Methodenartikel

Photobiomodulation unter elektroenzephalographischen Kontrollen des Schlafes zur Stimulation der lymphatischen Entfernung von Toxinen aus dem Gehirn der Maus

DOI:

10.3791/67035

⸱

28. Juni 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Saratov State University, 2Institute of Physics, Department of Optics and Biophotonics, Saratov State University, 3Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms, Saratov Scientific Centre of the Russian Academy of Sciences

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie stellt die nicht-invasive und tragbare Technologie der transkraniellen Photobiomodulation unter elektroenzephalographischer Kontrolle zur Stimulation der lymphatischen Entfernung von Toxinen (z.B. lösliches Amyloid beta) aus dem Gehirn von gealterten und nicht anästhesierten BALB/c-Männchen während des natürlichen Tiefschlafs vor.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die meningealen Lymphgefäße (MLVs) spielen eine wichtige Rolle bei der Entfernung von Giftstoffen aus dem Gehirn. Die Entwicklung innovativer Technologien zur Stimulation der MLV-Funktionen ist eine vielversprechende Richtung in der Behandlung verschiedener Hirnerkrankungen, die mit MLV-Anomalien verbunden sind, einschließlich Alzheimer- und Parkinson-Krankheiten, Hirntumoren, traumatischen Hirnverletzungen und intrakraniellen Blutungen. Schlaf ist ein natürlicher Zustand, in dem die Drainageprozesse des Gehirns am aktivsten sind. Daher kann die Stimulation der Gehirndrainage und der MLVs während des Schlafs die ausgeprägtesten therapeutischen Effekte haben. Solche kommerziellen Technologien gibt es derzeit jedoch nicht.

In dieser Studie wird eine neue tragbare Technologie der transkraniellen Photobiomodulation (tPBM) unter elektroenzephalographischer (EEG) Kontrolle des Schlafes vorgestellt, die entwickelt wurde, um die Ausscheidung von Toxinen (z. B. lösliches Amyloid beta (Aβ)) aus dem Gehirn gealterter BALB/c-Mäuse zu stimulieren und die therapeutische Wirksamkeit verschiedener optischer Ressourcen zu vergleichen. Die Technologie kann unter dem natürlichen Zustand eines Heimkäfigs ohne Anästhesie verwendet werden, um die motorische Aktivität von Mäusen zu erhalten. Diese Daten eröffnen neue Perspektiven für die Entwicklung nicht-invasiver und klinisch vielversprechender Phototechnologien zur Korrektur altersbedingter Veränderungen der MLV-Funktionen und der Drainageprozesse des Gehirns sowie zur effektiven Reinigung des Hirngewebes von Metaboliten und Toxinen. Diese Technologie ist sowohl für präklinische Studien zu den Funktionen des schlafenden Gehirns als auch für die Entwicklung klinisch relevanter Therapien für schlafbezogene Hirnerkrankungen gedacht.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Meningeale Lymphgefäße (MLVs) spielen eine wichtige Rolle bei der Entfernung von Toxinen und Metaboliten aus dem Hirngewebe 1,2,3. Die Schädigung von MLVs bei verschiedenen Hirnerkrankungen, einschließlich Tumoren, traumatischen Hirnverletzungen, Blutungen und neurodegenerativen Prozessen, geht mit einer Abnahme der MLV-Funktionen einher, die zum Fortschreiten dieser Pathologien führt 1,2,3,4,5,6 . Daher eröffnet die Entwicklung von Methoden zur Stimulation von MLVs neue Horizonte bei der Entstehung wirksamer Technologien zur Behandlung von Hirnerkrankungen. Kürzlich wurde eine nicht-invasive Technologie für eine effektive transkranielle Photobiomodulation (tPBM) vorgeschlagen, um MLVs zu stimulieren und Giftstoffe wie Blut und Aβ aus dem Gehirn zu entfernen 5,7,8,9,10,11,12. Interessant ist, dass der Tiefschlaf ein natürlicher Faktor für die Aktivierung von Lymphdrainageprozessen im Gehirn ist13,14. Basierend auf dieser Tatsache ist es logisch anzunehmen, dass die tPBM von MLVs während des Schlafs wirksamere therapeutische Effekte haben kann als während des Wachzustands 9,11,12,15. Derzeit gibt es jedoch keine kommerziellen Technologien für tPBM während des Schlafs16. Darüber hinaus werden Tierversuche zur Untersuchung der therapeutischen Wirkung von tPBM unter Narkose durchgeführt, die erforderlich ist, um das Gehirn genau mit Licht zu versorgen. Die Narkose beeinflusst jedoch die Drainage des Gehirns erheblich, was die Qualität der Forschungsergebnisse mindert17.

Aβ ist ein Stoffwechselprodukt normaler neuronaler Aktivität18. Wie es in kultivierten kortikalen Neuronen von Ratten festgestellt wurde, wird Aβ von ihnen mit hohen Raten in den extrazellulären Raum freigesetzt (2-4 Moleküle/Neuron/s für Aβ)19. Es gibt Hinweise darauf, dass die gelöste Form von Aβ, die sich im extrazellulären und perivaskulären Raum befindet, für Neuronen und Synapsen am toxischsten ist20. Das lösliche Aβ wird innerhalb von 1-2,5 h21 schnell aus dem menschlichen Gehirn ausgeschieden. MLVs sind die Tunnel zur Entfernung des löslichen Aβ aus dem Gehirn 1,7, das mit zunehmendem Alter abnimmt und zur Akkumulation von Aβ im gealterten Gehirn führt 1,22. Es gibt Hinweise darauf, dass extrazelluläre Anomalien des Aβ-Spiegels im Gehirn mit der kognitiven Leistungsfähigkeit im Alter korrelieren und mit der Entwicklung der Alzheimer-Krankheit (AD) assoziiert sind23,24. Daher gelten gealterte und alte Nagetiere als Alternativen zu transgenen Modellen für die Untersuchung der Amyloidose, einschließlich AD25,26.

In dieser Studie wird eine originelle und tragbare tPBM-Technologie unter elektroenzephalographischer (EEG) Kontrolle des tiefen oder nicht-schnellen Augenbewegungsschlafs (NREM) bei nicht anästhesierten männlichen BALB/c-Mäusen unterschiedlichen Alters vorgestellt, um die lymphatische Clearance von Aβ aus dem Gehirn in das periphere Lymphsystem (die tiefen zervikalen Lymphknoten, dcLNs) zu stimulieren.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem "Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren", der Richtlinie 2010/63/EU zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere und den Richtlinien des Ministeriums für Wissenschaft und Hochschulbildung der Russischen Föderation (Nr. 742 vom 13.11.1984) durchgeführt, die von der Bioethikkommission der Staatlichen Universität Saratow genehmigt wurden (Protokoll Nr. 7, 22.09.2022).

