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Methodik zur Untersuchung der Wechselwirkungen von Vitamin-A-Membranrezeptoren und Opsin-Protein mit ihren Liganden bei der Erzeugung des Retinyliden-Proteins

DOI:

10.3791/67036

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4. Oktober 2024

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1Department of Ophthalmology and Visual Neurosciences, University of Minnesota, 2High Throughput Screening Laboratory, Institute for Therapeutics Discovery & Development, University of Minnesota

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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In dieser Arbeit beschreiben wir zwei quantitative Methoden zur Untersuchung der Protein-Liganden-Wechselwirkungen von Vitamin-A-Membranrezeptoren und Photorezeptor-Opsin mit ihren jeweiligen physiologischen Liganden.

Zusammenfassung

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Die Verteilung von Vitamin A/all-trans-Retinol (ROL) über die Nahrung im Körper ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Retinoidfunktion in peripheren Geweben und die Bildung des Retinyliden-Proteins für die Sehfunktion. RBP4-ROL ist der Komplex von ROL mit dem Retinol-bindenden Protein 4 (RBP4), das im Blut vorhanden ist. Zwei Membranrezeptoren, Retinol Binding Protein 4 Receptor 2 (RBPR2) in der Leber und STimuliert durch Retinsäure 6 Retinol (STRA6) im Auge, binden zirkulatorisches RBP4 und dieser Mechanismus ist entscheidend für die Internalisierung von ROL in die Zellen. Die Etablierung von Methoden zur Untersuchung der Rezeptor-Liganden-Kinetik ist essentiell für das Verständnis der physiologischen Funktion von Vitamin-A-Rezeptoren für die Retinoid-Homöostase. Mit Hilfe von Oberflächenplasmonenresonanz-Assays (SPR) können wir die Bindungsaffinitäten und kinetischen Parameter von Vitamin-A-Membranrezeptoren mit seinem physiologischen Liganden RBP4 analysieren.

Diese Methoden können neue strukturelle und biochemische Informationen von RBP4-Bindungsmotiven in RBPR2 und STRA6 aufdecken, die für das Verständnis pathologischer Zustände von Vitamin-A-Mangel entscheidend sind. Im Auge wird internalisiertes ROL zu 11-cis Retinal metabolisiert, dem visuellen Chromophor, das in Photorezeptoren an Opsin bindet, um das Retinylidenprotein Rhodopsin zu bilden. Die Absorption von Licht bewirkt die cis-zu-trans-Isomerisierung von 11-cis-Retinal, was zu Konformationsänderungen im Rhodopsin und der anschließenden Aktivierung der Phototransduktionskaskade führt. Verminderte Konzentrationen von Serum- und okulärer ROL können die Bildung von Retonylidenprotein beeinflussen, was wiederum zu einer Rhodopsin-Fehllokalisation, einer Apoprotein-Opsin-Akkumulation, Nachtblindheit und einer Degeneration des äußeren Photorezeptorsegments führen kann, was zu Retinitis Pigmentosa oder Leber Congenital Amaurose führt.

Daher sind spektrophotometrische Methoden zur Quantifizierung des G-Protein-gekoppelten Rezeptors Opsin-11-cis-Netzhautkomplex in der Netzhaut entscheidend für das Verständnis der Mechanismen der retinalen Zelldegeneration in den oben genannten pathologischen Zuständen. Mit diesen umfassenden Methoden werden die Forscher in der Lage sein, die Vitamin-A-Versorgung über die Nahrung bei der Aufrechterhaltung der systemischen und okulären Retinoid-Homöostase besser zu beurteilen, die für die Erzeugung und Aufrechterhaltung von Retinyliden-Proteinkonzentrationen in Photorezeptoren entscheidend ist, was für die Aufrechterhaltung der Sehfunktion beim Menschen entscheidend ist.

Einleitung

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Über die Nahrung gewonnenes Vitamin A/all-trans-Retinol/ROL ist eine wichtige Komponente, die eine Rolle bei der Sehfunktion spielt 1,2. Das Chromophor 11-cis Retinal, ein Metabolit von Vitamin A in der Nahrung, bindet an den G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR) Opsin, um das Retinyliden-Protein Rhodopsin in den Photorezeptoren zu erzeugen. Wenn Licht auf das Auge fällt, erfährt die Konfiguration von Rhodopsin eine grundlegende Veränderung durch die Umwandlung seiner 11-cis-retinalen Komponente in die all-trans-retinal. Diese Konfigurationsänderung löst eine Phototransduktionskaskade innerhalb der Photorezeptoren der Stäbchen aus, die Licht in ein elektrisches Signal umwandelt, das über den Sehnerv an den visuellen Kortex im Gehirn weitergeleitet wird 3,4,5,6,7,8,9,10 . Verminderte Konzentrationen von Serum- und okulärer ROL können die Bildung von Retanylidenprotein beeinflussen, was wiederum zu einer Opsin-Fehllokalisation, einer Apoprotein-Opsin-Akkumulation, Nachtblindheit und einer Degeneration des Photorezeptor-OS führt, was zu Retinitis Pigmentosa oder Leber Congenital Amaurose führt, die zur Erblindung führen kann 3,10.

All-trans-Retinol ist die grundlegende Transportform von Vitamin A in der Nahrung und es ist die Quelle, aus der alle funktionellen Retinoide und Vitamin-A-Metaboliten in der Nahrung gewonnen werden. Die Leber dient als primäres Organ für die Vitamin-A-Speicherung über die Nahrung. Leberretinol wird über das Serum als dessen Komplex mit dem Retinol-bindenden Protein 4 (RBP4) transportiert. RBP4, das hauptsächlich in der Leber exprimiert wird, bildet mit dem Retinolsubstrat und Transthyretin (TTR) einen Holo-Komplex, der in den Kreislauf gelangt 11,12,13,14,15,16,17. Der Bericht über einen Zelloberflächenrezeptor für RBP4 in den 1970er Jahren führte zu der Hypothese, dass Membrantransportproteine den Transport von Retinoiden in und aus Zellen unterstützen. Der Zelloberflächenrezeptor für RBP4-gebundenes Retinol (RBP4-ROL) wurde im retinalen Pigmentepithel (RPE) des Auges als STimuliert durch Retinsäure 6 Retinol (STRA6) identifiziert. STRA6 bindet an den zirkulatorischen Holo-RBP4-Komplex und transportiert das RBP4-gebundene Retinol über das RPE, um von Photorezeptoren genutzt zu werden18,19. Mutationen in STRA6 können zu einer Vielzahl von Krankheiten und Phänotypen führen, die mit reduzierten okulären ROL-Konzentrationen verbunden sind. STRA6-Mutationen während der Entwicklung können zu Anophthalmie, Mikrophthalmie und anderen nicht-okulären Symptomen führen, die sich mit Phänotypen überschneiden, die mit dem Matthew-Wood-Syndrom assoziiert sind 20,21,22,23,24,25,26,27. STRA6 wird in verschiedenen Organen und Geweben exprimiert, wie z.B. dem RPE im Auge, aber nicht in allen Geweben26,27. Obwohl der primäre Ort der Retinoidspeicherung die Leber ist, wird STRA6 nicht in der Leber exprimiert.

