Bau eines Olfaktometers für Studien zum Geruchsverhalten von Nagetieren

Summary

Dieses Protokoll beschreibt den Aufbau eines Olfaktometers für Go/No-Go-Experimente zum Geruchsverhalten. Es werden Schritt-für-Schritt-Anleitungen zusammen mit Bildern bereitgestellt, um den erfolgreichen Bau des Olfaktometers zu gewährleisten. Informationen zur Fehlerbehebung von Problemen, die während des Prozesses auftreten, sind ebenfalls enthalten.

Abstract

Die Verwendung von Olfaktometern zur Untersuchung des Verhaltens und der Gehirnaktivität von Nagetieren während olfaktorischer Aufgaben ist entscheidend für das Verständnis der Schaltkreise des Gehirns. Diese hochentwickelten Geräte ermöglichen es Forschern, Geruchsreize präzise zu steuern und abzugeben und so komplexe Geruchsprozesse bei Nagetieren zu untersuchen. Obwohl kommerziell erhältliche Olfaktometer praktisch sind, stellen sie bei technischen Problemen eine Herausforderung dar, die oft kostspielige Hilfe erfordern und möglicherweise Forschungszeitpläne stören. Dieser Artikel beschreibt die Konstruktion eines benutzerdefinierten Olfaktometers, das speziell für Experimente mit dem Geruchsverhalten von Mäusen entwickelt wurde, und bietet eine umfassende Liste der Teile und Schritt-für-Schritt-Anleitungen. Das Olfaktometer wird über MATLAB gesteuert und bietet eine benutzerfreundliche Oberfläche für Forscher. Wichtig ist, dass der Open-Source-Code es den Benutzern ermöglicht, das System zu modifizieren und anzupassen und Verhaltensaufgaben an spezifische experimentelle Anforderungen anzupassen. Der Aufbau eines kundenspezifischen Olfaktometers gibt den Benutzern das Wissen und die Fähigkeit, unabhängig voneinander benutzerdefinierte experimentelle Designs und Fehlerbehebungen durchzuführen, was sowohl Zeit als auch Ressourcen spart. Dieser Ansatz erhöht nicht nur die Flexibilität der Forschung, sondern fördert auch ein tieferes Verständnis der Funktionalität des Geräts, was letztendlich zu robusteren und zuverlässigeren Geruchsstudien bei Nagetieren führt.

Introduction

Die komplizierten Mechanismen, die der olfaktorischen Entscheidungsfindung zugrunde liegen, bieten faszinierende Einblicke in die bemerkenswerte Komplexität des sensorischen Verarbeitungssystems des Gehirns ^1,2,3. Im Riechkolben von Mäusen konvergiert eine große Anzahl von olfaktorischen sensorischen Neuronen auf etwa 2.200 Glomeruli, die jeweils von Neuronen innerviert werden, die denselben Geruchsrezeptor^{exprimieren 4}. Bemerkenswert ist, dass bereits einzelne synthetische Geruchsstoffe einen erheblichen Teil der rund 1.100 Geruchsrezeptoren in Mäusen stimulieren können ^5,6. Die Herausforderung geht jedoch über die anfängliche Odormittelerkennung hinaus. Die zeitliche Dynamik der Ankunft von Duftstoffen, beeinflusst durch den rhythmischen Akt des Schnüffelns, bereichert die Sinneslandschaft weiter und fügt Informationsschichten hinzu, die das Gehirn entschlüsseln muss. Verstärkt durch die Komplexität natürlicher Reize, wie z. B. des Artgenossen-Urins, der Hunderte von Geruchsstoffen enthält, steht das olfaktorische System vor der gewaltigen Aufgabe, komplizierte Muster der glomerulären Aktivierung zu entwirren, um zwischen verschiedenen Düften zu unterscheiden ^7,8.

Um diese Herausforderung zu bewältigen, orchestriert das Gehirn die neuronale Aktivität in mehreren Regionen, einschließlich des piriformen Kortex, des lateralen entorhinalen Kortex, des Hippocampus, des olfaktorischen Tuberkels, des präfrontalen Kortex und sogar des Kleinhirns 9,10,11,12,13,14. Innerhalb dieser Schaltkreise integrieren und modulieren Pyramidenzellen im piriformen Kortex Informationen, die von Mitralzellen weitergeleitet werden, während andere Gehirnbereiche eine einzigartige Rolle bei der Gestaltung der Geruchswahrnehmung spielen 15,16,17. Darüber hinaus wird die Verarbeitung von olfaktorischen Reizen durch das Gehirn dynamisch von Kontextfaktoren beeinflusst, was die Anpassungsfähigkeit und Raffinesse des olfaktorischen Entscheidungsprozesses unterstreicht.

Dieser Artikel beschreibt die Konstruktion eines kundenspezifischen Olfaktometers, das eine computergesteuerte Beurteilung der Verhaltensleistung von sich frei bewegenden Mäusen ermöglicht, die an einer Go/No-Go-Aufgabe beteiligt sind. Bei dieser assoziativen Lernaufgabe initiiert die Maus mit Wasserentzug einen Versuch, indem sie an einem Wasserabgabeauslauf leckt, der sich in einem Nasenkegel befindet. Eines von zwei Odoriermitteln wird 1-1,5 s nach Beginn des Versuchs durch das Tier abgegeben. Wenn es sich bei dem Odorant um den belohnten (S+) Odorant handelt, erhält die Maus eine Wasserbelohnung, wenn sie mindestens einmal in jedem der vier Zeitfenster von 0,5 s leckt (ein Treffer). Andernfalls erhält die Maus keine Belohnung (Miss). Erhält das Tier den unbelohnten Geruchsstoff (S-), wird keine Belohnung abgegeben, und wenn die Maus in jedem der vier Zeitfenster (Fehlalarm, FA) leckt, wird eine Zeitverzögerung vor Beginn des nächsten Versuchs auferlegt. Wenn das Tier in einem der Zeitfenster nicht leckt, wird der Versuch als korrekte Abstoßung (CR) gewertet und es wird keine Zeitverzögerung angewendet. Der Prozentsatz der korrekten Leistung wird als Prozentsatz der Versuche berechnet, in denen die Maus in einem Zeitfenster von zwanzig Versuchen einen Treffer oder CR erzielt:

