Fortschritte in der Rinder-Organoid-Technologie unter Verwendung von Dünn- und Dickdarm-Monolayer-Grenzflächen

Die Kultivierung von Darmepithelstammzellen in dreidimensionalen (3D) Kulturen, den sogenannten Darmorganoiden, stellt einen bedeutenden Fortschritt in der In-vitro-Technologie zur Untersuchung von Darmfunktionen, Ernährung und Wechselwirkungen mit Krankheitserregern dar ^1,2. Diese Organoide ahmen die komplexe Struktur des In-vivo-Darmepithels nach, indem sie sich selbst replizieren und sich in 3D-Formationen organisieren, die verschiedene Darmzelllinien umfassen³. Dieses Merkmal unterstreicht ihr erhebliches Potenzial, das Verständnis der Darmbiologie voranzutreiben.

Das zunehmende Interesse an der Anwendung der Darmorganoid-Technologie bei Nutztieren erfordert die Verfeinerung der Kultur- und Erhaltungstechniken ^4,5. Die Bedeutung dieser Technologie wird durch ihre potenziellen Auswirkungen auf die Erforschung der Darmgesundheit von Nutztieren unterstrichen, die eine entscheidende Rolle für ihre Produktivität und damit für die Wirtschaftlichkeit der Lebensmittel- und Tierindustrie spielt, indem sie den Tierschutz und die Betriebskosten beeinflusst ^6,7. Insbesondere ist der Einsatz von Darmorganoidkulturen zur Erforschung der Darmfunktion von Rindern von größter Bedeutung, da sie als Reservoire für zoonotische enterische Krankheitserreger wie Salmonella spp. und Escherichia coli (E. coli) O157:H7⁸ dienen. Diese Krankheitserreger sind in bestimmten Segmenten des Darms lokalisiert, so dass es wichtig ist, die Methoden der Darmorganoid-Kultur nach Darmsegmenten zu unterscheiden, um die Genauigkeit in Studien zu erhöhen⁹.

Ein wesentliches Hindernis bei der Erforschung von Darmorganoiden ist der eingeschränkte Zugang zur apikalen Oberfläche der Epithelzelle¹⁰. Wenn die Zellen in einer extrazellulären Matrix (ECM) kultiviert werden, orientieren sie sich auf natürliche Weise so, dass die Basaloberfläche nach außen zeigt und die apikale Oberfläche nach innen gerichtet^{ist 10}. Um dieser Herausforderung zu begegnen, werden Methoden vorgestellt, bei denen 3D-Organoide in einzelne Zellen dissoziiert und in semipermeable Zellkulturinsertionen eingepflanzt werden. Dieser Aufbau stellt eine Grenzfläche zwischen der apikalen Oberfläche und einem basolateralen Kompartiment her. Dieses Protokoll zeigt, dass Zellen, die aus rinderintestinalen Organoiden gewonnen werden, eine kohärente 2D-Monoschicht bilden können, wie Messungen des transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER) und parazelluläre Permeabilitätstests belegen. Darüber hinaus wird die Entwicklung einer zellulären Polarität mit Bürstenrändern und Tight Junctions in den aus Organoiden gewonnenen 2D-Monoschichtzellen durch Immunfluoreszenz und Elektronenmikroskopie bestätigt, was die Eigenschaften des in vivo Darmepithels widerspiegelt.

In dieser Studie repräsentiert das Ileum den Dünndarmtrakt und das Rektum den Dickdarmtrakt. Diese Selektionen basieren auf relevanten enterischen Krankheitserregern wie Salmonella spp., die das Ileum¹¹ translozieren können, und E. coli O157:H7, von denen bekannt ist, dass sie hauptsächlich das Rektum⁹ bei Rindern besiedeln. Die Auswahl dieser spezifischen Darmsegmente unterstreicht die Notwendigkeit, die Methoden der Darmorganoid-Kultur auf die Darmregion zuzuschneiden, um die Präzision in der Forschung zu gewährleisten. Diese Methoden beschreiben das Verfahren zur effektiven Kultivierung einer von Organoiden abgeleiteten 2D-Monolayer-Schnittstelle aus diesen Darmsegmenten und bieten ein robustes Modell für die Erforschung der Darmgesundheit von Rindern, Krankheitserregerinfektionen und Wechselwirkungen zwischen dem Darmmikrobiom und dem Wirt.

