Kombination von Bildgebung und Elektrophysiologie zur Visualisierung und Aufzeichnung von sich ausbreitenden Depolarisationen bei Mäusen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll demonstriert die Kombination von Bildgebung und Elektrophysiologie, um sich ausbreitende Depolarisationen bei erwachsenen Mäusen nach einem leichten Schädel-Hirn-Trauma zuverlässig zu erkennen.

Zusammenfassung

Spreading Depolarisations (SDs) sind massive Ereignisse im Gehirn, die aufgrund ihrer langsamen Ausbreitung durch die graue Substanz oft unentdeckt bleiben. Da die SD-Erkennung schwer fassbar sein kann, wird sie mit mehreren Methoden optimal bestätigt. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Kombination von Bildgebung und Elektrophysiologie, um SDs auf eine Weise zu detektieren, die die meisten Laboratorien zuverlässig und einfach anwenden können. SDs treten nach traumatischen Hirnverletzungen, Schlaganfall, Subarachnoidalblutungen, Ischämie und Migräneaura auf. In der Vergangenheit wurden SDs mit Gleichstromverstärkern aufgezeichnet, die die langsame extrazelluläre Verschiebung und die Depression der hochfrequenten Aktivität auflösen können. Gleichstromverstärker sind jedoch für chronische In-vivo-Aufnahmen kaum zu verwenden. Dieses Protokoll verwendet einen gemeinsamen AC-Verstärker für In-vivo-Elektrophysiologie-Aufzeichnungen zur Bestätigung hochfrequenter Depressionen sowie eine nicht-invasive Bildgebung, die zum Nachweis der sich ausbreitenden Welle von SD erforderlich ist. Diese Methoden können zuverlässig für die meisten experimentellen Ansätze übernommen und/oder modifiziert werden, um das Vorhandensein oder Fehlen von SDs nach einer Hirnverletzung zu bestätigen.

Einleitung

Spreading Depolarisations (SDs) sind mit verschiedenen neurologischen Erkrankungen verbunden, darunter Schädel-Hirn-Trauma (TBI), Schlaganfall, Subarachnoidalblutungen, Ischämie und Migräneaura¹. SDs wurden mit dem Fortschreiten der Gewebeschädigung bei Schlaganfällen und SHT in Verbindung gebracht². Der genaue Mechanismus, der dem Fortschreiten des Gewebeverlusts zugrunde liegt, bleibt unklar^3,4. SDs treten jedoch auf, wenn der metabolische Bedarf der Neuronen nicht mit ausreichend Sauerstoff und Glukose gedeckt wird, da die Funktion der ATP-abhängigen Natrium-Kalium-Pumpe nicht mehr ausreicht, um Ionengradienten aufrechtzuerhalten. Um die Rolle von SDs beim Gewebeverlust zu verstehen, sind präzise Techniken erforderlich, um sie zu messen und zu untersuchen, was für den Fortschritt der wissenschaftlichen Erkenntnisse von entscheidender Bedeutung ist. SDs sind signifikante neurologische Ereignisse, die aufgrund des experimentellen Designs und/oder der Einschränkungen der Instrumentierung oft unentdeckt bleiben können.

Die Rolle von sich ausbreitenden Depolarisationen (SDs) beim Fortschreiten von Verletzungen wird derzeit geklärt, aber ihre Rolle bei leichten traumatischen Hirnverletzungen (mTBIs) bleibt unklar. Neuere Studien mit den in diesem Manuskript beschriebenen Techniken haben gezeigt, dass SDs in geschlossenen Schädel-mTBI-Mausmodellen initiiert werden, auch wenn es keine offensichtlichen Gewebeschäden oder Blutungen gibt^{5, 6}. Diese Studien deuten darauf hin, dass SDs zu akuten neurologischen Beeinträchtigungen und Neuroinflammation beitragen können. Darüber hinaus wurde das Vorhandensein von mTBI-induzierten SDs eng mit akuten Verhaltensdefiziten in Verbindung gebracht^6,7. Daher ist es wahrscheinlich, dass SDs in allen SHT-Modellen initiiert werden, aber ihre Rolle bleibt ohne Bestätigung schwer zu bestimmen. Die Bestätigung des Vorhandenseins von SDs ist entscheidend für die genaue Beurteilung der Ergebnisse von mSHT.

Sich ausbreitende Depolarisationen (SDs) werden durch einen signifikanten Abfall des extrazellulären Potentials gekennzeichnet, der als "DC-Verschiebung" bekannt ist, und durch eine Verschlechterung der hochfrequenten Aktivität⁸. Die Auflösung der "DC-Verschiebung" dauert in der Regel Sekunden (~10 s)⁹. Um die "DC-Verschiebung" zu erfassen, werden ein DC-Verstärker und Silberdrahtelektroden benötigt. In vivo wird die Elektrophysiologie jedoch in der Regel mit AC-Verstärkern durchgeführt, die darauf ausgelegt sind, niederfrequente Ereignisse herauszufiltern und Bewegungsartefakte zu reduzieren. Leider beseitigt diese Tieftonfilterung auch die "DC-Verschiebung". Außerdem ist Silber giftig und für chronische Aufnahmen ungeeignet. Häufig verwendete AC-Verstärker können die Depression der hochfrequenten Aktivität erkennen, jedoch ohne die damit einhergehende "DC-Verschiebung", die das Vorhandensein einer SD-Karte bestätigt, ist eine Herausforderung.