1. Montage der Hardware

  1. Schneiden Sie ein Stück Folientextolith mit einer Dicke von 1,5 mm x 2 mm zu. Dieses Teil wird als Leuchtdiode (LED) bezeichnet: Leiterplatte (PCB) (Abbildung 1C).
  2. Löten Sie eine LED an eine Leiterplatte, wie in Abbildung 1 gezeigt.
  3. Löten Sie zwei Kupferlitzen an die Pins einer LED und decken Sie diese dann mit einer Hülse ab.
  4. Drucken Sie das 3D-Modell des Rahmens aus (Abbildung 1A); Platzieren Sie eine LED (Abbildung 1B) und Magnete (Abbildung 1D) auf dem Rahmen. Platzieren Sie eine Unterlegscheibe (Abbildung 1E) auf dem Kopf der Maus.
  5. Gehen Sie folgendermaßen vor, um die Schaltung zu montieren (Abbildung 2).
    1. Schließen Sie zunächst den Widerstand an (Abbildung 2; R1) zwischen einer LED-Anode und einem 5-V-Anschluss am Arduino.
    2. Schließen Sie als Nächstes eine LED-Kathode an den Metalloxid-Halbleiter-Feldeffekttransistor (MOSFET) an (Abbildung 2; Q1) abtropfen lassen. Verbinden Sie dann die MOSFET-Quelle mit der Masse.
    3. Schließen Sie den Pulldown-Widerstand an (Abbildung 2; R2) zwischen dem MOSFET-Gate und der Masse. Verbinden Sie abschließend das MOSFET-Gate mit Pin 3 am Arduino.
  6. Schließen Sie eine LCD-Tastatur (Liquid Crystal Display) an den Arduino an.
  7. Drucken Sie die 3D-Modelle des Gehäuses, der Abdeckplatte und der Tasten aus. Setzen Sie die Arduino-Platine mit LCD-Tastaturabschirmung, MOSFET und LED-Anschluss in das Gehäuse ein, wie in Abbildung 3 gezeigt.

2. Software-Handbuch (Abbildung 4)

  1. Laden Sie den Arduino-Sketch (.ino-Datei) herunter und öffnen Sie ihn über die integrierte Entwicklungsumgebung (IDE) von Arduino (Supplementary Coding File 1).
  2. Wählen Sie den richtigen Kommunikationsport (COM) aus und flashen Sie die Firmware.
  3. Die Benutzeroberfläche besteht aus zwei Spalten. Verwenden Sie die Schaltflächen Links und Rechts , um zwischen diesen Spalten zu navigieren. Der Selektionsindikator befindet sich links neben der Spalte.
  4. Die linke Spalte auf dem Bildschirm ist das Auswahlfeld für das Tastverhältnis der Pulsweitenmodulation (PWM). Verwenden Sie die Tasten Nach oben und Nach unten , um das Arbeitsverhältnis einzustellen. Erreichen Sie die PBM-Dosis von 10/20/30 Dj/cm2 mit einem entsprechenden PWM-Tastverhältnis von 2 %/4 %/6 % in einer 17-minütigen Sitzung.
  5. Die rechte Spalte auf dem Bildschirm ist das Feld RUN/Off. Um diese Spalte auszuwählen, drücken Sie die rechte Taste auf der Tastatur und dann Auswählen. Wenn der Prozess ausgeführt wird, blinkt die Aktivitätsanzeige, und der Text auf der RUN-Taste ändert sich in OFF.
    ANMERKUNG. Die Mäuse werden über einen Zeitraum von 10 Tagen auf die Experimente vorbereitet, einschließlich der Implantation von EEG-Elektroden, der Implantation eines chronischen Katheters in den rechten Seitenventrikel zur Injektion von fluoreszierendem Aβ und der Platzierung einer Platte für PBM.

3. Implantation eines EEG-Aufzeichnungssystems (Abbildung 5)

  1. Wiegen Sie die Maus und betäuben Sie sie mit einer Mischung aus Zoletil 100 und Xylanit (100 mg/kg bzw. 10 mg/kg) durch intramuskuläre Injektion in den Oberschenkel.
  2. Wenn die Rückzugsreflexe des hinteren Fußes und die Einklemmreaktion des Schwanzes aufhören, platzieren Sie die Maus in einem stereotaktischen Rahmen über einem Heizkissen (Abbildung 5A).
  3. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augenlider auf, um ein Austrocknen der Augäpfel während der Operation zu verhindern. Wiederholen Sie diesen Vorgang bei Bedarf.
  4. Rasieren Sie den Kopf im Bereich von den Nasenknochen bis zum Hinterhauptbein mit einer Rasiermaschine und sterilisieren Sie die exponierte Haut zuerst mit Alkohol.
  5. Schneiden Sie mit einer geraden Präparierschere die Kopfhaut ab, halten Sie sie mit einer Mikrozange fest, reinigen Sie den Schädel von Faszien und trocknen Sie ihn mit Wattestäbchen. Verwenden Sie bei Bedarf die Blutstillungsmittel.
  6. Mit einem Bohrer mit einem Durchmesser von 1,3 mm bohren Sie auf jeder Seite entlang der Koordinaten 2 Löcher in die Schläfenknochen: AP = -1 mm für das erste Schraubenpaar und AP = -3 mm für das zweite Schraubenpaar.
  7. Legen Sie die EEG-Schrauben mit den Drahtleitungen für 5 min in Alkohol. Setzen Sie anschließend die EEG-Schrauben in die Kochsalzlösung ein.
  8. Setzen Sie vier versilberte Schrauben mit Elektroden bis zu einer Tiefe von 1 mm in die Löcher ein (Abbildung 5B).
  9. Befestigen Sie die Schrauben mit Zahnacryl an der Oberfläche des Schädels, so dass die von ihnen ausgehenden Elektroden zur Nase des Tieres hin angeordnet sind (Abbildung 5C). Lassen Sie das Dentalacrylat 15 Minuten aushärten.
  10. Befestigen Sie einen EEG-Aufzeichnungssensor mit Zahnacryl an der Nase des Tieres. Lassen Sie das Dentalkunststoff 30 Minuten lang aushärten (Abbildung 5D).
  11. Platzieren Sie die EMG-Elektroden mit einer gebogenen Pinzette auf der Rückseite des Musculus orbicularis oculi und fixieren Sie sie mit dem Zahnacryl. Lassen Sie das Dentalkunststoff 15 Minuten lang aushärten (Abbildung 5E).
  12. Schließen Sie die EEG-Elektroden an die versilberte Aussparung des Sensors an und löten Sie sie mit einer Lötstation ein. Befestigen Sie anschließend die EEG-Elektroden mit dem Dentalkunststoff (Abbildung 5F).
  13. Legen Sie die Maus nach der Operation auf ein Heizkissen, um die Körpertemperatur zu halten, bis sich das Tier vollständig von der Narkose erholt hat.
  14. Setzen Sie die Maus anschließend 10 Tage lang in einen individuellen Heimkäfig mit freiem Zugang zu Futter und Wasser mit Ibuprofen (40 mg/kg in 200 ml Wasser) zur Analgesie.

