Dieses Protokoll demonstriert die Kombination von Bildgebung und Elektrophysiologie, um sich ausbreitende Depolarisationen bei erwachsenen Mäusen nach einem leichten Schädel-Hirn-Trauma zuverlässig zu erkennen.
Methodenartikel
Kombination von Bildgebung und Elektrophysiologie zur Visualisierung und Aufzeichnung von sich ausbreitenden Depolarisationen bei Mäusen
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Spreading Depolarisations (SDs) sind massive Ereignisse im Gehirn, die aufgrund ihrer langsamen Ausbreitung durch die graue Substanz oft unentdeckt bleiben. Da die SD-Erkennung schwer fassbar sein kann, wird sie mit mehreren Methoden optimal bestätigt. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Kombination von Bildgebung und Elektrophysiologie, um SDs auf eine Weise zu detektieren, die die meisten Laboratorien zuverlässig und einfach anwenden können. SDs treten nach traumatischen Hirnverletzungen, Schlaganfall, Subarachnoidalblutungen, Ischämie und Migräneaura auf. In der Vergangenheit wurden SDs mit Gleichstromverstärkern aufgezeichnet, die die langsame extrazelluläre Verschiebung und die Depression der hochfrequenten Aktivität auflösen können. Gleichstromverstärker sind jedoch für chronische In-vivo-Aufnahmen kaum zu verwenden. Dieses Protokoll verwendet einen gemeinsamen AC-Verstärker für In-vivo-Elektrophysiologie-Aufzeichnungen zur Bestätigung hochfrequenter Depressionen sowie eine nicht-invasive Bildgebung, die zum Nachweis der sich ausbreitenden Welle von SD erforderlich ist. Diese Methoden können zuverlässig für die meisten experimentellen Ansätze übernommen und/oder modifiziert werden, um das Vorhandensein oder Fehlen von SDs nach einer Hirnverletzung zu bestätigen.
Einleitung
Spreading Depolarisations (SDs) sind mit verschiedenen neurologischen Erkrankungen verbunden, darunter Schädel-Hirn-Trauma (TBI), Schlaganfall, Subarachnoidalblutungen, Ischämie und Migräneaura1. SDs wurden mit dem Fortschreiten der Gewebeschädigung bei Schlaganfällen und SHT in Verbindung gebracht2. Der genaue Mechanismus, der dem Fortschreiten des Gewebeverlusts zugrunde liegt, bleibt unklar3,4. SDs treten jedoch auf, wenn der metabolische Bedarf der Neuronen nicht mit ausreichend Sauerstoff und Glukose gedeckt wird, da die Funktion der ATP-abhängigen Natrium-Kalium-Pumpe nicht mehr ausreicht, um Ionengradienten aufrechtzuerhalten. Um die Rolle von SDs beim Gewebeverlust zu verstehen, sind präzise Techniken erforderlich, um sie zu messen und zu untersuchen, was für den Fortschritt der wissenschaftlichen Erkenntnisse von entscheidender Bedeutung ist. SDs sind signifikante neurologische Ereignisse, die aufgrund des experimentellen Designs und/oder der Einschränkungen der Instrumentierung oft unentdeckt bleiben können.
Die Rolle von sich ausbreitenden Depolarisationen (SDs) beim Fortschreiten von Verletzungen wird derzeit geklärt, aber ihre Rolle bei leichten traumatischen Hirnverletzungen (mTBIs) bleibt unklar. Neuere Studien mit den in diesem Manuskript beschriebenen Techniken haben gezeigt, dass SDs in geschlossenen Schädel-mTBI-Mausmodellen initiiert werden, auch wenn es keine offensichtlichen Gewebeschäden oder Blutungen gibt5, 6. Diese Studien deuten darauf hin, dass SDs zu akuten neurologischen Beeinträchtigungen und Neuroinflammation beitragen können. Darüber hinaus wurde das Vorhandensein von mTBI-induzierten SDs eng mit akuten Verhaltensdefiziten in Verbindung gebracht6,7. Daher ist es wahrscheinlich, dass SDs in allen SHT-Modellen initiiert werden, aber ihre Rolle bleibt ohne Bestätigung schwer zu bestimmen. Die Bestätigung des Vorhandenseins von SDs ist entscheidend für die genaue Beurteilung der Ergebnisse von mSHT.
Sich ausbreitende Depolarisationen (SDs) werden durch einen signifikanten Abfall des extrazellulären Potentials gekennzeichnet, der als "DC-Verschiebung" bekannt ist, und durch eine Verschlechterung der hochfrequenten Aktivität8. Die Auflösung der "DC-Verschiebung" dauert in der Regel Sekunden (~10 s)9. Um die "DC-Verschiebung" zu erfassen, werden ein DC-Verstärker und Silberdrahtelektroden benötigt. In vivo wird die Elektrophysiologie jedoch in der Regel mit AC-Verstärkern durchgeführt, die darauf ausgelegt sind, niederfrequente Ereignisse herauszufiltern und Bewegungsartefakte zu reduzieren. Leider beseitigt diese Tieftonfilterung auch die "DC-Verschiebung". Außerdem ist Silber giftig und für chronische Aufnahmen ungeeignet. Häufig verwendete AC-Verstärker können die Depression der hochfrequenten Aktivität erkennen, jedoch ohne die damit einhergehende "DC-Verschiebung", die das Vorhandensein einer SD-Karte bestätigt, ist eine Herausforderung.
