Methodenartikel

Zweifarbige korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie zur Visualisierung von Wechselwirkungen zwischen Mitochondrien und Lysosomen

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DOI:

10.3791/67020

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27. September 2024

 , 
1Neural circuit research group, Korea Brain Research Institute

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen Mechanismus zur Verwendung von korrelativer Licht- und Elektronenmikroskopie, um die Wechselwirkung von Mitochondrien und Lysosomen, die mit mEosEM bzw. APEX2 markiert sind, sichtbar zu machen.

Zusammenfassung

Zelluläre Organellen, wie Mitochondrien und Lysosomen, weisen dynamische Strukturen auf. Trotz der höheren Auflösung der Transmissionselektronenmikroskopie für die Strukturanalyse ist die Lichtmikroskopie für die Visualisierung dynamischer Organellen durch zielspezifische Markierung unerlässlich. Das folgende Protokoll beschreibt eine Methode, die zweifarbiges korrelatives Licht und Elektronenmikroskopie (CLEM) kombiniert, um die Wechselwirkungen zwischen Mitochondrien und Lysosomen zu beobachten. In dieser Studie wurden Mitochondrien mit mEosEM (Mito-mEosEM) und Lysosomen mit TMEM192-V5-APEX2 markiert. Die Ergebnisse aus den CLEM-Bildern ermöglichen es uns, die Veränderungen in den Wechselwirkungen zwischen Mitochondrien und Lysosomen unter äußeren Stressbedingungen zu beobachten. Die Behandlung mit Bafilomycin (BFA), das die lysosomale Funktion hemmt, führte zu einer Zunahme des Kontakts zwischen Mitochondrien und Lysosomen, was zur Bildung von fragmentierten Mitochondrien führte, die in den Lysosomen eingeschlossen waren. Umgekehrt führte die Behandlung mit U18666A, die den Cholesterinexport aus Lysosomen hemmt, dazu, dass die Lysosomen von Mitochondrien umgeben waren, was auf eine ausgeprägte Form der Interaktion hindeutet. Diese Studie stellt eine effektive Methode vor, um die Wechselwirkungen zwischen Mitochondrien und Lysosomen in fixierten Zellen zu beobachten. Darüber hinaus bietet die CLEM-Bildgebung mit zweifarbigen Sonden ein leistungsfähiges Werkzeug für zukünftige Untersuchungen der Organellendynamik und ihrer Auswirkungen auf die Zellfunktion und Pathologie.

Einleitung

Mitochondrien und Lysosomen sind die wichtigsten membrangebundenen Organellen, die für die Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase unerlässlich sind. Mitochondrien sind hochdynamische zelluläre Organellen, die durch Spaltungs- und Fusionsereignisse moduliert werden1. Im Allgemeinen werden Mitochondrien als das Kraftwerk der Zelle bezeichnet und sind bekannt für ihre wichtige Rolle bei der oxidativen Phosphorylierung, der ATP-Produktion und der Metabolitenspeicherung, wie z. B. Calcium2. Zusätzlich zu ihrer Rolle im Energiestoffwechsel sind Mitochondrien an einer Reihe anderer zellulärer Signalprozesse beteiligt, darunter Apoptose3,4, Calcium signaling5,6 und Lipid Metabolism7,8. In ähnlicher Weise sind Lysosomen hochdynamische zelluläre Organellen, die mehrere Rollen als zelluläre Recyclingzentren spielen, um die zelluläre Sauberkeit durch Proteinabbau, Autophagie, Endozytose und Phagozytose aufrechtzuerhalten9. Neben ihrer Rolle beim Abbau spielen Lysosomen auch eine Rolle in der Zellphysiologie, wie z.B. bei der Nährstofferkennung, der Homöostase10, dem Fettstoffwechsel11 und der zellulären Dedifferenzierung12.