Die Darmkrypten wurden aus überschüssigen Darmproben gewonnen, die in einem örtlichen Schlachthof bezogen wurden, und die Signale der Spender sind in der ergänzenden Tabelle 1 enthalten. Organoide wurden aus Geweben hergestellt, die von Tieren stammten, die in einem Schlachthof auf humane Weise eingeschläfert wurden, und die Tiere wurden nicht ausschließlich für diese Forschung beschafft; Daher ist diese Studie von der IACUC-Überprüfung ausgenommen, und eine Ethikerklärung ist nicht anwendbar.

1. ECM-Beschichtung auf Zellkultureinsätzen für Organoid-abgeleitete 2D-Monolayer-Kultur

HINWEIS: Alle Verfahren werden mit sterilisierten Materialien und aseptischen Techniken in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt. Alle Reagenzien werden während des gesamten Verfahrens auf Eis gehalten, sofern nicht anders angegeben.

1. Bereiten Sie 100 μl ECM für die Beschichtung jedes 0,33 cm² Zellkultureinsatzes vor, indem Sie Basalmedium mit 2 % (v/v) ECM-basiertem Hydrogel in einem Mikroröhrchen gründlich mischen.
2. Nehmen Sie den einzelnen Zellkultureinsatz mit einer sterilisierten Pinzette aus der Verpackung und legen Sie ihn einzeln in die Vertiefungen einer 24-Well-Zellkulturplatte mit klarem Boden und flachem Boden.
3. 100 μl der in Schritt 1.1 hergestellten EZM-Beschichtung auf die apikale Kammer jedes in Schritt 1.2 vorbereiteten Zellkultureinsatzes auftragen.
4. Setzen Sie den Deckel wieder auf und inkubieren Sie die Zellkulturplatte mit den beschichteten Zellkultureinsätzen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂ für 1 h.
   1. Bei ilealen Organoidzellen ist der Einsatz nach 1 h Inkubation gebrauchsfertig. Bei rektalen Organoidzellen ist nach 1 h Inkubation die EZM-Beschichtung durch rektales Monolayer-Kulturmedium zu ersetzen und über Nacht zu inkubieren (Tabelle 1). Bereiten Sie zusätzliche Zellkultureinsätze für Blindkontrollen vor, wenn Sie TEER-Messungen durchführen sollen.

Tabelle 1: Zusammenfassung des optimierten Protokolls zur Erstellung von 2D-Monolayern, die aus adulten bovinen, ilealen und rektalen Organoiden gewonnen wurden.

2. Aussaat von ilealen und/oder rektalen Organoidzellen von Rindern und 2D-Monolayer-Kultur

HINWEIS: Das in diesem Abschnitt beschriebene Protokoll verwendet Rinder-Ileum- und Rektalorganoide, die unter Verwendung der beschriebenen Techniken auf 48-Well-Platten kultiviert und aufbewahrt wurden⁵. Für optimale Ergebnisse wird empfohlen, stabil erhaltene Organoide zu verwenden, die mehr als 3x nach der Erstetablierung und länger als 3 Tage nach der letzten Passage kultiviert wurden.