Spreading Depolarisations (SDs) können auch mit verschiedenen bildgebenden Verfahren nachgewiesen werden. Am häufigsten werden SDs mit Laser-Speckle-Kontrastbildgebung abgebildet, die den zerebralen Blutfluss durch den intakten Schädel misst10. SDs beeinflussen die zerebralen Gefäße und den Blutfluss erheblich. Bei den meisten Spezies außer Mäusen induzieren SDs eine sich ausbreitende Welle der Hyperperfusion, die sich mit der Vorderkante der SD11 ausbreitet. SDs können auch mit Calcium- oder Glutamat-Fluoreszenzindikatoren abgebildet werden12, obwohl dies die Beladung des Gewebes mit Farbstoffen oder genetisch kodierten Fluoreszenzindikatoren erfordert12,13. Interessanterweise können SDs aufgrund von intrinsischen optischen Signalen (iOS), die mit dem SD14 verbunden sind, mit bloßem Auge beobachtet werden. iOS sind komplexe Signale, die aus autofluoreszierenden Molekülen wie NAD(P)H und FADH15,16, Gewebeschwellungen17 und möglichen Veränderungen des zerebralen Blutflusses bestehen. Trotz ihrer Komplexität sind iOS-Signale zuverlässig und können in Wildtyp-Mäusen erfasst werden18. Dieses Protokoll beschreibt die Methode zur Bildgebung von iOS, da diese Technik in jedem Labor implementiert werden kann, ohne dass spezialisierte Viren oder transgene Tiere erforderlich sind.
Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, das Vorhandensein oder Fehlen einer sich ausbreitenden Depolarisation (SD) nach einem leichten Schädel-Hirn-Trauma (mTBI) experimentell mit gleichzeitiger Bildgebung und Elektrophysiologie zu bestätigen. Die In-vivo-Elektrophysiologie, die durch fortschrittliche Verstärker ermöglicht wird, ist eine häufig verwendete Technik. Diese Verstärker sind jedoch nicht in der Lage, die charakteristische "DC-Verschiebung" zu detektieren. Daher werden bildgebende Verfahren, wie sie in diesem Protokoll beschrieben werden, eingesetzt, um das Vorhandensein oder Fehlen von SDs sicher zu bestätigen. Der Vorteil der Kombination von Bildgebung und Elektrophysiologie besteht darin, dass die Bildgebung die Ausbreitung der SD erkennen kann, während die Elektrophysiologie die damit verbundene hochfrequente Depression identifizieren kann.
Insgesamt eignet sich diese Methode zur Untersuchung des Vorhandenseins von sich ausbreitenden Depolarisationen (SDs) nach einem Schädel-Hirn-Trauma (SHT). Seine Anwendung könnte das Verständnis der kortikalen Netzwerkfunktion nach SHT und SD verbessern. Dieses Protokoll kann von einem geschlossenen Schädelaufprallmodell auf andere Modelle übertragen werden, wie z. B. kontrollierte kortikale Auswirkungen, flüssige Perkussion oder Gewichtsabfall. Die Implementierung dieses Protokolls in mehreren Labors könnte die Rolle von SDs bei unterschiedlichen SHT-Schweregraden aufklären. Jedes etablierte TBI-Modell kann verwendet werden, gefolgt von den in diesem Protokoll beschriebenen iOS-Bildgebungs- und Elektrophysiologieverfahren.
Protokoll
Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem Animal Care and Use Committee (IACUC) des Instituts an der Universität von New Mexico durchgeführt. C57BL/6J-Mäuse wurden aus einer kommerziellen Quelle gewonnen. Es wurde die gleiche Anzahl von männlichen und weiblichen Mäusen im Alter von 8-14 Wochen verwendet. Alle Mäuse wogen ca. 20 g. Einzelheiten zu den Tieren, Reagenzien und Geräten, die in dieser Studie verwendet wurden, sind in der Materialtabelle aufgeführt. Die Zusatzdatei 1 enthält die Liste der Abkürzungen.
1. Vorbereitung des Schädels für Bildgebung und Elektrophysiologie
- Betäuben Sie das Tier in einer Isofluran-Induktionsbox mit 2%-3% Isofluran in 100% Sauerstoff, um die richtige Anästhesietiefe zu gewährleisten, ohne dass Sie durch ein Pfotenkneifen zusammenzucken müssen.
- Verabreichen Sie präoperative Analgetika (Buprenorphin mit langsamer Freisetzung, 3,25 mg/kg, SQ), bevor Sie das Tier in einen stereotaktischen Rahmen setzen und die Narkose (2% Isofluran) aufrechterhalten.
- Fügen Sie eine Augensalbe hinzu und halten Sie die Körpertemperatur des Tieres mit einem Heizkissen aufrecht, das eine Rückmeldung der Körpertemperatur hat.
- Rasieren Sie die Haare oberhalb des Schädels, wo der Schnitt sein wird, entlang der Mittellinie von der Augenfissur bis zum Lambda.
- Entfernen Sie die abgeschnittenen Haare, bevor Sie die Haut mit einem antiseptischen und desinfizierenden Peeling und einer Lösung sterilisieren. Mit 70 % Ethanol abschließen und dreimal wiederholen, um eine sterile Operationsstelle zu gewährleisten.
- Machen Sie mit einer Skalpellklinge #10 einen Schnitt in der Mittellinie von rostral nach kaudal, unmittelbar gefolgt von dem Auftragen von medizinischem Cyanacrylatkleber auf den Schnitt. Spreize die Haut seitlich, um den Schädel freizulegen.
- Geben Sie noch ein oder zwei Tropfen Cyanacrylatkleber auf den Schädel, um den Schädel zusätzlich zu schützen.
