Methodenartikel

Radiosynthese, Qualitätskontrolle und Positronenemissionstomographie von Kleintieren Bildgebung von 68Ga-markierten Nanomolekülen

DOI:

10.3791/67048

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4. Oktober 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nuclear Medicine, University Hospital RWTH Aachen, 2Department of Radiology and Nuclear Medicine, Maastricht University Medical Center, 3School of Nutrition and Translational Research in Metabolism (NUTRIM), Maastricht University, 4School for Cardiovascular Diseases (CARIM), Maastricht University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieser Artikel beschreibt die Radiosynthese, Formulierung und Qualitätskontrolle einer neuen radioaktiv markierten Sonde (d.h. 68Ga-markierter Nanobody NM-02) und ihre Verwendung für die PET/CT-Bildgebung von Kleintieren in einem Xenotransplantatmodell.

Zusammenfassung

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Die Positronen-Emissions-Tomographie (PET) und die Einzelphotonen-Emissions-Computertomographie (SPECT) bei Kleintieren sind in der präklinischen Krebsforschung von entscheidender Bedeutung und erfordern akribische Aufmerksamkeit bei der Radiotracersynthese, der Qualitätssicherung und den In-vivo-Injektionsprotokollen . Diese Studie stellt einen umfassenden Arbeitsablauf vor, der darauf zugeschnitten ist, die Robustheit und Reproduzierbarkeit von PET-Versuchen an Kleintieren zu verbessern. Der Syntheseprozess im radiochemischen Labor mit 68Ga ist detailliert und hebt strenge Qualitätskontroll- und Sicherungsprotokolle für jede Radiotracerproduktion hervor. Parameter wie Konzentration, molare Aktivität, pH-Wert und Reinheit werden streng überwacht und entsprechen den für Studien am Menschen geltenden Standards. Diese Methode führt eine optimierte Spritzenvorbereitung und eine speziell entwickelte 30G-Kanüle für präzise intravenöse Injektionen in Mäuse ein. Die Überwachung der Tiergesundheit während des Scans, einschließlich Temperatur und Herzfrequenz, gewährleistet ihr Wohlbefinden während des gesamten Eingriffs. Die Dosierungen für PET- und SPECT-Scans sind so festgelegt, dass die Datenerfassung mit der Minimierung der Strahlenbelastung von Tieren und Forschern in Einklang gebracht wird. In ähnlicher Weise verwenden CT-Scans vorprogrammierte Einstellungen, um die Strahlenbelastung zu begrenzen, was insbesondere in Langzeitstudien zur Bewertung der Behandlungseffekte relevant ist. Durch die Optimierung dieser Schritte zielt der Workflow darauf ab, die Verfahren zu standardisieren, die Variabilität zu reduzieren und die Qualität der PET/SPECT/CT-Bildgebung bei Kleintieren zu verbessern. Diese Ressource bietet wertvolle Erkenntnisse für Forscher, die die Genauigkeit und Zuverlässigkeit präklinischer Untersuchungen in der molekularen Bildgebung verbessern und letztendlich das Feld voranbringen wollen.

Einleitung

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Ein Thema, das von größter Relevanz ist, ist die Forschung im Bereich Brustkrebs. Brustkrebs ist nach wie vor eine häufig auftretende Krebserkrankung und macht etwa 1/3 aller Krebserkrankungen bei Frauen aus. Die Behandlung ist auf die biologischen und histologischen Eigenschaften des Tumors und auf das Stadium der Erkrankung abgestimmt. Die Überlebenschancen sind in der Regel gut, es sei denn, der Tumor hat bereits Metastasen gebildet, in diesem Fall beträgt das 5-Jahres-Überleben nur etwa 30 %1. Anderen gynäkologischen Krebserkrankungen droht ein ähnliches Schicksal, wobei beispielsweise Eierstockkrebs > 5-Jahres-Überleben von 95 % für Tumoren im Stadium 1 aufweist, aber nur 15 % für metastasierte Tumoren im Stadium 4 2,3.

Die nicht-invasive Bildgebung, insbesondere die Positronen-Emissions-Tomographie (PET), hat die Krebsforschung verändert, da sie beispiellose Einblicke in molekulare Aspekte des Tumors bietet, wie z. B. den Stoffwechsel, die Rezeptorexpression und das therapeutische Ansprechen 4,5,6. Es ermöglicht sowohl die Visualisierung als auch die Quantifizierung spezifischer Stoffwechselbereiche - so kann nicht nur die Wirkung von (neuen) Therapien zu sehr kurzen Zeitpunkten genau diagnostiziert, sondern auch überwacht werden. In der Tat ermöglicht die PET die Beurteilung des Ansprechens im Vergleich zum Nichtansprechen nach 1-3 Therapiezyklen und tut dies besser und schneller im Vergleich zu morphologischen Veränderungen, wie sie in der klassischen Computertomographie (CT) zu sehen sind7. Der nicht-invasive Charakter der PET ermöglicht auch Längsschnittstudien.

Jedes Tiermodell erfordert eine maximale Standardisierung, um die therapeutische Kapazität neuer (radioaktiver) Arzneimittel gründlich beurteilen zu können, daher muss der Schwerpunkt darauf gelegt werden - sowohl bei der Generierung des Tumormodells als auch bei der PET-Bildgebung/Datenanalyse bei Kleintieren. Man könnte über das beste Tumormodell bei Tieren diskutieren (subkutane Inokulation oder orthotope Implantation, Mäuse, menschliche oder syngene Tumoren, begleitet oder nicht von einer routinemäßigen klinischen Versorgung begleitet), aber das würde das Ziel dieser Veröffentlichung sprengen. Für Krebsstudien werden von uns mehrere Modelle verwendet, wobei es sich bei dem hier beschriebenen um ein relativ einfaches subkutanes Modell handelt.

Die Qualitätskontrolle in der Radiochemie ist für die Sicherheit der Tiere und die Wirksamkeit der Behandlung von größter Bedeutung. Dies betrifft nicht nur das Radiopharmakon selbst, sondern auch die Produktformulierung. Es gibt umfangreiche Rechtsvorschriften über die Herstellung von Radiopharmazeutika für klinische Anwendungen 8,9 (siehe 10 für einen ausführlichen Überblick über die geltenden Rechtsvorschriften und Leitlinien) und mehrere Leitlinien zu den Eigenschaften von Radiopharmazeutika für die präklinische Forschung (siehe 11 für einen ausführlichen Überblick). Wir stellen Radiopharmazeutika sowohl für klinische als auch für präklinische Anwendungen her und vereinfachen die Übersetzung von High-End-Qualitätskontrollen, wie sie in Synthesen für klinische Anwendungen zu finden sind, in solche für präklinische Anwendungen.