Trotz der Existenz zahlreicher Studien über die Funktionen einzelner zellulärer Organellen haben sich unsere jüngsten Forschungen auf die weniger verstandene Wechselwirkung zwischen Mitochondrien und Lysosomen konzentriert, von der gezeigt wurde, dass sie sowohl die zelluläre Physiologie als auch die Pathologie beeinflusst. Kontakte zwischen Mitochondrien und Lysosomen wurden in verschiedenen Zelltypen beobachtet, darunter Krebszellen, Neuronen und von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) abgeleitete Zellen13, und sie werden hauptsächlich unter zellulärem Stress oder bei neurodegenerativen Erkrankungen wie der Parkinson-Krankheit13,14 und der Charcot-Marie-Tooth-Krankheit15 beobachtet. Der Kontakt zwischen Mitochondrien und Lysosomen spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der metabolischen Homöostase durch den Austausch von Ionen (z. B. Ca2+)16, cholesterol17 und iron18 zwischen den beiden Organellen. Darüber hinaus spielt der Kontakt zwischen Mitochondrien und Lysosomen eine entscheidende Rolle bei der Qualitätskontrolle von zellulären Organellen. Zum Beispiel können beschädigte Mitochondrien durch den Prozess der Mitophagie für den Abbau anvisiert werden, bei dem sie von Autophagosomen verschlungen und zum Abbau an Lysosomen abgegeben werden. Folglich kann die Entfernung dysfunktionaler Mitochondrien erleichtert werden, bevor sie die Zelle oder normale Mitochondrien weiter schädigen. Diese Interaktion zwischen Mitochondrien und Lysosomen ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase und die Verhinderung der Anhäufung dysfunktionaler Organellen. So werden nur geschädigte Mitochondrien selektiv entfernt, so dass gesunde Mitochondrien innerhalb der Zelle optimal funktionieren können.

Korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM) ist ein bildgebendes Verfahren, das in letzter Zeit als Forschungsmethode Aufmerksamkeit erregt hat, indem es die Vorteile der Lichtmikroskopie (LM) und der Elektronenmikroskopie (EM) kombiniert, um detaillierte strukturelle Informationen auf verschiedenen Skalen zu liefern. Bei CLEM wird eine Probe zunächst mit LM abgebildet, um bestimmte interessierende Regionen zu identifizieren, gefolgt von EM-Probenvorbereitungsschritten wie Fixierung, Dehydratisierung und Einbettung. Die gleiche Probe wird dann unter einem Elektronenmikroskop betrachtet. Obwohl in letzter Zeit über CLEM-Methoden für lebende Zellen berichtet wurde19,20,21,22, bleibt es eine Herausforderung, optische Bilder hochdynamischer biologischer Proben mit elektronenmikroskopischen Bildern fixierter Zellen in einer einzigen Ebene zu kombinieren. Bei hochdynamischen Organellen wie Mitochondrien und Lysosomen kann sich ihre genaue Lokalisation ändern, wenn sie live unter dem Lichtmikroskop beobachtet werden, und sie bewegen sich auch während der kurzen Verzögerungszeit, die für die Fixierung erforderlich ist, weiter.

Daher wurden in diesem Protokoll zwei verschiedene molekulare Markierungen verwendet, die auch in fixativen Lösungen aktiv bleiben, um die Interaktion zwischen Mitochondrien und Lysosomen zu visualisieren, die eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der metabolischen Homöostase durch den Austausch von Ionen spielen (z.B. Ca2+)16, cholesterol17 und iron18 zwischen diesen Organellen. Die Konstrukte TMEM192-V5-APEX2 und Mito-mEosEM wurden verwendet, um die Wechselwirkungen von Mitochondrien und Lysosomen in kultivierten Zellen sowohl auf EM- als auch auf LM-Ebene zu beobachten. Für Mitochondrien wurde der mEosEM-Tag aufgrund seiner Fähigkeit ausgewählt, das Fluoreszenzsignal während der EM-Probenvorbereitung in einer Fixierlösung und OsO423 zu erhalten. Für Lysosomen wurde der APEX2-Tag, ein Protein von etwa 28 kDa, verwendet, um die Lokalisation eines spezifischen Proteins sowohl auf EM- als auch auf LM-Ebene zu untersuchen24. In Gegenwart von Wasserstoffperoxid bildet das Substrat des APEX2, Amplex-Red, ein unlösliches Polymer, das durch konfokale Mikroskopie an der Zielstelle des Tags beobachtet werden kann. In diesem Protokoll wurde zweifarbiges CLEM verwendet, um die Struktur der Wechselwirkungen zwischen Lysosomen und Mitochondrien in fixierten Zellen sichtbar zu machen.

Protokoll

Der Schritt-für-Schritt-Arbeitsablauf für die Probenvorbereitung ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Zellkultur und Transfektion

  1. HeLa-Zellen mit einer Dichte von 1 × 105 Zellen in 35-mm-Kulturschalen mit Glasgitterboden, die DMEM enthalten, mit 10 % fötalem Rinderserum und 100 μl/ml Penicillin und Streptomycin bei 37 °C.
  2. Am Tag nach der Aussaat der Zellen co-transfiziert die Zellen bei 30%-40% Konfluenz mit TMEM192-V5-APEX2- und Mito-mEosEM-Plasmiden unter Verwendung des Transfektionsreagenzes gemäß den Anweisungen des Herstellers (je 1 μg TMEM192-V5-APEX2- und Mito-mEosEM-Plasmid-DNA mit 3 μl Transfektionsreagenz). Nach der Transfektion werden die Zellen 18 h lang mit DMSO oder U18666A (2 μg/ml) und Bafilomycin A1 (100 nM) behandelt.

