Entwicklung einer Verhaltensbox zur Bewertung der Präpulshemmung und der neuronalen Aktivität in psychiatrischen Tiermodellen

Summary

Dieses Protokoll stellt eine Mikrocontroller-basierte Verhaltensbox dar, um die Prepuls-Inhibition (PPI) zu bewerten, indem Beschleunigungsdaten von einem Sensor unter der Box gesammelt werden. Diese Daten bewerten sensorische Gating-Defizite bei sozial isolierten Ratten, mit einer zusätzlichen Methode zur Synchronisierung von Daten mit neuronaler Aktivität, um neurophysiologische Studien zu Verhaltensstörungen voranzutreiben.

Abstract

Stress im frühen Leben wird als potenzieller Vorläufer von neurologischen Entwicklungsstörungen angesehen. Ein Ansatz, um diese Erkrankung in Tiermodellen zu untersuchen, ist die soziale Isolation nach der Entwöhnung. Es wurde gezeigt, dass diese frühe Belastung bei Nagetieren zu neuralen Veränderungen führt, die denen bei Patienten mit Schizophrenie ähneln, einschließlich eines verminderten präfrontalen Kortexvolumens, einer verminderten dendritischen Dornendichte und einer erhöhten dopaminergen Aktivität im ventralen tegmentalen Bereich. Das Prepuls-Inhibitions-Paradigma (PPI) ist eine etablierte Methode zur Beurteilung von sensorischen Gating-Defiziten sowohl in Human- als auch in Tiermodellen. PPI bezieht sich auf die Unterdrückung des Schreckreflexes auf einen stärkeren akustischen Reiz (z. B. 120 dB-Impuls), wenn ihm ein schwächerer akustischer Vorreiz (z. B. 65 dB-Impuls) vorausgeht. Dieses Phänomen ist bei psychiatrischen Patienten und Tiermodellen psychiatrischer Störungen oft reduziert. In diesem Artikel wird ein Protokoll zum Aufbau einer Verhaltensbox für PPI-Studien vorgestellt, das die Verwendung eines zugänglichen, kostengünstigen Tiermodells für Schizophrenie und die Synchronisierung der Verhaltensbox mit neuronalen Aufzeichnungen aus dem Modell (z.B. elektrophysiologische Aufzeichnungen) ermöglicht. Diese maßgeschneiderte Verhaltensbox erkannte effektiv Schreckreaktionen und erleichterte die PPI-Bewertung mit gleichzeitiger neuronaler Aufzeichnung bei sich frei verhaltenden Nagetieren, die nach der Entwöhnung isoliert wurden.

Introduction

Personen, bei denen Schizophrenie (SCZ) diagnostiziert wurde, weisen häufig sensomotorische Defizite auf. Eine verminderte Reaktion auf sensorische Stimulation und Schwierigkeiten, relevante Informationen aus verschiedenen sensorischen Eingaben zu erkennen, werden bei diesen Patienten häufig berichtet ^1,2. Bei gesunden Menschen verringert die Abgabe eines schwächeren Stimulus vor einem stärkeren den üblichen Schreckreflex auf den stärkeren Reiz³. Dieses Phänomen ist als Präpuls-Hemmung (PPI) bekannt und wurde verwendet, um sensorische Gating-Defizite bei Patienten mit SCZ und Tiermodellen von SCZ⁴ zu untersuchen.

In einer akustischen PPI-Aufgabe wird eine Schreckreaktion auf einen einzelnen starken akustischen Impuls (z. B. ~120 dB) mit der Schreckreaktion verglichen, wenn demselben Reiz in einem kurzen Intervall (30 bis 500) ein schwächerer Reiz (z. B. ~65 dB⁾ vorausgeht3,4. Bei gesunden Personen ist die Schreckreaktion auf den Puls vermindert, wenn der schwächere Vorpuls präsentiert wird (im Vergleich zur Schreckreaktion auf den einzelnen starken Impuls allein). Dieses Phänomen ist bei Personen mit SCZ gestört, die eine geringere Unterdrückung der Schreckreaktion aufweisen, selbst wenn der schwächere Vorpuls vor dem starken Puls 1,5,6,7,8 präsentiert wird.

