Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung der chirurgischen Technik, die beim Transfer von geklonten Schweineembryonen mittels Laparotomie bei Jungsauen verwendet wird.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung der chirurgischen Technik, die beim Transfer von geklonten Schweineembryonen mittels Laparotomie bei Jungsauen verwendet wird.
Dieses Protokoll zielt darauf ab, die chirurgische Technik für den Transfer geklonter Schweineembryonen in den Eileiter zu demonstrieren, eine Methode, die bei der Herstellung von genetisch veränderten Schweinen für die biomedizinische Forschung weit verbreitet ist. Neun Jungsauen wurden einer hormonellen Synchronisation und Laparotomie unterzogen, um geklonte Embryonen, die durch somatischen Zellkerntransfer (SCNT) in Stadien von bis zu 4 Zellen am Tag 2 erzeugt wurden, in den Eileiter zu übertragen. Die Schwangerschaftsdiagnose wurde 30 Tage nach der Transferoperation durch Ultraschalluntersuchung durchgeführt. Sechs der neun operierten Jungsauen zeigten bei der Ultraschalluntersuchung Anzeichen einer Trächtigkeit. Da es jedoch keine Fortschritte in der Entwicklung des Fötus gab, die durch eine Ultraschalluntersuchung beurteilt wurden, wurden die Jungsauen nach 60 Tagen einer Autopsie unterzogen, um biologisches Material zu sammeln und das Fortpflanzungssystem zu beurteilen. Adhäsionen wurden in den Gebärmutterhörnern, Eierstöcken und Eileitern beobachtet. Aus dem Uteruslumen von zwei der euthanasierten Jungsauen wurden eine und vier embryonale Strukturen mit einem Gestationsalter zwischen 12 und 20 Tagen gewonnen. Trotz des Fehlens lebender Ferkel, was wahrscheinlich auf die geringe Effizienz des Transfers von geklonten Schweineembryonen zurückzuführen ist, die von verschiedenen Faktoren, einschließlich der Anzahl und Qualität der übertragenen Embryonen, beeinflusst wird, erwies sich die vorgestellte Operationstechnik als schnell und sicher.
Schweine sind aufgrund ihrer anatomischen, physiologischen und genetischen Ähnlichkeiten mit dem Menschen ein hervorragendes experimentelles Modell für die biomedizinische Forschung1. Diese Tiere wurden häufig in der Forschung im Zusammenhang mit der Xenotransplantation eingesetzt, mit der Absicht, Organe, Zellen oder Gewebe zu produzieren, die bei der Transplantation in den Menschen ein geringes Abstoßungsrisiko aufweisen. Die Xenotransplantationsforschung zielt darauf ab, die Organversorgung für die Transplantation beim Menschen zu erhöhen und so die Warteliste der Patienten zu verkürzen2.
Die Produktion von Schweinen für die Xenotransplantation umfasst mehrere Schritte, einschließlich der Herstellung von Klonen aus genetisch veränderten Schweinezellen. Nach der In-vitro-Produktion von genetisch veränderten geklonten Embryonen werden die Embryonen mit einem synchronisierten Östruszyklus in das Fortpflanzungssystem einer Sau übertragen, um die Uterusphysiologie für die Aufnahme und Trächtigkeit des neuen conceptus3 vorzubereiten.
Der Embryotransfer bei Schweinen kann mit nicht-invasiven oder invasiven Methoden durchgeführt werden4. Zu den nicht-invasiven Methoden gehört der transzervikale Transfer, der keinen chirurgischen Eingriff erfordert. Diese Methode ist jedoch auf den Transfer von Embryonen in späteren Entwicklungsstadien (d. h. Morula- oder Blastozystenstadien) beschränkt und ermöglicht keine genaue Bestimmung der Kathetereinführungsstelle oder der Embryoablagerung5. Laparoskopie und Laparotomie gelten als invasive Methoden des Embryotransfers. Die Laparoskopie ist weniger invasiv, erfordert aber eine spezielle und kostspielige Ausrüstung, und ihre Effizienz variiert erheblich (von weniger als 20 % bis über 80 %), was auf verschiedene Faktoren zurückzuführen ist, wie z. B. die Schwierigkeit bei der Manipulation der Fortpflanzungsstrukturen und die Art des verwendeten Katheters 4,6. Daher ist der Transfer über die Laparoskopie im Vergleich zu chirurgischen Transfermethoden über die Laparotomieimmer noch weniger effizient.