Unser Forschungsschwerpunkt liegt auf der gerichteten Theranostik, insbesondere auf humanen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (HER2)-positiven Krebsarten. Daher entwickeln wir neue Radiopharmazeutika zur Diagnose und Überwachung von Krebs während der Behandlung. Erfolgreiche diagnostische Radiopharmaka werden auch als therapeutische Wirkstoffe unter Verwendung verschiedener Radioisotope evaluiert. Die Evaluierung dieser Radiopharmazeutika erfolgt zunächst im Tiermodell, wobei nach vielversprechenden präklinischen Ergebnissen eine klinische Translation angestrebt wird. In diesem Artikel stellen wir die verwendeten Protokolle vor, am Beispiel eines Radiopharmazeutikas, um die Qualitätskontrolle und -sicherung zu gewährleisten, sowie die Standardpraxis für die intravenöse Injektion von Mäusen und PET/CT-Scans, um die Genauigkeit und Zuverlässigkeit präklinischer Untersuchungen in der molekularen Bildgebung zu verbessern. Das Protokoll ist in drei verschiedene Abschnitte unterteilt: Radiochemie (Tracersynthese und Qualitätskontrolle), Tiermodellerstellung (subkutanes Tumormodell) und Bildgebung.

Protokoll

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Das Forschungsprotokoll entspricht den höchsten Standards des Tierschutzes und steht in strikter Übereinstimmung mit den Tierhaltungsrichtlinien des Universitätsklinikums RWTH Aachen. Wir verpflichten uns, eine ethische und humane Behandlung aller an den Studien beteiligten Tiere zu gewährleisten, und die Verfahren werden von der lokalen Tierethikkommission überprüft und genehmigt. Alle Tierversuche wurden von einer deutschen zuständigen Behörde (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen (LANUV) auf Einhaltung des Tierschutzgesetzes in Verbindung mit der Verordnung zum Schutz von Tieren, die für Versuchs- und andere wissenschaftliche Zwecke verwendet werden, genehmigt.

HINWEIS: Eine vollständige Liste der in dieser Studie verwendeten Geräte, Materialien und Reagenzien finden Sie in der Materialtabelle. Es ist wichtig zu beachten, dass die Handhabung von 68Ga nach Möglichkeit mit der Pipette erfolgen sollte und auf jeden Fall jegliches Metall vermieden werden sollte, da das Eisen die Markierungsausbeute erheblich verringern kann. Das bedeutet, dass Nadeln vermieden werden müssen, bis die radiochemischen Verfahren abgeschlossen sind.

1. Radiochemie

  1. Radiomarkierung von NM-02-DOTA-GA mit 68Ga
    ACHTUNG: Das Protokoll beinhaltet den Umgang und die Manipulation von radioaktivem Material. Forscher müssen die lokalen Gesetze zum Umgang mit radioaktiven Stoffen und ALARA-Praktiken (so niedrig wie vernünftigerweise erreichbar) befolgen, mit Bleiabschirmung arbeiten, die direkte Kontaktzeit minimieren und bei jedem Schritt der Strahlenbelastung einen maximalen Abstand einhalten. Experimentelle Abläufe müssen mit Radioaktivitätsdetektionsgeräten überwacht werden.
    1. Eluieren Sie den 68Ge/68Ga-Generator manuell oder automatisch in 10 mL von 0,6 M HCL (1,2 GBq/10 mL). Fangen Sie das 68Ga auf einer PS-H+ -Kartusche (Größe M - 0,8 ml) ein, indem Sie das Eluat durch die Kartusche leiten. Eluieren Sie die PS-H+ SPE-Kartusche mit insgesamt 1 mL 4 M NaCl schrittweise und langsam in ein Mikrozentrifugenröhrchen.
    2. Verwerfen Sie die ersten 0,3 mL des Eluats und sammeln Sie die restlichen 0,7 mL in einem anderen Mikrozentrifugenröhrchen.
    3. Nehmen Sie ein neues Mikrozentrifugenröhrchen und fahren Sie mit der Radiomarkierung von NM-02-DOTA-GA fort, wie im Protokoll des Herstellers angegeben.
      HINWEIS: Das Nanobody-Chelator-Konjugat (NM-02-DOTA-GA) wurde zuvor gemäß dem Protokoll des Lieferanten hergestellt. Das Konjugat kann in Aliquoten bei -80 °C mehrere Monate gelagert werden.
    4. Stellen Sie den pH-Wert des Produkts mit bis zu 5 μl 3 M NH4OAc auf etwa 7 ein.
  2. Qualitätskontrolle
    1. Messen Sie die Aktivität der konzentrierten Probe im Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Aktivitätsmessgerät in der richtigen Einstellung (68Ga als Isotop; 1 mL Spritze, 0,1 mL für die Geometrie). Die radiochemische Ausbeute (zerfallskorrigiert) sollte mindestens 40% betragen.
    2. Bestimmen Sie den pH-Wert mit einem pH-Teststreifen (0-14), indem Sie eine ausreichende Menge (10-15 μL) auf den pH-Teststreifen auftüfteln.
    3. Dünnschichtchromatographie (DC)
      1. Spot 1 μL des radioaktiven Reaktionsgemisches auf einem mit Siliziumdioxid imprägnierten DC-Streifen. Lassen Sie das Aliquot ca. 1 min trocknen. Lassen Sie die DCC mit Zitronensäure als mobiler Phase, vorgefüllt für ca. 2-3 mm, in einer geschlossenen DC-Kammer laufen. Entfernen Sie den DC-Streifen aus der Kammer, wenn die Flüssigkeit die Oberseite des Streifens erreicht hat.
      2. Legen Sie den DC-Streifen auf einen Funk-TLC-Scanner und messen Sie ihn gemäß dem Protokoll des Herstellers. Das Produkt sollte am Ursprung erscheinen (Rf < 0,2), während freie 68-Ga-Kationen mit der Lösungsmittelfront eluieren (Rf > 0,9).
      3. Berechnen Sie die Radiomarkierungsausbeute der Reaktion, indem Sie das Radiochromatogramm verwenden, indem Sie die integrierte Fläche unter der Kurve (AUC) von Rf 0,0-0,2 durch die Gesamt-AUC (Rf 0,0-1,0) dividieren und mit 100 multiplizieren.
    4. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)
      1. Stellen Sie sicher, dass die HPLC mindestens 10 Minuten lang mit dem richtigen Lösungsmittel gelaufen ist, damit alle Leitungen überflutet werden, und passen Sie die Einstellung für die Messung an. Verwenden Sie den isokratischen Fluss einer 50:50-Mischung aus Acetonitril (Lösungsmittel A) und einer Mischung aus 0,9%iger NaCl-Lösung (980 mL) in Kombination mit Trifluoressigsäure (1 mL) und Citratlösung (20 mL) als Lösungsmittel B. Messen Sie die UV-Absorption bei 280 nm.
      2. Nehmen Sie 5 μl des Produkts und verdünnen Sie es mit 15 μl 0,9 % NaCl. Injizieren Sie 15 μl des Gemisches in die analytische Radio-HPLC (5 μm SEC-s2000 154 Å Säule; Durchflussrate: 2 mL/min).
      3. Verwenden Sie den isokratischen Fluss einer 50:50-Mischung aus Acetonitril (Lösungsmittel A) und einer Mischung aus 0,9%iger NaCl-Lösung (980 mL) in Kombination mit Trifluoressigsäure (1 mL) und Citratlösung (20 mL) als Lösungsmittel B. Messen Sie die UV-Absorption bei 280 nm. Es gibt eine geringfügige Verschiebung der Retentionszeiten zwischen dem UV- und dem Gamma-Kanal; Dies ist auf das Design der HPLC zurückzuführen (das Gammasignal wird in Reihe nach dem UV-Detektor installiert).
      4. Bestimmen Sie die radiochemische Reinheit, indem Sie die Peaks in den Gammakanal integrieren. Das Produkt sollte sich in dem Integrationsbereich befinden, der zuvor durch Messung des nicht radioaktiv markierten Nanobodies bestimmt wurde. Integrieren Sie zusätzlich alle anderen Peaks in den Gammakanal und werten Sie sie als Verunreinigungen aus. Die Reinheit sollte >95% betragen.
    5. Endotoxin
      1. Bereiten Sie eine Verdünnung des Produkts im Verhältnis 1:20 mit einem Gesamtvolumen von 150 μl unter Verwendung von (zertifiziertem) endotoxinfreiem Wasser zum Verdünnen vor.
      2. Setzen Sie eine Einweg-Endotoxin-Kartusche, die im Handel mit allen erforderlichen Reagenzien vorbefüllt ist, in das Endotoxin-Testgerät ein und laden Sie 25 μl des verdünnten Produkts in jede Kartuschenkammer.
      3. Drücken Sie Play. Das PTS verfügt über interne Positiv- und Negativkontrollen und wird in den Abschlussbericht aufgenommen. Der Test dauert ca. 15 min. Das Produkt gilt als endotoxinfrei, wenn der Endotoxingehalt < 8,7 EU/ml bei Vmax = 20 mL beträgt.
    6. Retrospektive Sterilität
      1. Nach der Injektion und Entnahme der Qualitätsprobe ist das Radiopharmakon in einem sterilen Fläschchen im Kühlschrank bei 4 °C aufzubewahren.
      2. Übergeben Sie die Probe an ein zertifiziertes Institut zur Sterilitätsanalyse (entweder intern oder externes Unternehmen), wenn die Freigrenze von 10,5 Bq oder 10 Bq/g nicht überschritten wird, um eine Sterilitätsprüfung nach12 durchzuführen.
  3. Spritzenvorbereitung (eine pro Tier)
    1. Messen Sie die Aktivität des Produkts mit einem Aktivitätsmesser in der richtigen Einstellung (68Ga als Isotop; 1 mL Spritze, 0,1 mL für Geometrie).
    2. Nehmen Sie 15 MBq des Produkts (ca. 25 μl) in ein Mikrozentrifugenröhrchen und füllen Sie das Volumen mit 0,9 % NaCl auf 75 μl.
    3. Geben Sie 50 μl in die Spritze und messen Sie sie mit einem Aktivitätsmessgerät in der richtigen Einstellung (68Ga als Isotop; 1 mL als Spritze, 0,1 mL für die Geometrie). Die Spritze sollte 10 MBq des Produkts enthalten.
      HINWEIS: Sobald der 68Ga-markierte Nanobody NM-02 gebildet ist, sind beim Umgang mit dem 68Ga keine Pipettenspitzen mehr aus Kunststoff erforderlich. Von hier an verwenden Sie immer dann, wenn im Protokoll der Umgang mit einer Flüssigkeit erwähnt wird, eine geeignete Spritze (1 ml) und eine Nadel (27-30 G).