1. Ohne die EZM-basierte Hydrogelkuppel mit reifen Organoiden zu beschädigen, entfernen Sie das Organoid-Nährmedium mit einer Einweg-Glaspasteurpipet, die an ein Vakuumsystem angeschlossen ist, und fügen Sie 300 μl eiskalte ECM-Depolymerisationslösung pro Vertiefung hinzu. Mindestens 1 h bei 4 °C inkubieren.
   HINWEIS: Alternativ können Sie die Organoide, die eine Hydrogelkuppel auf ECM-Basis enthalten, nach der Zugabe von ECM-Depolymerisationslösung mechanisch aufbrechen und die Suspension in einem konischen 15-ml-Röhrchen auffangen, bevor Sie sie bei 4 °C inkubieren. Diese Methode wird empfohlen, wenn Organoide, die nicht für die 2D-Monolayer-Kultur vorgesehen sind, gleichzeitig auf derselben Platte kultiviert werden. Die Dichte der Organoidkulturen beeinflusst maßgeblich die Anzahl der erforderlichen Organoid-Kulturvertiefungen für eine optimale Aussaat in die Zellkultureinsätze.
   1. Für Organoidkulturen mit hoher Dichte (Ergänzende Abbildung 1A) wird für rektale Zellkultureinsätze ein Aussaatverhältnis im Bereich von 1:1 bis 1:2 verwendet, was bedeutet, dass eine Kulturvertiefung ein bis zwei Vertiefungen aussäen kann. Halten Sie für Ileum das Verhältnis bei 1:1. Im Gegensatz dazu erfordern Kulturen mit geringerer Dichte (Ergänzende Abbildung 1B) mehr Kulturvertiefungen; Verwenden Sie 3-4 rektale Organoid-Kulturvertiefungen für einen rektalen Zellkultureinsatz (Verhältnis 3-4:1) und 4-5 ileale Organoid-Kulturvertiefungen für einen ilealen Zellkultureinsatz (Verhältnis 4-5:1).
2. Prüfen Sie visuell auf vollständige EZM-basierte Hydrogelauflösung und sammeln Sie die Organoidsuspension in einem konischen 15-ml-Röhrchen.
3. Organoide durch Zentrifugation bei 200 x g und 4 °C für 5 min pelletieren. Überstand verwerfen. Resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml rekombinanter Zelldissoziationsenzymlösung, die mit 10 μM Y-27632 ergänzt wird.
4. Inkubieren Sie die Organoidsuspension in einem 37 °C Wasserbad für 10 Minuten mit intermittierendem Schütteln von 3-5 s und einem Wirbel alle 2-3 Minuten, um eine effektive Organoiddissoziation zu ermöglichen.
5. Nach dem enzymatischen Verdau fügen Sie 5 ml Basalmedium hinzu und pipettieren Sie aggressiv mit einer P1000-Mikropipette, um Organoide weiter in einzelne Zellen aufzuspalten. Untersuchen Sie die Suspension auf Organoid-Klumpen und wiederholen Sie das Pipettieren, wenn es noch visuell wahrnehmbar ist, um die Einzelzelldissoziation zu verbessern.
6. Bereiten Sie ein konisches 50-ml-Röhrchen mit einem 70-μm-Zellsieb vor. Befeuchten Sie das Sieb mit 1-2 ml Basalmedium.
7. Filterzellsuspension durch das Sieb, um Reste von ECM-basierten Hydrogelablagerungen und große Zellklumpen zu entfernen. Spülen Sie das ursprüngliche 15-ml-Röhrchen und das 70-μm-Zellsieb mit zusätzlichen 10 mL Basalmedium.
   HINWEIS: Wenn die Zellsuspension nicht leicht durch ein Sieb gelangt, kann dies ein Hinweis auf eine unvollständige Organoiddissoziation sein. Es kann versucht werden, die gesammelte Zellsuspension erneut durch dasselbe 70-μm-Zellsieb zu leiten. Zusätzliche enzymatische oder mechanische Störungen können erforderlich sein.
8. Pellet-Einzellige Suspension durch Zentrifugation bei 200 x g und 4 °C für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen mit einem geeigneten Volumen Basalmedium, um die Zellzählung durchzuführen.
9. Zählen Sie lebensfähige Zellen mit einem Hämozytometer nach der Trypanblau-Färbung, um die Gesamtzahl der entnommenen Zellen zu berechnen.
10. Pellet-Einzellige Suspension durch Zentrifugation bei 200 x g und 4 °C für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen auf die entsprechende Aussaatdichte in dem jeweiligen Monolayer-Kulturmedium (Tabelle 1).
    1. Bei ilealen Organoidzellen resuspendieren Sie die Zellen auf eine Konzentration von 2,5 x 10⁶ Zellen/ml, um eine Aussaatdichte von 5 x 10⁵ Zellen pro Zellkultureinsatz in 200 μl ilealem Monolayer-Kulturmedium zu erreichen, bei dem es sich um das Organoid-Kulturmedium handelt, das mit 500 nM LY2157299, 10 μM Y-27632 und 20 % fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt wird.
    2. Bei rektalen Organoidzellen resuspendieren die Zellen auf eine Konzentration von 1,5 x 10⁶ Zellen/ml, um eine Aussaatdichte von 3 x 10⁵ Zellen pro Zellkultur zu erreichen. Insert in 200 μl rektales Monolayer-Kulturmedium, d. h. das Organoid-Kulturmedium, ergänzt mit 100 nM CHIR99021, 500 nM LY2157299, 10 μM Y-27632, und 20 % FBS.
11. Entnehmen Sie die 24-Well-Zellkulturplatte mit ECM-beschichteten Zellkultureinsätzen und entleeren Sie die apikale Kammer des Zellkultureinsatzes mit vorsichtiger Vakuumabsaugung, um die Beschichtung nicht zu stören.
12. 200 μl der in Schritt 2.10 hergestellten Einzelzellsuspension werden vorsichtig in die apikale Kammer des Zellkultureinsatzes aufgetragen. Für die Blindkontrolle geben Sie 200 μl Kulturmedium ohne Zellen in die apikale Kammer. Für die Blindkontrolle geben Sie 200 μl Kulturmedium ohne Zellen in die apikale Kammer.
13. Tragen Sie 500 μl angemessen ergänztes Monolayer-Kulturmedium (abhängig von ilealen oder rektalen Zellen) auf die basolaterale Kammer jeder Vertiefung auf.
14. Inkubieren Sie in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂ , um die Zelladhäsion und das Zellwachstum zu erleichtern und eine konfluente 2D-Monoschicht auf dem Zellkultureinsatz zu bilden.
15. Wechseln Sie die Kulturmedien sowohl in den apikalen als auch in den basolateralen Kammern jeden zweiten Tag, beginnend 48 Stunden nach der Zellaussaat. Stellen Sie sicher, dass die Inkubationszeit für das Blindsteuerelement und die zellenthaltende Einfügung gleich ist.