Spreading Depolarisations (SDs) können auch mit verschiedenen bildgebenden Verfahren nachgewiesen werden. Am häufigsten werden SDs mit Laser-Speckle-Kontrastbildgebung abgebildet, die den zerebralen Blutfluss durch den intakten Schädel misst¹⁰. SDs beeinflussen die zerebralen Gefäße und den Blutfluss erheblich. Bei den meisten Spezies außer Mäusen induzieren SDs eine sich ausbreitende Welle der Hyperperfusion, die sich mit der Vorderkante der SD^{11 ausbreitet}. SDs können auch mit Calcium- oder Glutamat-Fluoreszenzindikatoren abgebildet werden¹², obwohl dies die Beladung des Gewebes mit Farbstoffen oder genetisch kodierten Fluoreszenzindikatoren erfordert^12,13. Interessanterweise können SDs aufgrund von intrinsischen optischen Signalen (iOS), die mit dem SD^{14 verbunden sind, mit bloßem Auge beobachtet werden}. iOS sind komplexe Signale, die aus autofluoreszierenden Molekülen wie NAD(P)H und FADH^15,16, Gewebeschwellungen¹⁷ und möglichen Veränderungen des zerebralen Blutflusses bestehen. Trotz ihrer Komplexität sind iOS-Signale zuverlässig und können in Wildtyp-Mäusen erfasst werden¹⁸. Dieses Protokoll beschreibt die Methode zur Bildgebung von iOS, da diese Technik in jedem Labor implementiert werden kann, ohne dass spezialisierte Viren oder transgene Tiere erforderlich sind.

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, das Vorhandensein oder Fehlen einer sich ausbreitenden Depolarisation (SD) nach einem leichten Schädel-Hirn-Trauma (mTBI) experimentell mit gleichzeitiger Bildgebung und Elektrophysiologie zu bestätigen. Die In-vivo-Elektrophysiologie, die durch fortschrittliche Verstärker ermöglicht wird, ist eine häufig verwendete Technik. Diese Verstärker sind jedoch nicht in der Lage, die charakteristische "DC-Verschiebung" zu detektieren. Daher werden bildgebende Verfahren, wie sie in diesem Protokoll beschrieben werden, eingesetzt, um das Vorhandensein oder Fehlen von SDs sicher zu bestätigen. Der Vorteil der Kombination von Bildgebung und Elektrophysiologie besteht darin, dass die Bildgebung die Ausbreitung der SD erkennen kann, während die Elektrophysiologie die damit verbundene hochfrequente Depression identifizieren kann.

Insgesamt eignet sich diese Methode zur Untersuchung des Vorhandenseins von sich ausbreitenden Depolarisationen (SDs) nach einem Schädel-Hirn-Trauma (SHT). Seine Anwendung könnte das Verständnis der kortikalen Netzwerkfunktion nach SHT und SD verbessern. Dieses Protokoll kann von einem geschlossenen Schädelaufprallmodell auf andere Modelle übertragen werden, wie z. B. kontrollierte kortikale Auswirkungen, flüssige Perkussion oder Gewichtsabfall. Die Implementierung dieses Protokolls in mehreren Labors könnte die Rolle von SDs bei unterschiedlichen SHT-Schweregraden aufklären. Jedes etablierte TBI-Modell kann verwendet werden, gefolgt von den in diesem Protokoll beschriebenen iOS-Bildgebungs- und Elektrophysiologieverfahren.

Protokoll

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem Animal Care and Use Committee (IACUC) des Instituts an der Universität von New Mexico durchgeführt. C57BL/6J-Mäuse wurden aus einer kommerziellen Quelle gewonnen. Es wurde die gleiche Anzahl von männlichen und weiblichen Mäusen im Alter von 8-14 Wochen verwendet. Alle Mäuse wogen ca. 20 g. Einzelheiten zu den Tieren, Reagenzien und Geräten, die in dieser Studie verwendet wurden, sind in der Materialtabelle aufgeführt. Die Zusatzdatei 1 enthält die Liste der Abkürzungen.

