Entwicklung eines unkomplizierten Modells für ein leichtes Schädel-Hirn-Trauma, modifiziert durch Weight-Drop-Methode und nachgewiesen durch Magnetresonanztomographie

Ein leichtes Schädel-Hirn-Trauma (mTBI) wird hauptsächlich bei Sportlern beobachtet, die Kontaktsportarten ausüben, Militärveteranen und Personen, die in Verkehrsunfälle verwickelt sind¹. Sie macht mehr als 85 % aller gemeldeten Kopfverletzungen^{aus 2}. Die weitreichende Ätiologie des mSHT und seine zunehmende weltweite Inzidenz unterstreichen die Einbeziehung des mTBI als vorläufiger umweltbedingter Risikofaktor für spät einsetzende neurodegenerative Erkrankungen³. Ein unkompliziertes leichtes SHT zeichnet sich durch einen Glasgow Coma Score (GCS) von 13-15 aus, wobei in der Computertomographie (CT) oder Magnetresonanztomographie (MRT) keine strukturellen Anomalien beobachtet werden. Häufige Symptome bei Patienten mit unkompliziertem mTBI sind Kopfschmerzen, Schwindel, Übelkeit oder Erbrechen sowie Müdigkeit. Die longitudinale Bewertung der Ergebnisse nach einem unkomplizierten mSHT stellt jedoch aufgrund der hohen Dropout-Rate bei Patienten erhebliche Herausforderungen^{dar 4}.

Die Besorgnis über wiederholtes mSHT hat zugenommen, insbesondere innerhalb der Profisportlergemeinschaft der National Football League (NFL), was in der Folge das Bewusstsein bei Nicht-Profisportlern geschärft^{hat 5}. Es wird davon ausgegangen, dass die Verwundbarkeit des Gehirns nach dem ersten mTBI zunimmt, wobei nachfolgende Beleidigungen die Verletzungsergebnisse möglicherweise verschlimmern. Jüngste Befunde aus der größten gespendeten Gehirnkohorte von Fußballspielern deuten nicht nur auf eine frühere Teilnahme am Fußball für den Schweregrad der chronischen traumatischen Enzephalopathie (CTE) hin, sondern deuten auch auf eine Korrelation zwischen verschiedenen fußballbezogenen Faktoren und dem Risiko und der Schwere von CTE⁶ hin. Daher wächst die Besorgnis über den Einfluss der Anzahl der Gehirnerschütterungen und des repetitiven Regimes auf den Verletzungsverlauf. In der präklinischen Forschung wurden neuropathologische Veränderungen, neuroinflammatorische Kaskaden und neuropsychologische Beeinträchtigungen nach wiederholtem mTBI unter Verwendung verschiedener Modelle für geschlossene Kopfverletzungen (CHI) untersucht 7,8,9,10,11,12,13,14 . Die Untersuchung von Aufprallparametern am unkomplizierten mTBI-Modell, das sportbedingte repetitive Erschütterungsstöße, die in der akuten Phase zu Funktionsbeeinträchtigungen und in der chronischen Phase zu Hirnatrophie führen, nachahmen kann, ist jedoch nicht gut untersucht.

Die Diffusions-Tensor-Bildgebung (DTI), eine Technik zur Beurteilung der Diffusion von Wassermolekülen, wird häufig in Studien zur Untersuchung der Auswirkungen von mSHT eingesetzt. Die fraktionale Anisotropie (FA), eine Schlüsselmetrik, die von der DTI abgeleitet wird, quantifiziert den Grad der Wasserdiffusivitätskohärenz und liefert Informationen über die strukturelle Organisation von Axonen und Nervenfaserbündeln. Eine Störung der FA-Werte in der weißen Substanz (WM) wurde nach mTBI in verschiedenen Modellen 8,10,11,15,16,17 vorgeschlagen. Darüber hinaus veränderten sich die axiale Diffusivität (AD) und die radiale Diffusivität (RD), die auf die Integrität des Axons und des Myelins hinweisen, nach mTBI in präklinischen Studien 10,15,16,18,19,20. Diskrepanzen in den DTI-Ergebnissen früherer Studien sind jedoch wahrscheinlich auf Unterschiede im Schweregrad des mTBI, Unterschiede in den Aufprallparametern, unterschiedliche mTBI-Modelle und inkonsistente Nachbeobachtungszeitpunkte nach der Verletzung^{zurückzuführen 9}.

Das vorliegende Protokollpapier zielt daher darauf ab, ein Tiermodell für mSHT zu etablieren, das die kumulativen Auswirkungen von einmaligem und wiederholtem mSHT bewerten soll. Wir haben umfassende und longitudinale Bewertungen einbezogen, einschließlich Bewertungen des Wohlbefindens der Tiere, der Verhaltensergebnisse, der DTI-Parameter und des kortikalen Volumens, um dynamische Veränderungen nach der Verletzung zu erfassen und die Auswirkungen verschiedener Wirkungsparameter zu untersuchen. Durch den Nachweis sowohl akuter funktioneller Beeinträchtigungen als auch langfristiger mikrostruktureller Veränderungen repliziert dieses Modell effektiv die Schlüsselmerkmale eines unkomplizierten mTBI, die in früheren Tierstudien nicht vollständig berücksichtigt wurden. In dieser Arbeit haben wir ein detailliertes Protokoll für die Entwicklung eines unkomplizierten mTBI-Modells unter Verwendung einer modifizierten Closed-Head-Weight-Drop-Methode ^8,11 und die Durchführung einer Längsschnittbewertung nach mSHT bereitgestellt.

Die Studie wurde in Übereinstimmung mit den Empfehlungen der National Institutes of Health Guidelines for Animal Research (Guide for the Care and Use of Laboratory Animals) und der Animal Research: Reporting In Vivo Experiments Guidelines durchgeführt. Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Nationalen Yang Ming Chiao Tung Universität genehmigt. Zwanzig Tiere wurden nach dem Zufallsprinzip 5 Gruppen zugeteilt (n = 4 pro Gruppe): (i) einmalige Stöße auf den sensomotorischen Kortex (SMCx/einfach), (ii) doppelte Stöße auf SMCx mit dem 1-h-Intervall (SMCx/2 Treffer/1 h), (iii) doppelte Stöße auf SMCx mit dem 10-Minuten-Intervall (SMCx/2 Treffer/10 min), (iv) doppelte Stöße auf das Zentralhirn mit dem 1-Stunden-Intervall (Zentral/2 Treffer/1 h), und (v) die Scheingruppe, die nur operiert wurde, aber nicht direkt auf den Kopf aufprallte, für die longitudinale Ergebnisbewertung (Abbildung 1). Bemerkenswert ist, dass die für diese Studie ausgewählten Intervalle zwischen den Verletzungen (1-Stunden- vs. 10-Minuten-Intervalle) so konzipiert wurden, dass sie die wiederholten subkonkussiven Stöße 8,10,11,13,21 nachahmen, die bei den Athleten, die Kontaktsportarten ausüben, bis zu tausend Mal innerhalb einer einzigen Saison auftreten können ^22,23.

