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Methodenartikel

Charakterisierung von Prokoagulanzien-Thrombozyten durch Messung der Phosphatidylserin-Exposition und der Mikrovesikelfreisetzung aus humanen gereinigten Blutplättchen

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DOI:

10.3791/67042

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29. November 2024

 ,  , 
1French Reference Centre for Inherited Platelet Disorders, University Hospital of Bordeaux, 2Department of Haematology, University Hospital of Bordeaux, 3Inserm U1034, Biology of Cardiovascular Disease

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Bildung von prokoagulanzien Blutplättchen wurde mit einem erhöhten Thromboserisiko korreliert. Hier wird ein präzises Protokoll zur Isolierung von gewaschenen Blutplättchen aus menschlichem Blut vorgestellt, das dazu bestimmt ist, die Exposition von Phosphatidylserin und Mikrovesikelfreisetzung zu quantifizieren, die charakteristische Merkmale von Prokoagulanzienthrombozyten sind.

Zusammenfassung

Aktivierte Blutplättchen fördern die Gerinnung vor allem, indem sie das Gerinnungsmittel Phospholipid Phosphatidylserin (PS) auf ihren äußeren Membranoberflächen freilegen und PS-exprimierende Mikrovesikel freisetzen, die die ursprüngliche Membranarchitektur und die zytoplasmatischen Komponenten ihrer Ursprungszellen beibehalten. Die Zugänglichkeit von Phosphatidylserin erleichtert die Bindung der wichtigsten Gerinnungsfaktoren und verstärkt die katalytische Effizienz von Gerinnungsenzymen erheblich, während die Freisetzung von Mikrovesikeln als zentraler Mediator der interzellulären Signalübertragung wirkt. Prokoagulanzien Blutplättchen spielen eine entscheidende Rolle bei der Stabilisierung des Blutgerinnsels während der Blutstillung, und ihr erhöhter Anteil im Blutkreislauf korreliert mit einem erhöhten Thromboserisiko. Es wurde auch gezeigt, dass Thrombozyten-Mikrovesikel reich an Wachstumsfaktoren sind, die die Wundheilung und die Entzündungsmodulation fördern. Die Analyse der Phosphatidylserin-Exposition und der Mikrovesikelfreisetzung mittels Durchflusszytometrie stellt aufgrund ihrer geringen Größe und der begrenzten Anzahl positiver Ereignisse für interessante Marker eine große Herausforderung dar. Trotz erheblicher Fortschritte in den letzten zehn Jahren sind die Methoden zur Bewertung der Phosphatidylserin-Exposition und der Mikrovesikelfreisetzung nach wie vor in Arbeit. Leider gibt es kein allgemeingültiges Protokoll, und es müssen mehrere Faktoren bewertet werden, um die am besten geeignete Methodik für jede spezifische Anwendung zu bestimmen. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von gewaschenen Blutplättchen aus menschlichem Blut, gefolgt von einer Kollagen- und/oder Thrombinaktivierung, um die Exposition von Phosphatidylserin und Mikrovesikel zu messen, die für prokoagulanziöse Blutplättchen charakteristisch sind. Dieses Protokoll soll die anfängliche Präparation von plättchenreichem Plasma und die Isolierung von gewaschenen Blutplättchen erleichtern. Schließlich werden die Exposition gegenüber Phosphatidylserin und die Freisetzung von Mikrovesikeln durch Durchflusszytometrie quantifiziert, was die Identifizierung von Blutplättchen des Gerinnungsgenerators ermöglicht.