HINWEIS: Das Auftragen von Klebstoff ist zeitkritisch, da der Schädel undurchsichtig wird, wenn er länger als 10 s der Luft ausgesetzt wird. Dadurch wird die Visualisierung der SD durch bildgebende Verfahren verschleiert. - Während der Kleber trocknet, verwenden Sie eine sterile chirurgische Schere, um die Schnittgröße über dem Kleinhirn zu erhöhen. Sobald der Kleber ausgehärtet ist, beginnen Sie mit der Implantation von Schädelschraubenelektroden.
- Sterilisieren Sie die Schädelschrauben vor der Implantation 20-30 s lang mit einem Bead-Sterilisator.
- Platzieren Sie die Schädelschrauben in einer Region, die weit von der SD-Initiationsstelle entfernt ist, um ein offenes Sichtfenster zu erhalten.
HINWEIS: Für chronische Aufzeichnungen im primären visuellen Kortex werden drei Schädelschrauben verwendet. Die erste Schraube wird etwa in y = -6,00 mm vom Bregma entfernt im Kleinhirn platziert und dient als Referenzelektrode. Die Aufzeichnungselektroden sind in einem Abstand von y = -2,79 mm vom Bregma und x = ±2,5 mm von der Mittellinie entfernt, innerhalb der linken und rechten Hemisphäre positioniert. - Bohren Sie mit einem Bohrer der Größe 0,8 mm Pilotlöcher durch den Schädel. Um sicherzustellen, dass das darunterliegende Gewebe nicht beschädigt wird, sind -0,5 mm in z ideal. Verwenden Sie #00-90 Schrauben, die mit Edelstahldraht auf Goldstifte vorgelötet sind.
- Drehen Sie die Schrauben nach unten in den Schädel.1,5-2 volle Umdrehungen bringen die Schraube durch den Schädel und in Kontakt mit der kortikalen Oberfläche.
- Wickeln Sie überschüssigen Draht um die Schraube und lassen Sie den Draht etwas locker, um ihn später auf der Bühne platzieren zu können.
- Setze auf die gleiche Weise die anderen Schädelschrauben ein.
- Sobald alle Schädelschrauben an Ort und Stelle sind, stecken Sie alle goldenen Stifte in den gewünschten Headstage-Anschluss. Halten Sie den Stecker mit dem stereotaktischen Arm an Ort und Stelle und halten Sie die Steckerstifte dicht über die Schraubenköpfe, während Sie darauf achten, dass sich die Drähte nicht berühren.
- Versiegeln Sie den gesamten Bereich mit Cyanacrylatkleber und achten Sie darauf, den Bildgebungsbereich vor den Schädelschrauben nicht zu stören.
- Bauen Sie Zahnzement um die Basis der Goldstifte auf und stellen Sie sicher, dass die Goldstifte von den Schädelschrauben nicht mit den Goldstiften im Kopfstadium verbunden werden.
- Lassen Sie den Zahnzement aushärten, bevor Sie den Kopftischverbinder entfernen.
- Nehmen Sie das Tier aus dem stereotaktischen Rahmen und setzen Sie es zurück in den Heimkäfig, um sich zu erholen. Befolgen Sie die postoperative Standardversorgung und halten Sie die Tiere auf einem Heizkissen, während sie sich von der Narkose erholen.
HINWEIS: Nach der Operation wurden die Tiere in Einzelunterkünften untergebracht und täglich auf Schmerzen überwacht. Befolgen Sie die lokalen institutionellen Richtlinien für die Analgesie. Wenn Sie ein Buprenorphin mit langsamer Freisetzung verwenden, überwachen Sie die Schmerzen und geben Sie möglicherweise eine zusätzliche Dosis nach 72 Stunden.
- Entfernen Sie alle Gegenstände, die sich an den Elektroden verfangen könnten, einschließlich Gehäuse und Anreicherung. Verwenden Sie Standardbettwäsche mit Ad-libium-Zugang zu Futter und Wasser.
HINWEIS: Rechnen Sie mit einer zweitägigen Erholungsphase zwischen Operation und Aufnahme.
2. Detektion von sich ausbreitenden Depolarisationen mit intrinsischer optischer Signalbildgebung (iOS) und AC-Elektrophysiologie
- Betäuben Sie die Tiere mit 2% Isofluran in 100% Sauerstoff.
HINWEIS: Der bildgebende Teil dieses Verfahrens sollte ~5 Minuten dauern, und die Menge der Isofluran-Exposition sollte konsistent sein. - Setzen Sie das Tier in einen stereotaktischen Rahmen. Halten Sie durch den Nasenkonus 1%-2% Isofluran in Sauerstoff.
HINWEIS: Es ist wichtig, die richtige Anästhesietiefe beizubehalten, da Isofluran dafür bekannt ist, SDs zu reduzieren. Während des gesamten Experiments wird empfohlen, 60-70 Atemzüge/min aufrechtzuerhalten. - Platzieren Sie das Tier unter der Kamera und stellen Sie sicher, dass die Kamera auf die kortikale Oberfläche fokussiert ist, indem Sie den Fokusring einstellen.
- Tragen Sie Mineralöl auf den Bildgebungsbereich auf, um die Transparenz zu erhöhen.
- Schalten Sie die Computer, die LED-Tafel und die elektrophysiologischen Geräte ein.
HINWEIS: Die LED-Tafel funktioniert am besten, wenn sie vor dem Tier positioniert wird, um das Bildgebungsfenster zu beleuchten, wenn die Deckenbeleuchtung ausgeschaltet ist. Das Licht wurde auf ~2.400 Lux (95 % Leistung) mit einer kühlen Temperatureinstellung von 4000 K eingestellt. - Ladeeinstellung für iOS mit Micro-Manager19,20,21,22.
- Drücken Sie Live, um die Maus unter der Kamera anzuzeigen und den Schädel des Tieres unter der Kamera zu zentrieren. Schließen Sie das "Live"-Fenster.