Alapatt und Kollegen entdeckten, dass der Retinol-Bindungsprotein-4-Rezeptor 2 (RBPR2) RBP4 mit hoher Affinität bindet und für die Aufnahme von RBP4-gebundenem Retinol in der Leber verantwortlich ist, ähnlich wie STRA6 im RPE28. Es wurde berichtet, dass RBPR2 die strukturelle Homologie mit STRA6teilt 29,30,31. Es wird vorgeschlagen, dass RBP4 an die Reste S294, Y295 und L296 auf RBPR2 bindet, einer Aminosäurebindungsdomäne, die teilweise auch zwischen RBPR2 und STRA6 konserviert ist 29,30,31. Aus diesen Studien wird vorgeschlagen, dass Vitamin-A-Membranrezeptoren wie STRA6 und RBPR2, die eine oder mehrere extrazelluläre Bindungsreste/-domänen enthalten, mit zirkulatorischem RBP4-ROL interagieren. Membranrezeptoren spielen daher eine wichtige Rolle bei der Rezeptorbindung an zirkulatorisches RBP4 für die ROL-Internalisierung in Zielgewebe wie Leber und Auge.

Im ersten Teil dieser Studie untersuchten wir mit Hilfe der Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) die Interaktion von zwei Vitamin-A-Membranrezeptoren (RBPR2 und STRA6) mit ihrem physiologischen Liganden RBP431. Die Bindungsaffinitäten und die Assoziations-/Dissoziationskinetik von Protein-Liganden-Komplexen können mit Hilfe von SPR in Echtzeit gemessen werden. Diese Methodik zielte darauf ab, kritische kinetische, strukturelle und biochemische Informationen über RBP4-Bindungsmotive in RBPR2 und STRA6 zu liefern, die für das Verständnis pathologischer Zustände von Vitamin-A-Mangel entscheidend sind31,32. Wie oben erwähnt, wird zirkulatorisches ROL über STRA6 in das RPE internalisiert, um das Chromophor 11-cis Retinal zu erzeugen, das an Opsin bindet, um das Retinylidenprotein Rhodopsin in Photorezeptorenzu erzeugen 33. Wir verwendeten spektrophotometrische Methoden, um das GPCR-Opsin und seinen Liganden 11-cis-Retina-Komplex in retinalen Lysaten von Mäusen zu quantifizieren, was für das Verständnis der Mechanismen des reduzierten Retinyliden-Proteins, Rhodopsin, bei retinitis pigmentosa oder Leber kongenitalen Amaurosa okulären pathologischen Zuständen entscheidend ist34. Im Allgemeinen können diese Protokolle angewendet werden, um in vitro die physiologischen Auswirkungen von mutierten RBP4, STRA6 oder RBPR2 auf die Beeinflussung der systemischen und okulären Vitamin-A-Homöostase oder den Einfluss von mutierten Rhodopsin- oder Retinoid-Zyklusproteinen auf die Sehfunktion zu untersuchen35,36.

Protokoll

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1. Methodik der Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)