3. TEER-Messung

HINWEIS: Bei der hier beschriebenen Methode wird ein kommerziell erhältliches manuelles TEER-Messsystem verwendet, das als epitheliales Voltohmmeter mit einem Paar Ag/AgCl-Elektroden bekannt ist (Abbildung 1A). Die Bestimmung von TEER über eine 2D-Monoschicht erfordert die Messung von Blind-Wells. Stellen Sie sicher, dass der Blindwert auf die gleiche Weise wie die Probe entnommen wird.

1. Entnehmen Sie eine Platte mit Zellkultureinsätzen mit Organoid-abgeleiteten 2D-Monolayer(n) und Rohling aus dem Inkubator. Lassen Sie die Platte ca. 10 min auf Raumtemperatur kommen.
2. Desinfizieren Sie die Elektroden mit 70% Ethanol und lassen Sie sie vollständig trocknen.
3. Führen Sie die Elektroden vorsichtig mit dem kurzen Ende in der apikalen Kammer und dem langen Ende in der basolateralen Kammer ein (Abbildung 1A).
   HINWEIS: Besondere Vorsicht ist geboten, um die Zellmonoschicht nicht zu stören.
4. Lassen Sie den Messwert ausgleichen und zeichnen Sie den Wert in Ohm auf, wenn er sich stabilisiert.
   HINWEIS: Die Empfindlichkeit des Voltohmmeters ist so, dass bei der Messung des elektrischen Widerstands Schwankungen des Ohmwerts auftreten. Ein zuverlässiger Messwert wird erhalten, wenn sich die Messungen stabilisieren und konstant um einen Plateauwert schweben.
5. Bestimmen Sie den TEER der 2D-Monoschicht mit der folgenden Formel:
   TEER (Ω x^{cm 2}) = Oberfläche der Zellkultureinsätze (^{cm 2}) x elektrischer Nettowiderstand
   Dabei ist der elektrische Nettowiderstand gleich dem gemessenen Widerstand des Zellen-Monolayer-Einsatzes abzüglich des gemessenen Widerstands des Rohlingseinsatzes. Zellkultureinsätze für 24-Well-Platten haben eine Oberfläche von 0,33 cm².

