eingriff. (A) Die Gebärmutter der Jungsau 2 ohne Flüssigkeit im Inneren, was eine negative Schwangerschaftsdiagnose kennzeichnet. Der trächtige Uterus von Jungsau 1 (B), Jungsau 3 (C) und Jungsau 4 (D) mit embryonalen Vesikeln mit Flüssigkeit im Inneren (Sternchen). Die trächtige Gebärmutter von Jungsau 3 (E) und Jungsau 7 (F) zeigt eine echoarme Struktur (Pfeil) innerhalb des embryonalen Vesikels, was auf eine fetale Bildung in der Frühphase am 32. Schwangerschaftstag hinweist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Präparierungsprozess, anatomische Studie, beschriftete Probensegmente, Diagramm für die Bildungsforschung.
Abbildung 2: Analyse des Fortpflanzungssystems. Bilder von Gebärmutter, Eierstöcken und Eileitern nach der Autopsie von Jungsau 1 (A), Jungsau 2 (B), Jungsau 3 (C), Jungsau 4 (D), Jungsau 5 (E), Jungsau 6 (F), Jungsau 7 (G), Jungsau 8 (H) und Jungsau 9 (I). Pfeile markieren Adhäsionen in Gebärmutterhörnern, Eierstöcken und Eileitern, und Pfeilspitzen markieren Ovarialzysten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Präparierbilder, die biologische Gewebeproben und Proben in der Petrischale für anatomische Studien zeigen.
Abbildung 3: Schwangerschaftsdiagnose. Embryonen im Frühstadium, die aus Jungsau 3 (A-D) und Jungsau 7 (E) entnommen wurden, weisen bei der sonographischen Untersuchung eine positive Schwangerschaftsdiagnose und hyperechoische Strukturen in den embryonalen Vesikeln auf. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Anzahl und Art der übertragenen Embryonen pro Jungsau, diagnostizierte Schwangerschaften und Anzahl der Embryonen, die nach der Autopsie der operierten Jungsauen gewonnen wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Werte, die den einzelnen operierten Jungsauen in Bezug auf das Erscheinungsbild der Schmerzzeichen zugewiesen wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Diskussion

Die beschriebene chirurgische Methode wurde zuvor von anderen Forschungsgruppen durchgeführt, die sich mit der Produktion von geklonten Schweinen oder genetisch veränderten geklonten Schweinen beschäftigen, mit Berichten über Geburten nach der Implementierung dieser Technik 15,16,17,18,19,20. Die Trächtigkeits- und Geburtenraten von SCNT-Embryonen, die aus verschiedenen Zelllinien produziert wurden, liegen zwischen 20 % und 30 % (von 264 Transfers seit 2017), mit durchschnittlich 3,2 ± 0,4 Ferkeln, die pro Wurf geboren wurden 3,21. Mehrere Faktoren hängen mit der geringen Effizienz dieser Technik zusammen, darunter das Synchronisationsprotokoll für Empfängersauen, die Synchronisation zwischen der Empfängersau und dem Stadium der übertragenen Embryonen, der Ort der Embryoablage, die Qualität der für SCNT verwendeten und produzierten Embryonen, die Qualität und das zelluläre Stadium der somatischen Zellen des Zellkernspenders und die Anzahl der übertragenen Embryonen21.

Laut der vorliegenden Studie erwies sich die beschriebene Operation als effektiv, schnell und sicher für die Durchführung des chirurgischen Transfers von geklonten Embryonen (bis zu einem 4-Zell-Stadium) bei Jungsauen, was zu einer positiven ultrasonographischen Gestationsdiagnose und Visualisierung der embryonalen Strukturen im Uteruslumen nach der Autopsie führte, wobei das Gestationsalter etwa zwischen 12 und 20 Tagen der Trächtigkeitlag 22. Eine weitere, weniger invasive Methode für den Transfer von SCNT-Embryonen in den Eileiter von Sauen ist die Laparoskopie. Die Effizienz dieser Technik variiert jedoch erheblich von weniger als 20 % bis über 80 %, was auf verschiedene Faktoren wie die Anatomie der Strukturen, die Art des verwendeten Katheters und die Lokalisation der Embryoablagerungzurückzuführen ist 4,6,23,24,25,26,27. Beim laparoskopischen Transfer von 2-4 Blastomer-Schweineembryonen über das Infundibulum auf 6 Sauen erreichten Wieczorek et al.4 nach dem Eingriff keine positiven Trächtigkeiten, und dieses Ergebnis hing mit Schwierigkeiten beim Einführen des Katheters in den Eileiter, dem flachen Kathetereinführen in den Eileiter und dem Auftreten einer Infundibulumperforation mit dem Katheter zusammen. Daher scheint die Methode des Embryotransfers über Laparotomie in den Eileiter von Sauen immer noch die effizienteste zu sein.