Ähnlich wie SCZ-Patienten weisen auch Ratten mit mesolimbischer Dopamin-Überaktivität einen verminderten akustischen PPI⁹ auf, was dieses Paradigma zu einem nützlichen Werkzeug macht, um Verhaltens- und physiologische Veränderungen in Tiermodellen der Schizophrenie zu untersuchen. Im Allgemeinen besteht die kommerzielle Vorrichtung für PPI aus einer akustischen Kammer, die Sensoren, Lautsprecher und Software zum Einstellen der experimentellen Parameter (z. B. Interpulsintervall und Intensität von Reizen), zum Aufzeichnen der Schreckreaktion von Nagetieren und zum Verarbeiten der Daten enthält. Kommerzielle Systeme bieten jedoch oft nur begrenzte Anpassungsmöglichkeiten und sind kostspielig. Do-it-yourself-Ansätze (DIY) für den Aufbau flexibler Forschungsapparate verbessern den Zugang zu Geräten und den Wissenstransfer¹⁰. DIY-Lösungen zur Untersuchung sensomotorischer Gating-Mechanismen wie PPI müssen mehrere Schlüsselfaktoren berücksichtigen, um Effektivität und Zuverlässigkeit zu gewährleisten. Zu den wesentlichen Überlegungen gehören Designspezifikationen, Umgebungs- und Lichtsteuerung, Schalldämpfung, Reizabgabesysteme, Verhaltensmesssensoren sowie Datenerfassung und -analyse.

DIY-Lösungen für Verhaltensboxen wurden für verschiedene Funktionen entwickelt, wie z. B. operante Leckenexperimente¹¹, auditive Unterscheidungsaufgaben^{12 und} Vordergliedmaßenfunktion¹³. Obwohl sich einige DIY-Ansätze auf Video-Tracking^{konzentrieren 14}, erfordert diese Art von Daten hohe Rechenressourcen, um analysiert zu werden. Eine Open-Source-Hardware- und Softwareplattform kann verwendet werden, um eine kostengünstige PPI-Verhaltensbox zu erstellen, die flexibel ist, benutzerdefinierte Experimente zu testen 15,16,17 und neuronale Aufzeichnungen von sich frei verhaltenden Tieren zu synchronisieren.

In diesem Artikel wird eine Methode zur Entwicklung einer Verhaltensbox zur Bewertung von PPI mit einer kostengünstigen Plattform zur Untersuchung des Isolationsmodells nach der Entwöhnung vorgestellt, einem Stress im frühen Leben, der zur Entwicklung von SCZ-ähnlichen Symptomen beiträgt und auch mit gleichzeitigen elektrophysiologischen Gehirnaufzeichnungen verwendet werden kann.

Protocol

Die Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt. Dieses Projekt wurde von der Ethikkommission des CEUA Santos Dumont Instituts genehmigt (Zulassungsnummer 04/2016). Für den PPI-Test wurden 35 Wistar-Ratten (3 Monate alt, 290-490 g; 19 Männchen und 16 Weibchen) einzeln in der PPI-Box bewertet. Alle 35 Ratten wurden nach der Entwöhnung einem Isolationsprotokoll unterzogen, bei dem sie einzeln unter einem 12/12-stündigen Lichtzyklus bei einer Temperatur von 23 °C und 70 % Luftfeuchtigkeit in einer kontrollierten Einrichtung mit ad libitum Zugang zu Futter und Wasser untergebracht wurden. Einzelheiten zu den in der Studie verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle enthalten.

