Methodenartikel

Charakterisierung von Prokoagulanzien-Thrombozyten durch Messung der Phosphatidylserin-Exposition und der Mikrovesikelfreisetzung aus humanen gereinigten Blutplättchen

DOI:

10.3791/67042

⸱

29. November 2024

 ,  , 
1French Reference Centre for Inherited Platelet Disorders, University Hospital of Bordeaux, 2Department of Haematology, University Hospital of Bordeaux, 3Inserm U1034, Biology of Cardiovascular Disease

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die Bildung von prokoagulanzien Blutplättchen wurde mit einem erhöhten Thromboserisiko korreliert. Hier wird ein präzises Protokoll zur Isolierung von gewaschenen Blutplättchen aus menschlichem Blut vorgestellt, das dazu bestimmt ist, die Exposition von Phosphatidylserin und Mikrovesikelfreisetzung zu quantifizieren, die charakteristische Merkmale von Prokoagulanzienthrombozyten sind.

Zusammenfassung

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Aktivierte Blutplättchen fördern die Gerinnung vor allem, indem sie das Gerinnungsmittel Phospholipid Phosphatidylserin (PS) auf ihren äußeren Membranoberflächen freilegen und PS-exprimierende Mikrovesikel freisetzen, die die ursprüngliche Membranarchitektur und die zytoplasmatischen Komponenten ihrer Ursprungszellen beibehalten. Die Zugänglichkeit von Phosphatidylserin erleichtert die Bindung der wichtigsten Gerinnungsfaktoren und verstärkt die katalytische Effizienz von Gerinnungsenzymen erheblich, während die Freisetzung von Mikrovesikeln als zentraler Mediator der interzellulären Signalübertragung wirkt. Prokoagulanzien Blutplättchen spielen eine entscheidende Rolle bei der Stabilisierung des Blutgerinnsels während der Blutstillung, und ihr erhöhter Anteil im Blutkreislauf korreliert mit einem erhöhten Thromboserisiko. Es wurde auch gezeigt, dass Thrombozyten-Mikrovesikel reich an Wachstumsfaktoren sind, die die Wundheilung und die Entzündungsmodulation fördern. Die Analyse der Phosphatidylserin-Exposition und der Mikrovesikelfreisetzung mittels Durchflusszytometrie stellt aufgrund ihrer geringen Größe und der begrenzten Anzahl positiver Ereignisse für interessante Marker eine große Herausforderung dar. Trotz erheblicher Fortschritte in den letzten zehn Jahren sind die Methoden zur Bewertung der Phosphatidylserin-Exposition und der Mikrovesikelfreisetzung nach wie vor in Arbeit. Leider gibt es kein allgemeingültiges Protokoll, und es müssen mehrere Faktoren bewertet werden, um die am besten geeignete Methodik für jede spezifische Anwendung zu bestimmen. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von gewaschenen Blutplättchen aus menschlichem Blut, gefolgt von einer Kollagen- und/oder Thrombinaktivierung, um die Exposition von Phosphatidylserin und Mikrovesikel zu messen, die für prokoagulanziöse Blutplättchen charakteristisch sind. Dieses Protokoll soll die anfängliche Präparation von plättchenreichem Plasma und die Isolierung von gewaschenen Blutplättchen erleichtern. Schließlich werden die Exposition gegenüber Phosphatidylserin und die Freisetzung von Mikrovesikeln durch Durchflusszytometrie quantifiziert, was die Identifizierung von Blutplättchen des Gerinnungsgenerators ermöglicht.

Einleitung

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Die Bildung von Blutplättchenprokoagulanzien ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Blutstillung 1,2,3. Dieser Prozess beinhaltet die Agonisten-induzierte Expression von Phospholipiden auf der Thrombozytenmembran, die für den Aufbau von Tenase- und Prothrombinase-Komplexen essentiell ist 1,3,4. Nach der Thrombozytenaktivierung werden auch Thrombozyten-Mikrovesikel kontinuierlich freigesetzt 5,6. Mikrovesikel (Durchmesser von 50 nm bis über 1 μm) kapseln sowohl die Membranstruktur als auch die zytoplasmatischen Bestandteile der Ursprungszellenein 7,8. Mikrovesikel sind wichtige Mediatoren der interzellulären Signalübertragung 9,10 und auch Repositorien von Wachstumsfaktoren, die die Wundheilung und die Entzündungsmodulation fördern11,12. Es wurde auch vermutet, dass Mikrovesikel 50- bis 100-mal mehr Prokoagulans sind als aktivierte Blutplättchen13. Jüngste Erkenntnisse deuten darauf hin, dass gespeicherte Blutplättchen aktiviert werden, was zur Produktion von Mikrovesikeln führt - dies hat potenzielle Auswirkungen auf die Praxis der Thrombozytentransfusionstherapie. Die verlängerte Lagerdauer und die erhöhte prokoagulanziöse Aktivität von Mikrovesikeln machen sie zu einem vielversprechenden Ersatz für Blutplättchen in Transfusionsanwendungen14.