Das chirurgische Risiko, das mit dem Laparotomieverfahren für den Embryotransfer bei Sauen verbunden ist, ist gering; Es ist jedoch wichtig, die Möglichkeit einer malignen Hyperthermie während der Anästhesie zu beachten, die häufig bei kommerziellen Schweinen der Rassen Landrasse und Large White beobachtet wird28. In diesem Fall zeigte keine der operierten Jungsauen klinische Anzeichen einer malignen Hyperthermie während der Narkose. Es besteht auch die Gefahr von leichten lokalen Blutungen aus größeren Gefäßen im subkutanen Bereich, die mit einer hämostatischen Pinzette oder dem Nähen mit resorbierbarem Nahtmaterial leicht gestoppt werden können. Es kann auch die Möglichkeit auftreten, dass während des Schnitts mit dem Skalpell beim Stich und beim Streckschnitt in der Linea alba mit einer Schere versehentlich ein Organ der Bauchhöhle, wie z. B. die Blase oder die Darmschlingen, eingeschnitten wird. In diesem Fall muss der Chirurg bei der Inzision der Linea alba und dem Nähen der Bauchmuskulatur genau darauf achten, dass die darunter liegenden Strukturen nicht geschnitten oder zerrissen werden.

Die manuelle Geschicklichkeit des Chirurgen ist für die richtige Manipulation der Eierstöcke und eine sorgfältige Exteriorisation unerlässlich, um einen Bruch der Gefäße des Eierstockstiels zu vermeiden. Wenn es Schwierigkeiten gibt, den Eierstock zu lokalisieren, ist es möglich, den Eingriff zu beginnen, indem man eines der Gebärmutterhörner lokalisiert und seine Verlängerung bis zur Spitze des Gebärmutterhorns am utero-tubalen Übergang in der Nähe des Eierstocks verfolgt. Es sollte darauf geachtet werden, dass Adhäsionen der Eierstöcke und der Gebärmutter aufgrund einer übermäßigen Manipulation dieser Organe vermieden werden. Die Hydratation dieser Strukturen mit Laktatlösung oder Kochsalzlösung bei 39 °C während der Operation kann dazu beitragen, Adhäsionsbildung zu verhindern29. Die Manipulation der Gebärmutterröhre, insbesondere im Bereich der Fimbrien, sollte sehr vorsichtig durchgeführt werden, um Dehnungen und Rupturen zu vermeiden. Obwohl ein einseitiger Embryotransfer, nur in einen der Uterustuben, durchgeführt werden kann, um eine übermäßige Manipulation der Gebärmutter zu vermeiden und die Operationszeit zu verkürzen, kann ein bilateraler Transfer sicherer und vorteilhafter sein, insbesondere in Fällen, in denen es zu einem versehentlichen Bruch eines der Uterustuben kommt oder Zweifel an der Embryoablage an der richtigen Stelle bestehen. Darüber hinaus wird der bilaterale Transfer eher empfohlen, da er im Vergleich zum einseitigen Transfer zu höheren Trächtigkeitsraten und einer höheren Anzahl geborener Ferkel führt16,30. Das Vorhandensein von Zysten ist mit einer regelmäßigen oder unregelmäßigen Rückkehr zur Brunst verbunden, wobei bis zu 10% der Frauen mit Ovarialzysten in der Anöstrus verbleiben. Es hängt mit verschiedenen Ursachen wie Stress, der Verwendung hormoneller Protokolle oder genetischer Vererbungzusammen 31,32. In unserem Fall traten follikuläre Zysten auf, obwohl die vom Hormonhersteller für die Wärmesynchronisation empfohlene Dosis und Verabreichungszeit eingehalten wurde.

Zu wissen, wie man das Ostium des Uteruskanüls durch die Öffnung der Fimbrien lokalisiert, ist von grundlegender Bedeutung für die korrekte Ablagerung der Embryonen an der richtigen Stelle. Um Fehler in Bezug auf den Ort der Embryoablage zu vermeiden, wird empfohlen, dass die Passage des Tomcat-Katheters, der mit Lösung (z. B. Wasser) gefüllt ist, durch das Ostium des Uteruskanüls bei Schlachthausproben vorab geschult wird. Wenn die Pipette an der richtigen Stelle eingeführt wird, ist es möglich, eine Zunahme des Volumens des Uterusschlauchs nach der Injektion der Lösung zu beobachten. Es ist erwähnenswert, dass die Chancen auf eine Schwangerschaft umso besser sind, je geringer die Menge an Flüssigkeit ist, die zusammen mit den Embryonen übertragen wird33. Wenn es für den Chirurgen sehr schwierig ist, das Ostium des Gebärmutterschlauchs zu finden, ist es möglich, eine Tasche auf dem Eileiter zu machen und den Katheter durch ihn einzuführen. Obwohl diese letzte Methode schneller ist und weniger Manipulationen am Eileiter erfordert, muss der Chirurg Blutgefäße vermeiden und sicherstellen, dass der Katheter korrekt in das Lumen des Eileiters eingeführt wurde.