- Drücken Sie Multi-D Acq.
- Wählen Sie im Fenster "Mehrdimensionale Erfassung" die gewünschten Zeitpunkte aus.
HINWEIS: Es wird empfohlen, 750 Bilder in einem Intervall von 250 ms zu zählen. - Speichern Sie Bilder im gewünschten Dateipfad und Namenspräfix.
- Verbinden Sie die goldenen Stifte vom Tier mit dem Kopfbühnenstecker und dann mit dem Kopftisch.
- Ladeeinstellung für die Intan-Software.
- Klicken Sie auf das Symbol Dateiformat auswählen und wählen Sie im Popup-Fenster das Format Eine Datei pro Signaltyp aus. Dadurch wird die Datei als ".dat" für die weitere Verwendung in MATLAB gespeichert.
- Wählen Sie auf der Registerkarte BW unter Hardwarebandbreite die Verstärkerbandbreite von 0,13 bis 500 Hz aus.
- Wählen Sie unter Filter Display Selector die Option WIDE aus, um den größtmöglichen Signalbereich abzudecken.
- Um den gewünschten Dateipfad zum Speichern auszuwählen, klicken Sie auf das Symbol Dateiname auswählen.
- Führen Sie den Aufprall mit einem elektromagnetischen Impaktor aus.
HINWEIS: Die Schlagkörpereinstellungen betragen 4 m/s Aufprallgeschwindigkeit und 5 mm Durchbiegung.- Schalten Sie den Schlagkörper ein und stellen Sie sicher, dass die Spitze richtig ein- und ausfährt, indem Sie den 3-Wege-Schalter betätigen, um die Spitze zurückzuziehen und die Spitze zu verlängern. Die Spitze sollte ausgestreckt werden, bevor Sie das Tier unter die Spitze setzen.
- Legen Sie das Tier schnell auf ein Schaumstoffbett und schieben Sie das Bett unter die Spitze.
- Richten Sie die Schlagkörperspitze an der Mittellinie und 1 mm rostral des Bregmas aus.
- Senken Sie die Schlagkörperspitze ab, bis sie die Oberseite des Kopfes des Tieres fest berührt.
HINWEIS: Schieben Sie die Spitze nicht nach unten in den Kopf. - Drücken Sie den Hebel, um die Schlagdüse zurückzuziehen, und senken Sie sie dann manuell um 5 mm ab, bevor Sie den Schlaghebel betätigen.
- Nehmen Sie das Tier sofort aus dem Schaumstoffbett und legen Sie das Tier innerhalb von 5 s zur Bildgebung unter die Kamera, da die SD nach dem Aufprall ausgelöst wird.
- Starten Sie die iOS-Bildgebung, indem Sie im Fenster Multidimensionale Erfassung auf Erwerben! klicken. Bild für 4 Minuten, um die gesamte SD-Karte zu erfassen.
- Starten Sie die elektrophysiologische Aufnahme, indem Sie auf das Aufnahmesymbol in der Intan-Software klicken.
- Nehmen Sie das Tier aus der Schaumstoffunterlage und lassen Sie es sich in einer offenen Arena oder einem Heimkäfig erholen.
HINWEIS: Es wird empfohlen, die Elektrophysiologie mindestens 1 Stunde lang aufzuzeichnen, damit sich die Funktion des kortikalen Netzwerks erholen kann. - Wenn die Aufnahme abgeschlossen ist, ziehen Sie den Netzstecker des Tieres aus der Kopfbühne und dem Stecker und setzen Sie das Tier wieder in seinen Käfig ein.
HINWEIS: Es wird empfohlen, zwischen jedem Aufprall und der Aufnahmesitzung 24 Stunden zu vergehen. Das Tier kann die gesamte Zeit außerhalb der Aufnahmesessions in seinem Käfig bleiben.
3. Visualisierung und Quantifizierung von iOS-Bildern
- Öffnen Sie in ImageJ19,20,21,22, den Bildstapel, indem Sie auf die Sequenz Datei > Importieren > Bild klicken.
- Scrollen Sie manuell durch die Bilder, um sicherzustellen, dass keine Bewegung oder andere Artefakte vorhanden sind.
- Um den Plot des SD zu generieren, erstellen Sie einen ROI, indem Sie mit dem Cursor ein Quadrat zeichnen.
HINWEIS: Es wird empfohlen, ein Quadrat mit 30 x 30 Pixeln zu verwenden. Man kann jede beliebige Form und Größe verwenden, aber stellen Sie sicher, dass sich die ROI-Größe nicht zwischen den Tieren ändert. - Erstellen Sie einen Plot, indem Sie auf Bild > Stapel > Z-Achsen-Profil plotten. Klicken Sie in der neu erstellten Grafik auf den Live-Button. Kehren Sie zum Bildstapel der SD zurück und verschieben Sie den ROI, bis das Diagramm die SD-Kurve zeigt. Das Diagramm sollte wie eine Sündenwelle aussehen, mit einem anfänglichen Anstieg, gefolgt von einem Rückgang unter die Grundlinie und einer langsamen Rückkehr zur Basislinie innerhalb weniger Minuten.
HINWEIS: Die Diagramme können als beliebige Einheiten (AU) oder als prozentuale Basislinie ausgedrückt werden, wobei die ersten Bilder als Basisliniendurchschnitt verwendet werden. - Klicken Sie im generierten Diagramm auf Liste, um eine Liste von Werten zu generieren, die in einer anderen Diagrammgenerierungssoftware oder Matlab dargestellt werden können.