Prozent richtig = 100 ((Treffer + CR) / 20)

Es gibt zwei Schlüsselprobleme, um das ordnungsgemäße Funktionieren von Olfaktometern zu gewährleisten, die zur Beurteilung des Geruchsverhaltens entwickelt wurden. Zunächst muss das Olfaktometer die Reaktionen der Maus in Echtzeit überwachen, um entsprechende Geruchs- und Wasserbelohnungen zu liefern. Dieses Olfaktometer wird durch die Überwachung von Lecksteinen erreicht, entweder durch Messung des Widerstands zwischen der Wasserhose und dem Kammerboden oder durch Messung der Kapazität¹⁸. Ein MATLAB-Programm verwendet diese Informationen dann, um Entscheidungen über die Abgabe von Odoriermitteln und die Wasserbelohnung zu treffen. Das zweite Problem ist die Notwendigkeit einer zuverlässigen, reproduzierbaren Odormittelabgabe. Dieses Olfaktometer wird durch Betätigung von Ventilen erreicht, die geruchsgesättigte Luft mit Trägerluft ausgleichen, die dann an einen Nasenkonus abgegeben wird. Luft wird mit dem Odormittel ausgeglichen, indem sie durch eine mit Mineralöl verdünnte Odorierlösung geblasen wird. Die Konzentration des Odoriermittels wird mit einem Photoionisationsdetektor gemessen und kann auf der Grundlage des Dampfdrucks und des Aktivitätskoeffizienten berechnet werden, wobei die von Williams und Dewan^{beschriebenen Verfahren 18,19} befolgt werden.

Protocol

Alle Experimente wurden gemäß den vom Anschutz Medical Campus Institutional Animal Care and Use Committee der University of Colorado genehmigten Protokollen durchgeführt. Bei den in dieser Studie verwendeten Tieren handelte es sich um männliche CaMKIIα WT-Mäuse, die zum Zeitpunkt der Tetrodenimplantation zwei Monate alt waren. Einzelheiten zu den in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle enthalten.

1. Platine und Löten von einpoligen, einstufigen (SPST) Tastern

1. Besorgen Sie sich die maßgefertigte weiße Fußleiste mit Löchern zur Befestigung der Racks für Geruchsventile, Durchflussmesser, SSR48-Platine und andere Komponenten, die in Abbildung 1A gezeigt sind.
   HINWEIS: Die in dieser Studie verwendete weiße Fußleiste wurde von der Maschinenwerkstatt des Neurotechnologischen Zentrums auf dem CU Anschutz Medical Campus hergestellt (Abbildung 1A). Die Designdateien sind verfügbar unter
2. Fügen Sie 1-Zoll-Schrauben und 3/4-Zoll-Abstandshalter für die Platzierung des SSR48-RACKs hinzu. Die Schrauben befinden sich oben rechts auf der Rückseite des Whiteboards (Abbildung 1A).
3. Montieren Sie das SSR48-RACK. Das SSR48-RACK befindet sich oben links auf der Rückseite des Whiteboards (Abbildung 1C).
4. Machen Sie Löcher (0,4 cm), um die Schraubklemmenleistenblöcke auf der Rückseite des Whiteboards zu platzieren. Die Schraubklemmenleistenblöcke befinden sich in der Mitte rechts auf der Rückseite des Whiteboards (Abbildung 1D).
5. Von oben nach unten: Der erste 4-Schrauben-Klemmleistenblock wird zum Anschluss von Drähten für 24 V verwendet. Der nächste Schraubklemmenblock wird für 5 V Leitungen verwendet. Lassen Sie einen Schraubklemmenleistenblock leer, und der letzte Block mit 4 Schraubklemmenleisten wird zum Anschließen von Erdungskabeln verwendet.
6. Bohren Sie Löcher (0,8 cm) in den Schaltkasten für die Platzierung der SPST-Taster. Die Steuerbox befindet sich an der vorderen Unterseite des Whiteboards (Abbildung 1E).
7. Richten Sie die SPST-Taster ein. Löten Sie zwei Drähte an den SPST-Taster. Es ist vorzuziehen, zwei verschiedene Farben zu verwenden, z. B. Rot und Schwarz oder Grün (Abbildung 1F).
8. Befestigen Sie den SPST-Taster an der Steuerbox. Die Drucktasten werden mit einer Mutter geliefert, die zur Befestigung an der Steuer-Blackbox verwendet wird (Abbildung 1G).
9. Sichern Sie die Drähte, indem Sie sie verdrehen oder mit Klebeband sichern, um sie zusammenzuhalten und zu organisieren.
   HINWEIS: Der 24-V-Strom wird für die Stromversorgung der Quetschventile und Geruchsventile verwendet, und der 5-V-Strom wird für den Leckkreislauf verwendet.
10. Platzieren Sie die Geruchsventile in den Schlitzen des Geruchsventils, das sich in der Mitte des Whiteboards befindet (Abbildung 2A).
    1. Ziehen Sie die Drähte ab, die von den Ventilen abgehen, und löten Sie einen Draht von jedem Ventil auf einen dickeren Draht. Stecken Sie einen Draht in die Erde an den Schraubklemmenblöcken auf der Rückseite des Whiteboards und einen zweiten Draht in den entsprechenden Pin im SSR48-RACK. Zum Beispiel geht Geruchsventil 1 zu Pin 1, Geruchsventil 2 geht zu Pin 2 usw. (Abbildung 2B).
    2. Verbinden Sie die Pins 1 bis 8 im SSR48-RACK mit je zwei Quetschventilen (Ein- und Ausgangsventile für die Mineralöl-Äquilibrierungsfläschchen). Verbinden Sie für jedes Ventil einen Draht von einem Taster mit dem 24-V-Strom und den anderen Draht mit dem Pin im SSR48-RACK, der mit dem Ventil verbunden ist. Der andere Draht geht vom Ventil zur Erde. In Abbildung 2B,C finden Sie Informationen zum Platzieren der Drähte an ihrem Platz.
    3. Setzen Sie das Wasserventil und das Endventil in die entsprechenden Schlitze in der Ventilplatte ein. Der Schlitz befindet sich in der Mitte des Whiteboards. Siehe die Ventilplatte in Abbildung 1 und die Anordnung der Ventile in Abbildung 3A.
    4. Verbinden Sie das Wasserventil und das Endventil mit der Masse und den Stiften 17 bzw. 18 im SSR48-RACK. Schließen Sie die Taster an 24 V und an die Pins 17 und 18 an (Abbildung 2B).