1. Vorbereitung des Schädels für Bildgebung und Elektrophysiologie

1. Betäuben Sie das Tier in einer Isofluran-Induktionsbox mit 2%-3% Isofluran in 100% Sauerstoff, um die richtige Anästhesietiefe zu gewährleisten, ohne dass Sie durch ein Pfotenkneifen
zusammenzucken müssen.
2. Verabreichen Sie präoperative Analgetika (Buprenorphin mit langsamer Freisetzung, 3,25 mg/kg, SQ), bevor Sie das Tier in einen stereotaktischen Rahmen setzen und die Narkose (2% Isofluran) aufrechterhalten.
3. Fügen Sie eine Augensalbe hinzu und halten Sie die Körpertemperatur des Tieres mit einem Heizkissen aufrecht, das eine Rückmeldung der Körpertemperatur hat.
4. Rasieren Sie die Haare oberhalb des Schädels, wo der Schnitt sein wird, entlang der Mittellinie von der Augenfissur bis zum Lambda.
5. Entfernen Sie die abgeschnittenen Haare, bevor Sie die Haut mit einem antiseptischen und desinfizierenden Peeling und einer Lösung sterilisieren. Mit 70 % Ethanol abschließen und dreimal wiederholen, um eine sterile Operationsstelle zu gewährleisten.
6. Machen Sie mit einer Skalpellklinge #10 einen Schnitt in der Mittellinie von rostral nach kaudal, unmittelbar gefolgt von dem Auftragen von medizinischem Cyanacrylatkleber auf den Schnitt. Spreize die Haut seitlich, um den Schädel freizulegen.
7. Geben Sie noch ein oder zwei Tropfen Cyanacrylatkleber auf den Schädel, um den Schädel zusätzlich zu schützen.
   HINWEIS: Das Auftragen von Klebstoff ist zeitkritisch, da der Schädel undurchsichtig wird, wenn er länger als 10 s der Luft ausgesetzt wird. Dadurch wird die Visualisierung der SD durch bildgebende Verfahren verschleiert.
8. Während der Kleber trocknet, verwenden Sie eine sterile chirurgische Schere, um die Schnittgröße über dem Kleinhirn zu erhöhen. Sobald der Kleber ausgehärtet ist, beginnen Sie mit der Implantation von Schädelschraubenelektroden.
   1. Sterilisieren Sie die Schädelschrauben vor der Implantation 20-30 s lang mit einem Bead-Sterilisator.
   2. Platzieren Sie die Schädelschrauben in einer Region, die weit von der SD-Initiationsstelle entfernt ist, um ein offenes Sichtfenster zu erhalten.
      HINWEIS: Für chronische Aufzeichnungen im primären visuellen Kortex werden drei Schädelschrauben verwendet. Die erste Schraube wird etwa in y = -6,00 mm vom Bregma entfernt im Kleinhirn platziert und dient als Referenzelektrode. Die Aufzeichnungselektroden sind in einem Abstand von y = -2,79 mm vom Bregma und x = ±2,5 mm von der Mittellinie entfernt, innerhalb der linken und rechten Hemisphäre positioniert.
   3. Bohren Sie mit einem Bohrer der Größe 0,8 mm Pilotlöcher durch den Schädel. Um sicherzustellen, dass das darunterliegende Gewebe nicht beschädigt wird, sind -0,5 mm in z ideal. Verwenden Sie #00-90 Schrauben, die mit Edelstahldraht auf Goldstifte vorgelötet sind.
   4. Drehen Sie die Schrauben nach unten in den Schädel.1,5-2 volle Umdrehungen bringen die Schraube durch den Schädel und in Kontakt mit der kortikalen Oberfläche.
   5. Wickeln Sie überschüssigen Draht um die Schraube und lassen Sie den Draht etwas locker, um ihn später auf der Bühne platzieren zu können.
   6. Setze auf die gleiche Weise die anderen Schädelschrauben ein.
   7. Sobald alle Schädelschrauben an Ort und Stelle sind, stecken Sie alle goldenen Stifte in den gewünschten Headstage-Anschluss. Halten Sie den Stecker mit dem stereotaktischen Arm an Ort und Stelle und halten Sie die Steckerstifte dicht über die Schraubenköpfe, während Sie darauf achten, dass sich die Drähte nicht berühren.
   8. Versiegeln Sie den gesamten Bereich mit Cyanacrylatkleber und achten Sie darauf, den Bildgebungsbereich vor den Schädelschrauben nicht zu stören.
   9. Bauen Sie Zahnzement um die Basis der Goldstifte auf und stellen Sie sicher, dass die Goldstifte von den Schädelschrauben nicht mit den Goldstiften im Kopfstadium verbunden werden.
   10. Lassen Sie den Zahnzement aushärten, bevor Sie den Kopftischverbinder entfernen.
   11. Nehmen Sie das Tier aus dem stereotaktischen Rahmen und setzen Sie es zurück in den Heimkäfig, um sich zu erholen. Befolgen Sie die postoperative Standardversorgung und halten Sie die Tiere auf einem Heizkissen, während sie sich von der Narkose erholen.
       HINWEIS: Nach der Operation wurden die Tiere in Einzelunterkünften untergebracht und täglich auf Schmerzen überwacht. Befolgen Sie die lokalen institutionellen Richtlinien für die Analgesie. Wenn Sie ein Buprenorphin mit langsamer Freisetzung verwenden, überwachen Sie die Schmerzen und geben Sie möglicherweise eine zusätzliche Dosis nach 72 Stunden.
9. Entfernen Sie alle Gegenstände, die sich an den Elektroden verfangen könnten, einschließlich Gehäuse und Anreicherung. Verwenden Sie Standardbettwäsche mit Ad-libium-Zugang zu Futter und Wasser.
   HINWEIS: Rechnen Sie mit einer zweitägigen Erholungsphase zwischen Operation und Aufnahme.