Methodische Innovationen wurden vorgenommen, um die Bildung von Blutplättchen-Prokoagulanzien sowohl bei Gesundheits- als auch bei Krankheitszuständen direkt und indirekt zu beurteilen 4,14,15. Die Bewertung der Phosphatidylserin-Exposition und der Mikrovesikelfreisetzung mit gereinigten Blutplättchen hat neue Daten darüber geliefert, wie die Prokoagulanzienreaktion der Blutplättchen bei verschiedenen menschlichen Krankheiten gestört wird 1,4. Dieses wachsende Forschungsfeld eröffnet auch Wege für therapeutische Interventionen 1,4. Die Isolierung und Analyse von gereinigten Blutplättchen aus dem Blut ist jedoch zeitaufwändig, erfordert spezielle Laborgeräte und ist daher derzeit nicht für die klinische Routinediagnostik adaptierbar16,17. Die Analyse der Phosphatidylserin-Exposition und der Mikrovesikelfreisetzung ist aufgrund ihrer geringen Größe und der Anzahl positiver Ereignisse für die interessierenden Marker ebenfalls eine Herausforderung18,19.

Die Durchflusszytometrie, die die fluoreszierende Annexin-V-Bindung nutzt, ist seit ihrer Einführung vor zwei Jahrzehnten ein Eckpfeiler bei der Bewertung der PS-Expression auf Blutplättchen und Mikrovesikeln20. Es hat sich bei der Untersuchung von gerinnungsfördernden Thrombozyten und Mikrovesikeln durchgesetzt21,22. Daher wird hier ein optimiertes Protokoll vorgestellt, das für die Isolierung von gereinigten Blutplättchen aus Blutproben unter Verwendung der von Cazenaves Gruppe23 entwickelten Technik und die anschließende Charakterisierung der Phosphatidylserin-Exposition und der Mikrovesikelfreisetzung durch Durchflusszytometrie nach Thrombozytenaktivierung24 verwendet werden kann. Dieses Protokoll wird weitere Studien und eine eingehende Charakterisierung von Prokoagulanzien-Thrombozyten in klinischen Populationen von Interesse erleichtern.

Protokoll

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Das Protokoll folgt den Richtlinien und wurde von der Ethikkommission für die Humanforschung des Universitätsklinikums Bordeaux genehmigt. Blutproben wurden von gesunden Freiwilligen entnommen, die eine Einverständniserklärung abgegeben hatten, und diese Proben wurden gemäß den institutionellen Protokollen verarbeitet. Spender, die Substanzen eingenommen hatten, die die Thrombozytenfunktion beeinträchtigen könnten, wurden ausgeschlossen, wenn diese Substanzen innerhalb von 10 Tagen vor den Versuchen eingenommen wurden. Gesunde Freiwillige erhielten eine Einwilligungserklärung, um ihr Blut zu entnehmen und ihre Daten zu veröffentlichen. Die Details zu den Reagenzien und den verwendeten Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Blutentnahme und Aufbereitung der gewaschenen Blutplättchen