1. PPI-Feld

1. Stellen Sie eine transparente Acrylbox mit 25 cm Länge, 20 cm Breite und 25 cm Höhe her, um eine sich frei verhaltende Ratte mit einem verdrahteten Kopftisch zu halten. Diese Höhe ist wichtig, um ein Entkommen von Ratten zu verhindern und den Kopftisch frei und sicher für neuronale Aufzeichnungen zu halten.
   1. Verwenden Sie selbstklebende Gummipads, um die Acrylbox von externen mechanischen Vibrationen zu isolieren (z. B. Labortisch mit anderen Geräten) und um den Beschleunigungsmesser ohne physischen Kontakt mit anderen Teilen (z. B. Bank oder Kabel) unter der Box befestigt zu halten.
      HINWEIS: Passen Sie die Größe der transparenten Acrylbox entsprechend den Aufgabenanforderungen an (z. B. Maus, Ratte, Weißbüschelaffe).
2. Löten Sie ein Flachbandkabel (26 AWG) direkt an die vier Stiftlöcher einer Beschleunigungssensorplatine: VCC (Spannung), GND (Masse), SCL (serieller Takt) und SDA (serielle Daten). Reinigen Sie die Mitte des Acryls und die flache Frontplatte des Beschleunigungsmessers. Verwenden Sie Cyanacrylatkleber oder Epoxidharz, um den Beschleunigungsmesser fest unter der Acrylbox zu befestigen.
   1. Warten Sie, bis es vollständig ausgehärtet ist (Abbildung 1). Verbinden Sie die andere Seite des Flachbandkabels wie folgt mit dem Mikrocontroller: VCC auf 3,3 V, GND auf GND, SCL auf SCL (I2C SCL) und SDA auf SDA (I2C SDA). Bewahren Sie den Beschleunigungsmesser ohne physischen Kontakt mit anderen Teilen (z. B. Bank oder Kabeln) unter der Box auf.
      HINWEIS: Es gibt mehrere Marken von DIY-Beschleunigungsmessern und Mikrocontrollern. Die Größe und der Typ des Mikrocontrollers und des Beschleunigungsmessers hängen vom Verwendungszweck und den Abmessungen/Spezifikationen der Box ab. Berücksichtigen Sie die Reinigungsverfahren nach jeder Testsitzung und tragen Sie bei Bedarf eine Schicht elektronischen Lack auf die Lötstellen und Schaltkreise auf, um die Metallteile des Beschleunigungsmessers zu isolieren und vor versehentlichen Spritzern zu schützen. Zu Vergleichszwecken wurden der DIY-Beschleunigungssensor und der handelsübliche Beschleunigungssensor nebeneinander unter der Box angebracht.
3. Eine schalldichte Kammer mit einer Fronttür und Kanten von 80 cm aus 15 mm dicker mitteldichter Faserplatte (MDF) herstellen. Kleiden Sie das Innere der Box mit Akustikschaum aus. Platzieren Sie einen Lautsprecher 20 cm über der Acrylbox so, dass sich die Kopfbühne und das Kabel frei bewegen können.
   1. Verbinden Sie den Audioausgang des Computers mit der Mikrocontroller-Platine (Analogeingang und GND) und dem Lautsprecher über einen handelsüblichen Audiodetektor, der akustische Reize vom Lautsprecher empfängt und TTL-Ereignismarker (Transistor-Transistor-Logik) generiert, um Verhaltens- und neuronale Daten zu synchronisieren (Abbildung 2).
      HINWEIS: Bauen Sie eine akustische Kammer gemäß den experimentellen Anforderungen (z. B. berücksichtigen Sie den Bedarf an Kameras, zusätzlichem Licht und Lautsprechern). Verwenden Sie einen Widerstandsteiler (z. B. 10 kΩ und 10 kΩ Widerstände), um das Computeraudio an den analogen Eingangsbereich des Mikrocontrollers von 0-5 V auszusenden. Ein kommerzielles Audiodetektorgerät empfängt den Audioeingang und sendet TTL (Transistor-Transistor-Logik) als Stimulus-Onset-Markierung für jede vom Computer gesendete akustische Stimulation (0-0,4 V gilt als niedriger Zustand und 2,8-5 V als hoher Zustand). Im Allgemeinen verfügen elektrophysiologische Systeme über BNC-Eingangsbuchsen, um TTL- oder analoge Signale (z. B. audiologische Stimuli) zu empfangen.
4. Verbinden Sie die Mikrocontroller-Platine über ein USB-Kabel mit dem Computer. Öffnen Sie die integrierte Entwicklungsumgebungssoftware für die Mikrocontroller-Platine.
   1. Wählen Sie die entsprechende Mikrocontrollerplatine, den COM-Port und die Baudrate aus. Öffnen Sie die Datei sketch, kompilieren Sie den Code und laden Sie ihn auf die Mikrocontroller-Platine hoch. Klicken Sie auf die serielle Schnittstelle des Monitors , um die eingehenden Daten zu überprüfen. Schließen Sie die Software für die Entwicklungsumgebung.
      HINWEIS: Wenn die Mikrocontroller-Platine über USB an einen Computer angeschlossen wird, wird ihr ein COM-Port zugewiesen. Öffnen Sie den Geräte-Manager in der Windows-Systemsteuerung und klicken Sie auf Ports (COM & LPT), um den dem Mikrocontroller zugewiesenen COM-Port (COM-Nummer) anzuzeigen. Die COM-Nummer muss mit der COM-Port-Einstellung der Entwicklungssoftware übereinstimmen. Ein Beispiel für eine Skizze finden Sie unter https://github.com/neurodeveloperISD.
5. Platzieren Sie ein digitales Schallhebelmessgerät an der gleichen Stelle, an der sich das Tier in der Box befinden wird. Überprüfen Sie die Hintergrundgeräusche in der Kammer bei geschlossener Tür. Spielen Sie die akustischen Stimuli ab und passen Sie den Erfassungsbereich des Schallpegelmessers (30-80 dB oder 80-130 dB) an, um die vom Computer gesendeten akustischen Reizpegel zu kalibrieren.
   HINWEIS: Gemäß dem experimentellen Protokoll können verschiedene Stimulisequenzen mit einer bevorzugten Open-Source-Sprache (z. B. Python) erstellt werden. Für diese Studie wurde 68 dB weißes Rauschen für 7 min mit zufälligen Vorpuls- und Pulskombinationen präsentiert. Exportieren Sie die Datei als Wave-Datei und die Tabellensequenz der Kombination aus Vorpuls und Impuls für die Offline-Analyse.
6. Öffnen Sie ein bevorzugtes Open-Source-Softwareprogramm, um Daten über die serielle Schnittstelle zu erfassen und zu speichern. Konfigurieren Sie den COM-Port, die Mikrocontroller-Platine und die Baudrate. Klicken Sie auf Verbinden , um die Rohdaten oder das Diagramm zu lesen. Klicken Sie auf Speichern , um die Aufzeichnung der Daten des Experiments zu starten.
   HINWEIS: Es gibt Open-Source-Software zum Aufzeichnen serieller Schnittstellen (z. B. CoolTerm, Python) und kommerziell erhältliche Software (z. B. Matlab).
7. Bevor Sie ein Tier platzieren, stellen Sie sicher, dass jede Komponente (Reizabgabe, Reaktionserkennung) ordnungsgemäß funktioniert. Überprüfen Sie den Zeitpunkt und die Reihenfolge der Stimuli (gemäß dem gewählten PPI-Protokoll). Überprüfen Sie, ob die Reaktionen des Beschleunigungsmessers genau erkannt und aufgezeichnet werden.
8. Sammeln und analysieren Sie die Antwortdaten, um den PPI-Effekt zu bewerten (Schritt 5). Verwenden Sie statistische Werkzeuge, um die Ergebnisse zu interpretieren und sensomotorische Gating-Defizite zu bewerten.