2. Detektion von sich ausbreitenden Depolarisationen mit intrinsischer optischer Signalbildgebung (iOS) und AC-Elektrophysiologie

1. Betäuben Sie die Tiere mit 2% Isofluran in 100% Sauerstoff.
   HINWEIS: Der bildgebende Teil dieses Verfahrens sollte ~5 Minuten dauern, und die Menge der Isofluran-Exposition sollte konsistent sein.
2. Setzen Sie das Tier in einen stereotaktischen Rahmen. Halten Sie durch den Nasenkonus 1%-2% Isofluran in Sauerstoff.
   HINWEIS: Es ist wichtig, die richtige Anästhesietiefe beizubehalten, da Isofluran dafür bekannt ist, SDs zu reduzieren. Während des gesamten Experiments wird empfohlen, 60-70 Atemzüge/min aufrechtzuerhalten.
3. Platzieren Sie das Tier unter der Kamera und stellen Sie sicher, dass die Kamera auf die kortikale Oberfläche fokussiert ist, indem Sie den Fokusring einstellen.
4. Tragen Sie Mineralöl auf den Bildgebungsbereich auf, um die Transparenz zu erhöhen.
5. Schalten Sie die Computer, die LED-Tafel und die elektrophysiologischen Geräte ein.
   HINWEIS: Die LED-Tafel funktioniert am besten, wenn sie vor dem Tier positioniert wird, um das Bildgebungsfenster zu beleuchten, wenn die Deckenbeleuchtung ausgeschaltet ist. Das Licht wurde auf ~2.400 Lux (95 % Leistung) mit einer kühlen Temperatureinstellung von 4000 K eingestellt.
6. Ladeeinstellung für iOS mit Micro-Manager^19,20,21,22.
   1. Drücken Sie Live, um die Maus unter der Kamera anzuzeigen und den Schädel des Tieres unter der Kamera zu zentrieren. Schließen Sie das "Live"-Fenster.
   2. Drücken Sie Multi-D Acq.
   3. Wählen Sie im Fenster "Mehrdimensionale Erfassung" die gewünschten Zeitpunkte aus.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, 750 Bilder in einem Intervall von 250 ms zu zählen.
   4. Speichern Sie Bilder im gewünschten Dateipfad und Namenspräfix.
7. Verbinden Sie die goldenen Stifte vom Tier mit dem Kopfbühnenstecker und dann mit dem Kopftisch.
8. Ladeeinstellung für die Intan-Software.
   1. Klicken Sie auf das Symbol Dateiformat auswählen und wählen Sie im Popup-Fenster das Format Eine Datei pro Signaltyp aus. Dadurch wird die Datei als ".dat" für die weitere Verwendung in MATLAB gespeichert.
   2. Wählen Sie auf der Registerkarte BW unter Hardwarebandbreite die Verstärkerbandbreite von 0,13 bis 500 Hz aus.
   3. Wählen Sie unter Filter Display Selector die Option WIDE aus, um den größtmöglichen Signalbereich abzudecken.
   4. Um den gewünschten Dateipfad zum Speichern auszuwählen, klicken Sie auf das Symbol Dateiname auswählen.
9. Führen Sie den Aufprall mit einem elektromagnetischen Impaktor aus.
   HINWEIS: Die Schlagkörpereinstellungen betragen 4 m/s Aufprallgeschwindigkeit und 5 mm Durchbiegung.
   1. Schalten Sie den Schlagkörper ein und stellen Sie sicher, dass die Spitze richtig ein- und ausfährt, indem Sie den 3-Wege-Schalter betätigen, um die Spitze zurückzuziehen und die Spitze zu verlängern. Die Spitze sollte ausgestreckt werden, bevor Sie das Tier unter die Spitze setzen.
   2. Legen Sie das Tier schnell auf ein Schaumstoffbett und schieben Sie das Bett unter die Spitze.
   3. Richten Sie die Schlagkörperspitze an der Mittellinie und 1 mm rostral des Bregmas aus.
   4. Senken Sie die Schlagkörperspitze ab, bis sie die Oberseite des Kopfes des Tieres fest berührt.
      HINWEIS: Schieben Sie die Spitze nicht nach unten in den Kopf.
   5. Drücken Sie den Hebel, um die Schlagdüse zurückzuziehen, und senken Sie sie dann manuell um 5 mm ab, bevor Sie den Schlaghebel betätigen.
   6. Nehmen Sie das Tier sofort aus dem Schaumstoffbett und legen Sie das Tier innerhalb von 5 s zur Bildgebung unter die Kamera, da die SD nach dem Aufprall ausgelöst wird.
10. Starten Sie die iOS-Bildgebung, indem Sie im Fenster Multidimensionale Erfassung auf Erwerben! klicken. Bild für 4 Minuten, um die gesamte SD-Karte zu erfassen.
11. Starten Sie die elektrophysiologische Aufnahme, indem Sie auf das Aufnahmesymbol in der Intan-Software klicken.
12. Nehmen Sie das Tier aus der Schaumstoffunterlage und lassen Sie es sich in einer offenen Arena oder einem Heimkäfig erholen.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, die Elektrophysiologie mindestens 1 Stunde lang aufzuzeichnen, damit sich die Funktion des kortikalen Netzwerks erholen kann.
13. Wenn die Aufnahme abgeschlossen ist, ziehen Sie den Netzstecker des Tieres aus der Kopfbühne und dem Stecker und setzen Sie das Tier wieder in seinen Käfig ein.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, zwischen jedem Aufprall und der Aufnahmesitzung 24 Stunden zu vergehen. Das Tier kann die gesamte Zeit außerhalb der Aufnahmesessions in seinem Käfig bleiben.