4. Implantation einer Platte für PBM

  1. Wiegen Sie die Maus und betäuben Sie sie mit einer Mischung aus Zoletil 100 und Xylanit (100 mg/kg; jeweils 10 mg/kg) durch intramuskuläre Injektion in den Oberschenkel 7 Tage nach der Implantation des EEG-Aufzeichnungssystems.
  2. Wenn die Rückzugsreflexe des hinteren Fußes und die Einklemmreaktion des Schwanzes aufhören, fixieren Sie die Maus in einem stereotaktischen System.
  3. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augenlider auf, um ein Austrocknen der Augäpfel während der Operation zu verhindern. Wiederholen Sie diesen Vorgang bei Bedarf.
  4. Befestigen Sie eine Metallplatte mit einem Durchmesser von 5 mm mit Zahnacryl und Dumont-Pinzette auf dem Hinterhauptbein des Schädels. Lassen Sie das Dentalacrylat 15 Minuten lang aushärten (Abbildung 6).

5. Vorbereitung eines chronischen Katheters

  1. Markieren Sie auf der Insulinnadel ein Segment 2 cm von der Seite des abgeschrägten Endes entfernt.
  2. Befestigen Sie die Insulinnadel im Nadelhalter von der Seite der abgeschrägten Spitze bis zum markierten Segment.
  3. Legen Sie einen 2 cm-PE-10 Polyethylen-Katheter über die gesamte verbleibende Länge der Nadel.
  4. Füllen Sie den Katheter mit einer Kochsalzlösung und decken Sie ihn mit einer Plastikkappe ab, um ihn zu verschließen.

6. Implantation eines chronischen Katheters in den rechten Seitenventrikel

  1. Nach der Implantation der Platte für PBM wird mit einem Bohrer ein Trepanationsloch bei den Koordinaten AP = -0,5 mm und ML = 1,2 mm mit einem Durchmesser von 1,5 mm gebohrt.
  2. Legen Sie den PE-10 Polyethylen-Katheter in eine stereotaktische Halterung und führen Sie ihn in den Schädel der Maus ein (DV = 2 mm). Fixieren Sie es anschließend mit dem Dentalacryl. Lassen Sie das Dentalacrylat 15 Minuten lang aushärten (Abbildung 7).
  3. Legen Sie die Maus nach der Operation auf ein Heizkissen, um die Körpertemperatur zu halten, bis sich das Tier vollständig von der Narkose erholt hat.
  4. Setzen Sie die Maus anschließend 10 Tage lang in einen individuellen Heimkäfig mit freiem Zugang zu Futter und Wasser mit Ibuprofen (40 mg/kg in 200 ml Wasser) zur Analgesie.

7. tPBM unter EEG-Kontrolle des NREM-Schlafs

  1. Schließen Sie ein beliebiges handelsübliches EEG-Aufzeichnungssystem an den Anschluss am Kopf der Maus an und stellen Sie den Anforderungswert für das PWM-Tastverhältnis ein.
  2. Überwachen Sie das EEG-Signal und warten Sie auf die Aktivität des Delta-Rhythmus. Wenn der NREM-Schlaf zu sehen ist, starten Sie den PBM-Prozess und stoppen Sie den Prozess, wenn der NREM-Schlaf in den REM-Schlaf (Rapid Eye Movement) oder Wachzustand übergeht. Die Dosis erhöht sich mit jeder Wechselwirkung, bis sie den erforderlichen Wert erreicht.
  3. Wenn die erforderliche PBM-Dosis erreicht ist, ist die Sitzung beendet.

8. Konfokale Bildgebung der lymphatischen Entfernung von Aβ aus dem Gehirn der Maus

  1. Verbinden Sie einen 10 cm Katheter mit einer Insulinnadel.
  2. Bereiten Sie mit einer Hamilton-Spritze mit einer 29-G-Nadel eine Infusion von fluoreszierendem Beta-Amyloid (FAβ) in einem Volumen von 5 μl in den Katheter vor. Lassen Sie den Katheter auf einer Hamilton-Spritze.
  3. Fixieren Sie die Hand der Maus und verbinden Sie den Katheter über eine Nadel mit dem implantierten chronischen Katheter.
  4. Verbinden Sie den Katheter mit einem Mikroinjektor. Platzieren Sie anschließend die Maus in einer einzelnen Box.
  5. Wählen Sie im Mikroinjektor-Menü die Injektionsrate 0,1 μl/min aus und drücken Sie die Start-Taste.
  6. Injektion von FAβ in den rechten Seitenventrikel vornehmen.
  7. Nach der FAβ-Verabreichung wird PBM mit einer LED für 61 Minuten nach dem Algorithmus durchgeführt: 17 min - Licht und 5 min - Pause über 61 min.
  8. Nach der PBM injizieren Sie intravenös einen beliebigen Tracer zur Markierung der Hirngefäße über den Schwanz.
  9. Nach der Injektion werden die Mäuse mit der CO2 -Euthanasiekammer eingeschläfert.
  10. Machen Sie mit einer scharfen, geraden Schere einen kleinen Querschnitt in die Haut entlang der Luftröhre und halten Sie die Haut mit einer geraden, nicht scharfen Pinzette fest.
  11. Machen Sie mit einer geraden Schere einen Längsschnitt über die gesamte Länge des Halses.
  12. Nehmen Sie mit einer gebogenen Pinzette die Speicheldrüsen auf und trennen Sie sie vorsichtig vom Bindegewebe. Legen Sie einen Wundretraktor auf den offenen Abschnitt des Schnitts und fixieren Sie ihn so, dass das umgebende Gewebe zurückgedrückt wird.
  13. Untersuchen Sie den Bereich zwischen der Luftröhre und dem M. cleidomastoideus mit zwei gebogenen Pinzetten von beiden Seiten des Halses.
  14. Wenn der tiefe zervikale Lymphknoten (dcLN) auf jeder Seite erkannt wird, entfernen Sie die dcLNs mit einer geraden Pinzette mit stumpfen Enden und schneiden Sie sie aus dem Bindegewebe ab.
  15. Legen Sie die dcLNs in eine Petrischale mit einer Kochsalzlösung und decken Sie sie mit horizontal ausgerichtetem Deckglas (25 mm × 50 mm × 0,17 mm) ab.
  16. Verwenden Sie ein beliebiges handelsübliches konfokales Mikroskop, um Bilder von ganzen dcLNs zu erhalten.