- Verwandeln Sie zur Visualisierung das Graustufenbild in eine Nachschlagetabelle in ImageJ von Image > Lookup Tables > Fire.
4. Elektrophysiologische Analyse
HINWEIS: Es wird empfohlen, dass die Expertise des Buzsaki-Labors und ihr MATLAB-generierter Code stark für die Visualisierung und Analyse elektrophysiologischer Daten genutzt werden. Für die Analyse müssen Sie MATLAB mit einem institutionellen Aktivierungscode und die Zip-Datei "Buzcode" des Buzsaki-Labors über GitHub (https://github.com/buzsakilab/buzcode) herunterladen.
- Stellen Sie in der Intan-Elektrophysiologie-Software sicher, dass die exportierten Rohdaten im Format ".dat" gespeichert werden.
HINWEIS: Matlab kann von der MathWorks-Website installiert werden. Für den Kauf und die Nutzung von Matlab ist ein institutioneller oder individueller Aktivierungscode erforderlich. Für die Durchführung dieser Analyse sind einige Vorkenntnisse mit dem Ausführen von Code in Matlab erforderlich. - Verwenden Sie die Funktion Buzaki Code bz_LoadBinary, um die Daten in Matlab zu laden.
HINWEIS: Beispiel "'data' = bz_LoadBinary ('vollständiger Dateipfad','frequency', Abtastfrequenz, nKanäle, Anzahl der Kanäle); - Filtern Sie das AC-Rauschen mit einem Kerbfilter, der bei 60 Hz zentriert ist.
HINWEIS: Beispiel notch_freq = 60; [b,a] = iirnotch(notch_freq/(sampling_frequency/2), notch_bandwidth/(sampling_frequency/2)); filtered_data = filtfilt(b, a, Daten); - Isolierung der hochfrequenten Aktivität mit einem Bandpassfilter mit einem Bereich von 0,5-100 Hz, gemäß den Empfehlungen der COSBID-Gruppe zur Analyse und Visualisierung von sich ausbreitenden Depolarisationen (SDs).
- Berechnen Sie das Leistungsspektrogramm mit dem Befehl pspectrum in MatLab.
- Zur Visualisierung stellen Sie das Hochfrequenz- und das Leistungsspektrogramm auf derselben Zeitskala und in einer Spalte dar.
HINWEIS: Von den Diagrammen aus wird es eine Verlängerung der hochfrequenten Depression und des Leistungsverlusts geben.
Ergebnisse
Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung des experimentellen Aufbaus. Die Aufzeichnungsschrauben werden im primären visuellen Kortex positioniert, wobei eine Schraubenelektrode im Kleinhirnläppchen als Bezugselektrode platziert wird. Die Schädelschrauben und Goldstifte werden mit Cyanacrylat-Kleber und Zahnzement am Schädel befestigt. Es ist entscheidend, den Zahnzement auf den kaudalen Teil des Schädels zu beschränken, um Platz für den Aufprall und die Bildgebung freizuhalten. Die Aufprallstelle, die mittig zur Medianebene und etwa 1 mm rostral zur Bregma liegt, ist in Abbildung 1 angegeben.
Repräsentative Bilder der intrinsischen optischen Signale (iOS) sind in Abbildung 2A dargestellt. Graustufenbilder werden mithilfe einer Fire-Farbpalette umgewandelt, um die Visualisierung ausbreitender Depolarisationen (SDs) zu verbessern. Die iOS umfassen verschiedene Signale, einschließlich NAD(P)H, FADH und Gewebereflektion, was die Interpretation und den Vergleich dieser Signale erschwert. Große Gefäße sollten durch das Sekundenklebefenster klar sichtbar sein (mit Pfeilen gekennzeichnet), während die gestrichelte Linie in Abbildung 2A die sich ausbreitende Welle der SD markiert. Obwohl sich SDs in Echtzeit schwer beobachten lassen, werden sie deutlicher, wenn die Bilder beschleunigt wiedergegeben werden (siehe ergänzendes Video 1). Einige kleine Äste können aufgrund von Vasokonstriktion „verschwinden“ (Abbildung 2A). Ein kleiner interessierender Bereich (ROI), extrahiert aus dem Bildstapel, sollte eine Z-Achsen-Plotdarstellung ähnlich der in Abbildung 2B ergeben. Aus den elektrophysiologischen Ableitungen sollte das extrahierte hochfrequente Signal den oberen Feldern in Abbildung 2C,D ähneln. Diese Ableitungen wurden unmittelbar nach der leichten traumatischen Hirnverletzung (mTBI) begonnen, wobei die Tiere während der 4-minütigen iOS-Bildgebung unter Isofluran-Anästhesie blieben. Nach Beendigung des Isoflurans sollte die hochfrequente Aktivität bei Scheintieren innerhalb einer Minute schnell zurückkehren, wie in Abbildung 2C (roter Kasten) gezeigt. Umgekehrt würde bei Auftreten einer SD die hochfrequente Aktivität mehrere Minuten lang unterdrückt bleiben, bevor eine Erholung eintritt (Abbildung 2D, roter Kasten). Die unteren Felder in Abbildung 2C,D zeigen die berechnete Leistung (V²) für jeden hochfrequenten Plot. Diese Leistungsplots helfen dabei, die Unterdrückung und Wiederherstellung der hochfrequenten Aktivität anhand des schnellen Anstiegs der Leistung zu erkennen (angezeigt durch die rechte Kante der roten Kästen).