Abbildung 1: Beschleunigungssensor fest unter der Verhaltensbox befestigt. Die Abbildung zeigt eine kostengünstige Beschleunigungssensorplatine (links) und einen kommerziellen High-End-Beschleunigungssensor (rechts) zum Datenvergleich. Der Beschleunigungsmesser muss fest mit der Acrylbox verbunden sein, und das Flachkabel muss mit dem Acryl verbunden sein, um ein Brechen durch Reinigungsverfahren und Tierwechsel zu vermeiden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Integrierte Mikrocontroller-basierte Verhaltensbox. Schematisch zeigt eine Ratte in der Acrylbox mit einem verdrahteten Kopftisch, der mit einem elektrophysiologischen Aufnahmesystem des Gehirns verbunden ist. Ein Beschleunigungsmesser unter der Box, der mit dem Mikrocontroller verbunden ist, sendet triaxiale Beschleunigungsmesserdaten an den Computer und erhält Stimuli-Trigger-Markierungen für die Offline-Datenverarbeitung. Ein Lautsprecher spielt die Geräuschkulisse und Schallimpulse ab, die Marker für die Daten des Beschleunigungsmessers auslösen. Ein Mikrofon erfasst akustische Reize, um sie mit elektrophysiologischen Daten zu synchronisieren (z. B. Erfassung des Vokalisationsverhaltens während der Aufgaben). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Isolationsverfahren nach dem Absetzen bei Ratten

1. Isolieren Sie die Jungtiere der Ratten unmittelbar nach der Entwöhnung (17^. bis 21^. Tag nach der Geburt) in einzelnen Käfigen und halten Sie sie mindestens 90 Tage nach der Geburt isoliert.
2. Führen Sie die neurochirurgische Mikroelektroden-Array-Implantation nach 90 postnatalen Tagen nach etablierten Protokollen durch^18,19.
3. Führen Sie die PPI-Aufgabe 7-10 Tage nach der Operation durch (siehe Schritt 4).