2. Konfokale mikroskopische Bildgebung

  1. Nachdem Sie die Zellen 18 h lang mit Bafilomycin und U18666A behandelt haben, entfernen Sie das Nährmedium und fügen Sie sofort 250 μl warme (30 °C-37 °C) Fixierlösung (2,5 % Glutaraldehyd und 2 % Paraformaldehyd in 0,1 M Natriumcacodylatlösung [pH 7,0]) durch vorsichtiges Pipettieren hinzu. Entfernen Sie sofort das Fixiermittel, ersetzen Sie es durch 1,5 ml frisches Fixiermittel und inkubieren Sie es 30 Minuten lang auf Eis. Waschen Sie dann die Zellen 3 x 10 min in 1 mL eiskaltem 0,1 M Natriumcacodylat-Puffer.
    HINWEIS: Aldehyddämpfe sind giftig. Alle Versuche sollten in einem belüfteten Abzug durchgeführt werden.
  2. Fügen Sie 1 ml kalte 20 mM Glycinlösung hinzu, um den Aldehyd zu löschen, und inkubieren Sie 10 Minuten lang auf Eis. Waschen Sie 3 x 10 Minuten in kaltem 0,1 M Natriumcacodylatpuffer
    3. .
  3. Eine frische Lösung mit 300 μM Amplex-Red wird durch Zugabe von 10 mM H2O2 zu einer 0,1 M Cacodylatlösung hergestellt. 500 μl Amplex-Red-Lösung in die Probenschale geben und 5 Minuten auf Eis inkubieren.
  4. Entfernen Sie die Amplex-Red-Lösung und spülen Sie sie 3 x 10 min mit 0,1 M Natriumcacodylatpuffer aus.
  5. Verwenden Sie nach der Amplex-Red-Färbung ein konfokales Mikroskop, um den Bereich um die interessierenden Zellen im 3 x 3-Kachel-Scan-Modus abzubilden. Erfassen Sie sowohl den differentiellen Interferenzkontrast (DIC) als auch das Fluoreszenzsignal, um das Raster und die Buchstaben auf der Gitterschüssel mit einem 40-fachen (oder 60-fachen) Objektiv zu identifizieren und aufzuzeichnen.
    HINWEIS: Diese Übersichtsbilder dienen als Karte zur Identifizierung spezifischer Zielzellen in den in Kunststoff eingebetteten Proben.
  6. Bilden Sie die Zielzellen bei hoher Vergrößerung mit einem 40-fachen (oder 60-fachen) Objektiv ab und nehmen Sie ein Z-Stapel-Bild auf.
    HINWEIS: Dieses Bild mit hoher Vergrößerung wird mit einem elektronenmikroskopischen Bild überlagert, um ein korrelatives Bild zu erstellen.

3. Probenvorbereitung für den EM-Block

  1. Nach der LM-Bildgebung 1 ml 1 % reduziertes Osmiumtetroxid (hergestellt durch Gehalt von 3 % Kaliumferrocyanid in 0,3 M Cacodylatpuffer mit einem gleichen Volumen von 2 % wässrigem Osmiumtetroxid) für die Nachfixierung bei 4 °C für 1 h zugeben und dann 3 x 10 Minuten lang mit destilliertem Wasser bei 4 °C spülen
    HINWEIS: Osmiumtetroxid-Dämpfe sind giftig. Alle Versuche sollten in einem belüfteten Abzug durchgeführt werden.
  2. 3 x 10 min mit destilliertem Wasser bei Raumtemperatur spülen und dann in einer abgestuften Ethanolserie jeweils 15 min (50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 100 % und 100 %) bei Raumtemperatur dehydrieren.
  3. Mischen Sie Ethanol mit Epoxidharz in Volumenverhältnissen von 3:1, 1:1 und 1:3 und bereiten Sie insgesamt 300 μl jeder Mischung vor. Gießen Sie jedes Epoxidharz in die Schale und lassen Sie es 1 h lang bei Raumtemperatur inkubieren. Verwenden Sie dann das 100%ige Epoxidharz für die Imprägnierung über Nacht.
  4. Bereiten Sie die Einbettkapsel oder das PCR-Röhrchen vor, indem Sie es mit frischem Epoxidharz füllen, das Röhrchen oder die Kapsel kopfüber auf den interessierenden Bereich legen und für 48 h bei 60 °C in einen Ofen stellen, um zu polymerisieren.