2. Stromversorgung

1. Kaufen Sie ein Netzteil und ein Verlängerungskabel. Informationen zur konkreten Art der Stromversorgung finden Sie in der Materialtabelle. Das Netzteil liefert 24 V (V3) und 5 V (V1) Ausgänge und Masse zum Olfaktometer.
2. Schneiden Sie den Stecker des Netzkabels für das Netzteil ab. Genauer gesagt, der weibliche Teil des Verlängerungskabels. Sobald es durchtrennt ist, sind drei Drähte zu sehen. Der grüne Draht ist mit G (Masse) am Netzteil verbunden, und die beiden anderen Drähte (weiß und schwarz) sind mit L bzw. N des 120-V-Wechselstromeingangs des Netzteils verbunden (Abbildung 3B).
   ACHTUNG: Die 120-V-Stromkabel liegen frei und es besteht Verletzungsgefahr durch Stromschlag. Am besten decken Sie es mit einem Isolator ab.
3. Schneiden Sie ein Ende des Kabels ab, das das SSR48-RACK mit Strom versorgt. Verbinden Sie einen der Drähte mit der G-Schraube im Netzteil und den zweiten mit dem V1 des Netzteils (Abbildung 3C).
4. Verbinden Sie an der Stromversorgung einen Draht von G2 mit der Masse an den Schraubklemmenleistenblöcken (Abbildung 2C).
5. Verbinden Sie an der Stromversorgung einen Draht von V1 mit den 5-V-Schraubklemmenblöcken (Abbildung 2C).
6. Verbinden Sie an der Stromversorgung eine Leitung von V3 mit den 24-V-Schraubklemmenblöcken (Abbildung 2C).

3. Sensorplatine lecken

1. Besorgen Sie sich ein Steckbrett mit 400 Verknüpfungspunkten, und verlegen Sie einen Draht, der von den Verknüpfungspunkten B7 bis B15 verbunden ist (Abbildung 3D).
2. Verbinden Sie ein Ende eines Drahtes mit dem Verknüpfungspunkt 6+ und das andere Ende mit dem Verknüpfungspunkt C22 des Steckbretts (Abbildung 3D).
3. Verbinden Sie ein Ende an D16 und das zweite Ende an G22 des Steckbretts (Abbildung 3D).
4. Verbinden Sie ein Ende eines Kabels mit dem Steckplatz I22 und das zweite Ende mit 29- des Steckbretts (Abbildung 3D).
5. Verbinden Sie ein Ende eines Kabels mit dem Steckplatz 20 A und das zweite Ende mit 29 A des Steckbretts (Abbildung 3D).
6. Verbinden Sie ein Ende eines Drahtes mit 21B und das zweite Ende mit 28B des Steckbretts (Abbildung 3D).
7. Verbinden Sie ein Ende eines Kabels mit Steckplatz 1+ des Steckbretts und das zweite Ende mit den 5 V der Schraubklemmenleistenblöcke (Abbildung 3D).
8. Verbinden Sie ein Ende eines Kabels mit Schlitz 1- des Steckbretts und das zweite Ende mit der Masse der Schraubklemmenleistenblöcke (Abbildung 3D).
9. Verbinden Sie ein Ende eines Kabels mit dem Steckplatz C7 des Steckplatins und das zweite Ende mit Pin 27 am SSR-48RACK (Abbildung 3D).
10. Verbinden Sie ein Ende eines Drahtes mit dem Schlitz 28C des Steckbretts, und am zweiten Ende ist eine Krokodilklemme angebracht, die mit dem Metallteil der Wasserhose verbunden wird (Abbildung 3D).
11. Verbinden Sie ein Ende eines Kabels mit dem Steckplatz 20B des Steckbretts und das andere Ende mit dem mittleren Anschluss des Potentiometers (Abbildung 3D). Die beiden Klemmen, die mit den Widerstandselementen des Potentiometers verbunden sind, sind mit Masse und 5 V verbunden. Die mittlere Klemme wird mit dem Steckbrett verbunden.
12. Besorgen Sie sich 21 mΩ Widerstände. Verbinden Sie für das erste Ende ein Ende mit 19 A und das zweite Ende mit 20 D. Verbinden Sie für das zweite Ende ein Ende mit 22C und das andere Ende mit 21D. Anschluss an das Potentiometer (Abbildung 3D).
13. Ermitteln Sie einen kΩ-Widerstand. Verbinden Sie ein Ende mit 14C und das zweite Ende mit 19C. Anschluss an das Potentiometer (Abbildung 3D).
14. Besorgen Sie sich einen 120-Ω-Widerstand. Verbinden Sie ein Ende mit 7D und das zweite Ende mit 7H (Abbildung 3D).
15. Besorgen Sie sich ein LED-Licht. Die Farbe spielt keine Rolle. Verbinden Sie ein LED-Kabel mit 7J und das zweite Kabel mit 6- (Abbildung 3D).
16. Besorgen Sie sich zwei Operationsverstärker (Operationsverstärker). Die Anschlüsse für den ersten sind E10 bis E16, F10-F16 (Abbildung 3D).