3. Chirurgisches Verfahren für die Elektrodenarray-Implantation des Gehirns

1. Ein Mikroelektrodenarray muss zuvor sterilisiert werden (in dieser Studie wurden 32 Wolframdrähte mit einem Durchmesser von 50 μm verwendet, Abbildung 3A). Das Tier wird in eine isolierte Box mit Isofluran-Anästhesie (5 % in 0,5 l/min O₂, gemäß institutionell anerkannten Protokollen) gebracht.
2. Nehmen Sie das Tier aus der Box und halten Sie es unter Isofluran-Anästhesie mit einem Anästhesie-Nasenkonus (1% in 0,5 L/min O₂). Verabreichen Sie Atropin intramuskulär in einer Dosis von 0,05 mg/kg. Rasieren Sie den Kopf des Tieres mit einer Lamina und verwenden Sie eine antiseptische Flüssigkeit. Nach 5 Minuten verabreichen Sie Ketamin intraperitoneal in einer Dosierung von 70 mg/kg und Xylazin intramuskulär in einer Menge von 3 mg/kg.
3. Legen Sie das Tier auf ein Heizkissen bei 37 ± 0,2 °C in der multiaxialen stereotaktischen Vorrichtung unter inhalierbarem Isofluran (1%-5% in 0,5 L/min O₂). Setzen Sie einen Rektalsensor zur Steuerung des Heizkissens zusammen mit einem Rektalsensor zur Überwachung der PO_2-Sättigung und der Herzfrequenz ein. Stellen Sie sicher, dass die Sauerstoffsättigung über 95 % liegt und die Herzfrequenz zwischen 200 und 300 Schlägen pro Minute liegt.
   HINWEIS: Beobachten Sie diese Parameter während des gesamten chirurgischen Eingriffs und passen Sie gegebenenfalls die Isoflurankonzentration an.
4. Tragen Sie steriles Gleitmittel auf die Augen des Tieres auf und bedecken Sie das Tier mit einem sterilen OP-Tuch.
   HINWEIS: Führen Sie alle folgenden chirurgischen Eingriffe unter aseptischen Bedingungen durch.
5. Öffnen Sie das Operationsfeld im Kopfbereich des Tieres und fixieren Sie es mit Nähten (4-0) mit der Haut. Tragen Sie Lidocain 20% subkutan auf den Schädel des Tieres auf und führen Sie einen Längsschnitt (~1,5 cm) der Kopfhaut durch, gefolgt von der Entfernung des Schädeldachperiosts. Reinigen Sie die Knochenoberfläche mit Wasserstoffperoxid.
6. Richten Sie Bregma und Lambda in derselben horizontalen Ebene aus, um eine bessere Genauigkeit der Kraniotomie zu erzielen, insbesondere wenn aus mehreren Hirnbereichen aufgezeichnet wird (diese Studie wurde aus dem ventralen Tegmentalbereich, der Amygdala, dem Nucleus Accumbens, dem Hippocampus und dem präfrontalen Kortex aufgezeichnet, Abbildung 3B).
7. Markieren Sie die Positionen der Bohrlöcher mit einem Roboterbohrer und setzen Sie 3 bis 4 Schrauben an verteilten Stellen an der schädelfernen Stelle der Kraniotomie ein, ohne die Dura mater zu perforieren (Abbildung 3C,D).
8. Es wird eine manuelle Kraniektomie¹⁹ durchgeführt, wobei der Umfang der Kraniotomie mit einem Zahnbohrer bei maximaler Geschwindigkeit für die Gehirnziele aufgebohrt wird (Abbildung 3E).
9. Entfernen Sie den Knochen, bewahren Sie die Dura mater mit steriler Kochsalzlösung auf und entfernen Sie die Dura mater.
   HINWEIS: Achten Sie auf den gesamten Prozess der Extraktion der Dura mater, um Hirnverletzungen zu vermeiden, die die Tiefengenauigkeit gefährden könnten.
10. Platzieren Sie die Elektroden des Arrays an den Kraniektomiepositionen und bewegen Sie sich im Elektrodenarray nach unten, bis die Elektroden in der tiefsten Position das Hirngewebe leicht berühren. Verwenden Sie für die elektrische Erdung der Elektroden einen Draht, der auf der Oberfläche des Schädels platziert und um die vier Schrauben herum angeordnet ist (Abbildung 3F).
    HINWEIS: Siehe die Schulung für neurochirurgische Implantate im Tiermodell¹⁹ mit einem alternativen Fach.
11. Führen Sie die Elektroden alle 100 μm bis zur Zielstelle ein und befestigen Sie sie mit Zahnzement, um den Konnektor fest am Schädel und außerhalb der Haut zu halten.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, dass Sie keinen Zahnzement auf das Hirngewebe oder in die Löcher der Stecknadeln fallen lassen.