  1. Sammeln Sie peripheres venöses Blut in Entnahmeröhrchen, die das aktive Antikoagulans Trinatriumcitrat mit Zitronensäure und Dextrose (ACD) enthalten, nachdem Sie die ersten 3 ml verworfen haben.
  2. Nach der Entnahme das Röhrchen vorsichtig umdrehen, um das Blut mit ACD zu mischen, und das Gemisch vor der Zentrifugation 15 Minuten bei Raumtemperatur ruhen lassen.
  3. Zählen Sie die Blutplättchen vor der Zentrifugation mit einem automatisierten Zellzähler, um die richtige Geschwindigkeit für die Zentrifugation zu bestimmen (Tabelle 1). Bereiten Sie plättchenreiches Plasma (PRP) durch Zentrifugation bei 250 x g für 10 Minuten bei Raumtemperatur (RT) vor, ohne die Bremse zu betätigen, um die Thrombozytenrückgewinnung zu optimieren.
    HINWEIS: Bei diesem Schritt entstehen drei Schichten in der Probe: die obere Schicht mit Plasma, Blutplättchen und einem kleinen Teil der weißen Blutkörperchen; eine mittlere Schicht, die mit weißen Blutkörperchen angereichert ist; und eine untere Schicht, die aus roten Blutkörperchen besteht. Übertragen Sie das PRP vorsichtig aus der oberen Schicht in ein neues konisches 50-ml-Röhrchen, um eine Kontamination mit roten und weißen Blutkörperchen zu vermeiden.
  4. Fügen Sie dem PRP 1 ml ACD-A (siehe Tabelle 2) und 6,25 μl Apyrase pro 9 ml hinzu.
    HINWEIS: Apyrase baut in einer Konzentration von 0,02 U/ml Spuren von ATP oder ADP ab, die von den Blutplättchen sezerniert werden, wodurch eine Desensibilisierung der Thrombozyten-ADP-Rezeptoren verhindert und die Thrombozytenform erhaltenbleibt 25. Ein Prostacyclin-PGI2-Inhibitor (0,5 μM) kann auch mit Apyrase aufgenommen werden, um die Thrombozytenaktivierung zu verhindern.
  5. Bereiten Sie das Plättchenpellet durch Zentrifugation bei RT bei 1100 x g für 10 min vor. Aspirieren Sie den Überstand, der Thrombozytenarmes Plasma (PPP) enthält, mit einer schonenden Methode, z. B. einer Pasteurpipette, und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml Waschpuffer (siehe Tabelle 3 und Tabelle 4). Vorsichtig mit einer Pipette homogenisieren und dann weitere 3-4 ml Waschpuffer hinzufügen.
    HINWEIS: Der Kalziumspiegel wird reduziert, um eine Gerinnung mit Gerinnselfaktoren im Plasma zu verhindern. In diesem Stadium wurde das plättchenarme Plasma vollständig entfernt, wodurch die Gerinnselbildung und die Thrombozytenaktivierung durch die Thrombinproduktion verhindert wurden.
  6. Erneut bei RT bei 1100 x g für 10 min zentrifugieren. Den Überstand aspirieren und das Pellet in 1 ml Waschpuffer resuspendieren. Übertragen Sie 150 μl der Thrombozytensuspension in ein 1,5-ml-Röhrchen zur Zellzählung mit einem automatisierten Zellzähler. Suspendieren Sie dann das Pellet mit 3-4 ml Waschpuffer.
  7. Führen Sie eine abschließende Zentrifugation bei 1100 x g für 10 min (bei RT) durch. Der Überstand wird aspiriert und das Thrombozytenpellet in einem Volumen Reaktionspuffer (siehe Tabelle 5 und Tabelle 6) resuspendiert, um eine Endkonzentration von 5 x 1011 Thrombozyten/l zu erreichen.
  8. Lassen Sie die gewaschenen Blutplättchen vor den Experimenten mindestens 30 Minuten ruhen, damit die verbleibenden Inhibitoren abklingen und sich die Blutplättchen an den Puffer gewöhnen können.

2. Vorbereitung des Assays

  1. Bereiten Sie alle Agonisten und Fluorochrome im Reaktionspuffer vor. 5 μl Thrombin zu 45 μl Puffer (Verdünnung 1:10) und 5 μl Ionophor zu 495 μl Puffer (Verdünnung 1:500) hinzufügen.
    1. Vergleichen Sie bei internen Assays nicht aktivierte Thrombozyten mit denen, die mit Einzel- und Doppelagonisten behandelt wurden. In verschiedenen Aliquoten werden 100 μl gewaschene Blutplättchen zu 50 x 109 Blutplättchen/l zu: i) 10 μl Reaktionspuffer, ii) 3 μl unverdünntem Kollagen (Endkonzentration von 30 μg/ml), iii) 10 μl vorverdünntem Thrombin (0,5 I.E./ml), iv) 3 μl unverdünntem Kollagen + 10 μl vorverdünntem Thrombin und v) 10 μl vorverdünntem Ionophor (Endkonzentration von 2 μM) zugegeben. von dem bekannt ist, dass es den intrazellulären Kalziumspiegel direkt erhöht, wie bereits erwähnt26.
      HINWEIS: Die Behandlung mit einem Calcium-Ionophor wie A23187 oder Ionomycin ist von entscheidender Bedeutung, da es zu einem ausgedehnten Phospholipidmembran-Scrambling und einer verstärkten PS-Externalisierung führt.
    2. Jedes Aliquot vorsichtig mit der Hand schütteln und bei 37 °C 5 min inkubieren.
      HINWEIS: Eine längere Inkubation mit Agonisten (30 Minuten) kann eine bessere Unterscheidung zwischen Thrombozytenpopulationen während des durchflusszytometrischen Analyseprozesses ermöglichen.
  2. Geben Sie 5 μl unverdünntes Annexin-V FITC in jedes Mikroröhrchen und inkubieren Sie es 10 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln.
    HINWEIS: Ein monoklonaler Antikörper gegen einen der plättchenspezifischen Rezeptoren, GPIX (CD42b) oder αIIb-Integrin (CD41, GPIIb), könnte ebenfalls enthalten sein, um Thrombozytenzellen besser identifizieren zu können.
  3. Fügen Sie 500 μl Reaktionspuffer hinzu, um den Prozess zu stoppen, und fahren Sie mit der Analyse der Probe mit einem Durchflusszytometer fort.