4. Luft- und Wasserversorgung

1. Setzen Sie zwei Durchflussmesser (2 l/min und 50 cm³/min) in die Halterungen des Durchflussmessers ein. Abbildung 4A zeigt das gesamte Luftstromsystem und Abbildung 4B zeigt die vergrößerte Ansicht der Durchflussmesser.
2. Besorgen Sie sich eine Aquarienpumpe mit einem Luftstrom von 2 l/min. Das hier verwendete Aquarienpumpenmodell verfügt über zwei Ausgänge (siehe Materialtabelle). Verbinden Sie ein kleines Stück Schlauch von jedem der beiden Ausgänge der Aquarienpumpe mit den beiden Eingängen eines T-Steckers (Abbildung 4B).
3. Verbinden Sie ein Stück Schlauch vom Ausgang des T-Steckers mit dem Eingang eines Aktivkohlefilters (Abbildung 4B).
4. Verbinden Sie den Schlauch vom Ausgang des Aktivkohlefilters mit einem T-Anschluss und verbinden Sie die beiden Ausgänge des Anschlusses mit einem Kugelhahn, um den Luftdurchsatz einzustellen (Abbildung 4C).
5. Verbinden Sie den Ausgang jedes Kugelhahns mit dem Eingang der Durchflussmesser (Abbildung 4D).
6. Verbinden Sie den Ausgang des 50 cm/min-Durchflussmessers mit dem oberen Verteiler und versorgen Sie die 40-ml-Geruchsausgleichsfläschchen mit in Mineralöl verdünnten Odoriermitteln (Abbildung 4E).
7. Verbinden Sie den Ausgang jedes Geruchsfläschchens mit dem entsprechenden Eingang im unteren Verteiler.
8. Bei den Schläuchen, die die Geruchsfläschchen mit den Verteilern verbinden, handelt es sich um Quetschventilrohre, die durch die beiden separaten Quetschventile geöffnet werden. Legen Sie den Schlauch in die Quetschventile.
9. Verbinden Sie den Ausgang des 2 L/min Durchflussmessers mit dem Eingang des seitlichen Eingangs des unteren Verteilers.
10. Verbinden Sie den Ausgang des unteren Verteilers mit dem Eingang des Endventils (Umlenkventil) (Abbildung 4F).
    1. Verbinden Sie den Standardausgang des Endventils mit dem Geruchsabgaberohr in der Go/No-Go-Kammer. Verbinden Sie den Standard-Aus-Ausgang des Endventils mit einem Auspuffrohr (Abbildung 4G). Dies führt zu einem kontinuierlichen nicht odorierten Luftstrom von 2 l/min, wenn das Endventil ausgeschaltet ist.
    2. Stellen Sie bei jedem Versuch sicher, dass sich das letzte Ventil einschaltet, wenn das Tier leckt, und die Luft zum Auslass leitet, und gleichzeitig das Geruchsventil eingeschaltet wird. Dies führt zu einer Äquilibrierung des Geruchs in der Hintergrundluftströmung.
    3. Stellen Sie nach 1-1,5 s sicher, dass sich das letzte Ventil abschaltet und die Luft zurück in die Kammer leitet. Dies führt zu einem starken Anstieg der Odormittelkonzentration. Nach 2,5 s schaltet sich das Geruchsventil ab und die Geruchskonzentration kehrt auf 0 zurück.
    4. Verbinden Sie eine 18-G-Nadel mit der Spitze der 5-ml-Spritze, die zur Verabreichung der Wasserbelohnung verwendet wird (Abbildung 4H).
    5. Verbinden Sie einen Schlauch (2 mm Durchmesser) mit der Spitze der Nadel (Abbildung 4H).
    6. Verbinden Sie das andere Ende des Schlauchs mit dem Eingang des Wasserventils. Möglicherweise muss ein Rohr mit einem anderen Durchmesser geschnitten werden, damit es in den Eingang des Wasserventils passt (Abbildung 4I).
    7. Verbinden Sie den Schlauch vom Ausgang des Wasserventils mit dem Leckauslauf (Abbildung 5A).

5. Anschließen des Olfaktometers an den Computer und Installieren der Software

1. Verbinden Sie das SSR48-RACK mit einem 100-poligen Buchse-auf-Buchse-Stecker mit dem DIO96H/50. Schließen Sie das USB-Kabel des DIO96/H50 an den Computer an (Abbildung 5B).
2. Laden Sie die neueste Version der mccdaq-Software und -Treiber sowie InstaCal herunter.
   HINWEIS: InstaCal ist das Programm, das die Kommunikation zwischen dem Computer und DIO96/H50 testet. Laden Sie die neueste Software und Treiber hier herunter: https://www.mccdaq.com/software-downloads.aspx.
3. Führen Sie InstaCal aus. Stellen Sie sicher, dass der "Universal Serial Bus" die Platine # als die richtige Nummer auflistet, normalerweise #1 = Platine #1 USB-DIO96H/50.
4. Laden Sie MATLAB herunter.
5. Laden Sie die MATLAB-Programme herunter, um das Olfaktometer von https://github.com/restrepd/dropc aus auszuführen.
6. Öffnen Sie MATLAB als Administrator und legen Sie den Pfad so fest, dass MATLAB die Programme erkennt. Klicken Sie auf der Registerkarte "Start" in der MATLAB-Umgebung im Abschnitt "Umgebung" auf "Pfad festlegen ". Daraufhin öffnet sich ein Dialog, in dem Sie Ordner im Suchpfad hinzufügen können.
7. Führen Sie daqregister('mcc') aus. Ändern Sie die Platinennummer in dropcInitializePortsNow.m.
   HINWEIS: handles.dio = digitalio('mcc',1); %(1 oder 0, je nach Computer).
8. Testen Sie dropcspm.m , indem Sie einen Probelauf durchführen, bei dem der Benutzer auf jeden Versuch "reagiert", indem er die elektrische Schleife zwischen dem Leckauslauf und dem Metallboden der geerdeten Kammer verbindet.
   HINWEIS: Das Olfaktometer ist jetzt einsatzbereit. Informationen zum Training der Maus finden sich in Nicole Arevalo et ^al.20.