  1. Aufbereitung und Aufreinigung des RBP4-Proteins der Maus
    1. Entwerfen Sie Primer zur Generierung von Maus-RBP4 (msRBP4) cDNA in voller Länge (NCBI-Referenzsequenz: NM_001159487.1). Klonieren Sie die msRBP4 cDNA in einen pET28a His-Tag Kanamycin-resistenten Expressionsvektor und exprimieren Sie sie in BL-21 DE3-Zellen (Table of Materials).
    2. Die BL-21 DE3-kompetenten Zellen (gemäß dem Protokoll des Herstellers) werden mit einem ligierten msRBP4-pET28a-Vektor transformiert und dann auf Luria-Bertani (LB) Bouillon-Agarplatten mit Kanamycin 50 μg/ml30,37 aufgebracht. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 °C in einem Inkubator und screenen Sie am nächsten Tag nach positiven Kolonien.
    3. Eine einzelne Kolonie wird entnommen und über Nacht bei 37 °C in 5 ml LB-Bouillon mit 50 μg/ml Kanamycin inkubiert.
    4. Für die Sekundärkultur in 500 ml LB-Bouillon mit Kanamycin 50 μg/ml ist 1 Vol.-% der Primärkultur (aus Schritt 1.1.3.) zu verwenden und 3-4 h lang bei 37 °C zu inkubieren; Überprüfen Sie die optische Dichte mit einem Spektralphotometer. Idealerweise ist bei einem OD-Wert zwischen 0,6 und 1 vorzugehen, um über Nacht eine Proteinexpression mit 0,5 mM IPTG bei 24 °C zu induzieren.
    5. Verwenden Sie mehrere IPTG-Konzentrationen von 0,1-1 mM und einen Temperaturbereich von 16-30 °C, um die Expression und Stabilität von msRBP4 zu optimieren.
    6. Die Kultur (aus Schritt 1.1.5.) bei 16.000 × g für 10 min zentrifugieren, den Überstand verwerfen und das Pellet auf Eis legen.
    7. Homogenisieren Sie das Pellet mit Lysepuffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1 % (v/v) Triton X-100, 10 % Glycerin, 0,5 mM PMSF und Proteaseinhibitoren [pH 8,0]). Beschallung des Lysats für einen 15 s EIN- und 30 s AUS-Zyklus mit einem Homogenisator mit einer Ausgangsleistung von 250 Watt und einer Ausgangsfrequenz von 40-50 % 20 kHz. 5x wiederholen.
    8. Entfernen Sie die Zelltrümmer und unlysierten Zellen durch Zentrifugation bei 16.000 × g für 20 Minuten. Führen Sie den Überstand des Lysats durch eine pufferäquilibrierte Nickel-NTA-Säule.
    9. Die Säule wird mit Lysepuffer (aus Schritt 1.1.8) gewaschen, der 30 mM Imidazol enthält.
    10. In Fraktionen eluiert das gebundene msRBP4-Protein mit einem Puffer, der 250 mM Imidazol enthält. Führen Sie die eluierten Fraktionen durch und überwachen Sie die Proteinmenge visuell mit einem 12%igen SDS-Polyacrylamidgel, das mit Coomassie Brilliant Blue R-250 in der Lösung Methanol:Wasser:Essigsäure (45:45:10) gefärbt wurde, und entfärben Sie es mit einer Lösung ohne Coomassie Methanol:Wasser:Essigsäure (45:45:10).
    11. Poolen Sie die ungenutzten Fraktionen und dialysieren Sie die gepoolten Fraktionen mit einer 10K-Dialysekassette von 10 kDa MWCO.
    12. Bewerten Sie die Qualität der dialysierten Fraktion auf einem 12%igen SDS-PAGE-Gel und quantifizieren Sie die Proteinkonzentration.
      HINWEIS: In der SPR-Analyse wurde das Apo-RBP4-Protein verwendet. Zur Erzeugung von Holo-RBP4 (RBP4-Retinol) siehe detaillierte Protokolle, die an anderer Stelle veröffentlicht wurden36,37.
  2. Erste Validierung von RBPR2- und STRA6-Peptiden mit RBP4 für Struktur und Interaktion mittels Tryptophan-Fluoreszenzassay und Zirkulardichroismus (CD)-Spektroskopie
    1. Tryptophan-Fluoreszenz-Assay
      1. Verwenden Sie das Online-Tool zur Analyse der Proteinzusammensetzung (https://web.expasy.org/protparam/) und fügen Sie die Aminosäuresequenz in einen Ein-Buchstaben-Code ein, um die strukturelle Zusammensetzung des rekombinanten RBP4-Proteins und der einzelnen Peptide von RBPR2 und STRA6 zu beurteilen und die Tryptophan-Aminosäurereste in den einzelnen Peptiden und Proteinen zu bestimmen (Materialtabelle).
      2. Klicken Sie auf die Schaltfläche Parameter berechnen und bewerten Sie die Aminosäurezusammensetzung für Tryptophan (Trp)-Reste.
        HINWEIS: Tryptophan-Rückstände müssen in den einzelnen Peptiden oder Proteinen, die analysiert werden, vorhanden sein.
      3. Verdünnen Sie die einzelnen RBPR2- und STRA6-Peptide in verschiedenen mikromolaren Konzentrationen und inkubieren Sie einzeln mit 3 μg msRBP4 in einer 96-Well-Platte bei Raumtemperatur für 5 min. Regen Sie die Mischung bei 290 nm an und scannen Sie die Emission von 300 nm bis 400 nm Wellenlänge.
      4. Normalisieren Sie die Daten mit der Bedingung Blank (nur Puffer, kein Peptid und kein Protein) und der Peptidkontrollbedingung (kein Protein) und plotten Sie.
        HINWEIS: Das Inkrement der Tryptophan-Fluoreszenz bei Exposition gegenüber einer niedrigen bis hohen Peptidkonzentration deutet auf eine positive Wechselwirkung zwischen den beiden einzelnen Peptiden und dem RBP4-Protein hin.
    2. Zirkulardichroismus-Spektroskopie (CD)
      1. Verdünnen Sie die einzelnen Peptide und das rekombinante RBP4-Protein in 1x PBS-Puffer, pH 7,0. Verwenden Sie verschiedene Konzentrationen von RBPR2- und STRA6-Peptiden und RBP4-Protein von 0,1 bis 10 μg/ml für eine Qualitätskontrolle, wie unten beschrieben.
      2. Geben Sie einzelne verdünnte Peptide und Proteine in eine 0,1 cm dicke Küvette und messen Sie die CD-Absorption/Elliptizität mit einem CD-Spektralphotometer (195-250 nm). Verwenden Sie die folgende Formel, um die mittlere Restelliptizität (θ) zu berechnen.
        [v] = (S × mRw)/(10cl)
        S steht für das CD-Signal in mθ; mRw steht für die mittlere Restmasse; c steht für die Konzentration des Proteins in mg/ml; und l steht für die Weglänge in cm.
      3. Berechnen Sie die prozentuale Änderung der Molekülstruktur mit der BeStSel-Sekundärstrukturanalyse zur Proteinfaltungsvorhersage durch CD-Spektroskopie (https://bestsel.elte.hu).
        HINWEIS: Die Sekundärstruktur zeigt die richtige Faltung und die konservierten Bestätigungen an, die für die Interaktionsstudie und das Ergebnis der Wechselwirkungen entscheidend sind. Überprüfen Sie die vorhergesagte Struktur der Domäne und fahren Sie mit der Interaktionsstudie fort.

2. SPR-Analyse zur Bestimmung der Bindungsaffinitäten und kinetischen Parameter von Vitamin-A-Membranrezeptoren (RBPR2 und STRA6) mit ihrem physiologischen Liganden RBP4