1. Induktion einer geschlossenen Kopfverletzung (CHI)

HINWEIS: Erwachsene männliche Sprague-Dawley-Ratten im Alter von 10 bis 12 Wochen und mit einem Gewicht von mehr als 250 g werden in einem 12/12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus mit Ad-libitum-Zugang zu Futter und Wasser untergebracht.

1. Setzen Sie die Ratte in eine kleine Induktionskammer und betäuben Sie sie mit einer Mischung aus Isofluran (5%) und medizinischer Luft (2,5-3 L/min). Nimm die Ratte aus der Kammer, bis sie nicht mehr auf ein Pfoten- oder Schwanzkneifen reagiert.
2. Lege die Ratte auf das Heizkissen.
   HINWEIS: Schalten Sie das Heizkissen während der Operation ein, um die Körpertemperatur der Ratten zu halten.
3. Bringen Sie die Ratte auf einen stereotaktischen Rahmen und sichern Sie ihn mit einer Zahnstange. Verabreichen Sie Isofluran in einer Menge von 2 % über den angeschlossenen Nasenkonus mit medizinischer Luft bei einer Durchflussrate von 1,5-2 l/min zur Aufrechterhaltung während der Operation.
4. Positionieren Sie die Ohrbügel. Stellen Sie sicher, dass die Ratte zentriert und symmetrisch auf dem stereotaktischen Rahmen steht.
   HINWEIS: Alle chirurgischen Eingriffe sollten unter aseptischen Bedingungen durchgeführt werden. Die Instrumente wurden vor der Operation mit einem Dampfautoklaven sterilisiert, ihre Spitzen wurden während des Eingriffs zusätzlich mit einem Bead-Sterilisator sterilisiert. Um eine Kontamination zu verhindern, wurde ein OP-Tuch über das Tier gelegt. Der Chirurg trug eine Mütze, um seine Haare zu bedecken, eine Maske, um sein Gesicht zu bedecken, und war während des Eingriffs mit einem Laborkittel und OP-Handschuhen ausgestattet²⁴.
5. Setzen Sie den Sensor des Pulsoximeters an die Hinterpfote des Tieres, um die Atemfrequenz, die Herzfrequenz, den Blutsauerstoffgehalt und die Körpertemperatur des Tieres zu überwachen.
6. Injizieren Sie 1 ml/kg Körpergewicht Lidocain (20 mg/ml) als Analgetikum subkutan in den Hals der Ratte.
7. Tragen Sie Haarentfernungscreme auf den Kopf des Tieres auf und warten Sie 3 Minuten. Wischen Sie die Creme mit 70%igen Isopropylalkoholtupfern aus.
8. Reinigen Sie die rasierte Stelle mehrmals mit einem sterilen, in Jod getränkten Wattestäbchen. Entfernen Sie die Jodrückstände mit einem Wattestäbchen, das in 70%igem Ethanol getränkt ist.
9. Setzen Sie mit einer sterilen chirurgischen Klinge einen etwa 2-2,5 cm langen Schnitt in die rasierte Haut, um an die Oberfläche des Schädels zu gelangen.
10. Entferne das Gewebe am Knochen mit einem Wattepad, um den Schädel freizulegen. Reinige die Schädeloberfläche mit einem Wattestäbchen, das in 0,9 % Kochsalzlösung getränkt ist, und reinige sie dann mit einem trockenen Wattepad.
    HINWEIS: Die Schädelnähte und sowohl Bregma als auch Lambda können nun leicht identifiziert werden.
11. Identifizieren Sie das Bregma als Referenzpunkt, um den Aufprallbereich anhand der Koordinate weiter zu ermitteln.
    HINWEIS: In diesem Protokoll werden zwei Koordinatensätze für die CHI-Induktion verwendet: (-2,5,-2,0) (2,5 mm lateral 2,0 mm posterior des Bregmas) auf dem sensomotorischen Kortex (SMCx) sowie (0,-3,0) auf dem Zentralhirn (zentral).
12. Identifizieren Sie die gewählten Koordinaten auf der Schädeloberfläche und zementieren Sie einen kreisförmigen Edelstahlhelm (10 mm Durchmesser und 1 mm Dicke) mit Zahnzement über die vorgesehene Stelle. Entfernen Sie das Heizkissen und das Pulsoximeter.
13. Bewegen Sie das stereotaktische Gerät und die Ratte auf dem Hubtisch (14 cm Länge, 8 cm Breite und 6,15 cm Tiefe) unter den CHI-Impaktor.
14. Heben Sie den Körper der Ratte mit einem Schaumstoffschwamm (19 cm lang, 10 cm breit und 4 cm tief, mit einer Dichte von 18 kg/m³) an.
15. Entfernen Sie die Ratte von den Ohrstangen des stereotaktischen Rahmens. Halten Sie die Ratte ruhig auf der Zahnstange, die mit dem Nasenkonus verbunden ist, und geben Sie 2 % Isofluran ab. Achten Sie darauf, dass Kopf und Körper in rostral-kaudaler Richtung ausgerichtet sind.
16. Stellen Sie den Hubtisch so ein, dass kein Platz zwischen dem CHI-Schlagkörper und dem Helm vorhanden ist. Schalten Sie Isofluran 5 s kurz vor dem Aufprall aus.
    HINWEIS: Um den Aufrichtungsreflex aufgrund einer Hirnverletzung zu spezifizieren, wurde eine vorübergehende Beendigung von Isofluran durchgeführt²⁵.
17. Lassen Sie ein 600 g schweres Messing aus einer Höhe von 1 m durch ein Edelstahlrohr (1 m Höhe mit einem Innendurchmesser von 20 mm zum Reinigen einer Säule mit Edelstahlgewichten) auf den gesicherten Schlagkörper mit einer runden Spitze fallen, die auf den Metallhelm zielt.
    HINWEIS: Bei den Tieren in der Scheingruppe kam es zu keinem Aufprall, da der Messingtropfen freigesetzt wurde, ohne den Helm auf dem Kopf der Ratte zu berühren.
18. Senken Sie den Hubtisch ab. Nehmen Sie die Ratte aus dem stereotaktischen Rahmen und legen Sie die Ratte in Rückenlage auf ein Heizkissen.
19. Notieren Sie den Zeitpunkt des Aufrichtreflexes, d. h. den Zeitpunkt, zu dem das Tier versucht, von der Rückenlage in die Bauchlage zu wechseln^26,27.
    HINWEIS: Die Tiere, die dem wiederholten CHI unterzogen wurden, wurden 3 Minuten vor dem 2^. Aufprall erneut betäubt. Bei den Tieren in der SMCx/Double/10 min-Gruppe, die nicht rechtzeitig in die Bauchlage zurückkehrten, wurde die entsprechende Zeit des Aufrichtreflexes mit 420 s aufgezeichnet.
20. Nach der Aufzeichnung des Aufrichtreflexes wird die Ratte erneut mit Isofluran betäubt (Schritt 1.1).
21. Immobilisieren Sie die Ratte mit dem stereotaktischen Rahmen in Schritt 1.2.
    HINWEIS: Nachdem Sie die Stabilität des Helms auf dem Dämpfer bestätigt haben, wiederholen Sie die Schritte 1.13-1.17 erneut, um den 2^. Aufprall durchzuführen.
22. Nehmen Sie den Helm ab. Entfernen Sie das gesamte Bindegewebe und den Zement auf der Oberseite des Schädels.
23. Bedecken Sie den Schädel mit dem Zahnzement und lassen Sie ihn trocknen. Überprüfen Sie mit der Pinzette, ob der Zahnzement steif und hart ist.
    HINWEIS: Der Zahnzement wurde auf den Schädel aufgetragen, um Anfälligkeitsartefakte zu beseitigen, die durch Schädel-Luft- oder Schädel-Blut-Grenzflächen zwischen Schädel und Kopfhaut nach der Operation verursacht wurden.
24. Schließen Sie den Schnitt mit chirurgischen Nähten aus 4-0 Nylon mit 4-5 unabhängigen Knoten.
    HINWEIS: Die Wunde ist ca. 2-2,5 cm lang. Stellen Sie sicher, dass die chirurgischen Nähte keine Kapillarwirkung haben und aus Seide oder Nylon bestehen. Nähen Sie den Schnitt nicht mit einem einzigen Knoten, um zu verhindern, dass sich die Wunde durch das Kratzen des Tieres öffnet.
25. Tragen Sie topische Antibiotika (Dermanest-Creme) auf die Operationsstelle auf, um Infektionen zu verhindern.
26. Injizieren Sie 1 ml/kg Körpergewicht Carprofen (50 mg/ml) subkutan in den Hals als postoperative Analgetika.
27. Setze die Ratte in einen sauberen Käfig auf einem Heizkissen, bis sie wieder zu Bewusstsein kommt. Sobald die Ratte aufrecht sitzt, bringe sie in den Heimkäfig zurück.
28. Verabreichen Sie dem Tier täglich 5 ml Paracetamol (24 mg/ml) in 200 ml Wasser gemischt als Analgetikum an 3 aufeinanderfolgenden Tagen nach der Operation.