9. Analyse von Aβ in den Lysaten des Hirngewebes

  1. Bereiten Sie die Proben für den Assay vor.
    1. Euthanasieren Sie Mäuse mit der CO2 -Euthanasiekammer.
    2. Enthaupte die Maus, entferne die Haut von ihrem Kopf und entferne die Muskeln vom Schädel.
    3. Machen Sie mit einer scharfen, geraden Schere zwei Schnitte vom großen Hinterhauptsforamen bis zum Gehörgang.
    4. Trennen Sie mit einer geraden Pinzette den ventralen Teil des Schädels, das Hinterhauptbein und die Knochen, die die Mittelohrhöhlen bilden.
    5. Trennen Sie mit einer Pinzette das Gehirn von den Scheitel- und Stirnknochen.
    6. Entfernen Sie mit einer geraden Schere den Oberkiefer und schneiden Sie die Riechkolben ab.
    7. Lege das Gehirn in die physiologische Lösung.
    8. Spülen Sie das Gehirn mit kalter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung, um überschüssiges Blut gründlich zu entfernen, und wiegen Sie es vor der Homogenisierung.
    9. Bereiten Sie einen Lysingpuffer pH 7,2 mit 1,5 mm KH2PO4, 8 mm Na2HPO4, 3 mm KCl, 137 mm NaCl und 0,1 % Tween20, 10 mM EDTA mit einer frisch zubereiteten Protease-Hemmmischung vor.
    10. Homogenisieren Sie das Gehirn in frischem Lysepuffer (1 ml Lysepuffer für 200-500 mg Gewebeprobe) mit einem Glashomogenisator auf Eis.
    11. Beschallen Sie eine resultierende Suspension mit einem Ultraschall-Zelldisruptor, bis die Lösung geklärt ist.
    12. Zentrifugieren Sie die Homogenate bei 10.000 × g für 5 min.
    13. Der Überstand wird mit einer mechanischen Einkanalpipette (100-1000 μl) entnommen und sofort untersucht oder aliquotiert und bei ≤-20 °C gelagert.
  2. Bereiten Sie die folgenden Materialien vor: Mikroplatten-Reader mit 450 nm ± 10 nm Filter; Mikrozentrifugenröhrchen; Ein- oder Mehrkanalpipetten mit hoher Präzision und Einwegspitzen; saugfähiges Papier zum Abtupfen der Mikrotiterplatte; Behälter für Waschlösung; 0,01 mol/l (oder 1x) phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS); und deionisiertes oder destilliertes Wasser.
  3. Bereiten Sie die Reagenzien vor.
    1. Bringen Sie die Bestandteile des Kits und die Proben vor der Verwendung auf Raumtemperatur (RT; 18-25 °C).
    2. Rekonstituieren Sie den Standard mit den 1,0 mL Standardverdünnungsmittel, halten Sie ihn 10 Minuten lang bei RT und schütteln Sie ihn vorsichtig (nicht zum Schäumen). Die Standard-Stammlösung ist 300 pg/ml. Bereiten Sie 5 Röhrchen mit einem Volumen von 0,6 ml Standardverdünnungsmittel vor und erstellen Sie eine dreifache Verdünnungsreihe.
    3. Setzen Sie 5 Punkte (300 pg/ml, 100 pg/ml, 33,33 pg/ml, 11,11 pg/ml und 3,70 pg/ml) des verdünnten Standards und die letzten Röhrchen mit dem Blindwert ein, der nur das Standardverdünnungsmittel (0 pg/ml) enthält.
    4. Drehen Sie die Stammlösungen von Nachweisreagenz A und Nachweisreagenz B vor der Verwendung schnell herunter. Verdünnen Sie sie 100-fach mit dem Assay-Verdünnungsmittel A und B, um die Arbeitskonzentration herzustellen.
    5. Verdünnen Sie 20 mL der konzentrierten Waschlösung (30x) mit 580 mL entionisiertem oder destilliertem Wasser, um 600 mL Waschlösung (1x) herzustellen.
    6. Aspirieren Sie die erforderliche Dosierung der Lösung mit sterilisierten Spitzen und schütten Sie die restliche Lösung nicht erneut in das Fläschchen.
  4. Führen Sie den Assay durch.
    1. Bestimmen Sie die Vertiefungen für einen verdünnten Standard, einen Blindwert und eine Probe.
    2. Bereiten Sie 5 Vertiefungen für Standardspitzen und eine Vertiefung für Blindspitzen vor.
      1. Geben Sie jeweils 50 μl Standard-, Blind- und Probenverdünnungen in die entsprechenden Vertiefungen. Geben Sie dann sofort 50 μl Nachweisreagenz A in jede Vertiefung.
      2. Schütteln Sie die Platte vorsichtig (ein Mikroplattenschüttler wird empfohlen) und decken Sie sie mit einem Plattenversiegeler ab. Die Platte 1 h lang bei 37 °C inkubieren. Nachweisreagenz A kann trüb erscheinen. Erwärmen Sie die Lösung auf RT und mischen Sie sie vorsichtig, bis sie gleichmäßig erscheint.
    3. Aspirieren Sie die Lösung und waschen Sie jede Vertiefung mit 350 μl 1x Waschlösung mit Hilfe einer Spritzflasche, einer Mehrkanalpipette, eines Verteilerspenders oder einer automatischen Waschmaschine. Den Teller 1-2 Min. ungestört stehen lassen. Lassen Sie die Platte auf saugfähigem Papier einrasten, um die restliche Flüssigkeit vollständig aus allen Vertiefungen zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Vorgang 3 Mal.
    4. Nach der letzten Wäsche den restlichen Waschpuffer aspirieren oder dekantieren. Stellen Sie sicher, dass die Waschlösung vollständig entfernt wird, indem Sie die Platte umdrehen und gegen saugfähiges Papier tupfen.
    5. Geben Sie 100 μl Arbeitslösung aus Nachweisreagenz B in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang bei 37 °C, nachdem Sie sie mit dem Plattenversiegeler abgedeckt haben.
    6. Wiederholen Sie die Aspirations-/Waschschritte für insgesamt 5 Minuten.
    7. Geben Sie 90 μl Substratlösung in jede Vertiefung und bedecken Sie die Platte mit einem neuen Plattenversiegeler. 10-20 min bei 37 °C (nicht länger als 30 min) lichtgeschützt inkubieren. Nach der Zugabe der Substratlösung färbt sich die Flüssigkeit blau.
    8. Geben Sie 50 μl einer Stopplösung in jede Vertiefung, um die Reaktion zu beenden. Durch die Zugabe der Stopplösung wird die Flüssigkeit gelb. Klopfen Sie auf die Seite, um die Flüssigkeit zu mischen. Wenn die Farbänderung ungleichmäßig ist, klopfen Sie vorsichtig auf die Platte, um eine gründliche Mischung zu gewährleisten.
    9. Stellen Sie sicher, dass Wasser und Fingerabdrücke auf der Unterseite der Platte vollständig entfernt werden und keine Blasenbildung auf der Flüssigkeitsoberfläche entsteht. Lesen Sie dann die Platte sofort in einem Mikroplatten-Reader bei 450 nm ab.
  5. Berechnen Sie die Ergebnisse.
    1. Ermitteln Sie den Durchschnitt der doppelten Messwerte für jeden Standard, jede Kontrolle und jede Stichprobe. Zeichnen Sie eine Standardkurve mit dem logarithmischen Bestand der Konzentration von Aβ 1-42 auf der y-Achse und der Absorption auf der x-Achse.
    2. Zeichnen Sie eine Kurve mit der besten Anpassung durch die Punkte, die durch Regressionsanalyse bestimmt werden kann.
    3. Wenn verdünnte Proben verwendet wurden, multiplizieren Sie die aus der Standardkurve erhaltene Konzentration mit dem Verdünnungsfaktor.
      HINWEIS: Für ELISA wurde in dieser Studie ein Kit zur Bestimmung von Aβ 1-42 verwendet.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Im ersten Schritt konzentrierte sich die Studie auf die Etablierung der effektiven Lichtdosis (eine 1050 nm LED) zur Stimulation der lymphatischen Entfernung von fluoreszierendem Aβ aus dem Gehirn an dcLNs bei wachen erwachsenen (2-3 Monate alten, 26-29 g) männlichen BALB/c-Mäusen. Die Lichtdosen wurden zufällig als 10 J/cm2, 20 J/cm2 und 30 J/cm2 ausgewählt, basierend auf unseren früheren Studien zu tPBM-Effekten auf die Entfernung verschiedener Farbstoffe und der roten Blutkörperchen aus dem Gehirn 7,8,9,10,11,12. Die Ergebnisse der konfokalen Bildgebung, die in Abbildung 8A-E dargestellt sind, zeigen deutlich die dosisabhängigen Wirkungen von tPBM auf die lymphatische Entfernung von fluoreszierendem Aβ aus dem Gehirn zu dcLNs. Die Lichtdosis 30 J/cm2 erwies sich im Vergleich zu den Lichtdosen 10 J/cm2 und 20 J/cm2 als die effektivste, da ein Fluoreszenzsignal von Aβ in dcLNs eine höhere Intensität aufwies.