6. Tierversuche

1. Bereiten Sie die Tierversuche sorgfältig vor, um mit dem Versuchsprozess zu beginnen. Wiegen Sie jede Maus einzeln mit einer kalibrierten Waage und notieren Sie das Gewicht in einem Laborprotokoll. Überwachen Sie diese wichtigen Daten während der gesamten Studie, um die Gesundheit der Tiere zu verfolgen und Gewichtsveränderungen umgehend zu beheben.
2. Legen Sie die Mäuse nach dem Wiegen vorsichtig in die speziell dafür vorgesehene Mauskammer. Aktivieren Sie die Sensoren und Reizabgabesysteme für die Geruchsunterscheidungsaufgabe. Stellen Sie sicher, dass die Kammer den Stress für die Tiere minimiert und gleichzeitig eine präzise Kontrolle der Versuchsbedingungen gewährleistet.
3. Stellen Sie sicher, dass sich das Tier in der Kammer wohlfühlt. Starten Sie das MATLAB-Programm , um experimentelle Parameter wie die Abgabe von Geruchsreizen (2,5 s), die Abgabe von Wasser und die Aufzeichnung von Reaktionen zu steuern. Analysieren Sie Daten in Echtzeit, um sofortiges Feedback über die Leistung des Tieres zu erhalten.
4. Überwachen und analysieren Sie die Leistung des Tieres kontinuierlich. Sehen Sie sich die berechnete Kompetenzbewertung basierend auf dem Prozentsatz der richtigen Antworten an. Streben Sie an, dass jedes Tier eine Leistungsbewertung von 80 oder mehr erreicht, was die Schwelle für die Aufgabenkompetenz markiert.
5. Beginnen Sie die neue Phase des Versuchs, sobald das Tier durchweg eine Leistungsbewertung von 80 oder höher erreicht, was auf die Beherrschung der anfänglichen Geruchspaarunterscheidung hinweist. Kehren Sie das Geruchspaar um, indem Sie den zuvor belohnten Duft unbelohnt lassen und umgekehrt.
   1. Testen Sie die kognitive Flexibilität und die Fähigkeit des Tieres, Assoziationen zu ver- und wieder zu verlernen, und gewinnen Sie so wertvolle Einblicke in die Plastizität des olfaktorischen Lernens bei Mäusen.

Results

In Anlehnung an das hier beschriebene Protokoll kann ein Olfaktometer eingerichtet werden, um das Go/No-Go-Verhalten von Mäusen bei der Unterscheidung von Gerüchen zu testen. Abbildung 6A zeigt das Verhalten einer Maus am ersten Tag des Trainings in der Go/No-Go-Aufgabe, wobei Ethylacetat als S+-Odorant und eine Kombination aus Ethylacetat und Propylacetat als S- verwendet wurde. Der Prozentsatz Richtig wird berechnet als der Prozentsatz der Versuche, in denen die Maus einen Treffer oder eine korrekte Ablehnung erzielt. Anfangs startete die Maus bei 50% korrekt, weil sie als Reaktion auf beide Geruchsstoffe leckte. Nach mehreren Versuchen lernte es jedoch, nur für den S+ zu lecken und hörte auf, für den S- zu lecken. Abbildung 6B zeigt den korrekten Prozentsatz für den letzten Tag der Go/No-Go-Aufgabe in Vorwärtsrichtung, an dem das Tier eine Leistung von 80 % oder mehr erreicht hat. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Odoriermittel umgekehrt (REV), wobei Ethylacetat als S-Odorant und die Kombination aus Ethylacetat und Propylacetat als S+ verwendet wurde. Abbildung 6C zeigt den Prozentsatz der Korrektheit am ersten Tag der Go/No-Go-Aufgabe in umgekehrter Richtung, wobei die Leistung der Maus auf 10 % sank. F zeigt die Leistung der Maus am letzten Tag der Umkehrung, an dem sie wieder die Leistungsfähigkeit erreicht hat.

Abbildung 1: Whiteboard-Vorderseite des Olfaktometers und Verkabelung. (A) Die Abmessungen des Olfaktometers betragen 22" B x 16" H x 8,5" T, dargestellt ohne Verkabelung oder Schnittstellen-/Leckbretter, wie von der Maschinenwerkstatt geliefert. Es sind Löcher für Geruchsventile, Thermometer, Wasser- und Endventile, Wasserspritze, Geruchsflaschenhalter, Geruchsventilgestell und die Mauskammer vorgebohrt. (B) Das Olfaktometer ist mit den 8 Schrauben ausgestattet, die für die Montage des SSR48-RACK auf der linken Rückseite erforderlich sind. (C) Olfaktometer mit eingebautem SSR48-RACK, einschließlich angebauter Relais. (D) Schraubklemmenleistenblöcke, die dem Olfaktometer hinzugefügt werden, mit vorgesehenen Abschnitten für 12 V, 5 V und Masse. (E) Steuer-Blackbox mit Bohrungen für SPST-Taster, mit Klebeband, das jeden Knopf durch die Ventilsteuerung beschriftet. (F) SPST-Taster mit zwei farbcodierten, geschrumpften Drähten, die zum Schutz exponierter Bereiche verlötet sind. (G) SPST-Taster, der an der Blackbox der Steuerung montiert und mit der mitgelieferten Sechskantmutter gesichert ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Geruchsventile und Schaltpläne. (A) Geruchsventile, die fest in Schlitzen sitzen und mit Schrauben befestigt sind. (B) Schema der Verkabelung des Geruchsventils mit dem SSR48-RACK und den Schraubklemmenleistenblöcken. (C) Schaltplan der Steuer-Blackbox, des Netzteils, des SSR48-RACK- und der Schraubklemmenleistenblöcke. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Wasser- und Endeinstellung des Ventils mit Stromversorgung. (A) Wasser- und Endventile, die in die dafür vorgesehenen Schlitze im Olfaktometer eingefügt und mit Schrauben gesichert werden. (B) Stromversorgungskabel zur Stromversorgung des Olfaktometers. (C) Stromverkabelung für das SSR48-RACK. (D) Lecken Sie den Sensor mit angeschlossenen Komponenten, einschließlich Widerständen, Drähten, LED und Operationsverstärker. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Luftzufuhrsystem mit Durchflussmessern und Schläuchen. (A) Durchflussmesser, die mit Schrauben am Gestell befestigt sind. (B) Aquarienpumpe, die mit einem Schlauch verbunden ist, verbunden mit einem T-Gelenk. (C) Ein Aktivkohlefilter mit Schläuchen am Ausgang und Anschlüssen zu einzelnen Reglern. (D) Schläuche von Reglern, die an die Eingänge von Durchflussmessern angeschlossen sind. (E) Schläuche, die an den Ausgängen des Durchflussmessers befestigt sind. (F) Schlauch vom Verteiler bis zum endgültigen Ventileingang. (G) Endventil mit Schlauch, der mit der Geruchsöffnung des Olfaktometers verbunden ist. (H) 5-ml-Spritze gefüllt mit Wasser, Schlauch an einer 18-g-Nadel befestigt. (I) Der Schlauch ist mit dem Eingang des Wasserventils verbunden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Endgültige Wasserventilanschlüsse und Systemübersicht. (A) Schlauch vom Ausgang des Wasserventils zum Lixit im Olfaktometer. (B) Anschluss des Olfaktometers an das DIO96H/50 über ein Buchse-zu-Buchse-Kabel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Beispiel für die Verhaltensleistung in einer Go/No-Go-Aufgabe für eine Maus. Der Prozentsatz der korrekten Antworten in jeder Sitzung wird angezeigt für: (A) Am ersten Tag der Vorwärtskonditionierung (S+: 1 % Isoamylacetat, S-: Mineralöl). (B) Der letzte Tag der Vorwärtskonditionierung. (C) Am ersten Tag nach der Umkehrung (S+: Mineralöl, S-: 1 % Isoamylacetat). (D) Der letzte Tag der umgekehrten Konditionierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Konzentrationszeitverlauf von Isoamylacetat in der Geruchsöffnung. Gemessene Konzentration von 10 % Isoamylacetat (in Mineralöl verdünnt) in der Geruchsöffnung unter Verwendung eines Photoionisationsgeräts (PID). Vertikale Linien zeigen den Beginn und das Ende der Geruchsabgabe an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Eine umfassende Schritt-für-Schritt-Anleitung für den Aufbau eines Olfaktometers, das für Geruchsassoziationsaufgaben ausgelegt ist, findet sich in der Literatur. Forscher können bei der Montage und dem Betrieb des Geräts auf verschiedene Herausforderungen stoßen, aber glücklicherweise gibt es etablierte Methoden zur Fehlerbehebung, um diese Probleme zu lösen. Einmal richtig konstruiert und kalibriert, dient das Olfaktometer als unschätzbares Werkzeug für Wissenschaftler, die Experimente im Zusammenhang mit dem Geruchssinn durchführen, und ermöglicht eine präzise Steuerung und Abgabe von Geruchsreizen.