2. Magnetresonanztomographie (MRT)

HINWEIS: Die T2-gewichtete Bildgebung und die Diffusions-Tensor-Bildgebung werden mit einem sequentiellen PET/MR 7T-System vor der CHI sowie 1 und 50 Tage nach der Verletzung durchgeführt (Abbildung 1). Eine MRT zu Studienbeginn wurde innerhalb von 1 Woche vor dem CHI-Eingriff durchgeführt. Für die Auswertungen am 1. und 50. Tag nach CHI wurden die Verhaltensbewertungen am Morgen durchgeführt, gefolgt von MRT-Scans am Nachmittag desselben Tages.

1. Betäuben Sie die Ratte in einer kleinen Induktionskammer, die mit einer Mischung aus Isofluran (5%) und medizinischer Luft (2,5-3 L/min) gefüllt ist.
2. Sobald die Ratte nicht auf ein Pfoten- oder Schwanzkneifen reagiert, unterbrechen Sie vorübergehend die Anästhesie, wenn Sie sie in Bauchlage in die Tierwiege legen.
3. Positionieren Sie die Ratte in der Kopfhalterung, die mit einem Nasenkonus verbunden ist, und geben Sie 2 % Isofluran mit medizinischer Luft bei einer Durchflussrate von 1,5-2 l/min zur Wartung während der Bildaufnahme ab.
4. Fixieren Sie den Kopf mit einem kleinen Stück Klebeband, um Bewegungen während des Scannens zu vermeiden.
   HINWEIS: Tragen Sie am ersten Tag nach dem CHI etwas Zahnpasta auf den Kopf der Ratte auf, um magnetische Anfälligkeitsartefakte aufgrund der Kopfhautentfernung zu vermeiden^28,29.
5. Legen Sie ein Druckkissen unter den Brustkorb der Ratte, um die Atmung zu überwachen. Kleben Sie die Oximeter-Clips an die hintere Gliedmaße, um die Herzfrequenz zu überwachen.
6. Führen Sie die Rektumsonde ein, um die Rektaltemperatur zu messen. Decken Sie die Ratte während des Experiments mit einer Heizdecke mit zirkulierendem warmem Wasser und einer Gewebeumhüllung ab, um die Körpertemperatur zu halten.
   HINWEIS: Überwachen Sie während des gesamten Experiments die physiologischen Bedingungen, einschließlich Herzfrequenz, Atemfrequenz und Rektaltemperatur. Überprüfen Sie vor dem Scannen alle physiologischen Signale der Ratte, um die Qualität des Vitalparametermonitors sicherzustellen.
7. Verwenden Sie das Laser-Positioniersystem des PET/MR-Scanners, um die Mitte des Kopfes für eine präzise Ausrichtung zu markieren.
8. Bewegen Sie das Tier mit dem motorisierten Tiertransportsystem automatisch in die MRT-Bohrung, bis die Mitte des Kopfes mit dem Iso-Zentrum des Scanners ausgerichtet ist.
   HINWEIS: Das in das PET/MRT-System integrierte motorisierte Tiertransportsystem gewährleistet eine genaue Positionierung der Tiere und rationalisiert den Arbeitsablauf beim Übergang zwischen den Bildgebungsmodalitäten.
9. Holen Sie sich eine MRT-Sequenz.
   1. Führen Sie die erste Lokalisierung und die allgemeine Anpassung durch.
   2. Verwenden Sie die mittlere sagittale Scheibe und richten Sie die 8^. Scheibe von vorne mit der Kreuzung der vorderen Kommissur aus.
      HINWEIS: Die koronalen Schnitte sind senkrecht zur horizontalen Ebene positioniert, die durch die Linie definiert wird, die die vordere Kommissur und die Basis des Kleinhirns verbindet, was einem Winkel von etwa 15° relativ zur Längsachse des Corpus callosum entspricht. Die wichtigsten Parameter des T2-RARE-Scans für die mittlere sagittale Schicht lauten wie folgt: Wiederholzeit (TR) = 2500 ms, Echozeit (TE) = 44 ms, Sichtfeld (FOV) = 3,5 cm, Matrixgröße = 256 256, Schichtdicke = 1 mm, Anzahl der Schichten = 1, SELTENHEITSFAKTOR = 8, Bandbreite = 75 kHz, Anzahl der Mittelwerte = 1, Erfassungszeit = 1 min 20 s.
   3. Verwenden Sie Rapid Acquisition with relaxation enhancement (RARE) mit Fettsuppression und einem Sättigungsband unter dem Gehirn, um T2-gewichtete Bilder als anatomische Referenz zu erhalten (Abbildung 2).
      HINWEIS: Die wichtigsten Parameter des T2-RARE Scans sind wie folgt: Wiederholzeit (TR) = 3600 ms, Echozeit (TE) = 40 ms, Sichtfeld (FOV) = 2 cm, Matrixgröße = 256 256, Schichtdicke = 1 mm, Anzahl der Schichten = 16, SELTENHEITSFAKTOR = 8, Bandbreite = 75 kHz, Anzahl der Mittelwerte = 8, Erfassungszeit = 7 min 40 s.
   4. Verwenden Sie ein 4-Schuss-Spin-Echo-EPI, um Diffusions-Tensor-Bilder aufzunehmen (Abbildung 2).