4. Schnitte und TEM-Bildgebung

  1. Nachdem das Epoxidharz vollständig polymerisiert ist, trennen Sie das untere Glas vom Polymerblock, indem Sie es in flüssigen Stickstoff tauchen.
  2. Legen Sie den Probenblock in den Probenhalter des Ultramikrotoms und setzen Sie ihn in den Trimmblock ein. Verwende eine Rasierklinge, um das Harz in eine trapezförmige oder rechteckige Form um das Objekt des Interesses zu trimmen.
  3. Legen Sie den beschnittenen Probenblock in den Probenhalter und stellen Sie die Diamanttrennscheibe ein. Stellen Sie sicher, dass die Vorderkante des Probenblocks perfekt parallel zur Kante der Diamantscheibe verläuft.
  4. Schneiden Sie mit einem Ultramikrotom ultradünne Schnitte etwa 60-70 nm aus den flach eingebetteten Zellen. Sammeln Sie die Serienprofile auf einem formvarbeschichteten Schlitzgitter und trocknen Sie sie auf einer heißen Platte.
  5. Färben Sie die Stelle 2 min lang mit dem Kontrastfleck und 1 min mit Bleicitrat.
  6. Platzieren Sie das Gitter zur Beobachtung in den TEM-Probenhalter. Identifizieren Sie die Zielzelle von Interesse anhand des DIC-Bildes des Lichtmikroskops. Stellen Sie den gesamten Zellbereich mit gekachelten, überlappenden Bildern mit 1.700-facher Vergrößerung dar.

5. Bild-Stitching mit imageJ Fiji.

  1. Um mit dem Zusammenfügen von Bildern zu beginnen, starten Sie imageJ Fiji25 und klicken Sie auf Datei | Neu | TrakEM2 (leer) | Wählen Sie den Speicherordner aus, um ein neues TrakEM226-Projekt zu erstellen (Abbildung 2A1).
  2. Öffnen Sie das Kachelbild-Dataset, indem Sie die unformatierten Kachelbilddaten per Drag & Drop in den Arbeitsbereich ziehen (Abbildung 2A2).
  3. Klicken Sie mit der rechten Maustaste und wählen Sie Ausrichten | Montage aller Bilder in dieser Ebene | elastisch (nichtlineare Blockkorrespondenzen), und klicken Sie dann auf OK, um die Standardwerte für verbleibende Parameter zu übernehmen (Abbildung 2A3).
  4. Klicken Sie mit der rechten Maustaste und wählen Sie Exportieren | Flaches Bild erstellen, um ein zusammengefügtes Bild zu erstellen, und klicken Sie dann auf Datei | Speichern unter, um das Bild zu speichern.

6. Ändern der Größe des Fluoreszenzbildes

  1. Öffnen Sie die Fotovergrößerungssoftware (siehe Materialtabelle). Klicken Sie auf Datei | Öffnen Sie das Fluoreszenzbild und wählen Sie es aus.
  2. Geben Sie die Breite und Höhe ein, die der Größe des Elektronenmikroskopbildes entsprechen sollen, und wählen Sie den Algorithmus aus, der in der Größenänderungsmethode angewendet werden soll (Abbildung 2B1).
  3. Klicken Sie auf Datei | Speichern unter, um das in der Größe geänderte Bild zu speichern.

7. Landmark-basierte Bildregistrierung mit dem Big Warp-Plugin

  1. Öffnen Sie ImageJ Fiji und ziehen Sie die verkleinerte Fluoreszenzmikroskopaufnahme (FM-Bild) und die zusammengesetzte elektronenmikroskopische Aufnahme (EM-Bild) per Drag & Drop.
  2. Klicken Sie auf Plugins | BigData-Betrachter | Big Wrap, um die Registrierung zu starten, klicken Sie dann auf das Dropdown-Menü, um das FM-Bild als bewegtes Bild und das EM-Bild als Zielbild auszuwählen (Abbildung 2C1).
    HINWEIS: Jedes FM- und EM-Bild verfügt über drei neue Popup-Fenster (BigWrap Moving Image, BigWrap Fixed Image und Landmarks), in denen Orientierungspunkte angezeigt werden.
  3. Vergleichen Sie die FM- und EM-Bilder mit Funktionen wie Zoom (Mausrad), Bilddrehung (Bewegen der Maus bei gedrückter linker Taste) und Verschieben (Bewegen der Maus bei gedrückter rechter Taste), und drücken Sie dann die Leertaste auf der Tastatur, um den Landmark-Modus einzuschalten, und drücken Sie die linke Maustaste, um mindestens drei Orientierungspunkte zu markieren, die in den FM- und EM-Bildern identifiziert wurden ( Abbildung 2C2, rosa Punkte und roter Pfeil).
  4. Nachdem Sie alle identifizierten Orientierungspunkte markiert haben, gehen Sie zu Datei | Bewegtbild exportieren | OK und es erscheint ein neues Popup-Fenster mit dem transformierten FM-Bild (Abbildung 2C3).
    HINWEIS: Das neu erstellte Popup-Fenster ist ein FM-Bild, das auf der Grundlage des Orientierungspunkts transformiert wurde. Überprüfen Sie die Achse, und nehmen Sie bei Bedarf Anpassungen vor, indem Sie Landmarken hinzufügen oder ändern und die Transformation neu berechnen.
  5. Klicken Sie auf Datei | Speichern unter, um das transformierte FM-Bild zu speichern.