Obwohl das Risiko postoperativer Infektionen durch diesen chirurgischen Eingriff gering ist, kann es aufgrund von Faktoren wie dem Reinheitsgrad des Bereichs, in dem die Tiere untergebracht sind, der Dauer des chirurgischen Eingriffs, der Aufrechterhaltung des Verbandes für eine angemessene Zeit und der korrekten Verschreibung von Medikamenten wie vorbeugender Antibiotikatherapie und Entzündungshemmern auftreten. Die plausibelste Hypothese für das Auftreten der Infektion, die bei einer der operierten Jungsauen beobachtet wurde, bezieht sich darauf, dass der Verband kurz nach dem Aufstehen des Tieres nach der Narkose abfällt. Obwohl die tägliche Reinigung der Operationswunde dieses Gistes mit in Kochsalzlösung getränkter Gaze und topischer Anwendung von Pearson-Salbe durchgeführt wurde, reichte ein solches Verfahren nicht aus, um eine aufsteigende Kontamination zu verhindern, und erforderte eine Anwendung von kaltem Wasser an der Stelle, eine Drainage, eine systemische Antibiotikatherapie und zusätzliche 3 Tage entzündungshemmende Behandlung. Auch bei Auftreten einer subkutanen Infektion zeigte diese Jungsau bei der sonographischen Untersuchung Anzeichen einer Schwangerschaft.

Nachdem wir bei früheren Operationen Nylonfäden und chirurgische Klammern zum Verschließen der Haut verwendet haben, haben wir uns für die Verwendung von Ethyl-Cyanacrylat-Klebstoff entschieden, um die Belastung beim Entfernen der Fäden zu reduzieren und verbleibende Fäden oder Klammern zu vermeiden. Das Vorhandensein von Fäden oder Klammern begünstigt kleine lokale Entzündungen mit Pustelbildung. Der Ethyl-Cyanacrylat-Klebstoff wurde bereits sicher bei chirurgischen Eingriffen eingesetzt und hat sich als wirksam, ungiftig und bakterizid erwiesen34,35. Alle Tiere zeigten eine ausgezeichnete Wundheilung ohne Komplikationen, mit Ausnahme der Jungsau, bei der der Verband kurz nach dem chirurgischen Eingriff abfiel.