3. Charakterisierung von gerinnungsfördernden Thrombozyten und Mikrovesikeln mittels Durchflusszytometrie (FC)

HINWEIS: Verwenden Sie für eine zuverlässige Analyse der Thrombozytenfunktion ein Durchflusszytometrie-Instrument (FC), das gemäß den etablierten Standardskonfiguriert ist 27. Das Gerät muss in der Lage sein, Vorwärtsstreuung (FSC) und mindestens ein Fluoreszenzsignal zu detektieren. Stellen Sie die Lichtstreu- und Fluoreszenzdetektoren auf logarithmische Verstärkung ein. Verdünnen Sie die Proben entsprechend für FC, um sicherzustellen, dass nur einzelne Blutplättchen mit einer reduzierten Datenerfassungsgeschwindigkeit gezählt werden.

  1. Stellen Sie das Durchflusszytometer auf eine "langsame" Flussrate mit einem Schwellenwert von mindestens 10.000 Thrombozytenereignissen ein. Überwachen Sie die Fluoreszenzemission mit einem Passfilter für FITC.
  2. Gate der Thrombozytenpopulation mit Hilfe der Vorwärtsstreuung (FSC). Untersuchen Sie Blutplättchen und freigesetzte Mikrovesikel nach ihrer Größe. Verwendung von Dichtediagrammen zur Identifizierung von Blutplättchen und freigesetzten Mikrovesikeln sowohl für ruhende als auch für stimulierte Blutplättchen; Analysieren Sie jede Gated Population unabhängig.
  3. Unterscheidung von gerinnungsfördernden Blutplättchen nach der FL1-Achse. Platzieren Sie den negativen Cut-off ganz rechts an der Thrombozytenpopulation im Ruhezustand (d. h. in Gegenwart von Reaktionspuffer). Klassifizieren Sie nach der Thrombozytenaktivierung alle Ereignisse, die rechts von diesem Grenzwert lokalisiert sind, als Thrombozyten, die Phosphatidylserin freisetzen.
  4. Unterscheiden Sie Mikrovesikel, die kleiner als Blutplättchen sind, durch ihre einzigartigen Lichtstreueigenschaften. Legen Sie den Cut-off-Wert auf den niedrigsten FSC-Wert fest, der in der ruhenden Thrombozytenpopulation beobachtet wurde. Nach der Aktivierung sind alle Phosphatidylserin-positiven Ereignisse, die unter diesen Schwellenwert fallen, als Mikrovesikel zu klassifizieren.
    HINWEIS: Berücksichtigen Sie individuelle Schwankungen der Thrombozytengröße, indem Sie den Cut-off bei Bedarf anpassen. Stellen Sie sicher, dass weniger als 1 % der Mikrovesikel im Ruhezustand vorhanden sind.

Ergebnisse

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Die Quantifizierung von gerinnungsfördernden Thrombozyten und Mikrovesikeln erfolgt mittels Annexin-V-Färbung, wobei mindestens 50.000 Ereignisse pro Probe aufgezeichnet werden. Wie in Schritt 2.2 beschrieben, wurden die Thrombozytenaggregationshemmungen zu Studienbeginn an Proben durchgeführt, die mit Reaktionspuffer inkubiert worden waren, wie in Abbildung 1A dargestellt. Die Thrombozytengrößen wurden anhand des medianen Forward-Scatter-Werts (FSC) gemessen. Obwohl die FSC von verschiedenen Faktoren beeinflusst wird, bleibt sie ein gängiger Proxy für die Schätzung der Zellgröße, einschließlich der von Blutplättchen. Dichtediagramme der Fläche (Abbildung 1A) wurden verwendet, um ruhende Thrombozyten und freigesetzte Mikrovesikel zu identifizieren und zu gaten.