      HINWEIS: Die wichtigsten Parameter des DTI-Scans lauten wie folgt: TR = 3000 ms, TE = 28 ms, Sichtfeld (FOV) = 2 cm, Matrixgröße = 96 96, Dicke = 1 mm, Anzahl der Schichten = 16, Dauer des Impulses (δ) = 5 ms, Zeit zwischen den beiden Impulsen (Δ) = 15 ms, Anzahl der B0 = 5, Anzahl der Richtungen = 30, b-Wert = 1000 s/mm³, Bandbreite = 150 kHz, Anzahl der Mittelwerte = 4, die Erfassungszeit = 14 min.
   5. Schließen Sie das Scanprotokoll ab. Schieben Sie die Tierwiege aus dem Magneten. Nehmen Sie das Tier aus der Wiege.
   6. Setze die Ratte in einen sauberen Käfig mit einem Heizkissen darunter, um ihre Körpertemperatur zu halten. Bringen Sie die Ratte in ihren Heimatkäfig zurück, sobald sie wieder zu Bewusstsein gekommen ist.
10. Bildvorverarbeitung
    HINWEIS: Verwenden Sie MRtrix3, Statistical Parametric Mapping (SPM)-Software und benutzerdefinierte MATLAB-Skripte für die Datenverarbeitung und -analyse.
    1. Entrauschen Sie die DTI-Bilder mit dem Befehl MRtrix3 (dwidenoise⁾³⁰.
    2. Entfernen Sie die Gibb-Klingelartefakte aus den DTI-Images mit dem MRtrix-Befehl (mrdegibbs)³⁰.
    3. Koregister von DTI-Bildern mit T2-gewichteten Bildern des einzelnen Motivs über Längsschnitte hinweg mithilfe von SPM-Funktionen (spm_coreg m und spm_powell m).
    4. Führen Sie ein Schädelstripping bei T2-gewichteten Bildern durch, indem Sie den Gehirnbereich Schicht für Schicht manuell konturieren, gefolgt von der Entfernung von Pixeln mit einer Intensität unterhalb des berechneten Schwellenwerts, der durch die Otsu-Methode³¹ (benutzerdefiniertes MATLAB-Skript thr_otsu2.m) bestimmt wurde.
    5. Führen Sie eine Probandenübergreifende Koregistrierung zwischen Tieren derselben Versuchsgruppe unter Verwendung der SPM-Funktionen (spm_coreg m und spm_powell m durch. Wenden Sie die Gehirnmaske auf die entsprechenden DTI-Bilder an.
       HINWEIS: Das Schädelstripping wird durchgeführt, um die Bearbeitungszeit des Computers zu verkürzen.
    6. Berechnen Sie Tensor-Maps basierend auf DTI (benutzerdefiniertes MATLAB-Skript, tensormap.m).
    7. Berechnung von FA-Maps (benutzerdefiniertes MATLAB-Skript, calFA.m)
       HINWEIS: Alle benutzerdefinierten MATLAB-Skripte sind über die folgende Datenbank (https://doi.org/10.57770/9ZESXD) verfügbar.
11. Bildanalyse-FA
    1. Zeichnen Sie Regionen von Interesse (Regions of Interest, ROIs) im Kortex und im Corpus Callosum (CC) für die drei aufeinanderfolgenden Bildsegmente unterhalb der CHI-Koordinate.
       HINWEIS: Alle ROIs wurden manuell gezeichnet und von 2 erfahrenen Prüfärzten, die für die Versuchsgruppen verblindet waren, visuell auf grobe Fehler überprüft.
    2. Extrahieren Sie den FA-Wert aus ROIs, und mitteln Sie ihn.
       HINWEIS: Für das Corpus callosum unterhalb des Kortex wurden Pixel mit Werten von FA < 0,35 in der ausgewählten ROI ausgeschlossen, um partielle Volumeneffekte zu eliminieren. Für den Kortex wurden alle Pixel mit Werten von FA < 0,35 im ROI für die Analyse rekrutiert.
12. Bildanalyse-Volumen
    1. Zeichnen Sie manuell ROIs, die die kortikalen Regionen für 11 aufeinanderfolgende Bildschnitte bei Bregma -7 bis +3 mm abdecken.
       HINWEIS: Alle ROIs wurden manuell von 2 erfahrenen Untersuchern erstellt, die für die Versuchsgruppen verblindet waren.
    2. Addieren Sie die Gesamtpixel der ROIs über die Slices und transformieren Sie sie in das Volumen, indem Sie die Schichtdicke (1 mm) multiplizieren.
    3. Normalisieren Sie das kortikale Volumen nach CHI mit dem entsprechenden Volumen vor CHI jedes Tieres.
       HINWEIS: Normalisieren Sie die Daten, um individuelle Unterschiede im Gehirnvolumen zwischen den Tieren vor der Präsentation zu eliminieren.

3. Bewertung des Verhaltens

HINWEIS: Die Verhaltensexperimente werden mit dem Beam-Walk-Balance-Test und mNSS vor CHI sowie 1 und 50 Tage nach CHI durchgeführt (Abbildung 1). Die gesamte Bewertung wurde von mindestens zwei Beobachtern durchgeführt, um die Genauigkeit, Konsistenz und Objektivität der gesammelten Daten zu gewährleisten.