Im zweiten Schritt zielte die Forschung darauf ab, die Wellenlängen zu finden, die für die lymphatische Eliminierung von fluoreszierendem Aβ aus dem Gehirn von erwachsenen (2-3 Monate alten, 26-29 g) wachen BALB/c-Mäusen am effektivsten sind, wobei die tragbaren Fotoplattformen mit den unterschiedlichen Lichtwellenlängen (880 nm, 1050 nm, 1300 nm) und Moden (1050 nm im Fortsetzungs- und Pulsregime) bei gleicher Dosis (30 J/cm2) verwendet wurden. Abbildung 9A-E zeigt die konfokalen Bildgebungsergebnisse von dcLNs in den getesteten Gruppen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Lichtwellenlänge 1050 nm im Pulsmodus im Vergleich zu anderen getesteten Wellenlängen (880 nm und 1300 nm) und die Wellenlänge von 1050 nm im kontinuierlichen Bereich eine signifikant höhere Entfernung von fluoreszierendem Aβ aus dem Gehirn zu dcLNs verursachten.

Im letzten Schritt wurden die Auswirkungen einer 1050 nm LED im Pulsmodus auf den Gehalt an löslichem Aβ im Gehirn von gealterten Mäusen vor und nach dem 10-tägigen Verlauf von tPBM unter einer EEG-Kontrolle von NREM und Wachheit untersucht. Die Immunoassay-Analyse zeigte, dass der lösliche Aβ-Gehalt im Gehirn bei gealterten männlichen BALB/c-Mäusen (16-18 Monate alt, 30-33 g) signifikant höher war als bei adulten männlichen BALB/c-Mäusen (2-3 Monate alt, 26-29 g). Der 10-tägige Verlauf von tPBM während des Tiefschlafs, aber nicht im Wachzustand, reduzierte den löslichen Aβ-Spiegel im Gehirn gealterter Mäuse effektiv auf den Spiegel des löslichen Aβ im Gehirn erwachsener Mäuse (Abbildung 10).

figure-results-1
Abbildung 1: Hardware-Montageprozess. (A) 3D-gedruckter Rahmen, (B) LED, (C) LED-Leiterplatte, (D) Magnete, (E) metallische Unterlegscheibe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-2
Abbildung 2: LED-Steuerkreis. R1 - Stromregelungswiderstand, R2 - Pulldown-Widerstand für das MOSFET-Gate, Q1 - n-Kanal-MOSFET. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

figure-results-3
Abbildung 3: 3D-Ansicht des Gehäuses. (A) 3D-gedruckte Abdeckplatte, (B) 3D-gedruckte Tasten, (C) LCD-Tastaturabschirmung für Arduino, (D) Arduino, (E) 3D-gedrucktes Gehäuse, (F) LED-Anschluss, (G) Kanal-MOSFET. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-4
Abbildung 4: Software. (A) Auswahltaste, (B) Linke Taste, (C) Auf- /Ab-Taste , (D) Rechte Taste, (E) Auswahlanzeige, (F) PWM-Tastverhältnis-Auswahlfeld, (G) RUN/OFF-Feld . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-5
Abbildung 5: Implantation eines EEG-Aufzeichnungssystems. (A) Schädelpräparation; (B) Implantation von Schrauben; (C) Fixierung der Schrauben mit dem Dentalacryl; (D) Befestigung des EEG-Aufzeichnungssensors; (E) Implantation und Fixierung der EMG-Elektroden auf der Rückseite des Musculus orbicularis oculi; (F) Die an die versilberte Aussparung des Sensors gelöteten Elektroden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-6
Abbildung 6: Fixierung einer Platte für PBM auf dem Hinterhauptbein des Schädels. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

figure-results-7
Abbildung 7: Implantation eines chronischen Katheters in die rechte Seitenkammer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

figure-results-8
Abbildung 8: Die Auswirkungen verschiedener LED-Dosen von 1050 nm auf die lymphatische Entfernung von fluoreszierendem Aβ aus dem Gehirn zu dcLNs. (A-D) Repräsentative Bilder von dcLNs aus der (A) Kontrollgruppe und der PBM-Gruppe mit (B) 10 J/cm2, (C) 20 J/cm2 und (D) 30 J/cm2; (E) Quantitative Analyse der Akkumulation von fluoreszierendem Aβ in dcLNs aus den getesteten Gruppen (n = 8, einfache ANOVA mit Duncan-Post-hoc-Test, **p < 0,01, *p < 0,05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-9
Abbildung 9: Die Auswirkungen verschiedener LED-Wellenlängen auf die lymphatische Entfernung von fluoreszierendem Aβ aus dem Gehirn zu dcLNs. (A-D) Repräsentative Bilder von dcLNs aus der PBM-Gruppe mit Impulsmodus 1050 nm (ImpMode_1050, A), 880 nm (ImpMode_880, B), 1300 nm (ImpMode_1300, C) und kontinuierlichem Modus 1050 nm (ContMode_1050 nm, D); (E) Quantitative Analyse der Akkumulation von fluoreszierendem Aβ in dcLNs aus den getesteten Gruppen (n = 8, unidirektionale ANOVA mit Duncan-Post-hoc-Test, **p < 0,01). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-10
Abbildung 10: Die PBM-Effekte (LED 1050 nm im Impulsmodus, 30 J/cm2) während NREM und im Wachzustand auf den Gehalt an löslichem Aβ (pg/ml) in Mausgehirnen von adulten und gealterten Mäusen. Eine unidirektionale ANOVA mit Duncan-Post-hoc-Test, **p < 0,01, *p < 0,05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Codierungsdatei 1: lcd1key.ino Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MLVs sind ein wichtiges Ziel für die Entwicklung innovativer Technologien zur Modulation der Drainage des Gehirns und zur Entfernung von Zelltrümmern und Abfallstoffen aus dem Gehirn, insbesondere bei älteren Probanden, deren MLV-Funktion abnimmt 1,22. In einem homöostatischen Zustand ist der Tiefschlaf mit der natürlichen Aktivierung der Reinigung des Gehirngewebes verbunden13,14. Daher ist zu erwarten, dass die Stimulation von MLVs während des Tiefschlafs effektiver ist als während des Wachzustands15,16. Die neue nicht-invasive und tragbare Technologie der tPBM unter EEG-Kontrolle des Schlafes zur Stimulation der lymphatischen Entfernung von löslichem Aβ aus dem Gehirn gealterter männlicher Mäuse wird hier vorgestellt.