3. Visualisierung und Quantifizierung von iOS-Bildern

1. Öffnen Sie in ImageJ^19,20,21,22, den Bildstapel, indem Sie auf die Sequenz Datei > Importieren > Bild klicken.
2. Scrollen Sie manuell durch die Bilder, um sicherzustellen, dass keine Bewegung oder andere Artefakte vorhanden sind.
3. Um den Plot des SD zu generieren, erstellen Sie einen ROI, indem Sie mit dem Cursor ein Quadrat zeichnen.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, ein Quadrat mit 30 x 30 Pixeln zu verwenden. Man kann jede beliebige Form und Größe verwenden, aber stellen Sie sicher, dass sich die ROI-Größe nicht zwischen den Tieren ändert.
4. Erstellen Sie einen Plot, indem Sie auf Bild > Stapel > Z-Achsen-Profil plotten. Klicken Sie in der neu erstellten Grafik auf den Live-Button. Kehren Sie zum Bildstapel der SD zurück und verschieben Sie den ROI, bis das Diagramm die SD-Kurve zeigt. Das Diagramm sollte wie eine Sündenwelle aussehen, mit einem anfänglichen Anstieg, gefolgt von einem Rückgang unter die Grundlinie und einer langsamen Rückkehr zur Basislinie innerhalb weniger Minuten.
   HINWEIS: Die Diagramme können als beliebige Einheiten (AU) oder als prozentuale Basislinie ausgedrückt werden, wobei die ersten Bilder als Basisliniendurchschnitt verwendet werden.
5. Klicken Sie im generierten Diagramm auf Liste, um eine Liste von Werten zu generieren, die in einer anderen Diagrammgenerierungssoftware oder Matlab dargestellt werden können.
6. Verwandeln Sie zur Visualisierung das Graustufenbild in eine Nachschlagetabelle in ImageJ von Image > Lookup Tables > Fire.

4. Elektrophysiologische Analyse

HINWEIS: Es wird empfohlen, dass die Expertise des Buzsaki-Labors und ihr MATLAB-generierter Code stark für die Visualisierung und Analyse elektrophysiologischer Daten genutzt werden. Für die Analyse müssen Sie MATLAB mit einem institutionellen Aktivierungscode und die Zip-Datei "Buzcode" des Buzsaki-Labors über GitHub (https://github.com/buzsakilab/buzcode) herunterladen.

1. Stellen Sie in der Intan-Elektrophysiologie-Software sicher, dass die exportierten Rohdaten im Format ".dat" gespeichert werden.
   HINWEIS: Matlab kann von der MathWorks-Website installiert werden. Für den Kauf und die Nutzung von Matlab ist ein institutioneller oder individueller Aktivierungscode erforderlich. Für die Durchführung dieser Analyse sind einige Vorkenntnisse mit dem Ausführen von Code in Matlab erforderlich.
2. Verwenden Sie die Funktion Buzaki Code bz_LoadBinary, um die Daten in Matlab zu laden.
   HINWEIS: Beispiel "'data' = bz_LoadBinary ('vollständiger Dateipfad','frequency', Abtastfrequenz, nKanäle, Anzahl der Kanäle);
3. Filtern Sie das AC-Rauschen mit einem Kerbfilter, der bei 60 Hz zentriert ist.
   HINWEIS: Beispiel notch_freq = 60; [b,a] = iirnotch(notch_freq/(sampling_frequency/2), notch_bandwidth/(sampling_frequency/2)); filtered_data = filtfilt(b, a, Daten);
4. Isolierung der hochfrequenten Aktivität mit einem Bandpassfilter mit einem Bereich von 0,5-100 Hz, gemäß den Empfehlungen der COSBID-Gruppe zur Analyse und Visualisierung von sich ausbreitenden Depolarisationen (SDs).
5. Berechnen Sie das Leistungsspektrogramm mit dem Befehl pspectrum in MatLab.
6. Zur Visualisierung stellen Sie das Hochfrequenz- und das Leistungsspektrogramm auf derselben Zeitskala und in einer Spalte dar.
   HINWEIS: Von den Diagrammen aus wird es eine Verlängerung der hochfrequenten Depression und des Leistungsverlusts geben.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt eine grafische Darstellung des Versuchsaufbaus. Die aufzeichnenden Schädelschrauben werden im primären visuellen Kortex positioniert, wobei eine Schädelschraubenelektrode als Masseelektrode im Kleinhirnvermis platziert wird. Die Schädelschrauben und Goldstifte werden mit Cyanacrylatkleber und Zahnzement am Schädel befestigt. Es ist wichtig, den Zahnzement auf den kaudalen Teil des Schädels zu beschränken, um Platz für Stöße und Bildgebung zu schaffen. Die Einschlagstelle, zentriert an der Mittellinie und etwa 1 mm rostral zum Bregma, ist in Abbildung 1 angegeben.