8. Überlagerung von CLEM-Bildern

  1. Ziehen Sie in ImageJ das transformierte FM-Bild und das zusammengefügte EM-Bild per Drag & Drop.
  2. Klicken Sie auf Bild | Typ | 8-Bit-Farbe, um den gleichen Bildtyp für die LM- und EM-Bilder festzulegen (Abbildung 2D1).
    HINWEIS: Das EM-Bild muss zweimal in der folgenden Reihenfolge konvertiert werden: 8-Bit -> RGB-Farbe -> 8-Bit-Farbe.
  3. Klicken Sie auf Bild | Farbe >| Kanäle zusammenführen, um die Bilder zu einem zusammengesetzten Bild zu kombinieren, indem Sie die FM- bzw. EM-Bilder aus dem Dropdown-Menü auswählen (Abbildung 2D2).
  4. Klicken Sie auf Datei | Speichern unter, um das CLEM-Bild zu speichern.

Ergebnisse

Um die Wechselwirkungen zwischen Mitochondrien und Lysosomen mittels dieses zweifarbigen CLEM-Protokolls sichtbar zu machen, verwendeten wir Mito-mEosEM und TMEM192-V5-APEX2. Fixierte Zellen wurden zunächst mit einem Lichtmikroskop abgebildet, gefolgt von der Probenentnahme und Bildgebung mittels Elektronenmikroskopie. Die Ergebnisse der korrelierten Bilder sind in Abbildung 3A,B und Abbildung 4A dargestellt. Gemäß dem oben beschriebenen Protokoll überprüften wir, ob wir Veränderungen in der Interaktion zwischen Mitochondrien und Lysosomen unter äußerer Belastung beobachten konnten.

Die Behandlung von Zellen mit BFA, einem lysosomalen V-ATPase-Inhibitor, hemmt die Autophagie, was zu einer verminderten mitochondrialen Qualität und erhöhten Interaktionen zwischen Mitochondrien und Lysosomen führt27. In BFA-behandelten Zellen beobachteten wir Mitochondrien, die innerhalb von Lysosomen eingeschlossen waren (Abbildung 3B), im Vergleich zu DMSO-behandelten Kontrollzellen (Abbildung 3A). Obwohl es schwierig ist, fragmentierte elektronendichte Mitochondrien und zelluläre Kompartimente innerhalb von Lysosomen allein anhand von Elektronenmikroskopieaufnahmen zu unterscheiden, können sie in korrelierten Bildern leicht identifiziert werden (Abbildung 3B1,B2). Die Struktur der mitochondrialen Störung (Abbildung 3A1,A2; blauer Pfeil), die in den Mitochondrien von DMSO-behandelten Zellen beobachtet wird, steht nicht in Beziehung zu Lysosomen. Die Struktur im Fluoreszenzbild, die wie ein innerhalb eines großen Mitochondriums eingeschlossener Lysosom erscheint, ist eine Struktur, bei der das Mitochondrium den Lysosom umgibt (Abbildung 3A2; roter Pfeil).

Als Nächstes untersuchten wir die Wirkungen von U18666A (2 µg/mL für 18 h), einem bekannten Inhibitor von NPC1, der den Transport von Cholesterin aus Lysosomen heraus blockiert28. Zellen, die mit U18666A behandelt wurden, zeigten eine verstärkte direkte Interaktion zwischen Mitochondrien und Lysosomen (Abbildung 4). Außerdem unterschieden sich die Kontakte zwischen Mitochondrien und Lysosomen in den mit U18666A behandelten Proben von denen in den mit BFA behandelten Proben. In mit BFA behandelten HeLa-Zellen ist das fragmentierte Mitochondrium vollständig im Lysosom eingeschlossen, eine zuvor beschriebene Mitophagie-Morphologie12,29. In der mit U18666A behandelten Gruppe erscheinen hingegen einige TMEM192-positive Lysosomen von Mitochondrien umschlossen (Abbildung 4D,E)30,31.