Kritische Schritte
Die heruntergeladene MATLAB-Version sollte 2015 sein, da der geschriebene Code mit dieser Version kompatibel ist und die Verwendung einer anderen Version zu Problemen führen kann. Es ist wichtig zu überprüfen, ob das richtige Board in instacall ausgewählt ist. Die Installation von mcc.dill kann durch Ausführen von daqregister('mcc') durchgeführt werden, während Sie als MATLAB-Administrator angemeldet sind.

Fehlerbehebung
Führen Sie zu Beginn jeder Schulungswoche die Kalibrierungssoftware (InstaCal) aus, um sicherzustellen, dass der PC und das Olfaktometer korrekt miteinander verbunden sind. Öffnen Sie dieses Programm, klicken Sie auf die Platine und klicken Sie auf Digitale Kalibrierung. Der Luftdurchsatz muss überprüft werden. Der Hintergrundluftstrom sollte 2 l/min betragen und der Durchfluss zu den Geruchsausgleichsfläschchen sollte 50 ml/min betragen. Es ist äußerst wichtig, den Luftdurchsatz routinemäßig am Ausgang des Olfaktometers zu überprüfen.

Bevor Sie eine Maus platzieren, ist es wichtig, sicherzustellen, dass die folgenden Parameter getestet werden: (1) Geruchsventile: Die Geruchsventile sollten beim Drücken der Taste auf der Blackbox angeklickt werden. Luftschläuche sollten in das Mineralöl eindringen, ohne dass sich Mineralöl in den Schläuchen befindet. (2) Geruchsschlauch: Wenn Gerüche keine Blasen erzeugen, kann der Schlauch an der Stelle, an der er normalerweise in der Nähe des Ventils einklemmt, verstopft sein. Möglicherweise ist ein Austausch der Schläuche erforderlich. (3) Endventil und Wasserventil: Das Endventil sollte sich korrekt öffnen und der Schlauch auf einwandfreie Funktion überprüft werden. Für das Wasserventil sollte die Luft, die den Wasserfluss blockiert, gereinigt werden, damit Wasser in den Lixit fließen kann. (4) Luftstrom: Die Durchflussmesser müssen kalibriert und angemessen positioniert erscheinen. (5) Relaisleuchten: Stellen Sie sicher, dass die "Lichter" an den Relais während des Experiments korrekt aktiviert werden. (6) Wasserbelohnungsrelais: Wenn eine Wasserbelohnung ausgegeben wird, sollte das Relais über dem Wasser blinken, während es die Belohnung ausgibt. (7) Geruchs- und Wasserbelohnungsrelais: Wenn ein Geruch mit einer Wasserbelohnung gekoppelt wird, sollte das rote Relais über der entsprechenden Ventilnummer während der Belohnung rot blinken.

Begrenzungen
Die Go/No-Go-Aufgabe testet die Fähigkeit der Maus, 2 Gerüche zu testen. Um die Aufgabe ausführen zu können, muss das Tier mehrere Sitzungen durchlaufen. Dies ist keine Hochdurchsatztechnik zum Testen der Geruchsunterscheidung. Das Olfaktometer ist für die Prüfung von Geruchsreizen konzipiert. Es handelt sich nicht um ein multisensorisches Prüfgerät. Es können jedoch Modifikationen vorgenommen werden, um andere sensorische Eingaben zu testen.

In diesem Artikel wird ein Olfaktometer zur Flüssigkeitsverdünnung beschrieben, bei dem die Luft, die mit einer Geschwindigkeit von 50 mL/min durch das in Mineralöl verdünnte Odormittel sprudelt, mit dem Hintergrundluftstrom von 2 l/min voräquilibriert wird. Bei diesem Odormittelabgabedesign bestimmt die Kinetik der Geruchsverdünnung im Trägerluftstrom die Geschwindigkeit des Anstiegs der Geruchskonzentration im Hintergrundluftstrom. Wie in Abbildung 7 gezeigt, steigt die Konzentration zwar innerhalb von 200 ms auf die Hälfte der Endkonzentration an, während sich die Geschwindigkeit der Konzentrationsänderung über eine halbe Sekunde hinaus verlangsamt. Obwohl diese Konfiguration keine quadratische Änderung der Geruchskonzentration hervorruft, wurde sie erfolgreich zur Untersuchung der Geruchsunterscheidung und -detektion eingesetzt²¹. Wenn das Versuchsprotokoll eine sprunghafte Änderung der Geruchskonzentration erfordert, sollte das Design für die Odormittelabgabe auf drei kontinuierliche Hintergrundluftstromkanäle von 2 l/min geändert werden, bei denen Odorstoffe kontinuierlich in den Hintergrundluftstrom von zwei der Hintergrundluftstromkanäle abgegeben werden. Der dritte Förderkanal würde mit Mineralöl ausgeglichene Luft liefern. In diesem Fall würden Umlenkventile verwendet, um eines der beiden Odormittel oder geruchsfreie Luft in die Geruchsöffnung umzuleiten. Dies würde zu einem stufenweisen Anstieg der Odormittelkonzentration an der Odorieröffnung führen (auch frühere Berichte^19,22). Unabhängig davon ist es wichtig, den zeitlichen Verlauf für die Änderung der Geruchskonzentration mit einem Photoionisationsdetektor zu dokumentieren.