Abbildung 1: Experimenteller Aufbau und Position von Impakt und Schädelstiften. Die dorsale Schädeloberfläche wird durch einen Hautschnitt freigelegt. Schädel und Haut werden mit Cyanoacrylat-Kleber versiegelt, um die Durchsichtigkeit zu verbessern. Ein Bohrloch für die Erdung wird bei y = -6,00 und x = 0 bezüglich Bregma angelegt. Bohrlöcher für Ableitelektroden werden bei y = -2,79 und x = ±2,5 bezüglich Bregma positioniert. Edelstahlschrauben werden durch den Schädel eingeschraubt und mit Goldstiften verlötet, wobei unbeschichteter Edelstahldraht verwendet wird. Es wird darauf geachtet, dass die Schädeloberfläche nicht übermäßig mit Zahnzement bedeckt wird, um ausreichend Platz für Impakt und Bildgebung zu gewährleisten. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Ansicht dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative iOS-Bilder und AC-Aufzeichnungen. (A) Repräsentative iOS-Bilder mit Pfeilen, die Blutgefäße markieren. Graustufenbilder wurden in ImageJ zur verbesserten Visualisierung in die Farbtabelle „Fire“ umgewandelt. Die gestrichelte schwarze Linie kennzeichnet die fortpflanzende SD, die in den iOS-Bildern als Welle erhöhter Intensität sichtbar ist. Die SD ist deutlich erkennbar, wenn man schnell durch den gesamten Bildstapel scrollt. Das iOS-Signal spiegelt verschiedene physiologische und metabolische Veränderungen im Zusammenhang mit der SD wider, einschließlich der mitochondrialen Produktion von NAD(P)H und FADH sowie neuronalem Ödem. Der schwarze Rahmen hebt den interessierenden Bereich (ROI) hervor, der zur Erstellung der Kurve in (B) verwendet wurde. Maßstabsbalken: 1 mm. (B) Repräsentativer Verlauf des iOS-Signals der SD, dargestellt als Prozentsatz des Ausgangswerts. Das iOS-Signal steigt an und kehrt innerhalb von etwa 60 s wieder nahe zum Ausgangswert zurück. Obwohl die Änderungen des iOS-Signals gering sind (etwa 10 %), sind sie ausreichend, um die SD zu identifizieren. In den AC-Aufzeichnungen sowohl für Sham- (C) als auch SD-Tiere (D) zeigen die oberen Spuren die Hochfrequenzaktivität, während die unteren Spuren die Leistung (V²) darstellen. Blaue Rahmen markieren Phasen der Isofluran-Anästhesie, während der rote Rahmen die Erholungsphase der Hochfrequenzaktivität nach Isofluran und SD bezeichnet. Die durch die SD hervorgerufene anhaltende Depression steht im Kontrast zur schnellen Wiederherstellung der Aktivität nach alleiniger Isofluran-Behandlung (Sham). Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
Zusatzvideo 1: Visualisierung einer sich ausbreitenden Welle. Die Videodatei wurde auf etwa das 8-fache Tempo beschleunigt, um die visuelle Identifizierung der sich ausbreitenden Welle zu erleichtern. Das Graustufenbild wurde in die Farbtabelle „Fire“ umgewandelt und in ImageJ als .AVI-Datei gespeichert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Zusatzdatei 1: Liste der Abkürzungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Diskussion
Sich ausbreitende Depolarisationen sind bei verschiedenen Krankheitsmodellen von entscheidender Bedeutung, darunter Schädel-Hirn-Trauma (TBI), Schlaganfall und Migräne1. Die genaue Detektion von SDs ist essentiell für das Verständnis ihrer Rolle bei akuten Verhaltensdefiziten und/oder der Aktivierung des Neuroimmunsystems nach leichten traumatischen Hirnverletzungen (mTBIs)23,24. Um das Risiko zu verringern, dass SDs bei Verwendung einer einzigen Methode fehlen, ist ein Multi-Methoden-Ansatz für eine effektive Visualisierung und Aufzeichnung von SDs erforderlich.
Während die Kombination von Techniken die Bestätigung von sich ausbreitenden Depolarisationen (SDs) ermöglicht, kann jede Technik potenzielle Fallstricke haben. Die in diesem Protokoll beschriebenen bildgebenden Verfahren sind für die meisten Laboratorien zugänglich und werden von Zepeda und Kollegendetailliert beschrieben 25. Die Präparation des Schädelfensters ist entscheidend, da undurchsichtige Fenster zu nicht aussagekräftigen Bildern führen können26. Dieses Problem kann gemildert werden, indem die Exposition des Schädels gegenüber der Luft vor dem Auftragen von Cyanacrylatkleber minimiert wird. Zusätzlich kann die Transparenz des Fensters mit einem Tropfen Mineralöl vor der Bildgebung verbessert werden. Bewegungsartefakte können auch die SD-Bestätigung erschweren, daher ist die Minimierung dieser Artefakte unerlässlich, um ein klares Video zu erhalten. Um dies zu beheben, ist es wichtig, das Tier während des gesamten Bildgebungsprozesses unter Isofluran zu halten27. Die Verwendung eines Nasenkonus erleichtert den effizienten Transfer des Tieres zwischen dem Schlagkörper und der Aufnahmeeinrichtung. Es ist wichtig, das Tier nach dem Aufprall schnell wieder unter den Nasenkegel zu legen, um so viel wie möglich von der SD-Ausbreitung zu erfassen. Bei diesem Modell mit leichtem Schädel-Hirn-Trauma (mTBI) reicht eine Aufzeichnung von ca. 4 Minuten in der Regel aus, um die gesamte SD zu erfassen. Bei schwereren SHT können jedoch spontane SDs durch Gewebeschäden erzeugt werden28. Eine kontinuierliche Bildgebung kann diese spontanen SDs erkennen, aber eine verlängerte Isofluran-Anästhesie kann es schwierig machen, hochfrequente Depressionen zu beobachten. Spontane SDs können elektrophysiologisch durch zusätzliche Depressionen in der hochfrequenten Aktivität nachgewiesen werden, aber die Bestätigung des Zusammenhangs zwischen Depression und SD ist ohne Bildgebung schwierig.