2. Generierung von Tiermodellen

  1. Unterbringung von Tieren
    1. Verwenden Sie weibliche immundefiziente Rj: ATHYM-Foxn1nu/nu-Mäuse im Alter von 6-8 Wochen (von einem kommerziellen Anbieter) zur Entwicklung subkutaner Tumoren. Bei der Ankunft alle Mäuse direkt im Tierzimmer unterbringen und mindestens 1 Woche Nachtransport zur Eingewöhnung geben.
    2. Halten Sie die Tiere in einem 12 h hellen/12 h dunklen Zyklus und bieten Sie freien Zugang zu Futter und Wasser. Halten Sie die Raumtemperatur und die relative Luftfeuchtigkeit zwischen 20-25 °C bzw. 45%-65%.
  2. Vorbereitung der Zellen für die Implantation
    1. Beginnen Sie die Zellkultur mit 1 x 106 SKOV-3-Zellen und geben Sie 25 ml vorgewärmtes DMEM/F12-Medium, angereichert mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin, in einen T175-Zellkulturkolben.
    2. Kultivieren Sie die Zellen in einem Inkubator bei 37 °C und 5% CO2 und tauschen Sie das komplette Medium mindestens 2x pro Woche aus.
    3. Nach 1 Woche oder spätestens 1 Tag vor der Zellimplantation werden 20 μl Medium aus dem Zellkulturkolben entnommen, um auf Mykoplasmen13 zu testen. Verwenden Sie nur Mykoplasmen-negative Zellen für die Zellinjektion.
    4. Am Tag der Zellinjektion aspirieren Sie das gesamte Medium und pipettieren Sie 5 ml PBS in die Flasche. Schwenken Sie die Flasche mehrmals hin und her, um das restliche Medium abzuwaschen.
    5. 3 ml Trypsin werden in den Kolben gegeben und 4 Minuten lang im Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert, um die Zellen zu dissoziieren. Prüfen Sie unter dem Mikroskop mit 40-facher Vergrößerung, ob sich die Zellen vom Zellkulturkolben gelöst haben.
    6. Fügen Sie 7 ml Medium hinzu, um die Trypsinaktivität zu neutralisieren, und überführen Sie die Zellsuspension in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen.
    7. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 150 x g für 5 min (bei Raumtemperatur), um ein Zellpellet zu erhalten. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 1 ml Medium hinzu, um die Zellen zu resuspendieren.
    8. Nehmen Sie 12 μl der Zellsuspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie die gleiche Menge Trypanblau hinzu. Beladen Sie die Hämozytometerkammer mit 10 μl der sorgfältig gemischten Zellsuspension.
    9. Zählen Sie die ungefärbten, lebensfähigen Zellen innerhalb des definierten Bereichs und berechnen Sie die Zellzahl. Stellen Sie die Zellkonzentration auf 5 x 107 Zellen/ml-Medium ein und mischen Sie die Zellsuspension vorsichtig mit 1 mL Basalmembranmatrix.
    10. Nehmen Sie 5 x 106 Zellen in 0,2 ml Zellmedium mit 50% Basalmembranmatrix in einer 1 mL Insulinspritze für jede Maus. Halten Sie die Spritze bis zur Injektion auf Eis, um eine Verfestigung der Basalmembranmatrix zu verhindern.
      HINWEIS: Wenn eine Maus weniger als 20 g wiegt, injizieren Sie nur 150 μl (für 15-20 g) oder 100 μl (für 10-15 g) der Mischung. Bei subkutanen Anwendungen wird darauf geachtet, dass das von der GV-SOLAS empfohlene maximale Volumen von 10 ml/kg Körpergewicht nicht überschritten wird14.
  3. Inokulation und Nachsorge
    1. Injizieren Sie die Zellsuspension subkutan in die Flanke des wachen Tieres, indem Sie Hals und Schwanz mit einer Hand fixieren. In der Regel bevorzugen wir Injektionen in die linke Flanke.
    2. Warten Sie 10-15 s, bis die Basalmembranmatrix ausgehärtet ist, und entfernen Sie dann die Nadel.
    3. Überwachen Sie das Tumorwachstum täglich nach der Implantation mit einem digitalen Messschieber, um zwei senkrechte Tumorachsen zu messen.
    4. Anhand dieser Messungen beurteilen Sie das Tumorwachstum anhand des Tumorvolumens, das nach folgender Formel berechnet wird:
      VT = L × B2 × π / 6
      wobei VT das Tumorvolumen in mm3 ist, L die Länge des Tumors in mm (d. h. die größere von zwei senkrechten Achsen) und B die Breite des Tumors in mm ist (d. h. die kleinere von zwei senkrechten Achsen15). Diese Technik neigt dazu, das Tumorvolumen zu überschätzen, da sie auch die Haut umfasst.
    5. Die Tumormasse beeinflusst das Gewicht der Maus, wenn sie auf der elektronischen Waage gemessen wird. Um das Gewicht des Tieres zu berechnen, das um die Tumormasse korrigiert wurde, verwenden Sie die folgende Formel:
      mMaus-T = mMaus - 0,82 × VT
      wobei mMaus-T das Gewicht der Maus ohne die Tumormasse in g ist, mMaus das Gewicht der Maus gemäß der elektronischen Waage in g und VT das berechnete Tumorvolumen in mm3 ist. Die Zahl 0,82 g/mm3 ergibt sich aus dem Mittelwert einer Reihe von Tumoren, die aus früheren Tierversuchen isoliert, gewogen und deren Volumen nach der angegebenen Formel bestimmt wurden. Sie stellt eine durchschnittliche Tumordichte dar.
    6. Bestimmen Sie außerdem, wie groß der Tumor im Vergleich zur Maus ist, und überwachen Sie die Tumorlast mit der folgenden Formel:
      Tumorlast [%] = (0,82 × VT) / mMaus × 100
      wobei die Tumorlast in Prozent ausgedrückt wird, entspricht 0,82 × VT der Tumormasse in g (d. h. VT, das berechnete Tumorvolumen in mm3, mal die mittlere Tumordichte), und mMaus ist das Mausgewicht gemäß der Skala in g.
    7. Wenn die Tiere ein Tumorvolumen von mehr als 200 mm3 erreichen, planen Sie sie je nach Versuch für eine nicht-invasive PET/CT oder SPECT/CT ein.