Bei den nicht aktivierten Blutplättchen wiesen weniger als 2,9 % Phosphatidylserin (PS) auf, das durch Annexin-V-Färbung bestimmt wurde. Bei Aktivierung der gewaschenen Blutplättchen entweder mit Kollagen allein oder in Verbindung mit Thrombin oder Calciumionophor gab es einen beobachtbaren Anstieg der PS-Exposition. Kollagen allein führte zu einem Anstieg der PS-positiven Blutplättchen um 26,7 %. Thrombin hatte nur minimale Auswirkungen auf die PS-Exposition (9,1 %), aber in Verbindung mit Kollagen erhöhte es den Prozentsatz der PS-exponierten Blutplättchen auf 36,2 %. Zum Vergleich: Die Behandlung mit 2 μM Ionophor führte dazu, dass 49,6 % der Blutplättchen prokoagulant wurden.

Abbildung 1 zeigt, dass der Ausgangsanteil von Mikrovesikeln aus gewaschenen Blutplättchen bei einer gesunden Person minimal war (0,3 %). Während Thrombin und Kollagen die Mikrovesikelbildung minimal erhöhten, stieg die Mikrovesikelbildung erst mit der Kombination von Kollagen und Thrombin signifikant an (Abbildung 1D; 11,4%). Die Zugabe von 2 μM Ionophor führte dazu, dass 44,0 % der Mikrovesikel, die von den Kontrollplättchen gebildet wurden, PS-exponiert waren.

Abbildung 2 gibt Aufschluss über die Variation, Wiederholbarkeit und Reproduzierbarkeit, die von diesem Prozess zu erwarten ist.

figure-results-1
Abbildung 1: PS-Exposition und Mikrovesikelbildung in ruhenden und aktivierten Kontrollthrombozyten. Die Blutplättchen waren entweder aktiviert oder nicht aktiviert (Ruhe) (A), mit 30 μg/ml Kollagen (B), mit 0,5 U/ml Thrombin (C), mit Kombinationen aus Kollagen und Thrombin (D) mit 2 μM Ionophor. Repräsentative Punktdiagramme zeigen die Thrombozytengröße (Forward Scatter (FSC log)) im Vergleich zur Annexin-V-Bindung. Horizontale und vertikale Linien (E) markieren die plättchennegative Population. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-2
Abbildung 2: Wiederholbarkeit und Reproduzierbarkeit der PS-Exposition und der Mikrovesikelbildung nach Inkubation mit Ionophor. Analyse der PS-Exposition und der Mikrovesikelbildung nach Inkubation mit entweder 2 μM oder 5 μM Ionophor in gewaschenen Blutplättchen, behandelt oder unbehandelt mit Citrat (einem Calciumchelator): (A) von 4 verschiedenen gesunden Kontrollen; (B) von einer gesunden Kontrollgruppe, die 5 Mal wiederholt wird; und (C) aus zwei gesunden Kontrollen, die von zwei verschiedenen Technikern erstellt wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Thrombozytenzahl im Vollblut (10,9 pro ml)Relative Zentrifugalkräfte (g)
<3070
30-50100
51-100130
101-150200
151-300250
301-600290
>600340

Tabelle 1: Relative Zentrifugalkräfte für die Präparation von plättchenreichem Plasma in Bezug auf die Thrombozytenzahl im Vollblut.

ReagenzMenge
Zitronensäure-Monohydrat (C6H8O7. H2O, 38 mM)8 g
Trinatriumcitrat-Dihydrat (Na3C6H5O7,2 H2O, 61 mM)ca. 180 Gramm
Glukose (C6H12O6, 136 mM)ca. 24,6 g
Der pH-Wert der Lösung sollte nicht angepasst werden. Halten Sie die Lösung bei 4 °C.

Tabelle 2: Herstellung einer 1 L wässrigen Lösung von Säure-Citrat-Dextrose (ACD).

ReagenzMenge
Zitronensäure-Monohydrat (C6, H, 8,O, 7. H2O, 36 mM)7,56 Gramm
NaCl (103 mM)6 g
NaOH4 g
MgCl2,6H 2O (1 mM)0,203 Gramm
Stellen Sie den pH-Wert auf 6,5 ein. Halten Sie die Lösung bei 4 °C.