1. Test der Beamwalk-Balance
   1. Schalten Sie die Videokamera ein und starten Sie den Timer.
   2. Platzieren Sie die Ratten an einem Ende des Schwebebalkens (3 cm tief, 3 cm breit, 80 cm lang und 60 cm über dem Boden).
   3. Stoppe den Timer, sobald die Ratte eine Runde absolviert hat, umfällt oder über 3 Minuten einfriert.
      1. Während des Versuchs ist der Tierzustand für die Beurteilung mit mNSS 11,32,33,34 zu beobachten. Befolgen Sie diese Standards für die Bewertung:
      2. Wenn die Ratte das Gleichgewicht mit einer stabilen Haltung auf dem Balken beibehält, weisen Sie eine Punktzahl von 0 zu.
      3. Wenn die Ratte die Seite des Balkens greift, wird die Punktzahl 1 vergeben.
      4. Wenn die Ratte mit einem Glied vom Balken fällt, wird die Punktzahl 2 vergeben.
      5. Wenn die Ratte mit zwei abgetrennten Gliedmaßen fällt oder sich auf dem Balken dreht (>60 s), wird die Punktzahl 3 vergeben.
      6. Wenn die Ratte versucht, auf dem Balken zu balancieren, aber herunterfällt (>40 s), vergeben Sie eine Punktzahl von 4.
      7. Wenn die Ratte versucht, auf dem Balken zu balancieren, aber herunterfällt (>20 s), wird die Punktzahl 5 vergeben.
      8. Wenn die Ratte nicht versucht, das Gleichgewicht zu halten oder sich an den Balken zu hängen und innerhalb von 20 s herunterfällt, wird eine Punktzahl von 6 vergeben.
      9. Wenn die Ratte die Aufgabe nicht erledigt, betrachten Sie sie als die maximale Zeit von 3 Minuten und vergeben Sie eine Punktzahl von 6.
   4. Planen Sie Testtage zu bestimmten Zeitpunkten.
      HINWEIS: Ratten, die den Beam Walk Round Trip für zwei Versuche vor CHI nicht abgeschlossen haben, sind von der nachfolgenden Operation und der anschließenden Verhaltensbeurteilung auszuschließen.
2. Modifizierter neurologischer Schweregrad (mNSS)
   HINWEIS: Die mNSS-Beurteilung umfasst motorische Tests, sensorische Tests, das Fehlen von Reflexen, abnormale Bewegungen, das Gleichgewicht des Strahls und das Gehen auf dem Boden ^32,33, das schnell täglich durchgeführt wurde.
   1. Führen Sie Motortests durch.
      1. Heben Sie die Ratte an der Basis des Schwanzes an und beobachten Sie die Reflexe ihrer Gliedmaßen etwa 15 s lang, um die richtige Beugung und Streckung zu beurteilen.
      2. Wenn in der Vordergliedmaße eine normale Beugung beobachtet wird, weisen Sie eine Punktzahl von 0 zu. Wenn keine Beugung beobachtet wird, weisen Sie eine Punktzahl von 1 zu.
      3. Wenn in der Hintergliedmaße eine normale Flexion beobachtet wird, weisen Sie eine Punktzahl von 0 zu. Wenn keine Beugung beobachtet wird, weisen Sie eine Punktzahl von 1 zu.
      4. Wenn sich der Kopf innerhalb von 30 s nach dem Anheben der Ratte am Schwanz um >10° zur vertikalen Achse bewegt, wird eine Punktzahl von 0 vergeben. Wenn nicht, vergeben Sie eine Punktzahl von 1.
         HINWEIS: In dieser Sitzung des Tests werden maximal 3 Punkte vergeben.
   2. Führen Sie Tests zur Platzierung von Gliedmaßen durch.
      HINWEIS: Der Platzierungstest wird durchgeführt, um die Koordination zwischen sensorischer (visueller, taktiler Empfindung und Propriozeption) und motorischer Funktion zu bewerten.
      1. Senken Sie die Ratte langsam in Richtung der Tischoberfläche. Beobachten Sie, ob die Pfoten der Ratten an die Oberfläche reichten und sich streckten.
      2. Wenn die Ratten die Oberfläche mit ausgestreckten und nach vorne gestreckten Gliedmaßen erreichten, vergeben Sie eine Punktzahl von 0. Wenn es eine Verzögerung oder keine Antwort gibt, weisen Sie eine Punktzahl von 1 zu.
      3. Lege die Ratte auf die Oberfläche und ziehe die Pfote gegen die Tischkante. Beobachten Sie, ob die Pfote wieder in eine normale Position auf der Tischoberfläche zurückkehrt.
      4. Wenn unmittelbare und normale Platzierungsreaktionen beobachtet werden, weisen Sie eine Punktzahl von 0 zu. Wenn verzögerte Einlagerungsantworten beobachtet werden, weisen Sie eine Punktzahl von 1 zu. Wenn keine Antwort erfolgt, weisen Sie eine Punktzahl von 2 zu.
         HINWEIS: In dieser Sitzung des Tests werden maximal 3 Punkte vergeben.
   3. Beobachten Sie das Fehlen von Reflexionen und abnormale Bewegungen.
      1. Achten Sie auf Kopfschütteln, um den Ohrmuschelreflex zu beurteilen, wenn Sie den Gehörgang mit dem Watteende eines Wattestäbchens berühren.
      2. Wenn ein normaler Reflex beobachtet wird, vergeben Sie eine Punktzahl von 0. Wenn kein Reflex beobachtet wird, vergeben Sie eine Punktzahl von 1.
      3. Beurteile das Vorhandensein des Hornhautreflexes, indem du die Hornhaut mit dem Wattesenden eines Wattestäbchens berührst.
      4. Wenn eine normale Antwort ausgelöst wird, weisen Sie eine Punktzahl von 0 zu. Wenn keine Augenblinzelreaktion ausgelöst wird, weisen Sie eine Punktzahl von 1 zu.
      5. Klatschen Sie kurz und kräftig in die Hände. Beobachte das Vorhandensein des Schreckreflexes.
      6. Wenn ein Reflex beobachtet wird, weisen Sie eine Punktzahl von 0 zu. Wenn kein Reflex beobachtet wird, vergeben Sie eine Punktzahl von 1.
      7. Beobachte, ob die Ratte Krampfanfälle, Myoklonus oder Myodystonie hat.
      8. Wenn einer von ihnen auftritt, weisen Sie eine Punktzahl von 1 zu.
         HINWEIS: In dieser Sitzung des Tests werden maximal 4 Punkte vergeben.
   4. Führen Sie den Balkenausgleichstest durch, wie zuvor beschrieben (Schritt 3.1).
      HINWEIS: In dieser Sitzung des Tests werden maximal 6 Punkte vergeben.
   5. Führen Sie einen Walk-on-the-Floor-Test durch.
      1. Bereiten Sie die Freifeldarena vor (75 cm Länge, 50 cm Breite und 40 cm Tiefe). Stellen Sie sicher, dass es sauber und frei von vorherigen Geruchshinweisen ist.
      2. Platziere eine Ratte in der Mitte der offenen Feldarena und beobachte, wie die Ratte in der Arena läuft.
      3. Wenn die Ratte einen regelmäßigen Spaziergang macht, weisen Sie eine Punktzahl von 0 zu.
      4. Wenn die Ratte nicht gerade laufen kann, vergeben Sie eine Punktzahl von 1.
      5. Wenn die Ratte auf die paretische Seite fällt, nachdem sie auf den Boden gelegt wurde, vergeben Sie eine Punktzahl von 3.
         HINWEIS: In dieser Sitzung des Tests werden maximal 3 Punkte vergeben.
   6. Fassen Sie alle Punktzahlen zusammen; Die maximal mögliche Punktzahl beträgt 18.
      HINWEIS: Die höhere Punktzahl weist auf ein schlechteres Ergebnis hin.