  1. Für die Immobilisierung von RBP4 auf der CM5-Chipoberfläche verwenden wir den SPR-Sensorchip, der einen auf eine Größe von ~100 nm erweiterten Carboxymethyldextran-Linker trägt, der kovalent an eine Goldoberfläche gebunden ist. In Gegenwart von 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (EDC) wandelt N-Hydroxysuccinimid (NHS) die Carboxylgruppen auf der Chipoberfläche in N-Hydroxysuccinimidester um, die spontan mit den Amingruppen von Aminosäuren und Proteinen reagieren und den Liganden zwingen, sich kovalent an die Chipoberfläche zu binden (Table of Materials).
    1. Immobilisieren Sie das gereinigte msRBP4-Protein auf dem Sensorchip (Abbildung 1 und Abbildung 2). Wählen Sie im Menü Ausführen der Software den Assistenten und fahren Sie mit der Option Immobilisierung fort. Der Ligand (msRBP4-Protein aus Schritt 1.1) wird in Immobilisierungspuffer (10 mM Natriumacetatpuffer, pH 5,0) auf 10 μg/ml (4 μl Ligand + 396 μl Puffer) verdünnt und die Kupplungsreagenzien in Fläschchen aliquotiert. Öffnen Sie das Fenster des Immobilisierungs-Setup-Assistenten in der Softwaresteuerung, wählen Sie CM5-Chip und dann die Option Immobilisierung der Flusszelle 2 und den Zielwert von 1.200 Response Unit (RU) für das Erreichen einer Rmax von 30 RU in der kinetischen Studie und Waschlösung: Ethanolamin. Geben Sie den Namen RBP4 ein und klicken Sie auf Weiter.
      HINWEIS: Optional: Das Dialogfeld "Systemvorbereitungen " für die Option "Vor dem Lauf anfüllen " ist nicht erforderlich, wenn zuvor eine Grundierung mit dem Laufpuffer PBST (phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit einer 0,05 %igen Tween-20-Detergenzienlösung) durchgeführt wurde.
    2. Klicken Sie im Dialogfeld Rack-Position auf Rack auswerfen. Nehmen Sie das Gestell und platzieren Sie die Fläschchen mit den für jedes Reagenz zugewiesenen Volumina: 156 μl msRBP4, 177 μl Ethanolamin, 89 μl EDC, 89 μl NHS und ein leeres Fläschchen. Setzen Sie das Rack mit den Probenfläschchen ein und klicken Sie auf OK und Weiter.
    3. Klicken Sie im Dialogfeld "Prepare Run Protocol " auf "Start and Save".
  2. Aufbau des kinetischen Assays für RBPR2- und STRA6-Peptide
    1. Verdünnen Sie die Maus-Peptide RBPR2, die mutierte RBPR2 und die STRA6-Peptide (chemisch zuvor31 synthetisiert und in der Materialtabelle aufgeführt) in Laufpuffer in einem Bereich von 0,8-26,6 μM.
    2. Öffnen Sie die Steuerungssoftware und wählen Sie Kinetik/Affinitäts-Assistent. Klicken Sie auf Datei | Öffnen Sie die Vorlage , und wählen Sie Kinetik/Affinität aus. Geben Sie den Flusspfad 2-1 des Dialogfelds für die Einspritzsequenz ein (Durchflusszelle 2 als aktiv und Flusszelle 1 als Referenz), überprüfen Sie den Chiptyp CM5 und klicken Sie auf Weiter. Aktivieren Sie im Setup-Dialogfeld die Option Startzyklen ausführen, geben Sie Lösung: Puffer und Zyklen: ein und klicken Sie auf Weiter.
    3. Geben Sie im Dialog für die Injektionsparameter die Werte für die Probenparameter ein: Kontaktzeit: 120 s, Durchflussrate 30 μL/min, Dissoziationszeit 300 s; für Regenerationsparameter : Geben Sie den Namen der Regenerationslösung ein: Glycin-HCl (pH 2,5), Kontaktzeit: 30 s, Durchflussrate: 30 μL/min und klicken Sie auf Weiter.
    4. Geben Sie im Dialogfeld "Proben" den Namen der Peptide, das Molekulargewicht und die Konzentrationen ein und klicken Sie auf "Weiter". Weisen Sie im Dialogfeld "Rack-Position" die verdünnten Peptide als einzelne ~120 μl Proben mit unterschiedlichen Konzentrationen von 1 bis 100 μM und ~230 μl Puffer, ~120 μl Puffer und ~1.000 μl Glycin, pH 2,5, den Positionen auf dem Rack zu. Klicken Sie auf Gestell auswerfen und setzen Sie alle Fläschchen ein. Klicken Sie auf Weiter, und klicken Sie im Dialogfeld Ausführungsprotokoll vorbereiten auf Start, geben Sie einen Dateinamen ein, und speichern Sie (Abbildung 2).
    5. Klicken Sie in der Software auf das Startmenü und wählen Sie Evaluierung. Wählen Sie Öffnen Sie die Datei in der Software und wählen Sie aus dem Dropdown-Auswahlmenü Fc2-1, um das Reference cell Blank-subtrahierte aktive Sensorgramm für die Assoziations- und Dissoziationsphasen der msRBP4- und mutierten msRBPR2- und msSTRA6-Peptide zu analysieren.
    6. Klicken Sie auf die Dropdown-Schaltfläche Kinetik/Affinität und wählen Sie Oberflächengebunden; Um das Dialogfeld Kurven auswählen zu öffnen, aktivieren Sie Spalte in der Tabelle einschließen und klicken Sie auf Weiter. Dialogfeld "Daten auswählen", um leere, subtrahierte Sensorgramme anzuzeigen. Klicken Sie auf Kinetik und Affinität, behalten Sie die Standardparameter bei, und klicken Sie auf die Option "Anpassen " für die Kurvenanpassung. Überprüfen Sie die Registerkarte Bericht auf die Gleichgewichtsdissoziationskonstante Kd und Ka oder Kbei der Assoziationsrate und Kd oder Kbei der Dissoziationsrate. Speichern Sie das Kinetics-Datensensorgramm in .txt tabulatorgetrennten Format, und verwenden Sie die Werte zum Plotten von Diagrammen (Abbildung 3).
    7. Um die Affinitätskinetikkonstante Kd (Ligandenkonzentration, die im Gleichgewicht an die Hälfte der Rezeptoren bindet) zu bestimmen, kopieren Sie die Datenspalten und fügen Sie sie in die Datei im .txt Format ein, die aus dem in der Software verwendeten Diagramm "Auswertung bis XY" generiert wurde. Klicken Sie auf Analysieren und nichtlineare Regression (Kurvenanpassung), überprüfen Sie die Datenspalte, und klicken Sie auf OK. Klicken Sie im Parameterdialogfeld auf Bindungssättigung und Ein Standort Spezifisches Bindungsanpassungsmodell mit der Formel:
      Y= (Bmax*X)/(Kd + X)
      Dabei ist Bmax die maximale Anzahl von Bindungsstellen (Response Unit), X die Konzentration der Peptide und Y die Bindung (Response Unit) (Abbildung 3).

3. Spektrophotometrie-Methode zur Quantifizierung des GPCR-11-cis-Netzhautproteinkomplexes (Retinylidenprotein Rhodopsin) in Netzhautlysaten