Tabelle 3: Zubereitung der Stammlösung von Waschpuffer.

ReagenzMenge
30% Rinderserumalbumin (BSA)583 μL
CaCl2, 0,25 m400 μL
Traubenzucker40 mg
Apyrase31,5 μL

Tabelle 4: Herstellung einer 50 mL Magistrallösung von Waschpuffer aus der Stammlösung.

ReagenzMenge
NaCl (137 mM)8 g
KCl (2,7 mM)0,2 g
MgCl2,6H 2O (1 mM)0,203 Gramm
HEPES (5 mM)ca. 1,19 Gramm
NaHCO3 (12 mM)1 g
NaH2PO4.2H 2O; 0,3 mM0,05 Gramm
Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein. Halten Sie die Lösung bei 4 °C.

Tabelle 5: Herstellung einer Stammlösung von Reaktionspuffer.

ReagenzMenge
30% Rinderserumalbumin (BSA)167 μL
CaCl2, 0,25 m400 μL
Traubenzucker50 mg

Tabelle 6: Herstellung einer 50 mL Magistrallösung von Reaktionspuffer aus der Stammlösung.

Diskussion

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Jüngste Studien zu gerinnungsfördernden Blutplättchen haben ihre Veränderungen bei mehreren Krankheiten hervorgehoben 1,28,29 und unterstreichen die Bedeutung ihrer detaillierten Analyse und Charakterisierung 30,31,32. Während die derzeitigen klinischen Tests zur Beurteilung der Bildung von Thrombozyten-Prokoagulanzien begrenzt sind, ist das klinische Interesse in den letzten zwei Jahrzehnten deutlich gestiegen. Zum Beispiel ist das Calcium-abhängige Scramblase TMEM16F (ANO6) an der Exposition gegenüber dem Gerinnungsmittel Phosphatidylserin (PS) beteiligt33. Varianten von TMEM16F sind mit dem Scott-Syndromassoziiert 33,34,35, einer seltenen Blutgerinnungsstörung, die durch ein gestörtes Phospholipid-Scrambling und eine verminderte Thrombinbildung in aktivierten Blutplättchen gekennzeichnet ist 36. Darüber hinaus werden erhöhte Prokoagulanzien-Thrombozytenspiegel mit thrombotischen Schlaganfällen und koronarer Herzkrankheit in Verbindung gebracht, was das Interesse an Therapien zur Eindämmung der Prokoagulanzienaktivität der Thrombozyten weckt37. Von den derzeit verfügbaren Methoden zur Beurteilung der Blutplättchenbildung von Prokoagulanzien ist die Beurteilung der PS-Exposition durch Annexin-V-Bindung und Mikrovesikelfreisetzung eine der am häufigsten verwendeten38,39.

Das hier skizzierte Protokoll ermöglicht die Isolierung von humangereinigten Blutplättchen und die Charakterisierung von gerinnungsfördernden Blutplättchen durch Messung der PS-Exposition und der Mikrovesikelfreisetzung mittels Durchflusszytometrie. Es ist wichtig, gesunden Freiwilligen zu raten, mindestens 10 Tage vor der Blutentnahme auf Medikamente zu verzichten, die die Blutplättchenfunktion beeinträchtigen können. Bei der Blutentnahme ist Vorsicht geboten, um ein Venentrauma oder einen zu langsamen Fluss zu vermeiden, da diese die Thrombinbildung und die Thrombozytenaktivierung induzieren können. Natriumcitrat-antikoaguliertes Blut wird für die Herstellung von gewaschenen Blutplättchen nicht empfohlen, da Restcalcium die Thrombinbildung und die Thrombozytenaktivierung während der Zentrifugation ermöglichen kann17. ACD-antikoaguliertes Blut hat einen pH-Wert von 6,5 und eine höhere Citratkonzentration von 22 mmol/l im Vergleich zu Citrat-antikoaguliertem Blut von 7,5 und einer Citratkonzentration von 13 mmol/L17. Der saure pH-Wert und die erniedrigte extrazelluläre Kalziumkonzentration im ACD-antikoagulierten Blut verhindern die Thrombozytenaggregation24. Die Minimierung der Thrombinbildung während des Entnahmeprozesses ist von entscheidender Bedeutung. Eine nicht-traumatische Venenpunktion mit mindestens einer 21 G-Nadel wird empfohlen, um eine venöse Stauung oder einen übermäßigen Druck zu verhindern. Zusätzlich sollten die ersten Milliliter Blut verworfen werden, um eine Kontamination mit Gewebefaktoren und Spuren von Thrombin17 zu vermeiden. Die Minimierung der Zeit zwischen der Venenpunktion und der Probenverarbeitung ist ebenfalls wichtig, da eine längere Blutlagerung zu einer Thrombozytenaktivierung führen kann, wodurch die PS-Exposition und die Freisetzung von Mikrovesikeln erhöhtwerden 40. Während des gesamten Thrombozytenpräparationsverfahrens muss besonders darauf geachtet werden, eine spontane Thrombozytenpräaktivierung zu verhindern, die während des Präparationsprozesses selbst auftreten kann41,17. Darüber hinaus erfordert die Isolierung gereinigter Blutplättchen eine sorgfältige Vermeidung einer Kontamination durch andere Blutzellen17. Dabei wird der Überstand nach dem Zentrifugieren der Blutplättchen gründlich abgesaugt, um eine saubere Zubereitung zu gewährleisten. Da das Pellet in der Regel sichtbar ist und fest an der Rohrwand haftet, kann der Überstand mit einer Pipettenspitze leicht abgesaugt werden.