Repräsentative Bilder für intrinsische optische Signale (iOS) sind in Abbildung 2A dargestellt. Graustufenbilder werden mithilfe einer Fire-Lookup-Tabelle konvertiert, um die Visualisierung von sich ausbreitenden Depolarisationen (SDs) zu verbessern. Das iOS umfasst verschiedene Signale, darunter NAD(P)H, FADH und Gewebereflexion, was die Interpretation und den Vergleich dieser Signale schwierig macht. Große Gefäße sollten durch das Sekundenkleberfenster (gekennzeichnet durch Pfeile) deutlich sichtbar sein, während die gestrichelte Linie in Abbildung 2A die sich ausbreitende Welle des SD markiert. Obwohl SDs in Echtzeit schwer zu beobachten sind, werden sie deutlicher, wenn die Bilder beschleunigt werden (siehe Ergänzendes Video 1). Einige kleine Äste scheinen aufgrund einer Vasokonstriktion zu "verschwinden" (Abbildung 2A). Ein kleiner Bereich of Interest (ROI), der aus dem Bildstapel extrahiert wird, sollte ein Diagramm auf der Z-Achse ergeben, das Abbildung 2B ähnelt. Aus den elektrophysiologischen Aufzeichnungen sollte das extrahierte Hochfrequenzsignal den oberen Feldern von Abbildung 2C,D ähneln. Diese Aufzeichnungen wurden unmittelbar nach dem leichten Schädel-Hirn-Trauma (mTBI) eingeleitet, wobei die Tiere während der 4-minütigen iOS-Bildgebung unter Isofluran-Anästhesie blieben. Nach der Entfernung von Isofluran sollte die hochfrequente Aktivität bei Scheintieren innerhalb einer Minute schnell zurückkehren, wie in Abbildung 2C (roter Kasten) gezeigt. Umgekehrt blieb die hochfrequente Aktivität bei Auftreten einer SD mehrere Minuten lang niedrig, bevor sie sich erholte (Abbildung 2D, roter Kasten). Die unteren Felder von Abbildung 2C,D zeigen die berechnete Leistung (V²) für jedes Hochfrequenzdiagramm an. Diese Leistungsdiagramme helfen dabei, die Unterdrückung und Wiederherstellung der hochfrequenten Aktivität durch den schnellen Anstieg der Leistung zu identifizieren (gekennzeichnet durch den rechten Rand der roten Kästchen).