Der Embryotransfer bei Sauen mittels Laparotomie ist ein relativ einfacher und schneller Eingriff, der in der Regel etwa 30 Minuten dauert. Sie sollte jedoch in einem chirurgischen Zentrum durchgeführt werden, das mit einem Inhalationsanästhesiegerät und einem spezialisierten Team ausgestattet ist. Für kommerzielle Schweinestämme (wie z.B. Landrassen, Große Weiße oder deren Kreuzungen) sind aufgrund des hohen Gewichts der Tiere (ca. 130-150 kg) spezielle Geräte wie Hebezeuge zum Heben von Jungsauen und ein breiter, stabiler Operationstisch erforderlich.
Damit die Operation erfolgreich ist, müssen die Embryonen zuvor auf ihr Entwicklungsstadium hin untersucht werden. Es wird empfohlen, Embryonen von bis zu 4 Zellen in die Gebärmutterröhre zu übertragen. Embryonen in Stadien jenseits von 4 Zellen, wie Morulas und Blastozysten, sollten auf das Gebärmutterhorn übertragen werden 7,8.
Obwohl Forschungsgruppen weltweit die Produktion und den chirurgischen Transfer von genetisch veränderten geklonten Schweineembryonen durchführen, gibt es immer noch keine klar definierten Protokolle, die dieses Verfahren durch Videos demonstrieren. Dieser Ansatz ist entscheidend für den Erfolg der Schwangerschaft, da die Technik eine genaue Ablagerung der Embryonen an der genauen Stelle des Eileiters erfordert, was die Lokalisierung des Eileiterostiums und das Einführen der Pipette mit den Embryonen umfasst. Diese Technik kann durch Erklärungsvideos des gesamten Verfahrens besser verstanden werden. Daher zielt dieser Artikel darauf ab, die Laparotomie-Operation für den Transfer geklonter Embryonen in den Eileiter von Jungsauen zu demonstrieren, eine wesentliche Voraussetzung für die zukünftige Produktion von gentechnisch veränderten Schweinen, die für Xenotransplantationen oder andere verwandte Zwecke verwendet werden sollen.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diese Studie wurde von der Ethikkommission für die Verwendung von Tieren in der Forschung des Instituts für Veterinärmedizin und Tierwissenschaften der Universität von São Paulo, Protokollnummer 6088030523, genehmigt. Neun sieben Monate alte Jungsauen aus der Kernschweinezucht Água Branca in der Stadt Itu im brasilianischen Bundesstaat São Paulo wurden direkt nach dem zweiten Brunstnachweis verwendet9. Die Einzelheiten zu den Reagenzien und der in der Studie verwendeten Ausrüstung sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Vorbereitung der Tiere
2. Chirurgischer Eingriff
3. Nachsorge
4. Ultraschalluntersuchung der Schwangerschaft
5. Euthanasie der Tiere
HINWEIS: Euthanasieren Sie die Jungsauen, die bei der sonographischen Untersuchung keine Föten in Größe und Aussehen zeigten, die dem Gestationsalter entsprachen.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
In diesem Artikel soll die Laparotomie-Operation für den Transfer geklonter Embryonen in den Eileiter von Jungsauen demonstriert werden. Alle Tiere blieben in einer adäquaten Anästhesieebene, ohne dass es zu intraoperativen Zwischenfällen oder Komplikationen während der Narkoseerholung kam. Die Jungsauen brauchten im Durchschnitt 2-3 Stunden, um nach Beendigung der Operation wieder aufzustehen.