Während der Zentrifugationswaschschritte werden die Blutplättchen in einem Puffer resuspendiert, der physiologische Bedingungen simuliert. Die Verwendung von gewaschenen Blutplättchen in einem physiologischen Puffer isoliert sie von Antikoagulanzien und Plasma und verhindert so Thrombin-vermittelte Artefakte. Während plättchenreiches Plasma (PRP) eine schnelle Methode ist, um hohe Thrombozytenkonzentrationen zu erhalten, ist seine Verwendung für funktionelle Studien durch Antikoagulanzien-induzierte pH-Änderungen und den extrazellulären Kalzium- und Proteingehalt des Plasmas eingeschränkt, der die Thrombozytenaktivierung beeinflussen kann17. Darüber hinaus würden hohe Mengen an PS, die während der Thrombozytenaktivierung gebildet werden, ausreichen, um den Aufbau von Plasmagerinnungskomplexen, den anschließenden Thrombin-Ausbruch und die Gerinnselbildung in PRP zu fördern, was die experimentellen Ergebnisse nicht interpretierbar macht. Im Gegensatz dazu wird eine Resuspension in einem Apyrase-haltigen Puffer empfohlen, um die Thrombozytenfunktionalität aufrechtzuerhalten, indem eine Desensibilisierung purinerger Rezeptoren durch den Abbau von ATP und ADP verhindertwird 42,43. Obwohl wiederholte Zentrifugations- und Waschschritte mehr Zeit erfordern, bieten Suspensionen von gewaschenen Blutplättchen, die nach diesem Verfahren hergestellt werden, den Vorteil einer höheren Stabilität (5-8 h) im Vergleich zu citrierten PRP-Präparaten, die nicht länger als 1-3 h stabil sind23.

Diese Studie zeigt die Machbarkeit und Einfachheit der Quantifizierung von Mikrovesikeln mittels Durchflusszytometrie. Die Produktion von Mikrovesikeln kann jedoch in den Ablagerungen und Geräuschen der Maschine verloren gehen. Daher ist es wichtig sicherzustellen, dass das Durchflusszytometer einer umfassenden Reinigung unterzogen wurde und dass die verwendeten Puffer keine kontaminierenden Partikel enthalten, die zu einem hohen Hintergrund während der Durchflusszytometrie-Analyse führen könnten. Alternativ können spezielle Durchflusszytometer mit Detektionsfunktionen für kleine Partikel verwendet werden, um die Bildung von Mikrovesikeln zu identifizieren. Die Bindung von Fluorescein-markiertem Annexin-V in Abhängigkeit vom PS-Gehalt der Membran wurde ebenfalls untersucht, wobei die entscheidende Rolle ausreichender Calciumkonzentrationen im Puffer für die Annexin-V-Bindung und die prokoagulansive Thrombozytenreaktion hervorgehobenwurde 44.