3. Bildgebung

  1. Spritzenvorbereitung (Sonderanfertigung)
    HINWEIS: Der Mausschwanz ist klein; daher ist die Verwendung einer 27G-Kanüle oder kleiner erforderlich (größere Zahlen entsprechen kleineren Nadeln). Bei weiblichen Mäusen sind die einzigen zugänglichen Venen für Bolusinjektionen die drei Schwanzvenen. Anatomisch gesehen liegt die dorsale Schwanzvene im Vergleich zu den beiden Seitenvenen näher an der Wirbelsäule; Injizieren Sie nicht in diese Vene, um iatrogenes Knochenkratzen zu vermeiden. Erfahrungsgemäß liefert die Verwendung einer 30G-Kanüle die besten Ergebnisse, da auch kleinere Venen zugänglich sein können. Da 30G-Katheter nicht käuflich zu erwerben sind, muss dieser Typ vom Forscher mit Sorgfalt hergestellt werden.
    1. Bereiten Sie die Spritze mit dem radioaktiven Tracer in Abhängigkeit vom geplanten Verabreichungsweg vor. Bei intravenösen Injektionen ist darauf zu achten, dass einer Maus von 25 g ein maximales Volumen von 5 ml/kg Körpergewicht verabreicht wird. Dies bedeutet ein maximales injiziertes Volumen von 125 μL.
    2. Um einen 30G-Katheter vorzubereiten, verwenden Sie zunächst eine beliebige 30G-Nadel und entfernen Sie den metallischen Nadelschaft, entweder mit einer Metallschere oder indem Sie ihn vom Kunststoff wegbiegen.
    3. Führen Sie manuell ein PE10-Rohr mit einem Durchmesser von 0,3 mm in den Teil der Welle ein, der von der Nabe entfernt wurde. Es muss darauf geachtet werden, dass das Rohr nicht perforiert wird.
      HINWEIS: Es können auch andere Kunststoffarten verwendet werden; PE10 bietet jedoch die beste Balance zwischen Wandsteifigkeit und Flexibilität.
  2. Intravenöse Injektion
    HINWEIS: Intravenöse Injektionen können auch bei wachen Tieren durchgeführt werden; Ist dies jedoch nicht erforderlich, müssen die Tiere unter Isofluran-Sedierung injiziert werden, um die Belastung des Versuchstieres zu verringern.
    1. Füllen Sie den 30G-Katheter mit 0,9 % NaCl-Puffer oder einem anderen gewünschten Puffer.
    2. Legen Sie die Maus in eine Induktionskammer und füllen Sie sie kontinuierlich mit einem Gemisch aus Sauerstoff (oder medizinischer Druckluft) und gasförmigem Isofluran, bis das Tier den Aufrichtreflex verliert. Für die Induktion verwenden Sie 3,5%-5% Isofluran mit einem Sauerstoff- oder Luftstrom von 0,8 l/min.
    3. Platzieren Sie die sedierte Maus sofort in einer anfänglichen ventralen Position auf einer Heizmatte (37-38 °C), während die Isofluran-Sedierung durch einen Nasenkonus aufrechterhalten wird. Kontrollieren Sie die Mäuse häufig auf Anzeichen von Überhitzung (z. B. übermäßige Dehnung, schnelle Atmung, Rötung der Haut). Zur Aufrechterhaltung der Anästhesie verwenden Sie 1,8%-2,5% Isofluran mit einem Sauerstoff- oder Luftstrom von 0,8 l/min.
    4. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen des Tieres auf, um ein Austrocknen während der Sedierung zu verhindern. Untersuchen Sie beide seitlichen Schwanzvenen und wählen Sie die beste für die Injektion aus. Die Sichtbarkeit und der Durchmesser der Vene müssen berücksichtigt werden. Um ein optimales Ergebnis zu erzielen, drehen Sie den Schwanz leicht, so dass die ausgewählte Vene mit der Heizmatte in Kontakt kommt, und lassen Sie die Vene 1 Minute lang erweitern.
    5. Drehen Sie die gesamte Maus in die seitliche Position, so dass die ausgewählte Vene nach oben kommt. Fixiere die Spitze und den Ansatz des Schwanzes mit Klebeband.
    6. Nehmen Sie den 30G-Katheter mit der dominanten Hand und legen Sie den Zeigefinger der nicht-dominanten Hand vorsichtig auf die ausgewählte Vene, um einen Blutstau im Inneren zu erzeugen. An der Stelle des Backups weitet sich die Vene und bildet einen kleinen Buckel.
    7. Platzieren Sie den 30G-Katheter mit der dominanten Hand parallel zum Schwanz in Richtung des Höckers an der Vene. Bewege die dominante Hand nach vorne. Meistens sorgt diese Technik für eine direkte Venenpunktion.
    8. Im Inneren der Vene wird der Blutrückfluss in der Kunststoffröhre sichtbar. Fixieren Sie den Kunststoffschlauch, um sicherzustellen, dass sich die Nadel während der Injektion nicht in der Vene bewegt. Führen Sie am freien Ende des Röhrchens die Tracer-Spritze ein, die mit einer 30G-Nadel verbunden ist.
      HINWEIS: Wenn eine dynamische Verteilung des Tracers beurteilt werden muss, müssen die folgenden Punkte durchgeführt werden, nachdem das Tier auf das PET-Scannerbett gelegt und das PET eingeleitet wurde.
    9. Injizieren Sie den Inhalt der Tracerspritze langsam für mindestens 10 s. Während die 30G-Nadel weiterhin mit dem 30G-Kathetersystem verbunden bleibt, entfernen Sie nur die Tracerspritze und schließen Sie eine Spritze mit 0,9 % NaCl-Puffer (oder einem anderen gewünschten Puffer) an, um den Katheter zu spülen. Überwachen Sie die Atmung während des Injektionsvorgangs kontinuierlich und passen Sie die Isoflurankonzentration so an, dass sie etwa 1 Atemzug pro Sekunde aufrechterhält.
    10. Entfernen Sie den 30G-Katheter aus der Schwanzvene und verwenden Sie eine sterile Baumwollkompresse, um die Blutung zu stoppen.
    11. Um die übrig gebliebene Aktivität zu messen, messen Sie den 30G-Katheter, die Pufferspritze, die leere Tracerspritze und die Wattekompresse, da sie alle geringe Mengen an Tracer enthalten, die das Tier nicht erreicht haben.
  3. PET/CT-Erfassung
    HINWEIS: Für 68Ga-markierte Nanobodies NM-02 werden alle Tiere mit einem PET/CT-System für Kleintiere abgebildet.
    1. PET-Akquisition
      1. Legen Sie die sedierte Maus in Bauchlage auf das Tierbett und befestigen Sie sie am PET-Scanner. Schalten Sie den Isofluranfluss auf den Nasenkegel des PET um und halten Sie ihn bei 1,5 %-2,5 % Isofluran in der medizinischen Luft bei 0,8 l/min, so dass die Atemfrequenz des Tieres während des Scans zwischen 75 und 50 Atemzügen pro Minute liegt.
      2. Fixieren Sie die Maus hinter dem Hals mit medizinischem Klebeband am Tierbett. Tragen Sie bei Bedarf noch einmal eine Augensalbe auf die Augen der Maus auf, um ein Austrocknen während der Sedierung zu verhindern.
      3. Schalten Sie das Heizkissen im Tierbett auf ca. 80 % Leistung ein, was etwa 30 °C entspricht.
      4. Stellen Sie die Erfassungszeit auf 45 Minuten ein und wählen Sie den interessierenden Bereich aus, der gescannt werden soll. Wählen Sie 68Ga als Studienisotop aus und starten Sie den Scan. Geben Sie die Menge der injizierten Aktivität, den Zeitpunkt der Injektion und den Zeitpunkt der Messung der leeren Spritze ein. Eine PET-Bettposition beträgt 160 mm, was lang genug für einen Ganzkörper-Mausscan ist.
      5. Wenn eine dynamische Verteilung des Tracers beurteilt werden muss, starten Sie zuerst den PET-Scan, warten Sie 30 s auf die Erfassung und fahren Sie erst dann mit den Schritten 3.2.9-3.2.10 fort. Lassen Sie den Katheter mit der Pufferspritze in der Maus, um weiteren Blutverlust zu vermeiden. Der Katheter kann am Ende der PET vor der CT-Aufnahme getrennt werden, um Artefakte zu vermeiden.
    2. CT-Erfassung
      1. Trennen Sie das Tierbett vom PET-Scanner und verbinden Sie es sofort mit dem CT-Scanner. Bei Bedarf auch die Kanüle von der Schwanzvene lösen. Mindestens 30 Minuten nach der Venenpunktion ist die Injektionsstelle bereits koaguliert, so dass keine Blutungen mehr auftreten.
      2. Schalten Sie den Isofluranfluss auf den Nasenkonus im CT-Scanner um.
      3. Wählen Sie denselben Bereich aus, der für die PET-Bildgebung gescannt werden soll. Wählen Sie das Standard-Erfassungsprotokoll: 440 μA, 50 kVp, 32 ms Belichtungszeit und 1080°-Drehung in einem Spiralmodus mit 960 Belichtungen/360°; Die Dauer des CT-Scans beträgt ca. 7 Minuten für einen Ganzkörper-Mausscan.
      4. Steuern Sie die Atemfrequenz und schalten Sie das Heizkissen im Tierbett ein. Überwachen Sie die Atmung während der Scans kontinuierlich und passen Sie die Isoflurankonzentration an, um eine Atemfrequenz zwischen 75 und 50 Atemzügen pro Minute aufrechtzuerhalten.