Einleitung

Die Bildung von Blutplättchenprokoagulanzien ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Blutstillung 1,2,3. Dieser Prozess beinhaltet die Agonisten-induzierte Expression von Phospholipiden auf der Thrombozytenmembran, die für den Aufbau von Tenase- und Prothrombinase-Komplexen essentiell ist 1,3,4. Nach der Thrombozytenaktivierung werden auch Thrombozyten-Mikrovesikel kontinuierlich freigesetzt 5,6. Mikrovesikel (Durchmesser von 50 nm bis über 1 μm) kapseln sowohl die Membranstruktur als auch die zytoplasmatischen Bestandteile der Ursprungszellenein 7,8. Mikrovesikel sind wichtige Mediatoren der interzellulären Signalübertragung 9,10 und auch Repositorien von Wachstumsfaktoren, die die Wundheilung und die Entzündungsmodulation fördern11,12. Es wurde auch vermutet, dass Mikrovesikel 50- bis 100-mal mehr Prokoagulans sind als aktivierte Blutplättchen13. Jüngste Erkenntnisse deuten darauf hin, dass gespeicherte Blutplättchen aktiviert werden, was zur Produktion von Mikrovesikeln führt - dies hat potenzielle Auswirkungen auf die Praxis der Thrombozytentransfusionstherapie. Die verlängerte Lagerdauer und die erhöhte prokoagulanziöse Aktivität von Mikrovesikeln machen sie zu einem vielversprechenden Ersatz für Blutplättchen in Transfusionsanwendungen14.

Methodische Innovationen wurden vorgenommen, um die Bildung von Blutplättchen-Prokoagulanzien sowohl bei Gesundheits- als auch bei Krankheitszuständen direkt und indirekt zu beurteilen 4,14,15. Die Bewertung der Phosphatidylserin-Exposition und der Mikrovesikelfreisetzung mit gereinigten Blutplättchen hat neue Daten darüber geliefert, wie die Prokoagulanzienreaktion der Blutplättchen bei verschiedenen menschlichen Krankheiten gestört wird 1,4. Dieses wachsende Forschungsfeld eröffnet auch Wege für therapeutische Interventionen 1,4. Die Isolierung und Analyse von gereinigten Blutplättchen aus dem Blut ist jedoch zeitaufwändig, erfordert spezielle Laborgeräte und ist daher derzeit nicht für die klinische Routinediagnostik adaptierbar16,17. Die Analyse der Phosphatidylserin-Exposition und der Mikrovesikelfreisetzung ist aufgrund ihrer geringen Größe und der Anzahl positiver Ereignisse für die interessierenden Marker ebenfalls eine Herausforderung18,19.

Die Durchflusszytometrie, die die fluoreszierende Annexin-V-Bindung nutzt, ist seit ihrer Einführung vor zwei Jahrzehnten ein Eckpfeiler bei der Bewertung der PS-Expression auf Blutplättchen und Mikrovesikeln20. Es hat sich bei der Untersuchung von gerinnungsfördernden Thrombozyten und Mikrovesikeln durchgesetzt21,22. Daher wird hier ein optimiertes Protokoll vorgestellt, das für die Isolierung von gereinigten Blutplättchen aus Blutproben unter Verwendung der von Cazenaves Gruppe23 entwickelten Technik und die anschließende Charakterisierung der Phosphatidylserin-Exposition und der Mikrovesikelfreisetzung durch Durchflusszytometrie nach Thrombozytenaktivierung24 verwendet werden kann. Dieses Protokoll wird weitere Studien und eine eingehende Charakterisierung von Prokoagulanzien-Thrombozyten in klinischen Populationen von Interesse erleichtern.