Abbildung 3: Mikroelektroden-Array-Implantat. (A) Mikroelektroden-Array mit 32 Wolframdrähten von 50 μm für die prälimbischen und infralimbischen PFC, VTA, AMY, NAcc und HIPC. (B) Rattenschädel mit den Gehirnzielen, Bregma und Lambda. (C) Bohrpositionen für Kraniektomie und Schrauben. (D) Schrauben zur Unterstützung des Mikroelektrodenarray-Implantats und der Kraniektomiezeichnung. (E) Schädelöffnungen ohne Dura mater. (F) Mikroelektroden, die in das Gehirn eindringen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

4. PPI und neuronale Aufzeichnungen

1. Verbinden Sie den Kopftisch sehr vorsichtig mit dem Konnektorimplantat am Rattenschädel.
   HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend, um zu vermeiden, dass die Mikrostifte des Kopftischsteckers brechen oder das Zahnacryl auf dem Schädel beschädigt wird. Das Tier kann in eine Box mit Isofluran-Anästhesie (5% in 0,5 l/min O₂) gelegt werden, um bei Bedarf den Anschluss zu erleichtern. Wenn Sie eine Anästhesie verwenden, um den Kopftisch anzuschließen, warten Sie, bis das Isofluran ausgewaschen ist, damit es das PPI-Verhalten und die Gehirnaktivität nicht beeinflusst.
2. Schalten Sie das neuronale Datenerfassungssystem ein und stellen Sie sicher, dass es Daten von den akustischen Reizen über den Mikrocontroller oder einen TTL-Generator empfängt, der mit dem Audiodetektor oder Mikrofon verbunden ist. Schalten Sie den Open-Source-Recorder der seriellen Schnittstelle ein, der zuvor in Schritt 1.6 überprüft wurde.
   HINWEIS: Je nach Laboreinrichtung können diese Synchronisationsverfahren unterschiedlich sein.
3. Beginnen Sie mit der Erfassung elektrophysiologischer (Spike- und lokales Feldpotential) und Beschleunigungssensordaten mit der Elektrophysiologie-Erfassungssoftware.
   HINWEIS: Überprüfen Sie die eingehenden Daten und passen Sie die Verstärkungseinstellung an, um ein Abschneiden des Signals oder das Erkennen von Spike-Wellenformen und der Spike-Erkennungsschwelle zu vermeiden. Abhängig vom Aufnahmesystem und den aufgezeichneten Daten kann man die Verstärkung und den Schwellenwert nur im Online-Modus anpassen. Stellen Sie sicher, dass die Filtereinstellung für die niederfrequenten Signale (LFP), in der Regel 0,5 Hz bis 100 Hz, für die hohen Frequenzen (Spikes), in der Regel 300 Hz bis 5000 Hz, und für das niederfrequente Rauschen, in der Regel 50/60 Hz, korrekt angegeben ist, um eine Offline-Analyse zu ermöglichen.
4. Setzen Sie das Tier 7 Minuten lang weißem Hintergrundrauschen (~68 dB) aus, wobei alle Arten von Impulsen 10 Mal pro Typ zufällig dargestellt werden (Abbildung 4). 4 veranschaulicht fünf Arten von Impulsen, die in diesem Protokoll verwendet werden: Impuls 1 (75 dB Vorimpuls, 30 ms Intervall und 120 dB Impuls), Impuls 2 (85 dB Vorimpuls, 30 ms Intervall und 120 dB Impuls), Impuls 3 (75 dB Vorimpuls, 100 ms Intervall und 120 dB Impuls), Impuls 4 (85 dB Vorimpuls, 100 ms Intervall und 120 dB Impuls), und Impuls 5 (120 dB Einzelimpuls).
5. Schalten Sie am Ende der Aufnahmesitzung die Aufnahmesoftware aus und trennen Sie den Headstage-Stecker.