  1. Transportieren Sie die vorgegebene Gruppe von Mäusen, bestehend aus adulten WT-C57BL/6J-Mäusen, in die Dunkelkammer.
  2. Passen Sie die Mäuse über Nacht für 12-16 Stunden dunkel an und setzen Sie die Maus bei rotem Licht in eine Euthanasiekammer und öffnen Sie das CO2 -Gasventil am Regler auf 5 L/min für ~5 min. Sorgen Sie für den Tod, indem Sie Druck auf den Hals und den nach hinten gezogenen Schwanz ausüben (Zervixluxation).
  3. Entkernen Sie die Augenkugeln und homogenisieren Sie die Augen in einem eiskalten Puffer, der 20 mM Bis-Tris-Propan (1,3-Bis(hydroxymethyl)methylamino)propan; BTP) pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA und mit Proteaseinhibitor (Materialtabelle).
  4. Das Homogenat wird 15 min lang bei 16000 x g bei 4 °C zentrifugiert, der Überstand mit wasserlöslichen zytosolischen Proteinen wird verworfen. Die pelletierte Membran und die Membranproteine werden in einem Puffer mit 20 mM n-Dodecyl-β-d-Maltosid (DDM), 20 mM Bis-Tris-Propan (BTP), pH 7,4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA und mit Proteaseinhibitor für 1 h bei 4 °C auf einer rotierenden Plattform resuspendiert und gelöst.
  5. Die resolubilisierte Membranfraktion wird 1 h lang bei 16000 x g, 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird mit 30 μl Rho 1D4-Antikörperkügelchen gemischt und 1 h bei 4 °C auf einer rotierenden Plattform inkubiert.
  6. Trennen Sie den Pulldown mit einem Magnetständer mit Kügelchen, entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die Kügelchen mit Puffer 20 mM Bis-Tris-Propan (BTP) pH 7,4, 500 mM NaCl und 2 mM DDM.
  7. Eluieren Sie das Rhodopsin-Protein, indem Sie es 5-10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit einem Puffer von 20 mM Bis-Tris-Propan (BTP), pH 7,4, 100 mM NaCl, 2 mM DDM mit 0,2 mg/mL 1D4-Peptid (-TETSQVAPA) inkubieren (Abbildung 4 und Abbildung 5).
  8. Analysieren Sie die Eluierung auf Absorption von 200 nm bis 800 nm mit einer rechteckigen Submikro-Quarzküvette mit 2 mm Öffnung, 10 mm Weglänge, 50 μl in einer schnellen Scan-Einstellung mit einem Spektralphotometer.
    HINWEIS: Verwenden Sie nur hochwertige Quarzküvetten (Abbildung 4).
  9. Um die Qualität zu validieren und zu bestimmen, überprüfen und belichten Sie die Elue 1 Minute lang mit hellem Licht, dann wiederholen Sie Schritt 3.8.
  10. Subtrahieren Sie die Blank-Extinktion und berechnen Sie das Verhältnis der analysierten Absorptionsspektren zur Absorption bei 500 nm für 11-cis-retinales Opsin, 380 nm für lichtexponiertes all-trans-retinales gebundenes Opsin und 280 nm für ligandenfreies Apo-Opsin-Protein (Abbildung 6). Das freie Opsin ohne Liganden retinal ergibt eine Basisabsorption bei 500 nm.
  11. Um die Rhodopsinkonzentration zu quantifizieren, verwenden Sie das Beer-Lambertsche Gesetz:
    A=ε· C·l oder C=A/ε·l
    Dabei ist A die Absorption ε molaren Extinktionskoeffizienten (Rhodopsin ε500 = 40.600 M−1 cm−1 für freies Apo Opsin ε280 = 81.200 M−1 cm−1), C ist die Konzentration und l Weglänge.
  12. Für die Quantifizierung von ligandiertem Opsin in Prozent wird ein Verhältnis von A280/A500 verwendet.
  13. Plotten Sie die Blank-subtrahierten Absorptionsspektren und berechnen Sie den freien Opsinwert32.
  14. Berechnen Sie die Konzentration von Rhodopsin mit dem Extinktionskoeffizienten ε500 = 40600 M-1 cm-1. Die Konzentration von ligandenfreiem Opsin wird nach dem Beer-Lambert-Gesetz unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten ε280 = 81.200 M-1 cm-1 berechnet.

Ergebnisse

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Es werden quantitative Methoden beschrieben, um Protein-Liganden-Wechselwirkungen von Vitamin-A-Membranrezeptoren und Photorezeptor-Opsin mit ihren jeweiligen physiologischen Liganden zu untersuchen. Die rekombinante Maus RBP4 sollte in E. coli exprimiert und das gereinigte Protein als konjugierter Ligand auf einem SPR-Chip verwendet werden. Das chemisch synthetisierte RBPR2, STRA6 und die Mutante S294A RBPR2 "SYL motif RBP4 interacting extracellular site" eines ~40 Aminosäuren Peptids wird als Analyt in verschiedenen Konzentrationen verwendet, um die Kinetik der Bindung und die Gleichgewichtssättigung Kd der Wechselwirkung zu messen (Abbildung 1 und Abbildung 2).

Das rekombinante RBP4-Protein als Ligand für RBPR2 und STRA6 zeigte eine Bindungsaffinität zu den interagierenden Stellen in diesen Peptiden, gemessen bei Kd ~22,38 μM bzw. ~26,73 μM. Das Aminosäuremotiv "SYL" spielt eine wesentliche Rolle bei der Stabilisierung dieser Wechselwirkungen sowohl in RBPR2 als auch in STRA6, und wie vorhergesagt, hatte das mutierte Peptid S294A einen erhöhten Kd von ~114,9 μM, was auf eine erhöhte Kopienzahl des mutierten RBPR2-Peptidbedarfs zum Erreichen der Bindungssättigung hindeutet (Abbildung 3). Die Retinolaufnahme im Auge über STRA6 und die Umwandlung in verschiedene Retinoide bis hin zur endgültigen Umwandlung von 11-cis-Retinal als Chromophor mit Bindung an den Lysin-296-Rest von Rhodopsin bildet einen funktionsfähigen Rezeptor für die Photonenwahrnehmung und das Sehen. Die kovalente Bindung von 11-cis retinal an das Protein Opsin zu Rhodopsin weist bestimmte charakteristische Absorptionsmerkmale auf. Die Proteinabsorption erfolgt bei 280 nm und die Absorption von freiem Retinol bei ~325 nm. Das Holo-Opsin mit 11-cis-Retinal- oder Rhodopsin-Absorption tritt jedoch bei einer Wellenlänge von 500 nm auf.

Jeder Defekt in dieser Komplexbildung aufgrund des geringen systemischen Retinols oder eines Defekts in der Retinolaufnahme durch eine Mutation in RBPR2 oder STRA6 führt zur Akkumulation von freiem Opsin oder Apoprotein-Opsin ohne Chromophor 11-cis Retinal, wodurch sich die charakteristische Absorption bei 500 nm zu einer niedrigen Absorption verschiebt. Durch Quantifizierung der Extinktion und unter Verwendung des Verhältnisses von Extinktion 280 nm und 500 nm Wellenlänge ist es möglich, die ligandierten Opsine oder Rhodopsin abzuschätzen. Durch eine kurze Lichteinwirkung ist es möglich, die Photoisomerisierung der 11-cis-retinalen Opsin-Absorption bei 500 nm mit der all-trans-retinal-gebundenen Opsin-Absorption (Meta II Rhodopsin) bei 380 nm zu überprüfen (Abbildung 4, Abbildung 5 und Abbildung 6). In einem Versuchsaufbau ist die Wahrscheinlichkeit von Artefakten und Verunreinigungen hoch; Die beiden Hauptursachen für die gefundenen Artefakte sind unbeabsichtigte Lichteinwirkung durch die Instrumente und niedrig konzentrierte Salzwäsche, bei der es nicht gelingt, Schadstoffmoleküle aus dem RPE oder der Linse zu entfernen (Abbildung 7).