Zellvorbereitung und Bildgebungsablauf: Transfektion, APEX2-Markierung, konfokale Mikroskopie, TEM-Setup-Analyse.
Abbildung 1: Schematische Übersicht der TEM-basierten KLEM unter Verwendung eines genetisch markierten Fluoreszenzprobes. (A) HeLa-Zellen wurden in 35-mm-Kulturschalen mit Glasgitterboden kultiviert. (B) Fixierte Zellen wurden mit Amplex-Red durch das APEX2-Protein markiert. (C) Fluoreszenzbilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop aufgenommen. Ein motorisierter Probentisch und die Tile-Scan-Funktion wurden verwendet, um ein großes Übersichtsbild sowie ein hochauflösendes Bild der Zielzelle zu erfassen. Das Übersichtsbild dient als Navigationskarte zur Lokalisierung der Zielzelle in plastik-eingebetteten Proben. (D) Fortsetzung mit Nachfixierung sowie Dehydrierung und Einbettung. (E) Die Einbettung erfolgte mittels einer PCR-Röhrchen oder BEEM-Kapsel, die mit Harz über der Zielzelle auf der Deckglaskappe gefüllt wurde. (F) Nach der Harzpolymerisation hinterließ das Entfernen der Deckglaskappe ein eingeprägtes Gittermuster auf der Unterseite des Blocks. (G) Die Zielzelle wurde anhand des eingeprägten Musters auf der Harzoberfläche identifiziert, und die Zielzelle wurde mit einem Ultramikrotom in etwa 60 nm dicken Schnitten präpariert. (H) Serienschnitte wurden auf einer mit Formvar beschichteten Kupfer-Rahmengrill aufgefangen. (I) Die Grills wurden mittels Transmissionselektronenmikroskopie untersucht. Abkürzungen: TEM = Transmissionselektronenmikroskopie; KLEM = korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie; ROI = Bereich von Interesse. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Diagramm der Bildverarbeitung: Bild-Stitching, Fluoreszenz-Größenänderung, Landmark-Registrierung, CLEM-Überlagerung.
Abbildung 2: Bildverarbeitung und Erstellung des CLEM-Bildes mittels ImageJ Fiji. (A1) Haupt-GUI von Fiji und TrakEM2. (A2) Import des Kachelbild-Datensatzes, aufgenommen mit TEM bei 1.700facher Vergrößerung. (A3) Ausrichtung und Beispiel eines zusammengesetzten Bildes mithilfe der Bildausrichtungsmethode von TrakEM2. (B1-B3) Umwandlung eines kleinen Lichtmikroskopiebildes in große, hochwertige Bilder mittels Software zur Bildvergrößerung. (C1-C3) Arbeitsablauf zur Registrierung zwischen Lichtmikroskopie- und Elektronenmikroskopie-Bildern unter Verwendung der Big-Wrap-Plug-in-Software. (D1-D3) Der Prozess der Überlagerung eines transformierten FM-Bildes und eines EM-Bildes zur Synthese eines korrelierten Mikroskopiebildes. Abkürzungen: TEM = Transmissionselektronenmikroskopie; CLEM = korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie; FM = Fluoreszenzmikroskopie. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Konfokale, TEM-, CLEM-Diagramm; Lokalisation von Mitochondrien, Lysosomen; Analyse zellulärer Strukturen.
Abbildung 3: CLEM-Aufnahmen der Kontaktstellen zwischen Mitochondrien und Lysosomen in unbehandelten Zellen oder solchen, die mit Bafilomycin A1 behandelt wurden. HeLa-Zellen wurden mit Mito-mEosEM (Mitochondrien; grün) und TMEM192-APEX2 (Lysosomen; rot) koadjektioniert und anschließend mit dem Amplex-Red-Farbstoff gefärbt. (A) Unbehandelte HeLa-Zellen. Molekulare Informationen aus dem Fluoreszenzsignal (linkes Panel) und ultrasruckturelle Informationen aus der TEM (mittleres Panel) wurden basierend auf dem mitochondriellen Signal und der Morphologie überlagert (rechtes Panel). (A1,A2) In unbehandelten HeLa-Zellen ist die mitochondriale Innenmembran unterbrochen (blauer Pfeil) oder Mitochondrien und Lysosomen befinden sich in unmittelbarer Nähe zueinander (roter Pfeil). (B1,B2) In HeLa-Zellen, die 18 h mit Bafilomycin A1 behandelt wurden, wurde Mitophagie beobachtet, charakterisiert durch das Einfangen nicht abgebauter Mitochondrien in Lysosomen (grüner Pfeil). Maßstabsbalken = 1 µm (A1,A2,B1,B2). Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Konfokale, TEM- und CLEM-Mikroskopieaufnahmen von Mitochondrien (grün) und Lysosomen (rot) in Zellen.
Abbildung 4: CLEM-Aufnahmen der Kontaktstellen zwischen Mitochondrien und Lysosomen nach Behandlung mit U18666A (A) Zweifarbige CLEM-Aufnahmen von Mito-mEosEM und TMEM192-V5-APEX2 (mit Amplex-Red markiert) exprimierenden HeLa-Zellen unter Behandlung mit U18666A (2 µg/mL für 18 h). (A1,A2) Rote Pfeile zeigen Kontaktstellen zwischen Mitochondrien und Lysosomen an. Maßstabsbalken = 1 µm. (B1-B3,C1-C3) Der rote Pfeil zeigt das Auftreten einer interorganellären Fusion zwischen Mitochondrien und Lysosomen in Serienaufnahmen an. Maßstabsbalken = 500 nm (B1-B3). Maßstabsbalken = 1 µm (C1-C3). (D,E) Hochvergrößerte TEM-Aufnahmen der Fusionsstellen zwischen Mitochondrien und Lysosomen. Pseudofarben dienen zur Unterscheidung zwischen Mitochondrium (grün) und Lysosom (rot). Maßstabsbalken = 100 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt die zweifarbige CLEM, um die Interaktion von Mitochondrien und Lysosomen in fixierten Zellen unter Verwendung von genetisch kodierten mEosEM- und APEX2-Tags zu beobachten. In den letzten Jahrzehnten haben Fortschritte in der Mikroskopie die Fähigkeit, Veränderungen in Organellennetzwerken zu beobachten, erheblich verbessert 32,33, und die Untersuchung von Organelleninteraktionen ist zunehmend interessant geworden. Die hochauflösende Mikroskopie wurde verwendet, um Veränderungen in hochdynamischen Kontakten zwischen Mitochondrien und Lysosomen zu beobachten 34,35,36. Trotz des Einsatzes der hochauflösenden Mikroskopie ist es jedoch schwierig, Veränderungen in der Dicke der inneren und äußeren Mitochondrienmembranen (ca. 22 nm) und der Cristae-Übergänge (ca. 28 nm) zu unterscheiden37. Die Transmissionselektronenmikroskopie hat den Vorteil, dass sie die Struktur biologischer Proben mit sehr hoher Auflösung beobachten kann, hat aber den Nachteil, dass die Bilder nur in Schwarz-Weiß betrachtet werden können, was die Unterscheidung von Organellen in komplexen Bildern erschwert. In unserem Protokoll haben wir eine CLEM-Methode verwendet, die die Vorteile der Licht- und Elektronenmikroskopie kombiniert, um die Wechselwirkung zweier verschiedener Organellen zu überwachen, indem sie mit unterschiedlichen Farben gefärbt werden. Insbesondere ist die zweifarbige CLEM ein unschätzbares Werkzeug für die Beobachtung und Analyse der Mitophagie, des Prozesses des mitochondrialen Abbaus innerhalb von Lysosomen, wie in Abbildung 3 gezeigt.