Abbildung 4: Arten von auditiven Reizen. Eine illustrierte Sitzung von 7 Minuten weißem Rauschen mit 5 Arten von Vorpuls + Puls-Kombinationen wurde nach dem Zufallsprinzip präsentiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

5. Elektrophysiologische und Verhaltensanalyse

1. Importieren Sie die Rohdaten mit Gehirndaten, Beschleunigung und akustischen Reizen in eine Signalverarbeitungsplattform. Extrahieren Sie Epochen, die auf jeden akustischen Reiz zentriert sind.
2. Normalisieren Sie die Mittelwerte entsprechend, um Werte zwischen Tieren zu vergleichen. Verwenden Sie den einzelnen Impuls (Impuls 5 in diesem Protokoll) als maximale Reaktion und normalisieren Sie den Reflex auf andere Impulse auf diesen Wert.
3. Betrachten Sie die Schreckamplitude für Impuls 5 als 100 % und die anderen Impulse als Funktion für Impuls 5.
   HINWEIS: Die Amplituden werden unter Verwendung des mittleren Quadrats (RMS) der drei Achsen des Beschleunigungsmessers (Abbildung 5A) extrahiert, um die Größe des Schrecks (Abbildung 5B) in einem Satz von n Werten auszudrücken. Der RMS ist eine mathematische Formel²⁰, wobei:
   
   ax = Beschleunigungsmesser x-Achse, ay = Beschleunigungsmesser y-Achse, az = Beschleunigungsmesser z-Achse
   t = Beginn des akustischen Stimulus plus 200 ms
   n = Sammlungswerte
   So berechnen Sie den prozentualen Prozentsatz des Effektivwerts der Impulse 1 bis 4 in Bezug auf den Impuls 5:
   
   RMS_pulse = RMSschreckle für den Pulse 1, 2, 3, 4
   RMS_pulse5 = RMSschreckle für den Pulse 5
4. Verwenden Sie die an das neuronale Datenerfassungssystem gesendeten TTLs, um die Gehirndaten rund um die akustischen Reize und Reflexreaktionen entsprechend zu analysieren.

Abbildung 5: Daten des Triaxialen Beschleunigungsmessers und RMS. (A) Die Daten des triaxialen Beschleunigungsmessers (x-, y-, z-Achse (g)) wurden während einer 6-minütigen Baseline- und zufälligen Stimulation von 80 PPI mit weißem Rauschen aufgezeichnet. (B) Startle RMS-Berechnung aus den drei Achsen des Beschleunigungsmessers (x, y, z, hervorgehobene graue Säule, erweitert in B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Results

Die Präpulshemmung zeigte keinen Unterschied für Impuls 1 und 3 im Vergleich zu Impuls 5 (nur 120 dB), aber einen statistischen Unterschied für Impuls 2 und 4 (p < 0,05) (Abbildung 6).

Abbildung 6: Durchschnittliche Antwortamplituden auf den auditiven Reiz in den fünf Art...