4. Tierpflege nach der Bildgebung

  1. Am Ende der Scans benötigt das Tier mindestens 15 Minuten, um aufzuwachen. Um Aggressionen durch Wurfgeschwister zu vermeiden, sperren Sie das Tier etwa 15 Minuten lang allein ein oder bis es in der Lage ist, selbstständig zu gehen, bis Sie es wieder in seinen ursprünglichen Käfig setzen. Verwenden Sie während dieser Zeit Infrarotlicht, um Unterkühlung zu vermeiden.
  2. Platzieren Sie das Tier zunächst auf der linken Seite (sichere Position), um einen hämodynamischen Schock zu vermeiden. Lassen Sie die Augensalbe einwirken, da sie vom Tier selbst entfernt wird, sobald es wach ist.

5. PET/CT-Rekonstruktion

  1. Führen Sie die PET-Rekonstruktion unter Verwendung einer 3-dimensionalen Erwartungsmaximierung geordneter Teilmengen (d. h. OSEM-3D mit 30 Iterationen) mit einem Energiefenster von ± 15 % von einem Peak von 511 keV bis zu einer isometrischen Voxelgröße von 0,4 mm in einer Matrix von 192 × 192 × 384 durch. Wenden Sie CT-basierte Korrekturen (d. h. Dämpfungskorrektur, Streukorrektur, Totzeit und Zufallsereignisse) auf die PET-Rekonstruktion an.
  2. Falls eine dynamische Verteilung des Tracers beurteilt werden muss, ist eine Multi-Frame-Rekonstruktion durchzuführen. Als Beispiel können die folgenden Frames für einen 45-minütigen Scan verwendet werden: 4 x 30 s, 3 x 1 min, 5 x 2 min, 2 x 5 min und 2 x 10 min.
  3. Rekonstruktion von CT-Standard-Erfassungsprotokollen unter Verwendung eines iterativen Rekonstruktionsalgorithmus (d. h. ISRA) auf eine isometrische Voxelgröße von 0,2 mm in einer 200 × 200 × 425 Matrix. Rechnen Sie mit Hilfe der Anbietersoftware CT-Werte in Hounsfield-Einheiten (HU) um, indem Sie die Formel verwenden:
    figure-protocol-1
    Dabei ist μw der lineare Dämpfungskoeffizient von Wasser, μa der lineare Dämpfungskoeffizient von Luft und μt der lineare Dämpfungskoeffizient des Gewebes.
  4. PET- und CT-Bilder wurden nach der Rekonstruktion automatisch mit Hilfe der Matrix abgeglichen, die aus einem Kapillarphantomscan generiert wurde. Archivieren Sie alle rekonstruierten Daten und übertragen Sie sie bei Bedarf mit Hilfe einer Bildanalysesoftware auf einen Datenbankserver.

6. Bildverarbeitung und -analyse

HINWEIS: Die mitregistrierten PET/CT-Bilder werden weiterhin für die Quantifizierung innerhalb des Datenbankservers einer Bildanalysesoftware verwendet, wobei jeder Hybrid-Scan als Subjekt gespeichert wird.