4. Immunhistologie

1. Transkardiale Perfusion^{durchführen 35}.
   HINWEIS: Die transkardiale Perfusion wird nach der MRT-Untersuchung 50 Tage nach der CHI durchgeführt (Abbildung 1).
   1. Setzen Sie die Ratte in eine kleine Induktionskammer und betäuben Sie sie mit Isofluran (5%), bis sie nicht mehr auf einen Pfoten- oder Schwanzstich anspricht.
   2. Verabreichen Sie 50 mg/kg Körpergewicht Zoletil (50 mg/ml) und 10 mg/kg Körpergewicht Xylazin (Roumpun, 23,32 mg/ml) über intraperitoneale Injektion für eine tiefe Anästhesie.
   3. Bringen Sie die Ratte in Rückenlage.
   4. Machen Sie mit einer Schere einen etwa 4-5 cm langen Querschnitt unter dem Brustkorb.
   5. Lokalisiere das Zwerchfell und schneide es, um das Herz freizulegen.
   6. Verwenden Sie eine hämostatische Pinzette, um die Lungenarterie zu klemmen, und machen Sie dann einen etwa 0,5 bis 1 cm langen Schnitt im rechten Vorhof.
   7. Verbinden Sie die Nadel mit der Rohrleitung, die an der Infusionspumpe befestigt ist.
   8. Führen Sie die Nadel in den linken Ventrikel ein.
   9. Das Tier wird durch transkardiale Perfusion (40 ml/min) mit 500 ml 0,9 % Kochsalzlösung gespült, bis das Blut geklärt ist.
   10. Perfundierte des Tieres durch transkardiale Perfusion (40 ml/min) mit 500 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) zur Fixierung.
   11. Entferne den Kopf der Ratte und schäle vorsichtig das Hirngewebe vom Schädel.
   12. Bewahren Sie das Gehirn in ca. 20 ml 4% PFA in der Flasche für 48 Stunden für die Nachfixierung auf.
2. Durchführung der Gewebeaufbereitung und IHC-Färbung ^36,37.
   HINWEIS: Führen Sie eine immunhistochemische Färbung an formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten mit dem Immunperoxidase-Sekundärnachweissystem-Kit durch.
   1. Verwenden Sie formalinfixierte und in Paraffin eingebettete Gewebeschnitte.
   2. Führen Sie eine Entparaffinisierung durch und behandeln Sie die Objektträger mit 3 % H₂O₂ , um die endogene Peroxidaseaktivität zu blockieren. Führen Sie die Antigengewinnung mit Citratpuffer bei 90 °C durch.
   3. Führen Sie eine immunhistochemische Färbung mit dem Immunperoxidase-Sekundärnachweissystem-Kit durch.
      HINWEIS: Die Färbevorgänge werden gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt.
   4. Verwenden Sie Hämatoxylin, um Proben gegenzufärben.
   5. Proben mit einem Antifading-Reagenz einbetten.
   6. Verwenden Sie Anti-Gliafibrilläres saures Protein (GFAP)-Antikörper für die immunhistochemische Färbung.
   7. Erfassen Sie die Bilder der ROIs mit einem lichtmikroskopischen Objektträgerscanner (Abbildung 6).

5. Statistische Analyse von Verhalten und Bildergebnissen

HINWEIS: In der aktuellen Studie wurde die statistische Analyse in SPSS durchgeführt. Die statistische Analyse kann jedoch in anderen statistischen Werkzeugkästen durchgeführt werden.

1. Laden Sie die Daten im Breitformat in eine SPSS *.sav Datei.
2. Führen Sie eine Varianzanalyse (ANOVA) mit wiederholten Messungen durch, um das Verhalten (normalisiertes Gewicht, mNSS und Strahlgangdauer) und die Bildergebnisse (FA-Werte im Kortex und CC) im Laufe der Zeit zwischen den Gruppen zu vergleichen.
   1. Klicken Sie > Allgemeine lineare Modell > wiederholten Messgrößen analysieren.
   2. Vergeben Sie einen Namen in das Feld "Name des Faktors innerhalb des Themas " (z. B. Zeit) und geben Sie "3" in das Feld "Anzahl der Ebenen " ein (drei Ebenen mit unterschiedlichen Nachverfolgungszeitpunkten). Vergeben Sie im Feld Messgrößenname einen Namen (z. B. mNSS) im Dialogfeld Wiederholte Messungen Faktor(en) definieren .
   3. Laden Sie die Within-Subject-Variablen (Daten, die vor , D1 und D50 nach CHI erfasst wurden), die getestet werden müssen, und geben Sie den Faktor zwischen den Probanden (z. B. Tiergruppen mit unterschiedlichen Wirkungsparametern) im Dialogfeld "Wiederholte Messungen " an.
   4. Wählen Sie Bonferroni als Post-hoc-Test für Faktoren (z.B. Tiergruppen) im Dialogfeld Post-hoc-Mehrfachvergleiche für beobachtete Mittelwerte aus.
      HINWEIS: Zur Korrektur mehrerer Vergleiche wurde der Fehler Typ I mit Bonferroni-Korrekturen (0,05/3) für die Vergleiche im Zeitverlauf angepasst. Die statistische Signifikanz wurde mit p < 0,05 (SPSS-adjustiert) definiert.
3. Führen Sie eine unidirektionale ANOVA-Analyse durch, um den Aufrichtreflex und die Veränderung des kortikalen Volumens zwischen den Gruppen zu vergleichen.
   1. Klicken Sie auf Analysieren > Mittelwerte > unidirektionalen ANOVA vergleichen.
   2. Laden Sie die Variablen (Aufrichtreflex und Änderung des kortikalen Volumens) in die Abhängigkeitsliste und die Gruppen als Faktor in das Dialogfeld Einseitige ANOVA.
   3. Wählen Sie Bonferroni als Post-hoc-Test im Dialogfeld Einmalige ANOVA: Nachträgliche Mehrfachvergleiche aus.
      HINWEIS: Um Mehrfachvergleiche zu korrigieren, wurde der Fehler vom Typ I mit Bonferroni-Korrekturen (0,05/5) für die Vergleiche zwischen den Gruppen angepasst. Die statistische Signifikanz wurde mit p < 0,05 (SPSS-adjustiert) definiert.