Die Bildgebung von lebenden Zellen wird in der Regel unter physiologischen Bedingungen durchgeführt, so dass die Forscher die dynamischen zellulären Prozesse in Echtzeit beobachten können. Elektronenmikroskopische Techniken erfordern jedoch oft zeitaufwändige Probenvorbereitungsverfahren, einschließlich Fixierung und Färbung. Die Zeitverzögerung zwischen der Bildgebung lebender Zellen und der Probenvorbereitung der Elektronenmikroskopie begrenzt die zeitliche Auflösung der Technik und kann dazu führen, dass möglicherweise dynamische zelluläre Ereignisse übersehen werden. Um die Einschränkung des CLEM lebender Zellen zu überwinden, haben wir ein zweifarbiges CLEM-Verfahren entwickelt, bei dem die mEosEM-Sonde23 und der chemische Farbstoff (Amplex-Red) mit dem APEX2-Proximity-Markierungsenzym38 gefärbt werden, ohne das Fluoreszenzsignal auch in rauen Fixierumgebungen zu verlieren. In einer früheren CLEM-Studie39 wurden Diskrepanzen zwischen Fluoreszenzsignalen und EM-Bildern gefunden, die auf zeitliche Auflösungsprobleme bei der TEM-Probenahme nach der Lebendzellbildgebung und technische Einschränkungen bei der Probenvorbereitung zurückzuführen sind. Durch die Aufnahme von Fluoreszenzbildern fixierter Zellen über einen ausreichenden Zeitraum (Z-Stack-Bildgebung ganzer Zellen bei hoher Vergrößerung) können wir jedoch das Problem der zeitlichen Auflösung lösen und die Korrelation zwischen LM- und EM-Bildern verbessern (Abbildung 3 und Abbildung 4).