Das hier beschriebene Olfaktometer ist für Verhaltensexperimente an Mäusen konzipiert, wurde jedoch in der Vergangenheit auch für Ratten verwendet. Der Hauptunterschied besteht darin, dass es notwendig ist, die Größe der Kammer für Studien mit Ratten^{zu vergrößern 23}. Schließlich beurteilt dieses Olfaktometer das Geruchsverhalten einer einzelnen Maus. Es wurde ein automatisiertes Olfaktometer mit hohem Durchsatz beschrieben, um mehrere Mäuse zu testen²⁴.

Bedeutung
Dieses Protokoll beschreibt ein maßgeschneidertes Olfaktometer, das die Kosten im Vergleich zu anderen verfügbaren Methoden reduziert.

Zukünftige Anwendungen
Das Olfaktometer wurde speziell für die Verwendung mit Mäusen entwickelt und muss für die Verwendung mit anderen Tieren, wie z. B. Ratten, modifiziert werden. Zusätzliche Funktionen, wie z. B. ein Multi-Elektroden-Aufzeichnungssystem (z. B. eine Multi-Elektroden-Aufzeichnungsplatine), eine Arduino Uno-Karte oder eine Kamera, können ebenfalls integriert werden.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 1/8' ’ Modularer IC Breadboard-Sockel	Gefunden am: amazon.com	ASIN ‏: B004MCSOQY	Treibt die Lichter an und leckt den Zensor
500 Stück sortierte Carbon-Filmwiderstände 1/4 Watt	Gefunden auf amazon.com Marke:bojack		Die Widerstände werden auf den BreadBoard-Sockel gelegt
50k-Ohm Linearkegelpotentiometer	Marke:TWTADE Gefunden auf: Amazon.com		Ermöglicht die Komponenten des Olfaktometers Stromversorgung: Ac 220V-6A Verschiebungsdurchmesser: 6mm/0,2" Wellenlänge: 15mm/0,59" Befestigungsgewinde. Knopfgröße 15/17mm/0,6 x 0,67" (d*H) die Einstellung der Leistung
5 mm rote LED	Gefunden auf: Amazon.com Marke:EDGELEC		Vorverdrahtet mit eingebautem Widerstand; 5 mm runde Glühbirne und verdrahtete LEDs - einfacher Anschluss mit 3-6 V DC Antrieb, 7,9 Zoll lange Drähte. Leistung: 1 Watt
6-Positionen-zweireihiger Brrier-Streifen	Gefunden am: Digikey.com	Basis-Produktnummer 1546306	Wird für Strom und Erde verwendet, je nachdem, wie es angeschlossen ist Nennspannung: 300 V Nennstrom (Ampere): 20 A Drahtstärke: 12-22 AWG
96 50-poliger Hochstrom-Steckverbinder Buchse auf Buchse	Gefunden auf: Amazon.com Marke: ‎ IIVVERR	Teilenummer:‎ F5C953EE65A980D	Gewicht: 109G Raster: 2,54 mm < br / > Gesamtgröße: 50 x 6,4 cm / 2 x 2,5 Zoll
Pumpe für Aquarien -AAPA7.8L 125 GPH, 2 STECKDOSEN 3W	Gefunden on:Amazon.com Marke: Hydrofarm store		Dieses wird mit dem doppelten offenen Kaltwassergehäuse verbunden und wird verwendet, um die Luft an der Maschine mit Strom zu versorgen
T-Stück mit Widerhaken Polyethylen 1/4"	Gefunden am: Uplastic.com	Artikel-Nr.:62200	Verbindet verschiedene Luftschläuche miteinander
T-Stück mit Widerhaken Polyethylen 3/16"	Gefunden am: Uplastic.com	Artikel-Nr.:62063	Verbindet verschiedene Luftschläuche miteinander
BD Präzisions-Gleitnadel für den allgemeinen Gebrauch 18 G & frac12;	Gefunden am: Medneedles.com	Artikelnummer: BD 305195	Wird für das Wassersystem verwendet
Blackbox/manuelle Steuerbox	Marke:Otdorpatio Gefunden auf: Amazon	n/a	Wird als Schaltkasten verwendet Abmessungen: 3,94 x 2,68 x 1,97
Kabel, PC-Netzteil interne Anschlüsse 10ft	Gefunden am: Amazon.com		Anschluss an das Netzteil 40 Watt
Cflex Schlauch, weiß ¼ ” ID x 3/8" OD	Gefunden on:uplastic.com	Artikel-Nr.:54033	Schläuche, die im Luftsystem verwendet werden
maßgefertigte weiße Grundplatte mit Löchern zur Befestigung der Gestelle für Geruchsventile, Durchflussmesser, SSR48-Platte	Die Maschinenwerkstatt des Neurotechnologischen Zentrums auf dem Medizinischen Campus der CU Anschutz
Umlenkventil– Miniatur-Inert-Flüssigkeitsventil, 3-Wege	Gefunden on:Radwell.com	Teilenummer: 003-0258-900	1/8 BARB 24VDC BIS ZU 1500 SCCM 4,2W
Doppeltes Kaltwassergehäuse mit offenem Ende und blauem Sumpf	Gefunden on:GRAINGER.COM MarkePENTAIR/PENTEK	Kompatibel mit Hersteller-Modellnummer150295; 150578; 151117; 151118; 151120; 155003; 244043; 244686; 244687
Fisherbrand EPA-Fläschchen aus Glas	Gefunden am: fishersci.com	Katalog-Nr. 02-912-379	Wird für Gerüche verwendet
Verschraubung Reduzierstück 1/4" x 1/8"	Gefunden am: uplastic.com	Artikel-Nr.: 64370	Adapter, der in den Schläuchen des Luftsystems verwendet wird.