Mit der Entwicklung von Open-Ephys- und Intan-Verstärkern ist die In-vivo-Elektrophysiologie nun für viele Labore zugänglich. Alle elektrophysiologischen Ableitungen erfordern die Implantation von Schädelschrauben und/oder Elektroden. In diesem Protokoll gibt es eine zweitägige Latenzzeit zwischen der Implantation der Schädelschrauben und der Aufzeichnung, um die Genesung zu unterstützen. Obwohl dieser Zeitraum möglicherweise nicht ausreicht, um sich vollständig von der Implantation zu erholen, sollte es nur minimale Schäden geben, da die Schädelschrauben das Hirngewebe nicht durchdringen. Darüber hinaus nimmt die Transparenz des mit Cyanacrylat versiegelten Schädels mit der Zeit ab, so dass die Bildgebung so schnell wie möglich durchgeführt werden sollte, um eine optimale Transparenz zu erreichen. Für die Elektrophysiologie ist es entscheidend, das 60-Hz-Rauschen zu minimieren. Stellen Sie sicher, dass der Experimentierbereich von der Wechselstromversorgung isoliert und ordnungsgemäß mit dem Intan-Verstärker geerdet ist. Obwohl Bewegungsartefakte nicht vollständig eliminiert werden können, können Beschleunigungssensoren auf dem Kopftisch helfen, Bewegungsperioden während der Nachbearbeitung zu identifizieren und zu entfernen. Insgesamt können diese Techniken wertvolle Einblicke in die SD-Erholung und die Funktion des kortikalen Netzwerks nach leichten traumatischen Hirnverletzungen (mTBIs) liefern.
Eine Einschränkung dieser Techniken besteht darin, dass die Tiere während der Bildgebung unter Narkose stehen. Die meisten SHT-Modelle erfordern jedoch eine Anästhesie, und es ist unwahrscheinlich, dass die verlängerte Anästhesie das Versuchsdesign signifikant beeinflusst. Isofluran reduziert die hochfrequente Aktivität signifikant27. Wenn die Isofluran-Exposition über den Bildgebungszeitraum hinausgeht, kann dies den Nachweis einer hochfrequenten Aktivitätswiederherstellung nach der SD erschweren. Daher ist es wichtig, eine Schein- oder Isofluran-allein-Gruppe in das Versuchsdesign einzubeziehen, um die Wiederfindung der hochfrequenten Aktivität zu vergleichen, wie in Abbildung 2 gezeigt. Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass elektrophysiologische Aufzeichnungen die Gleichstromverschiebung nicht erkennen. Die Amplitude und Dauer der DC-Verschiebung sind Indikatoren für die Gesundheit des Gewebes und die Erholung von der SD28. Nichtsdestotrotz wird die Bestätigung von SDs mit diesen Techniken immer noch wertvolle Einblicke in die SHT-Forschung liefern.
Alle SHT-Forscher würden von den hier beschriebenen Techniken profitieren, da es sehr wahrscheinlich ist, dass alle TBI-Modelle Spreizungsdepolarisationen (SDs) erzeugen. Das TBI-Feld würde erheblich davon profitieren, die Rolle von SDs bei Verletzungen, dem Fortschreiten von Verletzungen, der neuroimmunen Aktivierung und der Genesung zu verstehen. Neuere Forschungen deuten darauf hin, dass SDs zu Verhaltensdefiziten beitragen und ein zugrundeliegender Mechanismus für neurologische Beeinträchtigungen sein könnten 5,7. Die in diesem Protokoll beschriebenen Techniken werden dazu beitragen, den Zusammenhang zwischen SHT und SD aufzuklären. Zukünftige Anwendungen dieser Techniken könnten sich auf andere Forschungsbereiche erstrecken, einschließlich Schlaganfall, Epilepsie und Migräne.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch NIGMS P20GM109089 und PR200891 Zuschüsse des Verteidigungsministeriums unterstützt.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| #00-90 x .118 Maschinenschraube | US Micro Screw | 00.90-118-M-SS-P, Amazon | |
| Bohrer mit 0,8 mm Durchmesser | PCB-Bohrer | WYTP21, Amazon | |
| 16-A Headstage | Intan | C3335 | |
| 2,1 mm Fräser Mikrobohrer | Fine Science Tools | 19007-21 | |
| AC-Verstärker | Intan | RHD Aufnahmesystem | |
| C57BL/6J Mäuse | Jackson Laboratorium | Jax#000664 | |
| CCD-Kamera | Mightex | TCE-1304-U | |
| Verlängerungsobjektiv | Zeikos | ZE-ETN | |
| Ethiqa XR (Slow Release Buprenorphin) | Midwest Veterinary Supply | Produktnummer 267.10000.3 | |
| Gold-Anschlussstift (weiblich) | A-M Systems | 520100 | |
| Gold-Steckerstift (männlich) | A-M Systems | 520200 | |
| ImageJ2/Fiji | Image J | NA | |
| Impactor One | Leica | 39463930 | |
| LED-Panel-Platine | Supon | L122t | |
| MATLAB | MathWorks | Institutioneller oder individueller Aktivierungscode | |
| Cyanacrylatkleber in medizinischer Qualität | MasterBond | MB287 | |
| Micro-Manager Kamera Software | Image J | NA | |
| Nagelbohrer/-polierer | Makartt Nagelbohrer Elektrische Nagelfeile | JD700 | |
| Omnetic Steckverbinder | Omnetics | A79014-001 | |
| RHX Datenerfassungssoftware | Intan | NA | |
| Edelstahl unbeschichteter Draht (0,005") | A-M Systems | 792800 | |
| Stereotaxic Frame Kopf | Intruments | 1923-B | |
| Teets 'kalthärtende' Zahnzement | A-M Systeme | 525000, 526000 | |
| XLR Kameraobjektiv | Nikon | NIKKOR 50 mm f/1.8-16 |
Referenzen
- Pietrobon, D., Moskowitz, M. Chaos and commotion in the wake of cortical spreading depression and spreading depolarizations. Nat Rev Neurosci. 15 (6), 379-393 (2014).