  1. Identifizieren Sie den Tumor anhand der CT und wählen Sie diese als Region of Interest aus. Maskieren Sie die Tumorbasis manuell auf der CT.
  2. Um eine benutzerunabhängige Segmentierung zu erreichen, wird die neu gebildete Tumormaske auf PET oder SPECT untersucht. Für PET wird ein minimaler Schwellenwert von 1,0 standardisierter Aufnahmewert (SUV) verwendet. Verwenden Sie für die SPECT einen minimalen Schwellenwert, der höher ist als die durchschnittliche Blutpoolaufnahme, die im Herzen oder in der terminalen Bauchschlagader gemessen wird.
  3. Notieren Sie den Mittelwert, das Maximum, den Durchschnitt der heißesten 10 Voxel (d. h. den heißen Durchschnitt von 10) und die Gesamtaufnahme der neu generierten interessierenden Volumina.
  4. Verwenden Sie diese Werte, um SUV- und Target-to-Background-Werte (TBR) zu generieren, die für die statistische Analyse weiter verwendet werden.

Ergebnisse

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Einer der wichtigsten Aspekte der Qualitätskontrolle eines Radiopharmakons ist die HPLC, da sie nicht nur die chemische und radiochemische Reinheit (in diesem Fall 98,2%) zeigt, sondern auch den Nachweis der Identität des Radiopharmakons ermöglicht, indem die Elutionszeit und die Peakform mit der einer nicht-radioaktiven Referenzverbindung verglichen wird. Bei dieser Referenzverbindung handelt es sich in diesem Fall um einen unmarkierten Nanokörper, der sich durch klassische Techniken wie die Massenspektrometrie oder die Kernspinresonanz als die richtige Verbindung erwiesen hat. Diese Techniken können nicht direkt auf die radioaktive Verbindung angewendet werden (es gibt nicht genügend Masse, um ein Signal zu erzeugen), aber durch den Vergleich der radioaktiven Verbindung mit ihrer Referenz werden ausreichende Beweise dafür gesammelt, dass die richtige Verbindung tatsächlich markiert und während der Synthese nicht verändert wurde. Beachten Sie den geringfügigen Unterschied in der Retentionszeit zwischen dem radioaktiven Produkt und der Referenz in Abbildung 1, der der seriellen Messung des HPLC-Flusses entspricht (UV wird zuerst gemessen; der Fluss benötigt dann etwa 0,2 Minuten, um den Radioaktivitätsdetektor in einem typischen Aufbau zu erreichen).

figure-results-1
Abbildung 1: Typisches analytisches HPLC-Chromatogramm zur Qualitätskontrolle von 68Ga-markierten Nanobodies NM-02 (GLNM-02). Die UV-Absorption der kalten Verbindung (d. h. das obere Bild) wird bei 280 nm gemessen und zeigt einen Peak bei 4,18 min, mit einer Verschiebung von 0,22 min. Der Peak des 68-Ga-markierten Produkts ist im Gamma-Detektor (d. h. im unteren Bereich) zu sehen. Die radiochemische Ausbeute liegt bei 98,2 %. mAU = milli Absorptionseinheiten, NM-02 = unser Produkt, UV = ultravioletter Lichtkanal, nm = Nanometer, min = Minute, CPS = Zählungen pro Sekunde, GLMN-02 = 68Ga-markierte Nanobodies NM-02, 68Ga-DOTA-GA = [68Ga]Ga-DOTA-GA, γ ChA = Gammakanal. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

In Ermangelung einer HPLC oder zusätzlich zu dieser kann die DC-Methode verwendet werden, um die Markierungsausbeute und die Reinheit des Endprodukts zu bestimmen (jedoch nicht die Identität und nicht so detailliert wie die HPLC). Aufgrund ihrer geringen Komplexität ist die DC-Therapie ideal, wenn der Radiosyntheseweg noch optimiert wird. Abbildung 2 zeigt das DC-Chromatogramm des 68Ga-markierten Nanobodies NM-02 (scheinbare radiochemische Reinheit 99,9%).

figure-results-2
Abbildung 2: Typisches analytisches DC-Chromatogramm zur Qualitätskontrolle von 68Ga-markierten Nanobodies NM-02 (GLNM-02). Die Flächenzahlen werden gegen die Strecke aufgetragen, die das Lösungsmittel (Citrat) auf der DC-Platte zurückgelegt hat. Der Rf beträgt 0,2 und die radiochemische Reinheit 99,9 %. C = Anzahl, mm = Millimeter, GLNM-02 = 68Ga-markierter Nanobody NM-02, TLC = Dünnschichtchromatographie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Bei der Vorbereitung von Bilddaten für die Veröffentlichung ist es üblich, mindestens ein eigenständiges CT- und PET-Bild zu zeigen. Dieser Ansatz ermöglicht eine umfassende Bewertung der Biodistribution von Tracern. Die Standard-CT-Skalierung liegt zwischen -1000 HU und 1000 HU, was die Visualisierung aller Weichteile in einem einzigen Fenster ermöglicht. Wie in Abbildung 3A gezeigt, ermöglicht diese Methode eine klare Abgrenzung der Mausnieren bei gleichzeitiger Knochenbestimmung.

Für die PET-Skala legen Sie den unteren Schwellenwert bei einem SUV von 0,0 fest, während Sie einen minimalen oberen Schwellenwert von 1,0 beibehalten (Abbildung 3B), vorzugsweise unter Verwendung der Normalisierung des Körpergewichts während der SUV-Berechnung (d. h. SUVbw). Darüber hinaus wird für die Quantifizierung SUVmean im Vergleich zu SUVmax bevorzugt; Sollte der SUVmax verwendet werden, dann wird bei derSUV-BW-Berechnung der Durchschnitt der heißesten 10 Voxel anstelle des Wertes des heißesten Einzelvoxels verwendet. Bereiten Sie Merkmalsfusionen von PET/CT-Bildern vor, indem Sie die CT- und PET-Schichten zusammenführen (Abbildung 3C).

Um den Lesern eine unabhängige Beurteilung der Ganzkörper-Tracer-Bioverteilung zu ermöglichen, kann die maximale Intensitätsprojektion desselben PET-Scans mit derselben Skala wie die PET-Scheibe dargestellt werden (Abbildung 3D).

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Abbildung 3: In vivo PET/CT-Bilder einer subkutanen SKOV-3 tumortragenden Maus. Das Bild wurde 3 Stunden nach intravenöser Injektion von 5 MBq 68Ga-markiertem Nanobody NM-02 (GLNM-02) aufgenommen. (A) Das CT-Bild ist zwischen -1000 HU und 1000 HU skaliert, während (B) das PET-Bild zwischen einem SUV von 0,0 und 5,0 liegt. (C) Bei der PET/CT-Fusion wird die gleiche Skala verwendet. (D) Das MIP-PET-Bild (Maximum Intensity Projection) wird ebenfalls mit einem SUV von 0,0 und 5,0 skaliert. Alle PET-Bilder zeigen eine gute Tumoraufnahme von GLNM-02, und die renale Clearance ist deutlich sichtbar. CT = Computertomographie, PET = Positronen-Emissions-Tomographie, MIP = maximale Intensitätsprojektion, HU = Hounsfield-Einheit, SUV = standardisierter Aufnahmewert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Im speziellen Fall des 68Ga-markierten Nanobodies NM-02 kann eine bemerkenswerte Tumoraufnahme in der linken Flanke der Maus beobachtet werden. Zusätzlich ist auch die renale Clearance des Tracers offensichtlich. Durch die Präsentation der maximalen PET-Intensitätsprojektion wird auch die Harnblasenaktivität sichtbar, wodurch die renale Clearance des Tracers verstärkt wird. In diesem speziellen Fall ist es erwähnenswert, dass die Niere, der Tumor und die Blase nicht in derselben 2D-Schicht dargestellt werden können. Durch die Einbeziehung der Projektion der maximalen Intensität in Publikationen wird die gesamte Bioverteilung des Tracers im selben Bild dargestellt.