Harte Schläuche, Polyethylen für die Medizin, 0,045 (ID) 1 x 100
LED mit hohem Infrarotanteil	Gefunden auf amazon.com Marke: gikfun		Taktfrequenz des Speichers 1 MHz
Ic opamp gp 4 circuit 14dip	Gefunden auf: Amazon.com Marke:BOJACK		Betriebsspannung 50 Volt Maximale Spannung 50 Volt
Überbrückungskabel-Kit	Gefunden auf: Amazon.com Marke:Elegoo		Artikelabmessungen LxBxH: 0,04 x 8,27 x 0,04 Zoll
Mini-spst-Taster	Marke:Radioshack Gefunden am: Amazon.com	B000TLWZM6	Wird für die Geruchsventile verwendet Betriebsvolumen: 250V Nennstrom: 1 Ampere
Multimeter	Gefunden auf Amazon.com Marke:AstroAl		Genaue Messung von AC/DC-Strom, AC/DC-Spannung, Kapazität, Frequenz, Tastverhältnis, Widerstand, Diode, Durchgang und Temperatur
Nadelnase	Gefunden on:amazon.com Marke:WorkPro		Wird zum Biegen von Drähten verwendet
Geruchsventile	Gefunden on:Radwell.com	Artikelnummer: 192833415 Teilenummer:225T031	Pumpt Gerüche aus Geruchsfläschchen. 30 PSIG 12 VDC
Fototransistor	Gefunden auf: Amazon.com Marke:HILETGO		Spannung: 1,3-1,5 V Empfangsbereich: (NM) 400-1000 Kopfgröße: 5 mm x 5 mm / 0,2" x 0,2" (D*L)
Fototransistor und LED als Paar
Rohradapter 3/4" x 1/4"	Gefunden am: uplastic.com	Artikel-Nr.: 64807	Adapter, der in den Schläuchen des Luftsystems verwendet wird.
Rohradapter für Wassergehäusepumpe - m ¾ x1/4"	Usplastic.com	Artikel-Nr.: 64807	Temperaturbereich -50 ° F bis 275 ° F < br / > Maximaler Druck: 150 psi < br / > 0,0015 lbs
Stromversorgung 12V 30A 360W	Gefunden auf: Amazon.com Marke:ALITOVE		die Hauptstromquelle der Maschine.   Eingangsspannung: 220 Volt Ausgang: DC 12V 30A max.
PTFE-Schläuche	Gefunden auf Amazon.com
RITEFLOW DURCHFLUSSMESSER MIT GLATTEN ENDEN (UNMONTIERT)	Gefunden on:Globalindustrial.com Modellnummer:t9FB3075514	Artikelnummer: H40407-0075	Überwacht den Luftstrom im Olfaktometer 150-mm-Skala, Größe 2 Hersteller-Teilenummer: H40407-0075
Schraubenzieher	Gefunden auf: Amazon.com Marke:Sharden		Wird für Schrauben am Olfaktometer verwendet
Garnelenumwicklung / Schlauch (verschiedene Größen für 18-22 Gauge Draht	Gefunden auf: Amazon.com Marke:eventronic		Material: Hergestellt aus Polyolefin, Schrumpfungsverhältnis: 2: 1 (schrumpft auf 1/2 des mitgelieferten Durchmessers)
Silikonschlauch 0,030 x 0,065	Gefunden on:Amazon.com Marke:Wissenschaftliche Rohstoffe		Schläuche für die Geruchsfläschchen
Löten - mit Blei	Gefunden on:Uline.com	Nr. S-25294	Wird mit dem Lötkolben verwendet
Lötkolben	Gefunden on:Uline.com	Modell Nr .: H-10799	Wird zum Löten der Bottons an der Steuerbox und anderen Anschlüssen verwendet
Halbleiterrelaismodul mit vierfachem Ausgang – Rot	Gefunden am: https://www.sealevel.com/	Teil: OB5Q    Modell: QSSR-Modul mit DC-Ausgang	Kapazität: 8 pF Abmessungen: 2,4" (L) x 1,1" (B) x 3,1" (H) # der E/A: 4 Ausgänge Max. Netzspannung: 60 VDC Max. Einschaltstrom: 3A Minimale Netzspannung: 3 VDC Betriebstemperatur: -30 ; C bis 80°; C (-22°; F bis 176°; f) Ausgangsisolation: 4000 Vrms Lagertemperatur: -40 ; C bis 100°; C (-40°; F bis 212°; F)
SPST-Drucktaster	Marke:Apiele Gefunden am: Amazon.com	n/a	Wird im Steuerkasten des Steuerventils und des Endventils verwendet. Betriebsspannung 250 V Nennstrom: 1 Ampere, 3 Ampere
SSR-Gestell 48	Gefunden on:Radwell.com	Artikelnummer: 83105002	Verarbeitet alle Anschlüsse des Olfaktometers und arbeitet mit Quad-Type-Sooid-Zustandsrelais.
Ernährungssonden aus Edelstahl
Tipp Tinner und Reiniger	Gefunden auf: Amazon.com Marke:Thermaltronics	Modellnummer: FBA-TMT-TC-2
Ventilkugel PVC 1/4" Barb Buna	Gefunden am: uplastic.com	Artikel-Nr.:62281
Wasserventil	Gefunden am: Ph.parker.com	Teil #: 003-0257-900	Pumpt Wasser in die Kammer Maximale Durchflussmenge: 1500 sccm Spannung (VDC): 24 Maximaler Betriebsdruck: 50 psi, 3,44 bar
Draht 22awg	Marke:tuofeng Gefunden am: Amazon.com	N/a	Wird verwendet, um verschiedene Komponenten des Olfaktometers zu verdrahten Material: Kupfer Messgerät 30,0
Drahtschere	Gefunden on:Amazon.com Marke:Billbotk		Wird zum Schneiden von Drähten verwendet
	Als Marke: PTFE	Teil #036663601452	Zur Abgabe von Odorierungsmitteln verwenden.
https://medschool.cuanschutz.edu/neurotechnologycenter/Cores/machine-shop