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Protokoll

Das Protokoll folgt den Richtlinien und wurde von der Ethikkommission für die Humanforschung des Universitätsklinikums Bordeaux genehmigt. Blutproben wurden von gesunden Freiwilligen entnommen, die eine Einverständniserklärung abgegeben hatten, und diese Proben wurden gemäß den institutionellen Protokollen verarbeitet. Spender, die Substanzen eingenommen hatten, die die Thrombozytenfunktion beeinträchtigen könnten, wurden ausgeschlossen, wenn diese Substanzen innerhalb von 10 Tagen vor den Versuchen eingenommen wurden. Gesunde Freiwillige erhielten eine Einwilligungserklärung, um ihr Blut zu entnehmen und ihre Daten zu veröffentlichen. Die Details zu den Reagenzien und den verwendeten Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Blutentnahme und Aufbereitung der gewaschenen Blutplättchen

  1. Sammeln Sie peripheres venöses Blut in Entnahmeröhrchen, die das aktive Antikoagulans Trinatriumcitrat mit Zitronensäure und Dextrose (ACD) enthalten, nachdem Sie die ersten 3 ml verworfen haben.
  2. Nach der Entnahme das Röhrchen vorsichtig umdrehen, um das Blut mit ACD zu mischen, und das Gemisch vor der Zentrifugation 15 Minuten bei Raumtemperatur ruhen lassen.
  3. Zählen Sie die Blutplättchen vor der Zentrifugation mit einem automatisierten Zellzähler, um die richtige Geschwindigkeit für die Zentrifugation zu bestimmen (Tabelle 1). Bereiten Sie plättchenreiches Plasma (PRP) durch Zentrifugation bei 250 x g für 10 Minuten bei Raumtemperatur (RT) vor, ohne die Bremse zu betätigen, um die Thrombozytenrückgewinnung zu optimieren.
    HINWEIS: Bei diesem Schritt entstehen drei Schichten in der Probe: die obere Schicht mit Plasma, Blutplättchen und einem kleinen Teil der weißen Blutkörperchen; eine mittlere Schicht, die mit weißen Blutkörperchen angereichert ist; und eine untere Schicht, die aus roten Blutkörperchen besteht. Übertragen Sie das PRP vorsichtig aus der oberen Schicht in ein neues konisches 50-ml-Röhrchen, um eine Kontamination mit roten und weißen Blutkörperchen zu vermeiden.
  4. Fügen Sie dem PRP 1 ml ACD-A (siehe Tabelle 2) und 6,25 μl Apyrase pro 9 ml hinzu.
    HINWEIS: Apyrase baut in einer Konzentration von 0,02 U/ml Spuren von ATP oder ADP ab, die von den Blutplättchen sezerniert werden, wodurch eine Desensibilisierung der Thrombozyten-ADP-Rezeptoren verhindert und die Thrombozytenform erhaltenbleibt 25. Ein Prostacyclin-PGI2-Inhibitor (0,5 μM) kann auch mit Apyrase aufgenommen werden, um die Thrombozytenaktivierung zu verhindern.
  5. Bereiten Sie das Plättchenpellet durch Zentrifugation bei RT bei 1100 x g für 10 min vor. Aspirieren Sie den Überstand, der Thrombozytenarmes Plasma (PPP) enthält, mit einer schonenden Methode, z. B. einer Pasteurpipette, und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml Waschpuffer (siehe Tabelle 3 und Tabelle 4). Vorsichtig mit einer Pipette homogenisieren und dann weitere 3-4 ml Waschpuffer hinzufügen.
    HINWEIS: Der Kalziumspiegel wird reduziert, um eine Gerinnung mit Gerinnselfaktoren im Plasma zu verhindern. In diesem Stadium wurde das plättchenarme Plasma vollständig entfernt, wodurch die Gerinnselbildung und die Thrombozytenaktivierung durch die Thrombinproduktion verhindert wurden.
  6. Erneut bei RT bei 1100 x g für 10 min zentrifugieren. Den Überstand aspirieren und das Pellet in 1 ml Waschpuffer resuspendieren. Übertragen Sie 150 μl der Thrombozytensuspension in ein 1,5-ml-Röhrchen zur Zellzählung mit einem automatisierten Zellzähler. Suspendieren Sie dann das Pellet mit 3-4 ml Waschpuffer.
  7. Führen Sie eine abschließende Zentrifugation bei 1100 x g für 10 min (bei RT) durch. Der Überstand wird aspiriert und das Thrombozytenpellet in einem Volumen Reaktionspuffer (siehe Tabelle 5 und Tabelle 6) resuspendiert, um eine Endkonzentration von 5 x 1011 Thrombozyten/l zu erreichen.
  8. Lassen Sie die gewaschenen Blutplättchen vor den Experimenten mindestens 30 Minuten ruhen, damit die verbleibenden Inhibitoren abklingen und sich die Blutplättchen an den Puffer gewöhnen können.