Abbildung 1: Bewertung der Integrität der Epithelbarriere von 2D-Monolayern aus Rinderintestinalorganoiden. (A) Schematische Darstellung der geeigneten Positionierung der Elektroden in den apikalen und basolateralen Kammern eines Zellkultureinsatzes für TEER-Messungen. Die kurze Elektrode wird in die apikale Kammer eingeführt, und die lange Elektrode wird in der basolateralen Kammer mit Vorsicht platziert, um einen Kontakt mit der Membran zu vermeiden. (B) Schematische Darstellung des Permeabilitätstestverfahrens. Die Zellkulturkammern werden 2x mit erwärmtem PBS gewaschen und 0,5 mg/ml 4 kDa FITC-Dextran-Tracer, gelöst in PBS, auf die apikale Kammer aufgetragen. Wiederholte 50 μl Aliquots aus der basolateralen Kammer werden unter Wechsel eines gleichen Volumens PBS entnommen, um das Gesamtvolumen in der basolateralen Kammer während der gesamten Dauer der Inkubationszeit zu erhalten. Die Fluoreszenzintensität des Aliquots wird mit einem Mikroplatten-Reader gemessen, um die Diffusion des 4 kDa FITC-Dextran-Tracers über die Zellmonoschicht zu quantifizieren. (C) Die dynamische Entwicklung der Barriereintegrität in ilealen und rektalen Monoschichten im Laufe der Zeit wurde unter Verwendung von TEER-Messungen (dargestellt durch geschlossene Kreise für das Ileum und geschlossene Quadrate für das Rektum) und Permeabilitätsassays (gekennzeichnet durch offene Kreise für das Ileum und offene Quadrate für das Rektum) mit einem 4 kDa FITC-Dextran-Tracer bewertet. Am 3. Tag der Kultur zeigten beide Arten von Monolayern die Etablierung stabiler und funktioneller Epithelbarrieren, was durch ihre jeweiligen TEER- und Permeabilitätsprofile belegt wird. Die Ergebnisse sind der Mittelwert von mindestens zwei unabhängigen Experimenten mit zwei technischen Replikaten. Fehlerbalken stellen das SEM der Messungen dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

4. Parazellulärer Permeabilitätstest

HINWEIS: Dieser Assay beinhaltet die Bestimmung der Fluoreszenzintensität, die sich aus der Diffusion von Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-Dextran von der apikalen Kammer in die basolaterale Kammer über 2D-Monoschichten über 120 min ergibt (Abbildung 1B). Für optimale Ergebnisse wird empfohlen, die Lichtexposition während des Assays zu minimieren und unmittelbar nach jeder Probenahme Messungen in einem Mikroplatten-Reader durchzuführen, um eine Abnahme oder Löschung der Fluoreszenz zu verhindern. Jedes Well kann nur einmal verwendet werden und kann in nachfolgenden Assays nicht wiederverwendet werden. Bereiten Sie mindestens 2 Wells vor, die als technische Replikate für jeden Assay dienen. Zum Beispiel sind insgesamt 6 Wells erforderlich, um die in Abbildung 1C dargestellten Ergebnisse zu erhalten, wobei die Assays zu 3 verschiedenen Zeitpunkten (Tage 1, 3 und 5 der Kultur) doppelt durchgeführt wurden.

1. Herstellung von Standardkurvenverdünnungsreihen mit 4 kDa FITC-Dextran in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Pipettieren Sie für jede Verdünnung 50 μl in dreifacher Ausfertigung auf eine 96-Well-Platte.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, eine Reihe von 5-7 Verdünnungen im Bereich von 0 bis 0,5 mg/ml zu erstellen.
2. Bestimmen Sie die Fluoreszenzintensität der Standards in einem vorkalibrierten Mikroplatten-Reader bei einer Anregungswellenlänge von 495 nm und einer Emissionswellenlänge von 535 nm.
3. Berechnen Sie die lineare Regression mit den Ergebnissen der Fluoreszenzintensität, um eine Standardkurve zu erstellen.
4. Entnehmen Sie eine Platte mit Zellkultureinsätzen mit Organoid-abgeleiteten 2D-Monolayer(n) aus dem Inkubator. Entfernen Sie das Monolayer-Kulturmedium aus der apikalen und basolateralen Kammer des Zellkultureinsatzes, der die aus Organoiden gewonnene 2D-Monoschicht enthält, die beurteilt werden soll.
5. Waschen Sie jede Kammer 2x vorsichtig mit 200 μl (apikale Kammer) bzw. 500 μl (basolaterale Kammer) vorgewärmtem PBS.
6. Entfernen Sie die Waschlösung aus der apikalen Kammer und tragen Sie 200 μl 0,5 mg/ml 4 kDa FITC-Dextran-Tracer in PBS auf die apikale Kammer des Zellkultureinsatzes auf.
7. In einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂ 20 min inkubieren.
8. Nehmen Sie eine Probe von 50 μl aus der basolateralen Kammer der inkubierten 24-Well-Platte und übertragen Sie sie auf eine mit Mikroplatten-Readern kompatible 96-Well-Platte.
9. 50 μl frisches PBS in die basolaterale Kammer der beprobten Vertiefung einsetzen.
10. Führen Sie sofort eine Fluoreszenzintensitätsmessung in einem vorkalibrierten Mikroplatten-Reader bei einer Anregungswellenlänge von 495 nm und einer Emissionswellenlänge von 535 nm durch.
11. Wiederholen Sie die Schritte 4.6-4.10 alle 20 min bis 120 min. Wenn am Ende des Assays eine Konservierung der 2D-Monoschicht gewünscht wird, spülen Sie sowohl die apikale als auch die basolaterale Kammer mit frischem PBS 2x, ersetzen Sie sie durch frisches Monolayer-Kulturmedium und inkubieren Sie.
    HINWEIS: Es können weitere Evaluierungen von 2D-Monolayern durchgeführt werden, z. B. TEER-Messungen, Immunfluoreszenzfärbung usw.; Es wird jedoch nicht empfohlen, da ein rückständiger fluoreszierender Tracer wahrscheinlich ist und die Analyse beeinflussen kann.
12. Bestimmen Sie den scheinbaren Permeabilitätskoeffizienten (P_app) mit der folgenden Formel:
    