Offenlegungen

Keiner der Autoren legt einen Interessenkonflikt offen

Danksagungen

Wir bedanken uns bei der Tierklinik für Pferde und der Tierklinik für Wiederkäuer der Fakultät für Veterinärmedizin der Universität São Paulo (FMVZ/USP), São Paulo, Brasilien, FAPESP (Stipendium 2022/11459-3, Forschungsstiftung São Paulo), EMS Pharma, CNPq (Stipendium 405254/2022-9) und Água Branca Pig Farming, Itu, São Paulo, Brasilien.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,25 mL StrohhalmgenerischChirurgisches Material
1 mL SpritzeDescarpack341001Chirurgisches Material
10 mL SpritzeDescarpack324601Chirurgisches Material
20 mL SpritzeDescarpack324801Chirurgisches Material
3 mL SpritzeDescarpack324201Chirurgisches Material
5 mL SpritzeDescarpack324401Chirurgisches Material
60 mL SpritzeDescarpack323201Chirurgisches Material
9 mm EndotrachealtubusRusch112482-000090Chirurgisches Material
Allis PinzettegenerischChirurgischesInstrument
Amox LAJA Saú de AnimalMAPA Registrierung: 8.781/2004Arzneimittel
Bakhaus Pinzettegenerisch-chirurgischesInstrument
Katheter 20GDescarpack362401Katheter für den intravenösen Zugang
CetaminAgener Uniã oMAPA-Registrierung: SP-000292-5.000011 Anästhetikum
Leitfähiges klinisches GelRMCANVISA-Registrierung: 80122200013Chirurgisches Material
Dipyron D-500ZoetisMAPA-Registrierung: SP0000728-46Arzneimittel
Einweg-Skalpell Nr. 22WiltexANVISA-Registrierung: 10150470565Chirurgisches Instrument
Sterile Einweg-SchwammbürsteRioquimica7.89778E+12Chirurgische Asepsis
Easy-Scan:GoIMVESCG01Ultraschall
Endozime AW PlusRuhof34514Reinigungsmittel für chirurgische Instrumente
Fentanil (Fentanest)Cristá Lia ANVISA-Registrierung: 1029800810159Anästhetikum
Gosset-Retraktorgenerisch-chirurgischesInstrument
Halstead-Moskito-hämostatische Zangegenerisch-ChirurgischesInstrument
Heilsalbe - Unguento PearsonPearson SAMAPA-Registrierung: SP0000094-16Arzneimittel
WasserstoffperoxidlösungRioquimicaANVISA-Registrierung: 218690015Chirurgisches Material
IsofluoranBiochimicoANVISA-Registrierung: 100630222Anästhetikum
IV Tropfset Extensorgenerisch-Flüssigkeitstherapie
IV Makro-TropfsetDescarpack410301Flüssigkeitstherapie
Lactofur (ceftiofur)Ourofino SAMAPA Registrierung: SP0000051-50Pharmazeutisches Medikament
Laringoskop--Chirurgisches Instrument
Maxicam 2%Ourofino SAMAPA Registrierung: SP0000051-69Pharmazeutisches Medikament
Mikroporenkleber 5 cm x 10 cm Generikum1530Chirurgisches Material
MidazolamHipolaborANVISA-Registrierung: 1134301430035Anästhesie-Mehrwege-IV-Infusionsset
Descarpack413201Flüssigkeitstherapie-Nadel
40 mm x 1,2 mmDescarpack353601Sterile Nadel zum Auftragen von Medikamenten und Anästhetika.
Nadel 40 mm x 1,6 mmWiltexANVISA Registrierung: 10150470664Sterile Nadel zum Auftragen von Medikamenten und Anästhetika.
Nadelhaltergenerisch-ChirurgischesInstrument
Nylon 2 NahtfadenShalon MedicalN502CTI40Chirurgisches Material
Gewöhnlicher Stiftgenerisch-RegulärerStift zum Notieren
Physiologische Lösung 0,9% 500 mL BeutelJP FarmaMS:1.0491.0070Flüssigkeitstherapie
Polyglykolsäure 2 NahtfadenAtramatG4099-75HChirurgisches Material
KaliumchloridSamtecANVISA Registrierung: 1559200010139Parenteral
Arzneimittel Verfahren HandschuheDescarpack122401Persönliche Schutzausrüstung (PSA)
Propofol (Provive)Uniã o Quí GlimmerANVISA Registrierung: 1049714490057Anästhetikum
Ringer Laktatlösung 500 mL BeutelJP FarmaMS:1.0491.0061Flüssigkeitstherapie
Riohex 0,5% CloverxidinalkohollösungRioquimica218690356Chirurgische Asepsis
Riohex 2% Cloverxidinlösung mit TensidRioquimica218690356Chirurgische Asepsis
Kopfhaut 21 GDescarpack421201Chirurgisches Material
SchuhüberziehergenerischPersönliche Schutzausrüstung (PSA)
Sterile KompressenCremerANVISA Registrierung: 10071150065Chirurgisches Material
Sterile MullbindeProcitexANVISA Registrierung: 80245210083Chirurgisches Material
Sterile OP-Abdeckungen 140 cm x 90 cm Venkuri7010003OP-Material
Sterile OP-Abdecktücher 150 cm x 190 cm PolarFixF00208OP-Material
Sterile OP-HandschuheMucamboCA: 39.317Persönliche Schutzausrüstung (PSA)
Stethoskopgenerischechirurgische AusrüstungOP-Kappe
Descarpack93201Persönliche Schutzausrüstung (PSA)
OP-KittelDescarpack231101Persönliche Schutzausrüstung (PSA)
OP-MaskeDescarpack110701Persönliche Schutzausrüstung (PSA)
Chirurgische Schere stumpf-stumpfgenerischChirurgisches Instrument
Chirurgische Schere scharf-scharfgenerischChirurgisches Instrument
Chirurgisches Instrument Chirurgisches TackerTradevet-ChirurgischesMaterial
TekbondSekundenkleber Tek Bond78072720030Chirurgisches Material
ThermometergenerischChirurgischeGeräte
Drei-Wege-AbsperrhahnSolidor374Chirurgisches Material
TramadolhydrocloridAgener Uniã oMAPA-Registrierung: SP-000292-5.000002Anästhetikum
Transparenter FilmverbandSkinupperANVISA-Registrierung: 82307460014Chirurgisches Material
Wasserfester Klebstoff 10 cm x 4,5 cm;generisches364828Chirurgisches Material
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Referenzen

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