Alle chirurgischen Eingriffe dauerten im Durchschnitt 44 Minuten. Neun Jungsauen wurden operiert, wo...
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Die beschriebene chirurgische Methode wurde zuvor von anderen Forschungsgruppen durchgeführt, die sich mit der Produktion von geklonten Schweinen oder genetisch veränderten geklonten Schweinen beschäftigen, mit Berichten über Geburten nach der Implementierung dieser Technik 15,16,17,18,19,20....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Keiner der Autoren legt einen Interessenkonflikt offen
Wir bedanken uns bei der Tierklinik für Pferde und der Tierklinik für Wiederkäuer der Fakultät für Veterinärmedizin der Universität São Paulo (FMVZ/USP), São Paulo, Brasilien, FAPESP (Stipendium 2022/11459-3, Forschungsstiftung São Paulo), EMS Pharma, CNPq (Stipendium 405254/2022-9) und Água Branca Pig Farming, Itu, São Paulo, Brasilien.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,25 mL Strohhalm | generisch | Chirurgisches Material | |
| 1 mL Spritze | Descarpack | 341001 | Chirurgisches Material |
| 10 mL Spritze | Descarpack | 324601 | Chirurgisches Material |
| 20 mL Spritze | Descarpack | 324801 | Chirurgisches Material |
| 3 mL Spritze | Descarpack | 324201 | Chirurgisches Material |
| 5 mL Spritze | Descarpack | 324401 | Chirurgisches Material |
| 60 mL Spritze | Descarpack | 323201 | Chirurgisches Material |
| 9 mm Endotrachealtubus | Rusch | 112482-000090 | Chirurgisches Material |
| Allis Pinzette | generisch | Chirurgisches | Instrument |
| Amox LA | JA Saú de Animal | MAPA Registrierung: 8.781/2004 | Arzneimittel |
| Bakhaus Pinzette | generisch-chirurgisches | Instrument | |
| Katheter 20G | Descarpack | 362401 | Katheter für den intravenösen Zugang |
| Cetamin | Agener Uniã o | MAPA-Registrierung: SP-000292-5.000011 | Anästhetikum |
| Leitfähiges klinisches Gel | RMC | ANVISA-Registrierung: 80122200013 | Chirurgisches Material |
| Dipyron D-500 | Zoetis | MAPA-Registrierung: SP0000728-46 | Arzneimittel |
| Einweg-Skalpell Nr. 22 | Wiltex | ANVISA-Registrierung: 10150470565 | Chirurgisches Instrument |
| Sterile Einweg-Schwammbürste | Rioquimica | 7.89778E+12 | Chirurgische Asepsis |
| Easy-Scan:Go | IMV | ESCG01 | Ultraschall |
| Endozime AW Plus | Ruhof | 34514 | Reinigungsmittel für chirurgische Instrumente |
| Fentanil (Fentanest) | Cristá | Lia ANVISA-Registrierung: 1029800810159 | Anästhetikum |
| Gosset-Retraktor | generisch-chirurgisches | Instrument | |
| Halstead-Moskito-hämostatische Zange | generisch-Chirurgisches | Instrument | |
| Heilsalbe - Unguento Pearson | Pearson SA | MAPA-Registrierung: SP0000094-16 | Arzneimittel |
| Wasserstoffperoxidlösung | Rioquimica | ANVISA-Registrierung: 218690015 | Chirurgisches Material |
| Isofluoran | Biochimico | ANVISA-Registrierung: 100630222 | Anästhetikum |
| IV Tropfset Extensor | generisch-Flüssigkeitstherapie | ||
| IV Makro-Tropfset | Descarpack | 410301 | Flüssigkeitstherapie |
| Lactofur (ceftiofur) | Ourofino SA | MAPA Registrierung: SP0000051-50 | Pharmazeutisches Medikament |
| Laringoskop | - | - | Chirurgisches Instrument |