Die geringe Größe der Fotoplattform (7 mm x 11 mm) und ihr geringes Gewicht (1 g) ermöglichen eine feste und sichere Montage auf den Köpfen von Mäusen, wobei ihre natürliche motorische Aktivität erhalten bleibt. Dadurch entfällt auch die Notwendigkeit einer Anästhesie während der tPBM. Die tPBM während des Tiefschlafs kann mit jedem handelsüblichen Gerät zur EEG-Kontrolle der Schlafstadien durchgeführt werden. Auf diese Weise ermöglicht unsere Technologie die Durchführung der Studie in einem Heimkäfig, wobei die natürlichsten Bedingungen für die Tiere erhalten bleiben.

Im ersten Schritt wurde eine LED-Wellenlänge von 1050 nm nach dem Zufallsprinzip ausgewählt, um die effektive Dosis von Photoeffekten bei der lymphatischen Entfernung von fluoreszierendem Aβ aus dem Gehirn zu dcLNs bei wachen erwachsenen (2-3 Monate alten) Mäusen zu untersuchen. Die Wahl dieser Wellenlänge hängt mit den vorherigen Daten zur effektiven Stimulation von MLVs mit einem 1267 nm Laser 8,10,27,28,29,30,31,32,33,34 zusammen. Diese Wellenlänge fördert die direkte Erzeugung des Singulett-Sauerstoffs in kleinen Mengen im Hirngewebe und in seinen Hirnhäuten, was einer der Mechanismen ist, die der PBM der MLVszugrunde liegen 8,28,34. Die biologischen Wirkungen sowohl eines 1267-nm-Lasers als auch eines LED-Lasers von 1050 nm stehen jedoch in Zusammenhang mit der Erzeugung der Singulett-Sauerstoffanregung35. Tatsächlich stehen die Banden eines 1267 nm ± 20 nm Lasers und einer 1065 nm ± 15 nm LED in Verbindung mit der Bildung des Singulett-Sauerstoffs aus dem Grundzustand eines Sauerstoffmoleküls. Eine Bande eines 1267-nm-Lasers pumpt ein Sauerstoffmolekül direkt in den ersten angeregten Singulett-Zustand, während eine Bande von 1065 nm LED zusätzlicher Schwingungsenergie entspricht, die sehr schnell zerfällt und Wärme an die Umgebung abgibt. Darüber hinaus ist die Wasseraufnahme in der Wellenlänge von 1065 nm zehnmal geringer als in der Wellenlänge von 1267 nm, was sie für die biologische Forschung günstiger macht35. Darüber hinaus ist eine 1050 nm LED kommerziell auf dem Markt erhältlich und im Vergleich zu dem seltenen und teuren 1267 nm Laser viel billiger. Beachten Sie, dass das Emissionsband einer in dieser Studie verwendeten 1050-nm-LED 40 nm breit war und sich nur teilweise mit einem Singulett-Sauerstoffband überschneidet. Wir zeigten jedoch den signifikanten Effekt von tPBM auf die lymphatische Entfernung von fluoreszierendem Aβ aus dem Gehirn zu dcLNs mit einer 1050 nm LED (30 J/cm2). Die Lichtdosis 30 J/cm2 erwies sich im Vergleich zu den Lichtdosen 10 J/cm2 und 20 J/cm2 als am effektivsten, basierend auf der höheren Intensität eines Fluoreszenzsignals von Aβ in dcLNs. Somit kann eine 1050 nm LED sehr nützlich für die Anwendung der tPBM-Technik am Menschen sein, was mit dem allgemeinen Trend übereinstimmt, LEDs anstelle von Lasern für PBM36,37 zu verwenden.

Im zweiten Schritt sollte die Frage beantwortet werden, welche Lichtwellenlängen für die lymphatische Eliminierung von fluoreszierendem Aβ aus dem Gehirn erwachsener wacher Mäuse am effektivsten sind. Dieser Studienschritt wurde unter Verwendung einer tragbaren Fotoplattform mit unterschiedlichen Lichtwellenlängen (880 nm, 1050 nm, 1300 nm) und Moden (1050 nm im kontinuierlichen und Pulsregime) mit der gleichen Dosis (30 J/cm2) durchgeführt. Diese Wellenlängen wurden aufgrund der weit verbreiteten Verwendung in der klinischen Praxis für tPBM (880 nm) und neue teure LEDs (1300 nm) gewählt, die möglicherweise klinisch bedeutsam sein könnten. Darüber hinaus wurden die gepulsten und kontinuierlichen Moden nur für die 1050 nm LED als Lichtressource verglichen. Diese Daten zeigen deutlich, dass nur eine 1050 nm LED im Pulsmodus im Vergleich zu anderen Wellenlängen und die 1050 nm im kontinuierlichen Modus eine signifikante lymphatische Entfernung von Aβ aus dem Gehirn zu dcLNs verursacht. Diese Ergebnisse stimmen mit den Ergebnissen anderer Forscher überein, die ebenfalls auf den Vorteil der Verwendung eines gepulsten PBM hinweisen, um biologische Effekte effektiv zu erzielen 38,39,40.

Im letzten Schritt, bei der die effektive Wellenlänge, die Dosis und der Modus ausgewählt wurden, wurde die Untersuchung der Auswirkungen einer 1050 nm LED im Pulsmodus auf den Gehalt an löslichem Aβ im Gehirn von gealterten Mäusen vor und nach dem 10-tägigen Verlauf der tPBM unter einer EEG-Kontrolle von NREM und Wachheit durchgeführt. Die Immunoassay-Analyse zeigte, dass der lösliche Aβ-Gehalt im Gehirn bei gealterten Mäusen (16-18 Monate) signifikant höher war als bei erwachsenen Mäusen (2-3 Monate alt). Es ist interessant festzustellen, dass der 10-tägige Verlauf von tPBM während des Tiefschlafs, aber nicht im Wachzustand, den löslichen Aβ-Spiegel im Gehirn gealterter Mäuse effektiv auf den Spiegel von löslichem Aβ im Gehirn erwachsener Mäuse reduzierte. In anderen Studien wurde auch ein Anstieg des Aβ-Gehalts im Hirngewebe gesunder Mäuse und Ratten mit zunehmendem Alter festgestellt 25,26, was mit einer altersbedingten Abnahme der MLV-Funktionen verbunden sein kann, was zu einer unwirksamen Reinigung des Hirngewebes von diesem toxischen Protein führt 1,22. Die effektivere tPBM der Entfernung von löslichem Aβ aus dem Hirngewebe bei schlafenden Mäusen im Vergleich zu wachen Mäusen kann durch die natürliche Aktivierung der Hirngewebedrainage während des Schlafs erklärt werden. Die MLV-Morphologie ändert sich mit zunehmendem Alter erheblich, was zu einer verminderten lymphatischen Entfernung von Metaboliten aus dem gealterten Gehirn führt22. tPBM während des Schlafs hilft jedoch, die lymphatische Entfernung von löslichem Aβ aus dem Hirngewebe alternder Mäuse auf das Niveau erwachsener Tiere wiederherzustellen.