Discussion

Dieses Protokoll stellte eine DIY-Verhaltensbox vor, um Prepuls-Hemmungsaufgaben bei frei verhaltenden Wistar-Ratten zu untersuchen und gleichzeitig Gehirndaten aufzuzeichnen (in diesem Beispiel das lokale Feldpotenzial und die Spike-Aktivität). Die Box kann mit Komponenten gebaut und angepasst werden, die üblicherweise in neurowissenschaftlichen Labors zu finden sind, und ist somit zugänglich und kostengünstig. Solche DIY-Lösungen ermöglichen auch mehr Flexibilität bei der Gestaltung un...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acryl-Box	Sonderanfertigung		5 mm dicke Acrylplatte, 20 cm x 25 cm x 25 cm
Selbstklebende Gummipuffer	Gorilla-Körnung	MPU6050	Durchmesser 0,8" und Höhe 0,38". Gummipads zur Stabilisierung der Acrylbox und zur Isolierung von äußeren Vibrationen. Die Höhe sollte mehr als 5 mm betragen, da sich unter der Box MPU6050 befindet.
Arduino Uno	Arduino	ATmega328P	Arduino-Mikrocontroller-Board auf Basis des ATmega328P mit 14 digitalen Ein-/Ausgangspins, 6 analogen Eingängen und einer Taktfrequenz von 16 MHz.
Cedrus Stim-Tracker (Audio-Detektor)	Cedrus	https://cedrus.com/stimtracker/index.htm	Der Cedrus Stim-Tracker erkennt akustische Reize und sendet TTL-Marker an die Daten des Beschleunigungsmessers.
Cineplex Forschungssystem	Plexon	https://plexon.com/plexon-systems/cineplex-behavioral-research-system/	Aufzeichnung des Videos des Tieres, synchronisiert mit elektrophysiologischen Daten.
Cyanoacrilat-Kleber		MPU6050	Sekundenkleber, um den MPU6050 unter der Schachtel fest zu befestigen.
Digitales Schallhebelmessgerät			Dezibel-Messgerät zur Kalibrierung der vor dem Experiment eingestellten Stimuli.
IBM SPSS	SPSS (Statistisches Paket für die Sozialwissenschaften, USA)		IBM SPSS Statistics-Softwareplattform.
Matlab (Englisch)	MathWorks (Englisch)	https://www.mathworks.com/products/matlab.html	MATLAB-Plattform für Datenanalyse, Algorithmenentwicklung und Modellerstellung.
Mikro-Edelstahlschraube			Brillenschrauben mit 1,2 mm Durchmesser und 4 mm Länge.
Mikroeletroden-Array	Hauseigene Sonderanfertigung		Es verwendet einen Omnetics-Stecker und Wolfram-Drähte mit 50 Mikrometern, die mit Parylene von California Fine Wire beschichtet sind.
Mikrofon			Mikrofon zur Erfassung akustischer Stimulation, die mit elektrophysiologischen Daten synchronisiert ist.
Artikel-Nr.: MPU-6050	InvenSense	https://invensense.tdk.com/products/motion-tracking/6-axis/mpu-6050/	MPU-6050 ist ein 3-Achsen-Gyroskop und ein 3-Achsen-Beschleunigungsmesser
Multichannel-Akquisitionsprozessor	Plexon	SPITZE/LFP	MAP Plexon zur Erfassung neuronaler elektrophyiologischer Daten SPIKE/LFP und auxiliärer Kanäle (Mikrofon, TTL-Marker, Beschleunigungsmesser).
NeuroForscher	Nex	https://www.neuroexplorer.com/	NeuroExplorer Datenanalyseprogramm mit kontinuierlich aufgezeichneten Signalen und Zeitstempeln (Spike-Züge, Verhaltensereignisse)
Neuroforscher	Nex Technologie	https://www.neuroexplorer.com/	Software für die neurophysiologische Datenanalyse von SPIKE und LFP.
Offline-Sortierer	Plexon	https://plexon.com/products/offline-sorter/#38957t34842	Software für die Offline-Spike-Sortierung.
OffLineSorter	Offline-Sortierer	https://plexon.com/products/offline-sorter/	Offline Sorter ist eine Offline-Spike-Sortiersoftware
Rektaler Veterinär-SpO2-Sensor	KTMED	FS-03	SpO2-Sensor für Kleintiere
Flachbandkabel			Dünnes Flachbandkabel zum Anschluss MPU6050 an Arduino.
Roboter-Bohrer	Neurostar	https://robot-stereotaxic.com/drill-injection-robot/	Roboterbohrer, der mit Neurostar stereotaktisch verwendet wird. Er kann durch einen manuellen Bohrer ersetzt werden.
Lautsprecher			Der Lautsprecher hat einen Bereich von 100 bis 40 kHz und eine Intensität von bis zu 150 dB.
Stereotaktische Apparatur	Neurostar		Stereotaktisches Mittel für die Neurochirurgie bei Nagetieren