| Maxicam 2% | Ourofino SA | MAPA Registrierung: SP0000051-69 | Pharmazeutisches Medikament |
| Mikroporenkleber 5 cm x 10 cm | Generikum | 1530 | Chirurgisches Material |
| Midazolam | Hipolabor | ANVISA-Registrierung: 1134301430035 | Anästhesie-Mehrwege-IV-Infusionsset |
| Descarpack | 413201 | Flüssigkeitstherapie-Nadel | |
| 40 mm x 1,2 mm | Descarpack | 353601 | Sterile Nadel zum Auftragen von Medikamenten und Anästhetika. |
| Nadel 40 mm x 1,6 mm | Wiltex | ANVISA Registrierung: 10150470664 | Sterile Nadel zum Auftragen von Medikamenten und Anästhetika. |
| Nadelhalter | generisch-Chirurgisches | Instrument | |
| Nylon 2 Nahtfaden | Shalon Medical | N502CTI40 | Chirurgisches Material |
| Gewöhnlicher Stift | generisch-Regulärer | Stift zum Notieren | |
| Physiologische Lösung 0,9% 500 mL Beutel | JP Farma | MS:1.0491.0070 | Flüssigkeitstherapie |
| Polyglykolsäure 2 Nahtfaden | Atramat | G4099-75H | Chirurgisches Material |
| Kaliumchlorid | Samtec | ANVISA Registrierung: 1559200010139 | Parenteral |
| Arzneimittel Verfahren Handschuhe | Descarpack | 122401 | Persönliche Schutzausrüstung (PSA) |
| Propofol (Provive) | Uniã o Quí Glimmer | ANVISA Registrierung: 1049714490057 | Anästhetikum |
| Ringer Laktatlösung 500 mL Beutel | JP Farma | MS:1.0491.0061 | Flüssigkeitstherapie |
| Riohex 0,5% Cloverxidinalkohollösung | Rioquimica | 218690356 | Chirurgische Asepsis |
| Riohex 2% Cloverxidinlösung mit Tensid | Rioquimica | 218690356 | Chirurgische Asepsis |
| Kopfhaut 21 G | Descarpack | 421201 | Chirurgisches Material |
| Schuhüberzieher | generisch | Persönliche Schutzausrüstung (PSA) | |
| Sterile Kompressen | Cremer | ANVISA Registrierung: 10071150065 | Chirurgisches Material |
| Sterile Mullbinde | Procitex | ANVISA Registrierung: 80245210083 | Chirurgisches Material |
| Sterile OP-Abdeckungen 140 cm x 90 cm | Venkuri | 7010003 | OP-Material |
| Sterile OP-Abdecktücher 150 cm x 190 cm | PolarFix | F00208 | OP-Material |
| Sterile OP-Handschuhe | Mucambo | CA: 39.317 | Persönliche Schutzausrüstung (PSA) |
| Stethoskop | generische | chirurgische Ausrüstung | OP-Kappe |
| Descarpack | 93201 | Persönliche Schutzausrüstung (PSA) | |
| OP-Kittel | Descarpack | 231101 | Persönliche Schutzausrüstung (PSA) |
| OP-Maske | Descarpack | 110701 | Persönliche Schutzausrüstung (PSA) |
| Chirurgische Schere stumpf-stumpf | generisch | Chirurgisches Instrument | |
| Chirurgische Schere scharf-scharf | generisch | Chirurgisches Instrument | |
| Chirurgisches Instrument Chirurgisches Tacker | Tradevet-Chirurgisches | Material | |
| Tekbond | Sekundenkleber Tek Bond | 78072720030 | Chirurgisches Material |
| Thermometer | generisch | Chirurgische | Geräte |
| Drei-Wege-Absperrhahn | Solidor | 374 | Chirurgisches Material |
| Tramadolhydroclorid | Agener Uniã o | MAPA-Registrierung: SP-000292-5.000002 | Anästhetikum |
| Transparenter Filmverband | Skinupper | ANVISA-Registrierung: 82307460014 | Chirurgisches Material |
| Wasserfester Klebstoff 10 cm x 4,5 cm; | generisches | 364828 | Chirurgisches Material |
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.