Unter Berücksichtigung der Streuung von Lichtenergie beim Durchgang durch den Schädel begrenzt tPBM seine Wirkung nur auf MLVs, ohne tief in das Hirngewebe einzudringen. Trotz der Tatsache, dass die Lymphgefäße noch nicht direkt im Hirngewebe von Menschen und Tieren gefunden wurden, gibt es immer mehr Hinweise auf das Vorhandensein des zerebralen Lymphsystems 41,42,43,44. Dies erklärt die Ergebnisse, die zeigen, dass Toxine (Blut und Aβ) aus den tiefen Strukturen des Gehirns (dem Ventrikelsystem, dem Hippocampus) zu MLVs und weiter zur Peripherie (dcLNs) entfernt werden5,7. Im Laufe eines Jahrhunderts hat sich das Wissen angesammelt, das auf einen engen Zusammenhang zwischen der Drainage des Gehirns und dem peripheren Lymphsystem hinweist45. Auch wenn es kein allgemein anerkanntes lymphatisches Netzwerk im Zentralnervensystem gibt, gibt es Fakten, die auf eine lymphatische Entfernung von Makromolekülen aus den tiefen Teilen des Gehirns in die Peripherie hinweisen 1,2,3,4,5,6,7 Dies erklärt auch, warum tPBM, das nur auf MLVs wirkt, die Clearance von Blut und Aβ aus dem Gehirn stimuliert 5, 7. Urheberrecht

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie eine tragbare Technologie von tPBM unter EEG-Kontrolle des Schlafes vorstellt, die entwickelt wurde, um die Entfernung von Toxinen am Beispiel von löslichem Aβ aus dem Gehirn gealterter Mäuse zu photostimulieren und die therapeutische Wirksamkeit verschiedener optischer Ressourcen zu vergleichen. Die Technologie kann unter dem natürlichen Zustand eines Heimkäfigs ohne Anästhesie eingesetzt werden, wobei die natürliche motorische Aktivität von Mäusen erhalten bleibt. Diese Daten eröffnen neue Perspektiven für die Entwicklung nicht-invasiver und klinisch vielversprechender Phototechnologien zur Korrektur altersbedingter Veränderungen der MLV-Funktionen und der Drainageprozesse des Gehirns sowie für die effektive Reinigung des Hirngewebes von Metaboliten und Toxinen. Die vorgeschlagene Technologie zur Photostimulation der Gehirndrainage und der lymphatischen Entfernung von Toxinen aus dem Gehirn hat aufgrund der Streuung von Lichtenergie beim Durchgang durch den Schädel nur begrenzte Auswirkungen auf MLVs. Daher kann die Technologie zur Entwicklung neuer Methoden zur Behandlung von Hirnerkrankungen im Zusammenhang mit MLV-Dysfunktion eingesetzt werden. Die ausgeprägtesten stimulierenden Photoeffekte auf MLVs werden im Tiefschlaf (NREM) beobachtet, der den Einsatz von PBM unter EEG-Kontrolle erfordert. Dies führt zu gewissen Schwierigkeiten (technisch, programmierend) für die gleichzeitige Kontrolle des Beginns des Tiefschlafs und der Lichteinstrahlung.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Forschung wurde durch ein Stipendium der Russischen Wissenschaftsstiftung (Nr. 23-75-30001) unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0.1% Tween20Helicon,  RusslandSB-G2009-100ML
KatheterScientific Commodities Inc., USAPE-10, 0,28 mm ID & mal 0,61 mm OD
CO2 KammerBindemittel, DeutschlandCB-S 170
KonfokalmikroskopischNikon, JapanA1R MP
Dental AcrylZermack, Polen-RusslandVillacryl S, V130V4Z05
DrillForedom, RusslandSR W-0016
Dumont PinzetteStoelting, USA52100-07
Evans Blue dyeSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA206334
HamiltonHamilton Bonaduz AG, Schweiz29 G Nadel
IbuprofenSintez OJSC, RusslandN/A  Analgetikum
InsulinnadelINSUPEN, Italien31 G, 0,25 mm x 6 mm
Levomekol antibakterielle SalbeNizhpharmD06C Zur äußerlichen Anwendung in einer Dosis von 40 mg/g, 1 Mal pro Tag
MikrozangeStoelting, USA52102-02P
MikrozentrifugeGyrozen, SüdkoreaGZ-1312
MikroinjektorStoelting, USA53311
Unscharfe PinzetteStoelting, USA52108-83P
PINNACLE SystemPinnacle Technology, USA8400-K3-SLSystem zur Aufzeichnung von EEG (2 Kanälen) und EMG (1 Kanal) von Mäusen
RasiermaschineBraunSerie 3310s
Eppendorf, ÖsterreichEpp 3120 000.020, Epp 3122 000.019
NatriumchloridKraspharma, RusslandN/A
LötstationAOYUE, ChinaN/A
Stereotaktischer RahmenStoelting, USA51500
Gerade PräparierschereStoelting, USA52132-10P
TetracyclinJSC Tatkhimfarmpreparaty, RusslandN/AAugensalbe
PinzetteStoelting, USA52100-03
Ultraschall-ZelldisruptorBiobase, ChinaUSD-500
WundretraktorStoelting, USA52125
XylanitNita-Farm, RusslandN/AMuskelrelaxans
Zoletil 100Virbac Sante Animale, FrankreichN/AVollnarkose
Ein- und Mehrkanalpipetten