Ein weiterer Schlüsselfaktor für erfolgreiche CLEM-Ergebnisse ist die genaue Registrierung des LM-Bildes mit dem EM-Bild. Zu diesem Zweck haben wir zunächst eine Kombination aus DIC- und Fluoreszenzbildgebungsmodi während der lichtmikroskopischen Bildgebung verwendet, um eine Navigationskarte um die Zielzellen herum zu erstellen. Mit dieser Navigationskarte konnten wir die interessierenden Zellen auf dem Ultramikrotom und TEM leicht identifizieren. Zweitens konnten wir durch die Aufnahme von TEM-Kachelbildern ganzer Zellen bei hoher Vergrößerung viele Orientierungspunkte erhalten, die für die Bildregistrierung verwendet werden konnten. Unserer Erfahrung nach ist die Ausrichtungsgenauigkeit von LM- und EM-Bildern im Big Warp-Plugin umso besser, je höher die Anzahl der Landmarken ist.

In dieser Studie haben wir die Interaktionsdomänen von Lysosomen und Mitochondrien mit hochauflösenden CLEM-Ergebnissen gezeigt. Darüber hinaus ermöglichte die zweifarbige Sonde eine genaue Unterscheidung zwischen Mitochondrien und Lysosomen. Diese Methode hat jedoch einige Einschränkungen. Erstens, wenn die Reaktionszeit während der proximalen Markierung von Amplex-Red durch das APEX2-Enzym zu lang ist, diffundiert das Amplex-Red und färbt sich breiter als die Zielproteinstelle38. Zweitens ist die Dicke (Volumen der z-Achse) des Bereichs, in dem das Lysosom in die Mitochondrien eingeschlossen ist, recht klein, so dass die Verschmelzung der beiden Organellenmembranen in einem 50 nm dicken Serienschnitt nicht bestimmt werden kann. Darüber hinaus ist es eine große Herausforderung, die z-Achse eines optischen Schnitts mit dem Lichtmikroskop und eines mechanischen Schnitts mit dem Ultramikrotom genau auszurichten. Um diese Einschränkungen zu überwinden, kann die zweifarbige CLEM in Kombination mit der konventionellen Elektronentomographie40 oder dem seriellen Schnittvolumen-CLEM41 verwendet werden.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Diese Forschung wurde durch das KBRI-Grundlagenforschungsprogramm durch das Korea Brain Research Institute unterstützt, das vom Ministerium für Wissenschaft und IKT finanziert wird (24-BR-01-03). TMEM192-V5-APEX2-Plasmide wurden freundlicherweise von Hyun-Woo Rhee (Seoul National University) zur Verfügung gestellt. Die TEM-Daten wurden an den Brain Research Core Facilities in KBRI erfasst.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Chemikalien und Reagenzien
25% GlutaraldehydElektronenmikroskopie Sciences16200Aldehyddämpfe sind extrem giftig. Nur im Abzug verwenden.
30% Wasserstoffperoxid-LösungMerck107210
4% Paraformaldehyd-LösungBiosesangPC2031-100-00LDEHYD-Dämpfe sind extrem giftig. Nur im Abzug verwenden.
Amplex RotThermoFisherA12222
Epon 812Elektronenmikroskopie14120
EthanolMerck100983
Fugene HDPromegaE2311Plasmidtransfektion
GlycinSIGMAG8898
Bleicitrat 3%Elektronenmikroskopie Naturwissenschaften22410
Osmiumtetroxid 4 % wässrige LösungElektronenmikroskopie Sciences16320Sehr giftig. Nur im Abzug verwenden.
Kaliumhexacyanoferrat(II)-trihydrat SIGMAP3289
Natriumcacodylat-TrihydratSigma-AldrichC0250-500G
UranylacetatElektronenmikroskopieSciences 22400
UranyLess EM FärbungElektronenmikroskopieSciences 22409
Plasmid construction
Mito-mEosEMaddgen132706DOI:  10.1016/j.chembiol.2024.02.007
TMEM192-V5-APEX2Sharma N.  et al.N/ADOI:  10.1016/j.chembiol.2024.02.007
Tools
0.22 um SpritzenfilterSartorius16534
35 mm Gerasterte DeckglasschaleMattekP35G-1.5-14-CGRD
BEEM EinbettkapselnTed Pella130
Formvar unterstützt Kupfergitter mit einem SchlitzTed Pella01705
DiamantmesserDiATOMEDU4530
UltramikrotomLeicaARTOS 3D
Mikroskope
Inverse konfokale MikroskopieNikonA1 Rsi/Ti-E
TransmissionselektronenmikroskopieFEITecnai G2
Software und Algorithmen
Fiji/Image JNIH / Open Sourcehttps://imagej.nih.gov/ij/
ImageJ BigWarp SoftwarepaketNIH / Open Sourcehttps://imagej.net/plugins/bigwarp
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Gigapixel AI : https://www.topazlabs.com/gigapixel
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Referenzen

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