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Abbildung 1: Arbeitsbereich der Oberflächenplasmonenresonanz. Benötigte Materialien und Überblick über die SPR-Instrumentierung. (A) SPR-Chip-Laderampe. (A') CM5-Chip mit carboxymethyliertem Dextran kovalent gebundener Goldoberfläche für die Immobilisierung über -NH2-, -SH-, -CHO-, -OH- oder -COOH-Gruppen. (B) Roboter-Injektorgestell für die Probenbeladung. (B') Gummikappen Typ 3. (B'') 7-mm-Kunststofffläschchen für Probenaliquoten. (C,D) Ausgleichs-/Betriebspufferbehälter und Abfallsammelbehälter. (E) Bedienfeld der Biacore-Software. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Schematischer Überblick über die Oberflächenplasmonenresonanz und die Schritte der Sensorgrammerfassung. Schritt 1: Die CM5-Chip-Oberfläche immobilisiert mit dem RBP4-Protein mit einem Ziel von 1.200 Reaktionseinheiten. Schritt 2: Verschiedene Konzentrationen von RBPR2-Peptiden werden als Analyten ausgeführt, und diese biomolekulare Wechselwirkung verändert die Elektronenladungsdichte auf der Goldchip-Oberfläche, was zu einer Änderung/Verringerung der Lichtreflexion bei einem bestimmten Winkel oder einem Resonanzwinkel führt. Schritt 3: Das Waschen kehrt das Phänomen des Oberflächenplasmons um, was zur Umkehrung der Reflexionsintensität und zum Abfall des Sensorgramms auf die Basislinie führt. Die Kinetik dieser Wechselwirkungen wurde weiter verwendet, um die Assoziationsdissoziationskonstanten und die Stärke der Wechselwirkungen zu bestimmen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Oberflächenplasmonenresonanz-Bindungsstudien von einzelnen Vitamin-A-Rezeptor-Bindungsdomänenpeptiden mit ihrem physiologischen Liganden RBP4. (A) Die Software-Eingabeaufforderung, die die erreichte Immobilisierung von RBP4 auf der CM5-Chip-Oberfläche zeigt. (B,C,D) Sensogramme von Peptid-Liganden-Wechselwirkungen RBPR2-RBP4, STRA6-RBP4 und mutiertem S294A RBPR2-RBP4 in verschiedenen Konzentrationen. (B',C',D') Bindungskinetik und Gleichgewichtsbestimmung Kd , die die Differenz und Dichtheit des Bindungsmusters zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Arbeitsbereich der Opsin-11-cis-Netzhautabsorption und Überblick über die Instrumentierung. (A) Gekühlte Tischzentrifuge, alle LED-Anzeigen mit rotem Klebeband abgedeckt; (B) Spektralphotometer für den sichtbaren UV-Bereich, d. h. eine LED-Anzeige, die mit rotem Klebeband bedeckt ist; (B') Rechteckige Ultramikrozelle, Quarzküvette und magnetischer Ständer. (C) Anwendungssoftware scannen; (D) Deckel des Spektralphotometerfachs geöffnet, Küvettenhalter für die Analyse und Fachdeckel geschlossen. (E) Einrichtung mit ausgeschaltetem Licht und ausgeschaltetem Monitor für die Probenvorbereitung unter einer einzigen Rotlichtquelle. (F) Gekühlter Rotator für die Probenvorbereitung und Solubilisierung. (G) Licht-AUS-Setup mit eingeschaltetem Monitor für die Messung der Probenabsorption. (H) Analyse der Absorption im XY-Plot. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Überblick über den Arbeitsablauf der retinalen Absorptionsmethode von Opsin-11-cis. Schritt 1: Netzhäute von dunkeladaptierten Mäusen unter einer einzigen Rotlichtquelle werden isoliert, homogenisiert und solubilisiert, um Netzhautmembranfraktionen zu erhalten. Schritte 2-4: In einer Abfolge von Zentrifugationen wird das Pellet in Abwesenheit von Reinigungsmittel und in Gegenwart von DDM-Reinigungsmittelpuffer gelöst. Schritte 5-6: Das solubilisierte Pellet enthält retinale Photorezeptoren und andere Membranproteine, die für den Abbau und die Reinigung von Antikörpern bereit sind. Schritt 7: Das eluierte Opsin mit VAPA 1D4-Peptid ist bereit für die Absorptionsanalyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 6: Rhodopsin-Absorptionsspektren. (A) Dunkel adaptierter Retina-Extrakt von Mäusen unter Verwendung von 1D4-gereinigtem Rhodopsin mit einer maximalen Extinktion von 500 nm und (B) lichtexponierter Retina-Extrakt mit 1D4-gereinigtem Rhodopsin mit einer maximalen Extinktion von 380 nm. (C) Western Blot unter Verwendung von 1D4-Rhodopsin-Antikörpern, die die Qualität der Rhodopsin-Aufreinigung und Größenverteilung zeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 7: Artefakt der Rhodopsin-Absorptionsspektren. (A) Das Artefakt in den Absorptionsspektren von dunkeladaptiertem Augenextrakt ist mit dem Absorptionspeak bei 380 nm dargestellt; Die unbeabsichtigte Lichteinwirkung durch die LED-Indikatoren des Instruments oder das Versagen des Lichtblockers für die Dunkelkammertür führt zum Ausbleichen des Rhodopsinproteins. (B) Unzureichende Waschungen mit hohem Salzpuffergehalt führen zu einer Anreicherung von Verunreinigungen aus RPE, Linsen oder anderen Quellen aus Augenextrakten, was zu einer hohen Absorptionsspektrumausbreitung und Artefakten führt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 8: Schematische Darstellung der Wechselwirkungen zwischen Vitamin-A-Membranrezeptoren (RBPR2 und STRA6) und dem Opsin-Protein mit ihren jeweiligen Liganden (RBP4 und 11-cis retinal), die für die Bildung des Retinyliden-Proteins in Photorezeptoren für die Sehfunktion entscheidend sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung S1: Intrinsische Tryptophan-Fluoreszenzintensitäten. Vorläufiger Nachweis der Wechselwirkung und Änderung der Orientierungen von intrinsischen Tryptophanresten von RBP4 bei Wechselwirkung mit verschiedenen Konzentrationen von RBPR2- und STRA6-Peptiden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S2: RBPR2- und RBP4-Protein-Protein-Docking und -Interaktion. Grenzflächenreste werden in PyMOL visualisiert und die Orientierung von RBPR2 in der Membran wird mit dem Server-Tool https://opm.phar.umich.edu/ visualisiert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S3: Pipeline für die In-silico-Analyse der Protein-Protein-Docking-Wechselwirkung und möglicher Kontaktstellen. Die Analysepipeline veranschaulicht die Abfolge der Ausführung des Python-Skripts und der Verwendung der PyMOL-Befehlszeile von Schritt 1 bis 6, um die Zuverlässigkeit des Abrufens der Interaktionsorte sicherzustellen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S4: Sekundärstrukturanalyse der CD-Spektroskopie, die die Zusammensetzung der Peptide RBP4, RBPR2 und STRA6 zeigt. Das Tortendiagramm zeigt die Anteile der im Molekül vorhandenen Sekundärstrukturen. Mit dem BeStSel Secondary Structure Tool wurde die Vorhersage der Proteinfaltung durch Zirkulardichroismusspektroskopie (https://bestsel.elte.hu) analysiert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kritische Schritte im Protokoll
SPR-Methodik
In-silico-Modellierung und Docking-Analyse: Die vorhergesagte Struktur von RBPR2 (https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/Q9DBN1) und STRA6 sowie die bekannte Struktur für die msRBP4 PDB-Datenbank (RSCB PDB ID: 2wqa) sollten für die Docking-Studieverwendet werden 29,31. Zusätzlich sollten in vitro Methoden (Zellkultur) verwendet werden, um die Interaktion der mutmaßlichen Bindungsstellen an Vitamin-A-Rezeptoren (RBPR2 und STRA6) mit seinem Liganden (RBP4) zu bestätigen29,31 (Ergänzende Abbildung S1, Ergänzende Abbildung S2 und Ergänzende Abbildung S3). Bestimmen Sie die Qualität von Peptiden mit Hilfe der CD-Spektroskopie. Zuvor wurden für das Fern-UV-CD-Spektrum 1 mm rechteckige Zellen mit 0,1 μg/μl ~200 μl (3-4 μg RBP4-Protein, 32 μM RBPR2 und 32 μM STRA6-Peptide) verwendet31 (Ergänzende Abbildung S4). Der Stickstoffgasstrom sollte genutzt werden, um die Bildung schädlicher Ozon unter Emissions-Xenonlampen zu verhindern und die Hintergrundabsorption bei 200-300 nm zu verringern. Mit dem Standardparameter wurde das Spektrum von 185 nm bis 300 nm gemessen. Die Grundlinie sollte durch Subtraktion mit dem Blank korrigiert werden. Der Gehalt an Alpha-Helix und Beta-Faltblatt wird auf der Grundlage der Eigenschaft der Absorption berechnet, wie z. B. die negativen Peaks der Alpha-Helix bei 222 nm.