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Da Mesquita, S., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
  2. Chen, J., et al. Meningeal lymphatics clear erythrocytes that arise from subarachnoid hemorrhage. Nat Commun. 11, 3159(2020).
  3. Zou, W., et al. Blocking meningeal lymphatic drainage aggravates Parkinson's disease-like pathology in mice overexpressing mutated α-synuclein. Transl Neurodegener. 8, 7(2019).
  4. Hu, X., et al. Meningeal lymphatic vessels regulate brain tumor drainage and immunity. Cell Res. 30 (3), 229-243 (2020).
  5. Dong-Yu, L., et al. Photostimulation of brain lymphatics in male newborn and adult rodents for therapy of intraventricular hemorrhage. Nat Comm. 14 (1), 6104(2023).
  6. Bolte, A., et al. Meningeal lymphatic dysfunction exacerbates traumatic brain injury pathogenesis. Nat Commun. 11 (1), 4524(2020).
  7. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Mechanisms of phototherapy of Alzheimer's disease during sleep and wakefulness: the role of the meningeal lymphatics. Front Optoelectron. 16, 22(2023).
  8. Dongyu, L., et al. Photostimulation of lymphatic clearance of β- amyloid from mouse brain: new strategy for the therapy of Alzheimer's disease. Front Optoelectron. 16, 45(2023).
  9. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Mechanisms of phototherapy of Alzheimer's disease during sleep and wakefulness: the role of the meningeal lymphatics. Front Optoelectron. 16, 22(2023).
  10. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Intranasal delivery of liposomes to glioblastoma by photostimulation of the lymphatic system. Pharmaceutics. 15 (1), 36(2023).
  11. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Night photostimulation of clearance of beta-amyloid from mouse brain: New strategies in preventing Alzheimer's disease. Cells. 10 (12), 3289(2021).
  12. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Technology of the photobiostimulation of the brain's drainage system during sleep for improvement of learning and memory in male mice. Biomed Opt Express. 15 (1), 44-58 (2024).
  13. Fultz, N., et al. Coupled electrophysiological, hemodynamic, and cerebrospinal fluid oscillations in human sleep. Science. 366 (6465), 628-631 (2019).
  14. Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the adult brain. Science. 342 (6156), 373-377 (2013).
  15. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Phototherapy of Alzheimer's disease: Photostimulation of brain lymphatics during sleep: A systematic review. Int J Mol Sci. 24 (13), 10946(2023).
  16. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Brain waste removal system and sleep: Photobiomodulation as an innovative strategy for night therapy of brain diseases. Int J Mol Sci. 24 (4), 3221(2023).
  17. Hablitz, L. M., et al. Increased glymphatic influx is correlated with high EEG delta power and low heart rate in mice under anesthesia. Sci Adv. 5 (2), 5447(2019).
  18. Fukumoto, H., et al. Primary cultures of neuronal and non-neuronal rat brain cells secrete similar proportions of amyloid beta peptides ending at A beta40 and A beta42. Neuroreport. 10 (14), 2965-2969 (1999).
  19. Moghekar, A., et al. Large quantities of Abeta peptide are constitutively released during amyloid precursor protein metabolism in vivo and in vitro. J Biol Chem. 286 (16), 15989-15997 (2011).
  20. Wells, C., Brennan, S., Keon, M., Ooi, L. The role of amyloid oligomers in neurodegenerative pathologies. Int J Biol Macromol. 181, 582-604 (2021).
  21. Savage, M., et al. Turnover of amyloid beta-protein in mouse brain and acute reduction of its level by phorbol ester. J Neurosci. 18 (5), 1743-1752 (1998).
  22. Ahn, J., et al. Meningeal lymphatic vessels at the skull base drain cerebrospinal fluid. Nature. 572 (7767), 62-66 (2019).
  23. Stevens, D., et al. Regional amyloid correlates of cognitive performance in ageing and mild cognitive impairment. Brain Commun. 4 (1), 016(2022).
  24. Ma, C., Hong, F., Yang, S. Amyloidosis in Alzheimer's disease: Pathogeny, etiology, and related therapeutic directions. Molecules. 27 (4), 1210(2022).
  25. Kobro-Flatmoen, A., Hormann, T., Gouras, G. Intracellular amyloid-β in the normal rat brain and human subjects and its relevance for Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 95 (2), 719-733 (2023).
  26. Ahlemeyer, B., Halupczok, S., Rodenberg-Frank, E., Valerius, K., Baumgart-Vogt, E. Endogenous murine amyloid-β peptide assembles into aggregates in the aged C57BL/6J mouse suggesting these animals as a model to study pathogenesis of amyloid-β plaque formation. J Alzheimers Dis. 61 (4), 1425-1450 (2018).
  27. Zhinchenko, E., et al. Pilot study of transcranial photobiomodulation of lymphatic clearance of beta-amyloid from the mouse brain: Breakthrough strategies for nonpharmacologic therapy of Alzheimer's disease. Biomed Opt Express. 10 (8), 4003-4017 (2019).
  28. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Transcranial photobiomodulation of clearance of beta-amyloid from the mouse brain: Effects on the meningeal lymphatic drainage and blood oxygen saturation of the brain. Adv Exp Med Biol. 1269, 57-61 (2021).
  29. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Photobiomodulation of lymphatic drainage and clearance: Perspective strategy for augmentation of meningeal lymphatic functions. Biomed Opt Express. 11 (2), 725-734 (2020).
  30. Zhinchenko, E., et al. Photostimulation of extravasation of beta-amyloid through the model of blood-brain barrier. Electronics. 9 (6), 1056(2020).
  31. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Photostimulation of cerebral and peripheral lymphatic functions. Transl Biophotonics. 2 (1-2), e201900036(2020).
  32. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Photomodulation of lymphatic delivery of liposomes to the brain bypassing the blood-brain barrier: New perspectives for glioma therapy. Nanophotonics. 10 (12), 3215-3227 (2021).
  33. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Photomodulation of lymphatic delivery of Bevacizumab to the brain: The role of singlet oxygen. Adv Exp Med Biol. 1395, 53-57 (2022).
  34. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Transcranial photosensitizer-free laser treatment of glioblastoma in rat brain. Int J Mol Sci. 24 (18), 13696(2023).
  35. Blázquez-Castro, A. Direct 1O2 optical excitation: A tool for redox biology. Redox Biol. 13, 39-59 (2017).
  36. Spitler, R., Berns, M. Comparison of laser and diode sources for acceleration of in vitro wound healing by low-level light therapy. J Biomed Opt. 19 (3), 038001(2014).
  37. Sato, K., Watanabe, R., Hanaoka, H., Nakajima, T., Choyke, P., Kobayashi, H. Comparative effectiveness of light emitting diodes (LEDs) and Lasers in near infrared photoimmunotherapy. Oncotarget. 7 (12), 14324-14335 (2016).
  38. Keshri, G., Gupta, A., Yadav, A., Sharma, S., Singh, S. Photobiomodulation with pulsed and continuous wave near-infrared laser (810 nm, Al-Ga-As) augments dermal wound healing in immunosuppressed rats. PLoS One. 11 (11), e0166705(2016).
  39. Kim, H., et al. Pulse frequency dependency of photobiomodulation on the bioenergetic functions of human dental pulp stem cells. Sci Rep. 7 (1), 15927(2017).
  40. Chen, Z., et al. The pulse light mode enhances the effect of photobiomodulation on B16F10 melanoma cells through autophagy pathway. Lasers Med Sci. 38 (1), 71(2023).
  41. Mezey, E., et al. An immunohistochemical study of lymphatic elements in the human brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (3), e2002574118(2021).
  42. Chang, J., et al. Characteristic features of deep brain lymphatic vessels and their regulation by chronic stress. Research. 6, 0120(2023).
  43. Prineas, L. W. Multiple sclerosis: Presence of lymphatic capillaries and lymphoid tissue in the brain and spinal cord. Science. 203 (4385), 1123-1125 (1979).
  44. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Pilot identification of the Live-1/Prox-1 expressing lymphatic vessels and lymphatic elements in the unaffected and affected human brain. bioRxiv. , 458990(2021).
  45. Semyachkina-Glushkovskaya, O., Postnov, D., Kurths, J. Blood-brainbarrier, lymphatic clearance, and recovery: Ariadne's thread in labyrinths of hypotheses. Int J Mol Sci. 19 (12), 3818(2018).

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Photobiomodulationstherapiemeningeale Lymphgef eEEG Schlafmonitoringcerebrale DrainageAmyloid Beta Entfernungtranskranielle PBMKonfokalmikroskopieNREM SchlafstimulationToxine im Mausgehirnnicht invasive Gehirntherapie

Verwandte Artikel