Abbildung 1: Versuchsaufbau und Lage von Schlag- und Schädelschrauben. Die dorsale Oberfläche des Schädels wird durch einen Hautschnitt freigelegt. Der Schädel und die Haut sind mit Cyanacrylatkleber versiegelt, um die Transparenz zu erhöhen. Aus Bregma wird ein Bohrloch für den Boden bei y = -6,00 und x = 0 gebohrt. Bohrlöcher für Aufzeichnungselektroden werden bei y = -2,79 und x = ±2,5 von Bregma platziert. Edelstahlschrauben werden durch den Schädel gefädelt und mit unbeschichtetem Edelstahldraht auf Goldstifte gelötet. Es wird darauf geachtet, dass die Schädeloberfläche nicht übermäßig mit Zahnzement bedeckt ist, um ausreichend Platz für Aufprall und Bildgebung zu gewährleisten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Repräsentative iOS-Bilder und AC-Aufnahmen. (A) Repräsentative iOS-Bilder mit Pfeilen, die Blutgefäße anzeigen. Graustufenbilder werden zur besseren Visualisierung in die Fire-Lookup-Tabelle in ImageJ konvertiert. Die gestrichelte schwarze Linie kennzeichnet die sich ausbreitende SD, die in iOS als Welle erhöhter Intensität visualisiert wird. Die SD-Karte ist gut sichtbar, wenn man schnell durch den gesamten Bildstapel scrollt. Das iOS-Signal spiegelt verschiedene physiologische und metabolische Veränderungen wider, die mit der SD verbunden sind, einschließlich der mitochondrialen Produktion von NAD(P)H und FADH sowie neuronaler Ödeme. Das Blackbox markiert den Bereich of Interest (ROI), der zum Generieren der Ablaufverfolgung in (B) verwendet wurde. Maßstabsleiste: 1 mm. (B) Repräsentative Spur der iOS-SD-Karte, ausgedrückt als Prozentsatz der Basislinie. Das iOS-Signal steigt an und kehrt innerhalb von ca. 60 s in die Nähe der Grundlinie zurück. Obwohl die Änderungen in den iOS-Signalen gering sind (ca. 10 %), reichen sie aus, um die SD zu identifizieren. In den AC-Aufzeichnungen sowohl für Schein- (C) als auch für SD (D) Tiere zeigen die oberen Spuren eine hochfrequente Aktivität und die unteren Spuren die Leistung (V²). Blaue Kästchen zeigen die Perioden der Isofluran-Anästhesie, während das rote Kästchen die Erholungsphase der hochfrequenten Aktivität von Isofluran und SD anzeigt. Der anhaltenden Depression, die durch SD induziert wird, steht die rasche Wiederherstellung der Aktivität nach alleiniger Einnahme von Isofluran (Schein) gegenüber. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzendes Video 1: Visualisierung von sich ausbreitenden Wellen. Die Videodatei wird auf ca. das 8-fache beschleunigt, um die visuelle Identifizierung der sich ausbreitenden Welle zu erleichtern. Das Graustufenbild wurde in die Fire-Lookup-Tabelle konvertiert und als .AVI Datei in ImageJ gespeichert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 1: Liste der Abkürzungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Sich ausbreitende Depolarisationen sind bei verschiedenen Krankheitsmodellen von entscheidender Bedeutung, darunter Schädel-Hirn-Trauma (TBI), Schlaganfall und Migräne¹. Die genaue Detektion von SDs ist essentiell für das Verständnis ihrer Rolle bei akuten Verhaltensdefiziten und/oder der Aktivierung des Neuroimmunsystems nach leichten traumatischen Hirnverletzungen (mTBIs)^23,24. Um das Risiko zu verringern, dass SDs bei Verwendung einer einzigen Methode fehlen, ist ein Multi-Methoden-Ansatz für eine effektive Visualisierung und Aufzeichnung von SDs erforderlich.

Während die Kombination von Techniken die Bestätigung von sich ausbreitenden Depolarisationen (SDs) ermöglicht, kann jede Technik potenzielle Fallstricke haben. Die in diesem Protokoll beschriebenen bildgebenden Verfahren sind für die meisten Laboratorien zugänglich und werden von Zepeda und Kollegen^{detailliert beschrieben 25}. Die Präparation des Schädelfensters ist entscheidend, da undurchsichtige Fenster zu nicht aussagekräftigen Bildern führen können²⁶. Dieses Problem kann gemildert werden, indem die Exposition des Schädels gegenüber der Luft vor dem Auftragen von Cyanacrylatkleber minimiert wird. Zusätzlich kann die Transparenz des Fensters mit einem Tropfen Mineralöl vor der Bildgebung verbessert werden. Bewegungsartefakte können auch die SD-Bestätigung erschweren, daher ist die Minimierung dieser Artefakte unerlässlich, um ein klares Video zu erhalten. Um dies zu beheben, ist es wichtig, das Tier während des gesamten Bildgebungsprozesses unter Isofluran zu halten²⁷. Die Verwendung eines Nasenkonus erleichtert den effizienten Transfer des Tieres zwischen dem Schlagkörper und der Aufnahmeeinrichtung. Es ist wichtig, das Tier nach dem Aufprall schnell wieder unter den Nasenkegel zu legen, um so viel wie möglich von der SD-Ausbreitung zu erfassen. Bei diesem Modell mit leichtem Schädel-Hirn-Trauma (mTBI) reicht eine Aufzeichnung von ca. 4 Minuten in der Regel aus, um die gesamte SD zu erfassen. Bei schwereren SHT können jedoch spontane SDs durch Gewebeschäden erzeugt werden²⁸. Eine kontinuierliche Bildgebung kann diese spontanen SDs erkennen, aber eine verlängerte Isofluran-Anästhesie kann es schwierig machen, hochfrequente Depressionen zu beobachten. Spontane SDs können elektrophysiologisch durch zusätzliche Depressionen in der hochfrequenten Aktivität nachgewiesen werden, aber die Bestätigung des Zusammenhangs zwischen Depression und SD ist ohne Bildgebung schwierig.