Analysieren Sie die RBPR2- und STRA6-Proteine und topologischen Domänendaten in der Datenbank (https://www.uniprot.org), bestätigen Sie die bisher bekannten möglichen Interaktionsstellen aus extrazellulären Regionen und verwenden Sie die Sequenz ~40-50 Aminosäuren, um die Peptide chemisch zu synthetisieren. Die Studie benötigt für die Untersuchung von Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen ein gereinigtes rekombinantes Maus-RBP4 (msRBP4)-Protein und chemisch synthetisierte RBPR2- und STRA6-Peptide, die die vorgeschlagenen RBP4-Bindungsreste umfassen 18,19,29,31. Vor der Shortlist der Peptide muss die extrazelluläre Peptidsequenz der interagierenden Vitamin-A-Rezeptorproteine mittels In-silico-Analyse (computerbasiertes Protein-Liganden-Docking) bestimmt werden31. Der SPR-Assay wird durchgeführt, um die Kinetik von Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen zu verstehen. Es ist von entscheidender Bedeutung, die vorhergesagten Interaktionsorte durch computergestützte In-silico-Assays oder durch In-vitro-Analysen zu kennen. In dieser Studie verweist das designte Peptid auf die extrazelluläre Region der Membranproteine RBPR2 und STRA6, von denen bekannt ist, dass sie mit RBP4 interagieren. Um genaue Ergebnisse zu gewährleisten und potenzielle Artefakte und negative SPR-Sensorgramme zu vermeiden, ist es entscheidend, die Puffer, Peptidkonzentrationen und die Löslichkeit zu standardisieren. Für Rhodopsin-Absorptionsstudien erfordert die Isolierung von retinalem Lysat strenge Dunkelbedingungen und Waschschritte, um Artefakte und unerwünschte Absorptionsspitzen zu vermeiden (Abbildung 7).

Um die Bedeutung des SYL-Motivs auf Vitamin-A-Transporter bei der Bindung von RBP4, RBPR2, STRA6 und einer Mutante S294A-RBPR2 zu verstehen, wurden Peptide31 chemisch synthetisiert, indem eine Kondensationsreaktion der Carboxyl- und Aminogruppen zwischen zwei Aminosäuren durchgeführt wurde. Das Protokoll folgte der präzisen schrittweisen Zugabe von sequenziellen Aminosäuren zum Verankerungsharz. Der Prozess der Aminosäuresynthese erfährt chemische Modifikationen des Schutzes und der Entschützung der Aminosäureeinheit des N-Terminus, wodurch die Synthese und die Bildung von Peptidpolymeren ermöglicht werden. Nach Fertigstellung wird das Peptid aus dem Harz gewonnen und gereinigt. Die anfängliche Validierung der Wechselwirkungen zwischen RBP4-Protein und Vitamin-A-Rezeptorpeptiden sollte mit einem internen Tryptophan-Fluoreszenz-Assay bestätigt und mit einem CD-Spektrometer überprüft werden (Ergänzende Abbildung S1). Die anfängliche Interaktionsqualität des rekombinanten RBP4-Proteins mit Maus-STRA6 (msSTRA6), Maus-RBPR2 (msRBPR2) und Kontrollpeptiden sollte mit Hilfe eines intrinsischen Tryptophan-Fluoreszenz-Assays bestätigt werden (ergänzende Abbildung S1). Der intrinsische Tryptophan-Fluoreszenz-Assay ist ein kritisches experimentelles Verfahren zur Beurteilung des Quenchings oder der Verstärkung von Tryptophan-Aminosäureresten in Proteinen für die Fluoreszenz nach Bindung des Rezeptors und des Liganden. Die gemessene Fluoreszenz ist ein direkter Hinweis auf die Veränderung der lokalen Umgebung als Folge der Wechselwirkung.

Modifikationen und Fehlerbehebung der Methoden
Optimieren Sie die SPR mit Laufpuffern: 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (Tween 20) oder 1x HEPES (P20). Um Ausfällungen zu vermeiden, sollten die verdünnten Peptide vor der Verwendung zentrifugiert und filtriert werden. Standardisierung der Rhodopsin-Absorption mit verschiedenen Puffern mit hohem Salzgehalt (300-500 mM NaCl). Um die Rhodopsin-Absorptionsspitzen im Dunkeln bei 500 nm zu bestätigen, setzen Sie die Proben 30 s lang Licht aus und wiederholen Sie die Messung, um die Qualität durch die Verschiebung des Absorptionspeaks auf 380 nm und die Wirksamkeit des Pulldowns sicherzustellen.