Abbildung 2 zeigt longitudinale MRTs von repräsentativen Tieren mit Schein- und repetitiver CHI am SMCx. In T2-gewichteten Bildern wurde 1 und 50 Tage nach CHI keine signifikante Schädelfraktur oder Hirnkontusion gefunden. In den FA-Karten wurde an 1 und 50 Tagen nach CHI kein signifikantes Ödem oder eine signifikante Deformation des WM gefunden. Alle Tiere, die in dieser Studie einer CHI unterzogen wurden, überlebten die gesamte Versuchsdauer von 50 Tagen, was eine niedrige Mortalität (0-5%)7 des CHI-Modells zeigt.

Der Grad der Beeinträchtigung des Bewusstseins unmittelbar nach einer Hirnverletzung wurde durch den Verlust des Aufrichtungsreflexes, der intrinsischen Neigung zur Selbstkorrektur seiner Position, bei Tieren bewertet. Im Vergleich zu Schein- und Einzel-CHI bei SMCx verlängerte sich die Zeit bis zur Wiedererlangung des Aufrichtreflexes bei Tieren nach wiederholtem CHI (Abbildung 3A). Das allgemeine Wohlbefinden der Tiere nach CHI spiegelte sich in der Veränderung des normalisierten Körpergewichts und des mNSS wider. Bei den Gruppen wurde nach CHI kein signifikanter Gewichtsverlust beobachtet (Abbildung 3B). Während an Tag 50 nach einer einzelnen CHI ein höherer mNSS-Score festgestellt wurde, wurde an Tag 1 nach wiederholter CHI ein signifikanter Anstieg des mNSS-Scores beobachtet und bis zum Tag 50 unabhängig vom Schweregrad und der Aufprallstelle hoch gehalten (Abbildung 3C). Die erhöhte mNSS, die durch repetitive CHI am Zentralhirn induziert wurde, nahm an Tag 50 ab und war damit signifikant niedriger als die entsprechende CHI bei SMCx. Das Gleichgewicht und die koordinierte Motorik bei Ratten nach CHI wurden durch den Beamwalk-Test bewertet. Eine signifikante Zunahme der Beamwalk-Dauer wurde an Tag 1 nach wiederholtem CHI beobachtet und bis zum Tag 50 hoch gehalten, unabhängig vom Schweregrad und der Aufprallstelle (Abbildung 3D). Die verlängerte Strahlgangdauer, die durch repetitives CHI am Zentralhirn induziert wurde, nahm an Tag 50 ab und war damit signifikant kürzer als die entsprechende CHI an SMCx.

Eine signifikante Abnahme des kortikalen Volumens wurde 50 Tage nach der CHI beobachtet (Abbildung 4A). Die kortikalen Volumina an Tag 50 betrugen 99,63 % ± 2,15 %, 95,98 % ± 1,65 %, 92,26 % ± 2,22 % bzw. 90,28 % ± 1,17 % gegenüber dem Ausgangsvolumen, jeweils im Schein- und nach einmaligem und wiederholtem CHI mit den 1-Stunden- und 10-Minuten-Intervallen bei SMCx (Abbildung 4B). Das kortikale Volumen an Tag 50 betrug 91,54 % ± 1,98 % gegenüber dem Ausgangsvolumen nach wiederholtem CHI mit dem 1-Stunden-Intervall am Zentralhirn. Verglichen mit der Scheingruppe wurde ein signifikanter kortikaler Verlust nach CHI beobachtet. Verglichen mit der Einzel-CHI-Gruppe wurde ein signifikanter kortikaler Verlust nach wiederholtem CHI beobachtet. Eine signifikante Verringerung des kortikalen Volumens wurde in den Schnitten bei Bregma -4 bis +0 und Bregma -5 bis +1 nach wiederholtem CHI in den Intervallen von 1 h und 10 min beobachtet. (Abbildung 4C). Im Vergleich zwischen den CHI-Tieren mit unterschiedlichen Einschlagsstellen wurde ein signifikant kleineres kortikales Volumen nur in der Scheibe bei Bregma 0 nach CHI am Zentralhirn gefunden. Während in denvorangegangenen 11 und aktuellen Studien über eine signifikante kortikale Atrophie berichtet wurde, werden T2-gewichtete Bilder mit hoher räumlicher Auflösung, idealerweise in 3D, für eine präzise volumetrische Analyse empfohlen. Darüber hinaus könnten zukünftige Studien, die einen atlasbasierten diffeomorphen Registrierungsansatz38 anwenden, die regionalen Veränderungen des Gehirns, die mit leichten Hirnverletzungen verbunden sind, besser berücksichtigen.

Die kortikalen FA-Werte während der longitudinalen MRT-Scans wurden berechnet, um die zaghaften mikrostrukturellen Veränderungen nach CHI anzuzeigen. Nach einer einzigen CHI an SMCx wurden keine signifikanten FA-Veränderungen unterhalb der Einschlagsstelle beobachtet. Nach repetitiver CHI am SMCx wurde ein signifikanter Anstieg der ipsi-läsionalen kortikalen FA im Kortex an Tag 50 im Vergleich zum Ausgangswert und 1 Tag nach repetitiver CHI mit dem 1-Stunden-Intervall beobachtet (Abbildung 5A). Darüber hinaus wurde eine signifikante Reduktion der FA im ipsi-läsionalen Kortex 1 Tag nach repetitiver CHI mit dem 10-Minuten-Intervall gezeigt, was signifikant niedriger ist als nach einmaliger und wiederholter CHI mit dem 1-Stunden-Intervall. CHI am SMCx induzierte keine signifikanten Veränderungen der FA im Kortex des Zentralhirns (Abbildung 5B). Nach repetitiver CHI am Zentralhirn wurde an Tag 50 im Kortex im Vergleich zum Ausgangswert und Tag 1 ein signifikanter Anstieg der kortikalen FA unterhalb des Zentralhirns beobachtet (Abbildung 5B).