2. Vorbereitung des Assays

  1. Bereiten Sie alle Agonisten und Fluorochrome im Reaktionspuffer vor. 5 μl Thrombin zu 45 μl Puffer (Verdünnung 1:10) und 5 μl Ionophor zu 495 μl Puffer (Verdünnung 1:500) hinzufügen.
    1. Vergleichen Sie bei internen Assays nicht aktivierte Thrombozyten mit denen, die mit Einzel- und Doppelagonisten behandelt wurden. In verschiedenen Aliquoten werden 100 μl gewaschene Blutplättchen zu 50 x 109 Blutplättchen/l zu: i) 10 μl Reaktionspuffer, ii) 3 μl unverdünntem Kollagen (Endkonzentration von 30 μg/ml), iii) 10 μl vorverdünntem Thrombin (0,5 I.E./ml), iv) 3 μl unverdünntem Kollagen + 10 μl vorverdünntem Thrombin und v) 10 μl vorverdünntem Ionophor (Endkonzentration von 2 μM) zugegeben. von dem bekannt ist, dass es den intrazellulären Kalziumspiegel direkt erhöht, wie bereits erwähnt26.
      HINWEIS: Die Behandlung mit einem Calcium-Ionophor wie A23187 oder Ionomycin ist von entscheidender Bedeutung, da es zu einem ausgedehnten Phospholipidmembran-Scrambling und einer verstärkten PS-Externalisierung führt.
    2. Jedes Aliquot vorsichtig mit der Hand schütteln und bei 37 °C 5 min inkubieren.
      HINWEIS: Eine längere Inkubation mit Agonisten (30 Minuten) kann eine bessere Unterscheidung zwischen Thrombozytenpopulationen während des durchflusszytometrischen Analyseprozesses ermöglichen.
  2. Geben Sie 5 μl unverdünntes Annexin-V FITC in jedes Mikroröhrchen und inkubieren Sie es 10 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln.
    HINWEIS: Ein monoklonaler Antikörper gegen einen der plättchenspezifischen Rezeptoren, GPIX (CD42b) oder αIIb-Integrin (CD41, GPIIb), könnte ebenfalls enthalten sein, um Thrombozytenzellen besser identifizieren zu können.
  3. Fügen Sie 500 μl Reaktionspuffer hinzu, um den Prozess zu stoppen, und fahren Sie mit der Analyse der Probe mit einem Durchflusszytometer fort.

3. Charakterisierung von gerinnungsfördernden Thrombozyten und Mikrovesikeln mittels Durchflusszytometrie (FC)

HINWEIS: Verwenden Sie für eine zuverlässige Analyse der Thrombozytenfunktion ein Durchflusszytometrie-Instrument (FC), das gemäß den etablierten Standardskonfiguriert ist 27. Das Gerät muss in der Lage sein, Vorwärtsstreuung (FSC) und mindestens ein Fluoreszenzsignal zu detektieren. Stellen Sie die Lichtstreu- und Fluoreszenzdetektoren auf logarithmische Verstärkung ein. Verdünnen Sie die Proben entsprechend für FC, um sicherzustellen, dass nur einzelne Blutplättchen mit einer reduzierten Datenerfassungsgeschwindigkeit gezählt werden.