Grenzen der Methoden
SPR kann spezifische Informationen über die Interaktion zweier Proteine liefern; Wenn die Interaktion jedoch eine dritte unbekannte Komponente erfordert, können die Daten komplex zu verstehen sein. Die Änderung der Konformation des Moleküls bleibt in der Wechselwirkung unerkannt. Da das RBP4-Protein in Abwesenheit von Retinol (Apo-RBP4) hergestellt wird, wird die Bindung von Apo-RBP4 an seine Rezeptoren gemessen. Daher kann Retinol-beladenes RBP4 (Holo-RBP4) im Vergleich zu apo-RBP4 eine veränderte Affinität zu den RBPR2- und STRA6-Rezeptoren aufweisen35,36. Interessanterweise wurden die Affinitäten für Apo- und Holo-RBP4 für STRA6 zuvor sowohl im mikromolaren Bereich gezeigt, als auch im mikromolaren Bereich, und es wurde kein statistischer Unterschied zwischen den Bindungen von Apo- und Holo-RBP4 an den STRA6-Rezeptorbeobachtet 35. Die Rhodopsin-Absorptionsmethode kann das Vorhandensein von unligandiertem Opsin (Apoprotein-Opsin) im Auge identifizieren, aber nicht den ursächlichen Mechanismus.

Rhodopsin-Absorptionsspektren
KRITISCHER PRÜFPUNKT: Die Photoisomerisierung von 11-cis-Retinal zu all-trans-Retinal ist hochsensitiv und augenblicklich32. Die Quantifizierung von Rhodopsin (Holo-Opsin) sollte unter strengen Dunkelbedingungen durchgeführt werden, um den korrekten Opsin- und 11-cis-Retinalgehalt im Dunkeln (500 nm) oder unter lichtadaptierten Bedingungen als Meta II Rhodopsin (380 nm) zu messen32. Mäuse sollten daher in einem dunklen Raum für 12-16 Stunden dunkel angepasst werden, um ungebleichtes Rhodopsin32 zu messen. Zu diesem Zweck sollte die Dunkelkammer komplett dunkel sein, wobei die Eingangstür mit Verdunkelungstuch bedeckt und externe LED-Lichtquellen an allen Geräten mit rotem Klebeband bedeckt sind. Decken Sie den Laptop-Bildschirm mit einer roten Plastikfolie ab und halten Sie ihn geschlossen, bis er benötigt wird. Eine Rotlichtquelle ist ebenfalls erforderlich.

KRITISCHER SCHRITT: Standardisieren Sie die Waschschritte bei verschiedenen hohen Salzkonzentrationen, um Linsen- oder RPE-Proteine oder Molekülverunreinigungen zu entfernen, die eine Wellenlängenabsorption von 300 bis 500 nm aufweisen und möglicherweise die Messung der Opsinabsorption beeinträchtigen könnten.

Bedeutung der Methoden im Vergleich zu bestehenden/alternativen Methoden
Es gibt keinen praktikablen Ansatz, um die systemische Retinoidverwertung, die Beiträge mehrerer Gewebe und den Einfluss von Mutationen in Retinol-bindenden Proteinrezeptoren auf die Retinol-Verteilungsmechanismen zu untersuchen. Dieses Protokoll verwendet zwei wesentliche Techniken, um die fehlenden Verbindungen beim Retinolmangel in Photorezeptoren mit Apo-Opsin und der Nutzung der Retinoidspeicherung in der Leber über RBPR2-RBP4-Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen zu verstehen und zu füllen (Abbildung 3, Abbildung 6 und Abbildung 8).

Bedeutung und Einsatzmöglichkeiten der Methode in spezifischen Forschungsbereichen
SPR- und absorptionsbasierte Rhodopsinspektroskopie-Assays bieten eine aussagekräftige Strategie zur Untersuchung systemischer und okulärer Vitamin-A-Homöostase-Mechanismen für die Bildung des Retinyliden-Proteins (Rhodopsin). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Techniken und experimentellen Ansätze die Kinetik des Membranrezeptor-abhängigen Transports von diätetischen Retinoiden durch die Leber und ins Auge aufklären können, was die Bildung von Rhodopsin erleichtert (Abbildung 8). Sie helfen auch dabei, die Mechanismen und okulären Folgen von Mutationen in Vitamin-A-Rezeptoren und Opsin-Proteinen zu verstehen, insbesondere bei der Bindung an ihre jeweiligen Liganden. Diese Wechselwirkungen können die Bildung des Retanyliden-Proteins beeinflussen, das für die Sehfunktion entscheidend ist.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht. Die Geldgeber spielten keine Rolle bei der Konzeption der Studie; bei der Erhebung, Analyse oder Interpretation von Daten; beim Verfassen des Manuskripts oder bei der Entscheidung, die Ergebnisse zu veröffentlichen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren danken Dr. Beata Jastrzebska, Ph.D. (Department of Pharmacology, Case Western Reserve University, OH) für ihre Ratschläge zum Rhodopsin-Absorptionsprotokoll. Diese Arbeit wurde durch ein NIH-NEI-Stipendium (EY030889 und 3R01EY030889-03S1) und teilweise durch die Startkapitalhilfe der University of Minnesota für G.P.L. unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2-D Quant KitCytiva80648356
Amine Coupling KitCytivaBR100050
Biacore AuswertesoftwareBiacore S200Version 1.1
Biacore Sensor Chip CM5CytivaBR100530
Bis Tris PropanSigmaB6755-25G20 mM
BL21 DE3 kompetente ZellenThermo ScientificEC0114
CD SpektralphotometerJascoJ-815 Spektropolarimeter
Glycin HCLFisher BioreagentsBP381-1
GraphPad Prism Modellanpassung, Datenanalyse
LB-BouillonFisher BioreagenzienBP1426-500
n-Dodecyl-β-d-Maltosid (DDM)EMD Millipore324355-1GM2-20 mM
pET28a His-tag Kanamycin-resistenter ExpressionsvektorAddgene69864-3
Plasmid-AufreinigungskitQiagen27106
Rho1D4 MagBeadsCubeBiotech33299
Slide-A_Lyzer 10K-DialysekassetteThermo Scientific66810
Tween20Fisher BioreagentsBP337-5000,05
UV-vis-SpektralphotometerAgilent Cary 60 UV-Vis
Peptide name<>Peptide sequenceHPLC-purityMass Spec
Maus Rbpr2 (42)HVRDKLDMFEDKLESYLTHM
NETGTLTPIILQVKELISVTKG		92.14%Conforms
Mouse Stra6 (40)SVVPTVQKVRAGINTDVSYL
LAGFGIVLSEDRQEVVELVK		90.84%Entspricht
Maus Rbpr2 Mutante S294A (42)HVRDKLDMFEDKLEAYLTHM
NETGTLTPIILQVKELISVTKG		0.92%Entspricht
%

Referenzen

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Vitamin A RezeptorenRetinol bindendes ProteinOberfl chenplasmonenresonanzLigandenbindungskinetikRhodopsin QuantifizierungPhototransduktionskaskadespektrophotometrische AnalyseRetinoid Hom ostaseOpsin Ligand Interaktion

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