Diskussion

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Radiosynthese
Die hier beschriebene Radiosynthese ist typisch für eine neue 68-Ga-markierte Verbindung - kurze Synthesezeit, wobei der Schwerpunkt auf einem geeigneten pH-Wert liegt und Metalle nach Möglichkeit vermieden werden. Dafür ist es wichtig, sich strikt an die Reihenfolge zu halten, in der die Komponenten hinzugefügt werden. In jedem Fall muss der pH-Wert der 68Ga Lösung zunächst mit 3 M NH4OAc auf pH 4 eingestellt werden; Andernfalls kann sich der Nanobody abbauen, wenn der pH-Wert zu sauer ist. Die allgemeinen Konzepte der 68-Ga-Synthesewurden bereits in16 Jahren beschrieben, daher werden wir hier nicht ins Detail gehen. Das automatisierte Synthesemodul bedarf einer weiteren Optimierung hinsichtlich einer Reduzierung der Strahlendosis. Dies erfordert einen erheblichen Aufwand, der den Rahmen der explorativen Forschung in einem typischen präklinischen Experiment, wie hier beschrieben, sprengt. Darüber hinaus ist es unwahrscheinlich, dass eine automatisierte Synthese die kleinen Volumina liefert, die wir mit der derzeitigen Methode (< 1 ml) herstellen können, was höhere Konzentrationen von 68Ga und eine höhere spezifische Aktivität ermöglicht.

Die Qualitätskontrolle sollte nach wie vor sehr detailliert durchgeführt und registriert werden. Eine Ausnahme bildet der pH-Wert: Während pH-Messungen für klinische Synthesen häufig sehr genau mit pH-Messgeräten durchgeführt werden, reicht es hier aus, den pH-Wert mit einem einfachen pH-Streifen zu messen, da die Anforderungen an intravenöse Injektionen dies zulassen (jeder pH-Wert zwischen 6 und 8 ist zulässig14). Diese einfache Technik reduziert die Kosten und die Wahrscheinlichkeit, dass Geräte mit radioaktivem Material kontaminiert werden.

Formulierungen für Tiermodelle
Die endgültige Formulierung des Tracers ist ein entscheidender Aspekt des Tracers, ein Aspekt, der in der präklinischen Forschung oft nur schlecht beschrieben wird. Während es klare Rechtsvorschriften für die Formulierung von Arzneimitteln für Versuche am Menschen, einschließlich Radiopharmazeutika, gibt, gibt es präklinisch nur Leitlinien17,18, die nicht speziell auf Lösungsmittel oder Formulierungen eingehen. Diese Leitlinien werden häufig bei der Erstellung oder Bewertung gesetzlich vorgeschriebener Protokolle zur Genehmigung durch (Tier-)Ethikkommissionen (in Deutschland: LANUV19) verwendet, betonen jedoch in diesen Dokumenten nur unzureichend die Bedeutung der Formulierung. Es ist wahrscheinlich, dass schlechte Formulierungen zu falschen (negativen) Ergebnissen führen können, aber eine solche Behauptung ist schwer zu überprüfen, wenn man bedenkt, dass auch im Bereich der Onkologie immer noch ein hartnäckiger Publikationsbias besteht20.

Zusätzlich zu den ARRIVE-Richtlinien haben wir uns dafür entschieden, uns so weit wie möglich an die Gesetzgebung zu halten, die für den Menschen konzipiert wurde, und davon auszugehen, dass Formulierungen, die für den Menschen geeignet sind, im Allgemeinen auch für Nagetiere geeignet sind. Der Hauptunterschied besteht in der Größe des Subjekts und damit in der Volumenmenge, die sicher injiziert werden kann. Zu diesem Zweck haben wir uns dafür entschieden, die Verbindung nach Möglichkeit mit Molekulargewichts-Cut-off-Filtern (MWCO) zu reinigen, da sich diese bei der Reinigung großer Verbindungen als wirksam erwiesenhaben 21. Sie ermöglichen es, einen typischen 68Ga-markierten Tracer schließlich in einer Lösung seiner Wahl und in einem kleinen Volumen aufzulösen, das für Mäuse geeignet ist (typische maximale intravenöse Injektion 100 - 150 μL).

In Deutschland dient die GV-SOLAS (Gesellschaft für Versuchstierkunde) als Vermittler zwischen Tierschutz und Forschung, von der Mensch und Tier profitieren. Daher hat dieser Verband Empfehlungen für mehrere Aspekte der Tierversuche, insbesondere in den Bereichen Onkologie und Anästhesie, erarbeitet, um die Tierpflege auf nationaler Ebene zu standardisieren14. Von nun an setzen die meisten zuständigen Behörden und nationalen Ethikkommissionen die Einhaltung dieser Empfehlungen durch Tierprotokolle durch. GV-SOLAS hat Empfehlungen für das maximale Volumen der meisten Anwendungsrouten. Für die intravenöse Injektion wird eine maximale Menge von 5 ml/kg Körpergewicht empfohlen; Bei einer 25-g-Maus entspricht dies 150 μL. Aus diesem Grund sind alle radioaktiven Tracerproduktionen auf ein maximales Injektionsvolumen von 150 μl pro Tier eingestellt. Das Überschreiten dieser Schwelle bei intravenöser Injektion erhöht das Risiko einer akuten Herzinsuffizienz, die durch Hypervolämie verursacht wird. Wiederholte intravenöse Injektionen, die diesen Schwellenwert überschreiten, führen zu einem erhöhten Risiko für Lungenfibrose, da jede Injektion in Abhängigkeit von der Strömungsgeschwindigkeit ein leichtes Lungenödem verursacht. Ein menschliches Äquivalent der in diesem Artikel vorgestellten Maus-IV wäre die intravenöse Injektion in einen Bolus (innerhalb von 10 s) eines Gesamtvolumens von 375 ml für einen 75 kg schweren Menschen. In der klinischen Standardversorgung werden 500 ml 0,9%ige NaCl-Lösung über 1 h verabreicht; Dies bedeutet, dass 375 ml über 45 Minuten verabreicht werden, um Komplikationen zu vermeiden.

GV-SOLAS empfiehlt, dass die Tumorlast nicht mehr als 5 % erreicht; Falls das Tier behandelt wird, kann die Belastung auf bis zu 10 % verlängert werden22. Dieser Unterschied zwischen behandelten und unbehandelten Gruppen hat das Potenzial, einen Forschungsbias zu schaffen, insbesondere im Falle des Überlebens, da behandelte Tumormäuse eine höhere Tumorlast erreichen können als die afferente Kontrollgruppe. Um solche Fälle zu vermeiden, sollte entweder auch die Tumorlast von 5 % für Behandlungstiere festgelegt werden; Dies kann jedoch zu ethischen Dilemmata führen, wenn es darum geht, Versuchstiere vor Erreichen eines sogenannten humanen Endpunkts zu töten, oder (vorzugsweise) argumentieren, dass die Erhöhung auf 10% im Falle der afferenten Kontrollgruppen ethisch begründet ist, um Verzerrungen zu vermeiden.