Nach einzelnem CHI an SMCx wurden keine signifikanten Veränderungen der FA im CC unterhalb des ipsi-läsionalen SMCx beobachtet (Abbildung 5A). Nach repetitiver CHI am SMCx wurde eine signifikante Abnahme der ipsi-läsionalen FA im CC im Kortex an Tag 50 im Vergleich zu Studienbeginn und 1 Tag nach repetitiver CHI mit dem 1-Stunden-Intervall beobachtet (Abbildung 5A). Eine Reduktion der FA in der ipsi-läsionalen CC an Tag 1 und eine anschließende Erholung an Tag 50 wurde nach wiederholter CHI im 10-Minuten-Intervall beobachtet. In der ipsi-läsionalen CC zeigte sich nach repetitiver CHI mit dem 10-Minuten-Intervall ein signifikant niedrigerer FA-Wert an Tag 1 im Vergleich zu repetitiver CHI mit dem 1-Stunden-Intervall; Es zeigte sich ein signifikant höherer FA-Wert an Tag 50 im Vergleich zu Schein-, Einzel- und Wiederholungs-CHI mit dem 1-Stunden-Intervall. Nach repetitiver CHI am Zentralhirn wurde an Tag 1 im Vergleich zu CHI bei SMCx und an Tag 50 im Vergleich zur Scheingruppe ein signifikanter Anstieg der FA im CC unterhalb der ipsi-läsionalen SMCx beobachtet (Abbildung 5A).

Die Neuroinflammation nach CHI wurde durch die Expression von GFAP am Tag 50 nach der Verletzung beurteilt. Die Ergebnisse der Immunfärbung zeigten, dass sich Astrozyten in der ipsilesionalen SMCx nach CHI ansammelten, unabhängig von Schweregrad und Aufprallstelle (Abbildung 6).

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Versuchsdesigns. Schemata mit den wichtigsten Schritten, einschließlich der Einleitung einer geschlossenen Kopfverletzung und dem entsprechenden Zeitplan für jede Bewertung. MRT-Scans und Verhaltensuntersuchungen vor CHI wurden innerhalb von 7 Tagen vor der Operation durchgeführt. Die Zeit, bis der Aufrichtreflex wiedererlangt ist, wurde als Grad der Beeinträchtigung des Bewusstseins bewertet. Längsschnitt-MRT und Verhaltensdaten wurden 1 und 50 Tage nach der CHI erhoben. Die Ratten wurden nach Abschluss aller Experimente getötet, gefolgt von einer Immunhistologie. Abkürzung: SMCx/single = einzelner Aufprall auf den sensomotorischen Kortex; SMCx/2 Treffer/1 h = doppelte Schläge bei SMCx mit dem 1-h-Intervall; SMCx/2 Treffer/10 min = doppelte Schläge bei SMCx mit dem 10-Minuten-Intervall; Zentral/2 Treffer/1 h = doppelte Stöße am Zentralhirn mit dem 1-Stunden-Intervall. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Repräsentative MRT-Bilder nach CHI. Die T2-gewichteten Bilder (obere Reihe) und FA-Karten (untere Reihe) des repräsentativen Tieres vor und an den Tagen 1 und 50 nach Schein- und Doppel-CHI bei SMCx mit dem 10-Minuten-Intervall. Keine fokale Kontusion auf T2-gewichteten Bildern nach experimenteller CHI. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Verhaltensdefizite nach CHI mit unterschiedlichen Aufprallparametern. (A) Die Zeit, bis der Aufrichtreflex nach dem letzten Aufprall wiedererlangt ist. Die Zeit des Aufrichtungsreflexes nahm nach wiederholtem CHI am SMCx zu. (B) Kein signifikanter Unterschied im normalisierten Körpergewicht nach CHI (normalisiert auf die Prä-CHI-Baseline) zwischen den Gruppen. Eine Zunahme der (C) mNSS- und (D) Beam-Walking-Dauer wurde nach wiederholtem CHI beobachtet. Während mNSS und Beam-Walking-Dauer nach CHI bei SMCx hoch blieben, erholten sie sich nach CHI am Zentralhirn an Tag 50. One-Way-ANOVA mit Bonferroni-Post-hoc-Test für die Zeit des Aufrichtungsreflexes; wiederholte ANOVA mit Bonferroni-Post-hoc-Test für das normalisierte Gewicht, mNSS und die Strahl-Wachdauer: *, p < .017 zwischen den Zeitpunkten; +, p < 0,05 vs. Schein; #, p < .05 vs. SMCx/einzeln; §, p < .05 vs. SMCx/2 Treffer/1 h. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Kortikale Atrophie 50 Tage nach CHI mit unterschiedlichen Wirkungsparametern. (A) Schnittausrichtung auf dem mittleren sagittalen Bild. Die blaue Linie zeigt die horizontale Ebene, die die vordere Kommissur und die Basis des Kleinhirns verbindet; Die gestrichelte Bline-Linie zeigt die Längsachse des Corpus Callosum. (B) Illustrative kortikale ROIs (rot) überlagert von T2-gewichteten Bildern in den repräsentativen Bildschnitten zur Messung des kortikalen Volumens. (C) Die Veränderung des kortikalen Volumens nach CHI wurde als Prozentsatz des Ausgangsvolumens zwischen verschiedenen Schichten bei Bregma -7 bis +3 mm dargestellt. Es wurde eine Abnahme des kortikalen Volumens 50 Tage nach CHI nachgewiesen, die von den Wirkungsparametern abhängig ist. Die Daten werden als Mittelwert ± std ausgedrückt. One-Way-ANOVA mit Bonferroni-Post-hoc-Test : +, p < 0,05 vs. Schein; #, p < 0,05 vs. SMCx/einzeln; §, p < .05 vs. SMCx/2 Treffer/1 h. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Längsveränderungen der FA nach CHI mit unterschiedlichen Impact-Parametern. Automatisch segmentierte ROIs sind der Kortex (grün) und das Corpus callosum (CC) (rot) tief an der Aufprallstelle bei (A) SMCx und (B) Zentralhirn. Der Einschub zeigt das 3D-Bild des Gehirns mit der Scheibe unter der Aufprallstelle. Die longitudinale Nachbeobachtung von FA-Werten, die vor und am 1. und 50. Tag nach dem CHI erfasst wurden, wurde als mittlerer ± STD dargestellt. Die Veränderung der FA nach wiederholtem CHI war ausgeprägt und abhängig von den Impact-Parametern. Wiederholte ANOVA mit Bonferroni-Post-hoc-Test: *, p < 0,05 zwischen den Zeitpunkten; +, p < 0,05 vs. Schein; #, p < .05 vs. SMCx/einzeln; §, p < .05 vs. SMCx/2 Treffer/1 h. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: CHI-induzierte Neuroinflammation 50 Tage nach der Verletzung im Kortex unterhalb der Einschlagstelle. Repräsentative Bilder der Großhirnrinde unterhalb der Einschlagsstelle mit GFAP-Färbung. Die Akkumulation von Astrozyten (Pfeile) im Kortex wurde nach CHI beobachtet. Maßstabsbalken = 40 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Autoren haben keine potenziellen Interessenkonflikte offenzulegen.