- Hartings, J. A., et al. Repetitive cortical spreading depolarizations in a case of severe brain trauma. Neurological Res. 30 (8), 876-882 (2008).
- Andrew, R. D., et al. Questioning glutamate excitotoxicity in acute brain damage: The importance of spreading depolarization. Neurocrit Care. 37, 11-30 (2022).
- Andrew, R. D., et al. Thecritical role of spreading depolarizations in early brain injury: Consensus and contention. Neurocrit Care. 37, 83-101 (2022).
- Pacheco, J., et al. Spreading depolarizations are associated with concussion-like behavior. eNeuro. 6 (6), (2019).
- Bouley, J., Chung, D. Y., Ayata, C. Y., Brown, R. H., Henninger, N. Cortical spreading depression denotes concussion injury. J Neurotrauma. 35, 1-10 (2018).
- Pinkowski, N. J., et al. Spreading depolarizations contribute to the acute behavior deficits associated with a mild traumatic brain injury in mice. J Neurotrauma. 41 (1-2), 271-291 (2023).
- Dreier, J. P., et al. Recording, analysis, and interpretation of spreading depolarizations in neurointensive care: Review and recommendations of the COSBID research group. J Cereb Blood Flow and Metab. 37 (5), 1595-1625 (2017).
- Herreras, O., Somjen, G. G. Analysis of potential shifts associated with recurrent spreading depression and prolonged unstable spreading depression induced by microdialysis of elevated K+ in hippocampus of anesthetized rats. Brain Res. 610 (2), 283-294 (1993).
- Boas, D. A., Dunn, A. K. Laser speckle contrast imaging in biomedical optics. J Biomed Opt. 15 (1), 011109(2014).
- Hadjikhani, N., et al. Mechanisms of migraine aura revealed by functional MRI in human visual cortex. PNAS. 98 (8), 4687-4692 (2001).
- Dietz, R. M., Weis, J. H., Shuttleworth, C. W. Contributions of Ca2+ and Zn2+ to spreading depression-like events and neuronal injury. J Neurochem. 109 (Suppl 1), 145-152 (2009).
- Reinhart, K. M., Shuttleworth, C. W. Ketamine reduces deleterious consequences of spreading depolarizations. Exp Neurol. 305, 121-128 (2018).
- Mané, M., Müller, M. Temporo-spectral imaging of intrinsic optical signals during hypoxia-induced spreading depression-like depolarization. PLoS One. 7 (8), (2012).
- Brennan, A. M., Connor, J. A., Shuttleworth, C. W. NAD(P)H fluorescence transients after synaptic activity in brain slices: predominant role of mitochondrial function. J Cereb Blood Flow and Metab. 26 (11), 1389-1406 (2006).
- Shuttleworth, C. W., Brennan, A. M., Connor, J. A NAD(P)H fluorescence imaging of postsynaptic neuronal activation in murine hippocampal slices. J Neurosci. 23 (8), 3196-3208 (2003).
- Sword, J., Croom, D., Wang, P. L., Thompson, R. J., Kirov, S. A. Neuronal pannexin-1 channels are not molecular routes of water influx during spreading depolarization-induced dendritic beading. J Cereb Blood Flow and Metab. 37 (5), 1626-1633 (2017).
- Chung, D. Y., et al. Real-time non-invasive in vivo visible light detection of cortical spreading depolarizations in mice. J Neurosci Methods. 309, 143-146 (2018).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinform. 18 (1), 1-26 (2017).
- Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using µManager. Curr Protoc Mol Biol. 14, (2010).
- Edelstein, A. D., et al. Advanced methods of microscope control using µManager software. J of Biol Methods. 1 (2), e10(2014).
- Soldozy, S., et al. Cortical spreading depression in the setting of traumatic brain injury. World Neurosurg. 134, 50-57 (2020).
- Zepeda, A., Arias, C., Sengpiel, F. Optical imaging of intrinsic signals: Recent developments in the methodology and its applications. J Neurosci Methods. 136 (1), 1-21 (2004).
- Steinzeig, A., Molotkov, D., Castrén, E. Chronic imaging through "transparent skull" in mice. PLoS One. 12 (8), (2017).
- Sword, J., Masuda, T., Croom, D., Kirov, S. A. Evolution of neuronal and astroglial disruption in the peri-contusional cortex of mice revealed by in vivo two-photon imaging. Brain. 136 (5), 1446-1461 (2013).
- Hudetz, A. G., Vizuete, J. A., Pillay, S. Differential effects of isoflurane on high-frequency and low-frequency oscillations in the cerebral cortex and hippocampus in freely moving rats. Anesthesiology. 114 (3), 1588-1595 (2011).
- Reinhart, K. M., Morton, R. A., Brennan, K. C., Carlson, A. P., Shuttleworth, C. W. Ketamine improves neuronal recovery following spreading depolarization in peri-infarct tissues. J Neurochem. 168 (5), 855-867 (2023).
Nachdrucke und Genehmigungen