    ΔQ / Δt = Konzentration des fluoreszierenden Tracers, die die Monoschicht über die spezifische Zeitdauer in die basolaterale Kammer des Zellkultureinsatzes gelangt ist, gemessen an der Fluoreszenzintensität und über die Standardkurve auf μg/mL extrapoliert
    A = Oberfläche der Zellkultureinsätze
    C_o = Konzentration des fluoreszierenden Tracers, der der apikalen Kammer des Zellkultureinsatzes zugesetzt wird, in μg/ml

5. Immunfluoreszenzfärbung von Organoid-abgeleiteten 2D-Monoschichten

1. Entfernen Sie das Monolayer-Kulturmedium mit Vakuumsauger aus dem Zellkultureinsatz und fügen Sie 200 μl 4 % Paraformaldehyd (PFA) hinzu. Zur Zellfixierung 15-30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
2. PFA mit Vakuumsauger entfernen und mit 100 μL PBS 2x waschen.
3. Permeabilisieren Sie Zellen mit 100 μl 0,3 % Triton X-100 in 2 % Rinderserumalbumin (BSA) in PBS, indem Sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren.
4. Überstand mit Vakuumabsaugung entfernen und mit 100 μL PBS 2x waschen.
5. Überstand entfernen und durch 2 % BSA in PBS ersetzen und zur Blockierung 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
6. Überstand entfernen, 100 μl Primärantikörper, verdünnt in 2 % BSA in PBS, aufbringen und 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C inkubieren.
   HINWEIS: Die Konzentrationen der verwendeten Primärantikörper sind in der Materialtabelle aufgeführt. Sofern nicht anders angegeben, werden die Empfehlungen des Herstellers befolgt.
7. Überstand entfernen und mit 100 μl PBS 3x waschen.
8. 100 μl Sekundärantikörper, verdünnt in 2 % BSA in PBS, geben und 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C inkubieren.
   HINWEIS: Dieser Schritt kann übersprungen werden, wenn der verwendete Primärantikörper mit einer Fluoreszenzsonde konjugiert wird. Die Konzentrationen der verwendeten Sekundärantikörper sind in der Materialtabelle aufgeführt. Sofern nicht anders angegeben, werden die Empfehlungen des Herstellers befolgt.
9. Überstand entfernen und mit 100 μl PBS 3x waschen.
10. Optional: Für die Gegenfärbung von F-Aktin und -Kernen (DAPI) durch Mischen beider Sonden in geeigneter Verdünnung (gemäß Herstellerempfehlung) in PBS vorbereiten, 100 μl auftragen und 30 min bei Raumtemperatur inkubieren. Überstand entfernen und mit 100 μl PBS 3x waschen.
11. Schneiden Sie die Membran des Zellkultureinsatzes vorsichtig mit einer Skalpellklinge aus und montieren Sie sie mit einer Einstecklösung auf einen Objektträger. Legen Sie ein Deckglas an und beobachten Sie.

Dieses Protokoll erzeugt zuverlässig robuste, von Organoiden des Rinderdarms abgeleitete 2D-Monoschichten aus dem Dünn- und Dickdarmtrakt und emuliert die Komplexität des in-vivo-Darmepithels . Bei dieser Methode werden reife Organoide verwendet, die aus Darmgrubenproben gesunder Rinder entwickelt wurden, die unter optimierten Bedingungen kultiviert wurden. Interessanterweise sind die erfolgreichen und wiederholbaren Bedingungen für die von Organoiden abgeleiteten 2D-Monoschichten einzigartig für das Segment des Darms (Tabelle 1). Dies unterstreicht, wie wichtig es ist, optimierte Kulturtechniken für das interessierende Darmsegment zu haben.