Da die Tumorlast jeden Tag nicht-invasiv berechnet werden muss, wenden wir einen Korrekturfaktor (d.h. 0,82) an, um das täglich berechnete Tumorvolumen in ein Tumorgewicht umzurechnen. Wir berechneten diesen Faktor, indem wir die Tumordurchmesser mit einem digitalen Messschieber vor der Tötung der Tiere gemäß dem Protokoll und später das tatsächliche Tumorgewicht mit einer Waage maßen. Dieser Korrekturfaktor unterscheidet sich von der Dichte des Tumorgewebes, da das gemessene Tumorvolumen auch die Haut umfasst. Daher liegt dieser Faktor wahrscheinlich bei < 1,0, da das gemessene Tumorvolumen größer ist als das reale Tumorvolumen. Da die von uns gewogenen Tumore relativ groß waren, da die Beurteilung am letzten Tag des Experiments erfolgte, überschätzt dieser Faktor in der Tat das Gewicht kleiner Tumoren. Es sollte nur zur Beurteilung der Tumorlast verwendet werden.

Ein weiterer Aspekt der GV-SOLAS-Empfehlungen ist, dass für Mäuse ein fester Tumordurchmesser von 15 mm als humaner Endpunkt festgelegt wird17. Häufig neigt der Tumor dazu, entlang des Nadelkanals, der durch die subkutane Injektion entsteht, schnell zu wachsen, wenn nach der Lösung, die Tumorzellen enthält, keine Luft oder ein Pfropfen injiziert wird. Daher werden die 15 mm schneller zu bestimmten Anwendungswegen erreicht. Da einige Tumoren erfahrungsgemäß in einer elliptischen Form wachsen, haben wir die oben erwähnte Tumorvolumenformel angepasst und verwendet, um unvoreingenommene Vergleiche zwischen verschiedenen Applikationswegen anzustellen.

Die von uns verwendeten Tiermodelle sind nach den Richtlinien von ARRIVE17 und PREPARE18 konzipiert und ermöglichen eine einfache experimentelle Reproduktion. Das Modell unterliegt einem gewissen Grad an Variation, da die Tumorwachstumsrate zwischen verschiedenen Mäusen variiert, was die Standardisierung und Interpretation erschwert. Diese Variationen spiegeln jedoch die intra- und intertumorale Heterogenität wider, die bei den Krebspatienten vorhanden ist23.

Dieses Protokoll ist nicht ohne Einschränkungen. Die Tiere müssen während der Injektion, insbesondere während der PET/CT-Untersuchung, sediert werden. Die Sedierung, insbesondere mit Isofluran, beeinträchtigt den Blutfluss, und die Tiere können unterkühlt werden, was die Verwendung einer Heizmatte und die Überwachung der Sedierungstiefe erfordert. Dieses Problem kann vermieden werden, indem wache Tiere gescannt werden. Dies erfordert jedoch spezialisierte Software und Know-how im eigenen Haus, die oft nicht verfügbar sind.

Eine weitere Einschränkung ist die Strahlendosis. Obwohl die Dosis, die die Tiere erhalten, für einen einzelnen Scan vernachlässigbar ist, kann die Durchführung mehrerer Scans (d. h. insbesondere bei mehr als 10) zu einer signifikanten kumulativen Dosis führen, die sich möglicherweise auf das Tumorwachstum auswirkt. Wenn das Tumorwachstum ein Ausleseparameter ist, ist es wichtig, dass alle Tiere die gleiche Anzahl von Scans und Dosen erhalten, um vergleichbare Gruppen zu gewährleisten, was den Arbeitsaufwand des gesamten Projekts erhöht. Die Verwendung eines PET/MRT-Systems anstelle eines PET/CT-Systems könnte die Strahlenbelastung reduzieren. Dieser Ansatz ist jedoch mit längeren Scanzeiten, zusätzlichen Kosten und einer anderen Methode zur Gewinnung anatomischer Informationen verbunden.

Durch die Einhaltung der Empfehlungen von Tierschutzorganisationen wie GV-SOLAS in Deutschland und die Befolgung etablierter Richtlinien wie ARRIVE und PREPARE bemühen wir uns, Tiermodelle zu standardisieren und die Variabilität der Versuchsprotokolle zu minimieren. Diese Bemühungen sind entscheidend, um die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit präklinischer Studien zu gewährleisten und letztendlich die Translation vielversprechender Radiopharmazeutika vom Labor auf das Krankenbett zu erleichtern.

Offenlegungen

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FMM ist medizinischer Berater für NanoMab Technology Ltd. und Advanced Accelerator Applications (AAA) GmbH. Kürzlich erhielt er institutionelle Zuschüsse von NanoMab Technology Ltd., Siemens und GE Precision Healthcare LLC. Darüber hinaus hat er einen interventionellen Forschungsvertrag mit CURIUM.

Danksagungen

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Die Autoren danken Susanne Allekotte für ihre technische Unterstützung.

Materialien

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Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Equipment
Aktivitätsmessgerät ISOMED 2010Nuviatech Healthcare -
Zentrifuge MIKRO 185Andreas Hettich GmbH & Co. KG1203
Endotoxin-Testung Endosafe nexgen-PTSCharlesRiver-Heizblock
NANOCOLOR VARIO C2Macherey-Nagel919350
HPLC-System, inkl. RadiodetektorKnauer & Raytest-Bildanalysesoftware
Pmod 4.4 PMOD TechnologiesLLC-PET/CT-System
Kleintiere β-CUBE und X-CUBEMolecubes NV-TLC
MiniGITA*Elysia-Raytest-
Materialien0,3
mm Durchmesser PE10Schlauchfischerwissenschaftlich 22-204008
30G NadelB|Braun4656300
Zentrifugalfilter; 10 kDa MWCO, 0,5 mLMilliporeUFC501008
Chromatographie-Papierstreifen iTLC-SGAgilent TechnologiesSGI0001
Endotoxin-Kartusche, 0,05 EU/ml Empfindlichkeit Charles RiverPTS-2005
HPLC-Säule Biosep SEC-s2000
; Co. KG731861
Steriles Fläschchen 10 mLALK Life Science SolutionsSEV100
Reagenzien
68Ge/68Ga-GeneratorNRF-iThembaLABSaA
AmmoniumacetatMerck KGaA101116
ZitronensäureMerck KGaA
SalzsäureMerck KGaA320331
NaClMerck KGaAS9888
Nanobody NM-02Radiopharm Theranostics-P-SCN-Bz-DOTA-GA
CheMatechC115
TrifluoressigsäureMerck KGaAT6508
ReinstwasserMerck KGaA
für Phenomenex-Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 mL)Eppendorf 0030125150 pH-Streifen 0,0 - 6,0 Merck KGaA 109531 pH-Streifen 0-14 Merck KGaA 109535 PS-H SPE-Kartusche Macherey Nagel GmbH &100241101262

Referenzen

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