  1. Stellen Sie das Durchflusszytometer auf eine "langsame" Flussrate mit einem Schwellenwert von mindestens 10.000 Thrombozytenereignissen ein. Überwachen Sie die Fluoreszenzemission mit einem Passfilter für FITC.
  2. Gate der Thrombozytenpopulation mit Hilfe der Vorwärtsstreuung (FSC). Untersuchen Sie Blutplättchen und freigesetzte Mikrovesikel nach ihrer Größe. Verwendung von Dichtediagrammen zur Identifizierung von Blutplättchen und freigesetzten Mikrovesikeln sowohl für ruhende als auch für stimulierte Blutplättchen; Analysieren Sie jede Gated Population unabhängig.
  3. Unterscheidung von gerinnungsfördernden Blutplättchen nach der FL1-Achse. Platzieren Sie den negativen Cut-off ganz rechts an der Thrombozytenpopulation im Ruhezustand (d. h. in Gegenwart von Reaktionspuffer). Klassifizieren Sie nach der Thrombozytenaktivierung alle Ereignisse, die rechts von diesem Grenzwert lokalisiert sind, als Thrombozyten, die Phosphatidylserin freisetzen.
  4. Unterscheiden Sie Mikrovesikel, die kleiner als Blutplättchen sind, durch ihre einzigartigen Lichtstreueigenschaften. Legen Sie den Cut-off-Wert auf den niedrigsten FSC-Wert fest, der in der ruhenden Thrombozytenpopulation beobachtet wurde. Nach der Aktivierung sind alle Phosphatidylserin-positiven Ereignisse, die unter diesen Schwellenwert fallen, als Mikrovesikel zu klassifizieren.
    HINWEIS: Berücksichtigen Sie individuelle Schwankungen der Thrombozytengröße, indem Sie den Cut-off bei Bedarf anpassen. Stellen Sie sicher, dass weniger als 1 % der Mikrovesikel im Ruhezustand vorhanden sind.

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Ergebnisse

Die Quantifizierung von gerinnungsfördernden Thrombozyten und Mikrovesikeln erfolgt mittels Annexin-V-Färbung, wobei mindestens 50.000 Ereignisse pro Probe aufgezeichnet werden. Wie in Schritt 2.2 beschrieben, wurden die Thrombozytenaggregationshemmungen zu Studienbeginn an Proben durchgeführt, die mit Reaktionspuffer inkubiert worden waren, wie in Abbildung 1A dargestellt. Die Thrombozytengrößen wurden anhand des medianen Forward-Scatter-Werts (FSC) gemessen. Obwohl die FSC von verschiedene...

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Diskussion

Jüngste Studien zu gerinnungsfördernden Blutplättchen haben ihre Veränderungen bei mehreren Krankheiten hervorgehoben 1,28,29 und unterstreichen die Bedeutung ihrer detaillierten Analyse und Charakterisierung 30,31,32. Während die derzeitigen klinischen Tests zur Beurteilung der Bildung von Thrombozyten...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
(CD42b, GPIX) APCBeckman CoulterB13980
ACD-A BlutentnahmeröhrchenBD Vacutainer366645
Annexin-V FITCBD Pharmingen560931
Apyrase Grad VIISigma-AldrichA6410
Rinderserumalbumin 30%Sigma-AldrichA9576
CaCl2, 0.25MSigma-AldrichC3881
Zitronensäure-MonohydratMerck5949-29-1
Kollagen Stago86924
Glukose Sigma-AldrichG8270
Hepes Sigma-AldrichH3375
Ionophor Calbiochem/VWR100105
KCl Merck7447-40-7
MgCl2Sigma-AldrichM0250
NaCl VWR27810.295
NaOH Merck1.06498
NatriumhydrogencarbonatMerck6329NaHCO3
Thrombin Hyphen BiomedEZ 006 A
Trinatriumcitrat-Dihydrat Sigma-AldrichG8270Na3C6H5O7*2H2O
α IIb Integrin (CD41, GPIIb) PC7Beckman Coulter6607115

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