Daten, die die Stabilität von Thrombozytenproben im Laufe der Zeit belegen, sind derzeit rar. Mehrere Laboratorien haben dieses Problem gelöst, indem sie Proben durch Zugabe einer Fixierlösung, wie z. B. eines formaldehydhaltigen Puffers, stabilisiert haben. Die Zugabe eines Fixiermittels zu frisch entnommenen Thrombozytenproben hat den Vorteil, dass die Proben für eine spätere Analyse aufbewahrt werden. Dennoch kann die Formaldehydfixierung zu einer künstlich erhöhten Annexin-V-Bindung führen. Rochat et al. zeigten, dass die Thrombozytenfixierung mit einer niedrig konzentrierten, calciumfreien Formaldehydlösung den Anteil der Annexin-V-positiven Blutplättchen nicht verändert45. Forscher, die eine Fixierung benötigen, sollten jedoch ihr spezifisches Protokoll optimieren, um sicherzustellen, dass sie nicht zu künstlich veränderten Ergebnissen führt. Andernfalls sollten die Proben sofort verarbeitet werden.

Ein weiterer Weg, der ebenfalls zu einer PS-Exposition führen kann, ist die intrinsische Apoptose, ein Prozess, von dem bekannt ist, dass er die Lebensdauer der Blutplättchen im Blutkreislauf reguliert46. Die Aktivierung der pro-apoptotischen BAK- und BAX-Proteine führt zu einer Caspase-Aktivierung, die die Externalisierung von PS fördert, was zu einer in vivo-Clearance von Blutplättchen führt. Kürzlich wurde vorgeschlagen, dass ein weiterer Thrombozytenoberflächenmarker, P-Selektin/CD62P, zusätzlich zu Annexin-V verwendet werden sollte, um Prokoagulanzien von apoptotischen Thrombozytenzu unterscheiden 47. Es wird erwartet, dass prokoagulanziöse Thrombozyten sowohl für PS- als auch für P-Selektinmarker positiv sind, während apoptotische Thrombozyten positiv für Annexin-V, aber negativ für P-Selektin sind. Die Zeit ist jedoch auch ein Unterscheidungsmerkmal zwischen prokoagulanziellen und apoptotischen Blutplättchen47. Die Erzeugung von gerinnungsfördernden Blutplättchen in vitro ist ein schneller Prozess, während die intrinsische Apoptose ein langsamerer Prozess ist und Stunden dauert48. In diesem Zusammenhang ist die Verwendung zusätzlicher Marker zur Beurteilung der gerinnungsfördernden Blutplättchen nicht erforderlich, was die Methode vereinfacht. Anhaltende Anstiege der intrazellulären Ca2+ - und prokoagulanziellen Thrombozytenbildung treten innerhalb weniger Minuten bei sehr starken Agonisten wie Ionophor oder kombinierter Aktivierung mit Kollagen und Thrombin auf, während ein BCL-XL-Inhibitor (oder BH3-Mimetikum) die Bildung apoptotischer Thrombozyten auslöst, indem er pro-apoptotisches BAK und BAX aktiviert, was zu einer Permeabilisierung der mitochondrialen Außenmembran und einer Cytochrom-C-Freisetzung führt. und Caspase-Aktivierung49.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das hier beschriebene Protokoll die Isolierung von gereinigten Blutplättchen und deren anschließende Charakterisierung auf prokoagulanziöse Aktivität unter Verwendung von Standardlaborgeräten und Durchflusszytometrie erleichtert. Dieses Verfahren ebnet den Weg für die zukünftige Erforschung von gerinnungsfördernden Blutplättchen in Blutproben von Patienten mit potenziellen Anwendungen in der klinischen Praxis, wie z. B. bei der Diagnose des seltenen Scott-Syndroms50.

Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
(CD42b, GPIX) APCBeckman CoulterB13980
ACD-A BlutentnahmeröhrchenBD Vacutainer366645
Annexin-V FITCBD Pharmingen560931
Apyrase Grad VIISigma-AldrichA6410
Rinderserumalbumin 30%Sigma-AldrichA9576
CaCl2, 0.25MSigma-AldrichC3881
Zitronensäure-MonohydratMerck5949-29-1
Kollagen Stago86924
Glukose Sigma-AldrichG8270
Hepes Sigma-AldrichH3375
Ionophor Calbiochem/VWR100105
KCl Merck7447-40-7
MgCl2Sigma-AldrichM0250
NaCl VWR27810.295
NaOH Merck1.06498
NatriumhydrogencarbonatMerck6329NaHCO3
Thrombin Hyphen BiomedEZ 006 A
Trinatriumcitrat-Dihydrat Sigma-AldrichG8270Na3C6H5O7*2H2O
α IIb Integrin (CD41, GPIIb) PC7Beckman Coulter6607115

Referenzen

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