Mit der Entwicklung von Open-Ephys- und Intan-Verstärkern ist die In-vivo-Elektrophysiologie nun für viele Labore zugänglich. Alle elektrophysiologischen Ableitungen erfordern die Implantation von Schädelschrauben und/oder Elektroden. In diesem Protokoll gibt es eine zweitägige Latenzzeit zwischen der Implantation der Schädelschrauben und der Aufzeichnung, um die Genesung zu unterstützen. Obwohl dieser Zeitraum möglicherweise nicht ausreicht, um sich vollständig von der Implantation zu erholen, sollte es nur minimale Schäden geben, da die Schädelschrauben das Hirngewebe nicht durchdringen. Darüber hinaus nimmt die Transparenz des mit Cyanacrylat versiegelten Schädels mit der Zeit ab, so dass die Bildgebung so schnell wie möglich durchgeführt werden sollte, um eine optimale Transparenz zu erreichen. Für die Elektrophysiologie ist es entscheidend, das 60-Hz-Rauschen zu minimieren. Stellen Sie sicher, dass der Experimentierbereich von der Wechselstromversorgung isoliert und ordnungsgemäß mit dem Intan-Verstärker geerdet ist. Obwohl Bewegungsartefakte nicht vollständig eliminiert werden können, können Beschleunigungssensoren auf dem Kopftisch helfen, Bewegungsperioden während der Nachbearbeitung zu identifizieren und zu entfernen. Insgesamt können diese Techniken wertvolle Einblicke in die SD-Erholung und die Funktion des kortikalen Netzwerks nach leichten traumatischen Hirnverletzungen (mTBIs) liefern.

Eine Einschränkung dieser Techniken besteht darin, dass die Tiere während der Bildgebung unter Narkose stehen. Die meisten SHT-Modelle erfordern jedoch eine Anästhesie, und es ist unwahrscheinlich, dass die verlängerte Anästhesie das Versuchsdesign signifikant beeinflusst. Isofluran reduziert die hochfrequente Aktivität signifikant²⁷. Wenn die Isofluran-Exposition über den Bildgebungszeitraum hinausgeht, kann dies den Nachweis einer hochfrequenten Aktivitätswiederherstellung nach der SD erschweren. Daher ist es wichtig, eine Schein- oder Isofluran-allein-Gruppe in das Versuchsdesign einzubeziehen, um die Wiederfindung der hochfrequenten Aktivität zu vergleichen, wie in Abbildung 2 gezeigt. Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass elektrophysiologische Aufzeichnungen die Gleichstromverschiebung nicht erkennen. Die Amplitude und Dauer der DC-Verschiebung sind Indikatoren für die Gesundheit des Gewebes und die Erholung von der SD²⁸. Nichtsdestotrotz wird die Bestätigung von SDs mit diesen Techniken immer noch wertvolle Einblicke in die SHT-Forschung liefern.

Alle SHT-Forscher würden von den hier beschriebenen Techniken profitieren, da es sehr wahrscheinlich ist, dass alle TBI-Modelle Spreizungsdepolarisationen (SDs) erzeugen. Das TBI-Feld würde erheblich davon profitieren, die Rolle von SDs bei Verletzungen, dem Fortschreiten von Verletzungen, der neuroimmunen Aktivierung und der Genesung zu verstehen. Neuere Forschungen deuten darauf hin, dass SDs zu Verhaltensdefiziten beitragen und ein zugrundeliegender Mechanismus für neurologische Beeinträchtigungen sein könnten ^5,7. Die in diesem Protokoll beschriebenen Techniken werden dazu beitragen, den Zusammenhang zwischen SHT und SD aufzuklären. Zukünftige Anwendungen dieser Techniken könnten sich auf andere Forschungsbereiche erstrecken, einschließlich Schlaganfall, Epilepsie und Migräne.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
#00-90 x .118 Maschinenschraube	US Micro Screw	00.90-118-M-SS-P, Amazon
Bohrer mit 0,8 mm Durchmesser	PCB-Bohrer	WYTP21, Amazon
16-A Headstage	Intan	C3335
2,1 mm Fräser Mikrobohrer	Fine Science Tools	19007-21
AC-Verstärker	Intan	RHD Aufnahmesystem
C57BL/6J Mäuse	Jackson Laboratorium	Jax#000664
CCD-Kamera	Mightex	TCE-1304-U
Verlängerungsobjektiv	Zeikos	ZE-ETN
Ethiqa XR (Slow Release Buprenorphin)	Midwest Veterinary Supply	Produktnummer 267.10000.3
Gold-Anschlussstift (weiblich)	A-M Systems	520100
Gold-Steckerstift (männlich)	A-M Systems	520200
ImageJ2/Fiji	Image J	NA
Impactor One	Leica	39463930
LED-Panel-Platine	Supon	L122t
MATLAB	MathWorks	Institutioneller oder individueller Aktivierungscode
Cyanacrylatkleber in medizinischer Qualität	MasterBond	MB287
Micro-Manager Kamera Software	Image J	NA
Nagelbohrer/-polierer	Makartt Nagelbohrer Elektrische Nagelfeile	JD700
Omnetic Steckverbinder	Omnetics	A79014-001
RHX Datenerfassungssoftware	Intan	NA
Edelstahl unbeschichteter Draht (0,005")	A-M Systems	792800
Stereotaxic Frame Kopf	Intruments	1923-B
Teets 'kalthärtende' Zahnzement	A-M Systeme	525000, 526000
XLR Kameraobjektiv	Nikon	NIKKOR 50 mm f/1.8-16