1 Tag nach der Aussaat dissoziierter reifer Organoide auf einen Zellkultureinsatz schien sich eine 2D-Monoschicht zu bilden (Abbildung 2A). Trotz dieses anfänglichen Auftretens blieben die TEER-Messungen sowohl für ileale als auch für rektale Monoschichten zu diesem Zeitpunkt niedrig (Abbildung 1C). Darüber hinaus zeigte ein parazellulärer Permeabilitätstest, dass die Monoschicht nach nur 1 Tag Kultivierung die Passage eines 4 kDa FITC-Dextran-Tracers durch die Zellschicht ermöglichte (Abbildung 1C). Am 3. Tag der Kultur zeigten beide Arten von Organoid-abgeleiteten 2D-Monoschichten eine signifikante Reifung, die sich in erhöhten TEER-Werten und Resistenz gegen den 4 kDa FITC-Dextran-Tracer zeigte, ein Trend, der sich bis zum 5. Tag der Kultur fortsetzte.

Besonders bemerkenswert ist die Variabilität zwischen den Spezies, bei der trotz niedrigerer TEER-Werte von 2D-Monolayer-Kulturen von Rinderorganoiden im Vergleich zu menschlichen und hunden unter ähnlichen Bedingungen 12,13,14,15 die Integrität der Membran intakt bleibt. Diese Schlussfolgerung ergibt sich aus der angemessenen Reaktion der Monoschichten in Permeabilitätsassays, was darauf hindeutet, dass niedrige TEER-Werte in Rinderproben nicht unbedingt auf einen Mangel an Barrierefunktion zurückzuführen sind. Diese Integrität ist entscheidend für eine funktionelle Epithelbarriere und wird durch die sorgfältige Interpretation der Permeabilitätsassay-Ergebnisse zusammen mit TEER-Messungen effektiv demonstriert.

Die Visualisierung der zellulären Abgrenzung und der gut entwickelten Mikrovilli auf der apikalen Oberfläche der 2D-Monoschichten mit Rasterelektronenmikroskopie, die spezialisierte mikroanatomische Strukturen zeigt, verstärkte die Reifung sowohl der ilealen als auch der rektalen Organoid-abgeleiteten 2D-Monoschichten weiter (Abbildung 2B). Darüber hinaus bestätigte die Immunfluoreszenzfärbung der 2D-Monoschichten das Vorhandensein von apikalen Bürstenrand, basolateralen Adhärenzverbindungen und schleimproduzierenden Becherzellen sowohl in ilealen (Abbildung 3A) als auch in rektalen (Abbildung 3B) Organoid-abgeleiteten 2D-Monoschichten. Diese Ergebnisse bestätigen, dass die entwickelte 2D-Monoschicht in Zusammensetzung und Bildung komplex ist und nicht nur Schlüsselmerkmale eines intakten Darmepithels zum Ausdruck bringt, sondern auch aus einer zellulären Population mit mehreren Linien besteht.

Die erfolgreiche Entwicklung von 2D-Monoschichten beruht auf der Adhärenz der Zellen an der EZM und dem Wachstum an der Konfluenz, um eine intakte Epithelschicht zu schaffen. Insbesondere eine ungleichmäßige EZM-Verteilung oder suboptimale Bedingungen während der Inkubation auf dem Zellkultureinsatz können zu einer teilweisen Ablösung der Zellschicht führen, die sich besonders an ihren Rändern bemerkbar macht (Abbildung 4Ai). Dieses Problem wird noch verschärft, wenn die Zellen mit einer höheren als der optimalen Dichte ausgesät werden oder die Aussaatzellen nicht gleichmäßig über die Kulturoberfläche verteilt sind, ein Szenario, das oft auf die unvollständige Dissoziation von Organoiden in eine einzelne Zellsuspension zurückzuführen ist. Eine solche ungleichmäßige Verteilung kann zur Bildung von Lücken innerhalb der Monoschicht und/oder zur 3D-Morphogenese auf einem Zellkultureinsatz führen (Abbildung 4Aii). Im Gegensatz dazu kann eine Untersaat der Zellen auch zu einer erfolglosen oder verzögerten Monolagenentwicklung über den erwarteten Kulturzeitraum führen, was sich versehentlich auf die Effizienz nachfolgender Studien mit dem 2D-Monolayer-System auswirkt (Abbildung 4Aiii). Darüber hinaus kann eine Kontamination des Kultursystems auch zur Bildung von Lücken innerhalb der Monoschicht führen, die die einmal gebildete konfluente Monoschicht in einem späteren Stadium der Kultur stören (Abbildung 4Aiv). Anhaltende TEER-Werte und die Reaktion auf die parazelluläre Permeabilität können durch Störungen in der Zellschicht durch aggressive Wasch- oder Handhabungstechniken beeinflusst werden, selbst wenn die oben genannten potenziellen Ursachen für das Versagen vor diesen Assays nicht festgestellt wurden (Abbildung 4B). Daher ist eine sorgfältige Zellhandhabung und die Bewertung der Bildung oder Störung von Monolagen von größter Bedeutung für die erfolgreiche Entwicklung von Organoid-abgeleiteten 2D-Monoschichten durch die effektive Anwendung von Strategien zur Fehlerbehebung.

Abbildung 2: Mikroskopische Charakterisierung der von Rindern, ilealen und rektalen Organoiden abgeleiteten 2D-Monoschichten. (A) Repräsentative Phasenkontrastmikroskopie-Bilder von 2D-Monoschichten an Tag 1 und Tag 3 (D1 und D3) der Kultur auf einem Zellkultureinsatz. Maßstabsbalken = 100 μm. (B) Repräsentative Rasterelektronenmikroskopie-Aufnahmen von 2D-Monolayern mit unterer (links) und höherer (rechts) Vergrößerung. Eine detaillierte Zelloberflächenstruktur, einschließlich Mikrovilli, kann sowohl in ilealen (oben) als auch in rektalen (unten) Monoschichten wahrgenommen werden. Linker Maßstabsbalken = 10 μm, rechter Maßstabsbalken = 2 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Immunfluoreszenzcharakterisierung von 2D-Monoschichten, die von ilealen und rektalen Organoiden abgeleitet sind. (A, B) Das Panel (A) zeigt ileale und das Panel (B) zeigt rektale Organoide. Auf der linken Seite sind F-Aktin-Fasern mit Phalloidin (rot) hervorgehoben, was die Architektur des Zytoskeletts und die Bildung apikaler Bürstenränder veranschaulicht. Das mittlere Bild zeigt die basolaterale Lokalisation von Adhärens-Verbindungen, markiert durch E-Cadherin (grün), was auf die Zell-Zell-Adhäsion und die Integrität der Monoschicht hinweist. Auf der rechten Seite ist das Vorhandensein von Mucin-produzierenden Becherzellen durch SNA (grün) gekennzeichnet, wobei ein Z-Stapel-Bild die apikale Sekretion von Muzin in der ilealen Monoschicht darstellt. Die Zellkerne wurden in allen Bildern mit DAPI (blau) gegengefärbt. Darüber hinaus zeigt die Z-Stack-Bildgebung über alle Bilder hinweg die Bildung einer einzelnen Zellschicht innerhalb des Kultureinsatzes. Maßstabsleiste = 25 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Charakterisierung der suboptimalen 2D-Monolagenbildung. (A) repräsentative Phasenkontrastbilder, die (i) die teilweise Ablösung der Monoschicht entlang des Randes des Zellkultureinsatzes zeigen; (ii) die Entwicklung von 3D-Auswüchsen und die Bildung von Lücken innerhalb der Monoschicht; iii) unvollständige oder verzögerte Monolagenbildung aufgrund einer geringeren als der optimalen Aussaatdichte, die sich als lückenhafte Adhärenz der Zellen bemerkbar macht; und (iv) Bildung von Lücken innerhalb der einmal gebildeten 2D-Monoschicht in einem späteren Stadium, wahrscheinlich als Folge einer vermuteten Kontamination. Maßstabsbalken = 100 μm. (B) Abnehmende TEER-Messungen in Verbindung mit steigenden Permeabilitätsprofilen nach Tag 3 deuten darauf hin, dass es nicht gelungen ist, stabile und funktionelle Epithelbarrieren zu etablieren. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) aus einem einzigen Experiment mit zwei technischen Replikaten dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: Dichtevariationen in Organoidkulturen des Rinderdarms in EZM-basiertem Hydrogel. Organoide des Rinderdarms, die in einem Hydrogel auf EZM-Basis kultiviert wurden; (A) hohe Dichte und (B) niedrige Dichte. Maßstabsleiste = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 1: Zusammengefasste Signale von Gewebespendern. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.