Methodenartikel

Studien zur entzündungshemmenden Wirkung von Xiaoyao-Pillen bei der Behandlung von postmenopausaler Osteoporose bei Mäusen

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DOI:

10.3791/67051

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23. August 2024

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1Department of Histology and Embryology, Youjiang Medical University for Nationalities, 2Department of Geriatric Orthopedics, Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities, 3Department of Pathophysiology, Youjiang Medical University for Nationalities

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Postmenopausale Osteoporose hat sich zu einem globalen Problem der öffentlichen Gesundheit entwickelt. Das Ziel dieser Studie ist es, die therapeutischen Wirkungen und die damit verbundenen Mechanismen der Xiaoyao-Pillen der traditionellen chinesischen Medizin bei dieser Erkrankung zu untersuchen.

Zusammenfassung

Osteoporose ist eine häufige Stoffwechselerkrankung bei älteren und postmenopausalen Frauen, die im Frühstadium keine offensichtlichen Symptome aufweist. In den letzten Stadien dieser Erkrankung sind die Patienten anfällig für Frakturen, die ihre Gesundheit und Lebensqualität ernsthaft beeinträchtigen können. Der weltweite Anstieg der Lebenserwartung hat Osteoporose zu einem globalen Problem gemacht. Die Xiaoyao-Pillen wurden zuvor
Wird bei der Behandlung von Depressionen verwendet. Darüber hinaus schien das Medikament eine östrogenähnliche Aktivität zu haben, die die Expression von ALP, einem frühen Osteoblasten-spezifischen Marker, und COL-1, einem Hauptbestandteil der extrazellulären Knochenmatrix, beeinflusste. Xiaoyao-Pillen wurden auf ihre Auswirkungen auf die postmenopausale Osteoporose (PMOM) bei Mäusen untersucht. Die Zielinformationen jeder pflanzlichen Komponente der Xiaoyao-Pillen wurden über die Datenbank der Systempharmakologie der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCMSP) abgerufen. Informationen von GeneCards, OMIM, PharmGkb, TTD, DrugBank und anderen Websites wurden verwendet, um das regulatorische Netzwerk des Kräuterkomplexes über Cytoscape und das String-Netzwerk zu konstruieren und die Proteininteraktionen zu bewerten. Die Mäuse wurden ovariektomiert und mit hohen und niedrigen Dosen von Xiaoyao-Pillen behandelt, und diese wurden mit Kontrollen verglichen. Ihre Symptome wurden durch Immunzytochemie des Knochengewebes beurteilt. Die Ergebnisse deuteten darauf hin, dass Xiaoyao-Pillen die Fähigkeit hatten, die Symptome von PMOM bei ovariektomierten Mäusen über den IL-17-Signalweg zu lindern. Dieses Medikament hat das Potenzial, ein neuartiges Therapeutikum zur Behandlung von Osteoporose zu werden.

Einleitung

Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) definiert Osteoporose (OP) als eine Krankheit, die durch eine Abnahme der Knochenmasse und eine Verschlechterung der Mikroarchitektur des Knochengewebes gekennzeichnet ist, was zu einer Zunahme der Knochenbrüchigkeit und damit zu einem erhöhten Frakturrisiko führt1. Die klinische Bedeutung der Osteoporose besteht darin, dass sie zu Frakturen führen kann, die mit hoher Mortalität, Morbidität und wirtschaftlichen Kosten verbunden sind2. Postmenopausale Osteoporose (PMOP) wird durch eine Abnahme des Östrogenspiegels bei Frauen nach der Menopause verursacht, was zu einer Erhöhung der Osteoklastenaktivität führt, was zu Knochenverlust und Zerstörung der Knochenmikrostruktur führt. Dies führt häufig zu Osteoporose mit schwerwiegenden Auswirkungen auf die Gesundheit3. Zu den derzeitigen Therapien für PMOP gehören Östrogenersatztherapien, Bisphosphonate und Parathormon, aber sie können unterschiedlich starke Nebenwirkungen, unzureichende langfristige Compliance und hohe Kosten haben4. Daher ist eine erschwingliche pflanzliche Medizin für einen großen Teil der Bevölkerung eine praktikable Alternative.

Xiaoyao-Pillen sind im Chinesischen Arzneibuch5 enthalten und enthalten acht pflanzliche Bestandteile, darunter Chai Hu, Angelica sinensis, Weiße Paeonia lactiflora, Atractylodes macrocephala, Poria cocos, Menthae Herba, Süßholz und frischer Ingwer. Alle diese Kräuter sind dafür bekannt, dass sie die Leber entgiften und die Milz stärken, das Blut nähren und den Menstruationszyklus regulieren, und die Mischung wurde auch zur Behandlung von Depressionen verwendet6. Die Rolle von Xiaoyao-Pillen bei Osteoporose ist jedoch unklar.

Frühe Studien deuten darauf hin, dass Entzündungen zu Knochenschwund führen können7 und dass der mit diesem Prozess verbundene Rückgang der Knochendichte durch die Menopause beschleunigt werden kann. Darüber hinaus besteht ein starker Zusammenhang zwischen der Entwicklung von Osteoporose und Entzündungen. Der Entzündungsfaktor Interleukin-17 (IL-17) ist ein entzündungsfördernder Faktor, der von Th17-Zellen, einer Untergruppe der CD4+ T-Lymphozyten, sezerniert wird. Diese Zellen werden mit mehreren chronischen Entzündungszuständen in Verbindung gebracht und spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der Knochenzerstörung bei rheumatoider Arthritis8. Darüber hinaus stimuliert IL-17 den nuklearen Faktor-κ B-Ligandenrezeptor-Aktivator (RANKL), der die Osteoklastogenese reguliert, was zu einer stärkeren Knochenresorption als zur Knochenbildung führt9. IL-17 stimuliert die Expression anderer osteoklastogener Zytokine wie TNFα, IL-1, IL-6 und IL-8. Es hat die Fähigkeit, mit anderen Entzündungsfaktoren zu synergistieren, was es zu einem wichtigen Entzündungseffektor macht10.

Studien haben auch einen Zusammenhang zwischen Xiaoyao-Pillen und Entzündungen gezeigt. Shi et al.11 und Fang et al.12 haben kürzlich bestätigt, dass Xiaoyao-Pillen die Spiegel von IL-6 bzw. TNF-α senken können. In einer anderen Studie zur stoffwechselassoziierten Steatohepatitis wurde berichtet, dass Xiaoyao-Pillen die Expression von Propionsäure hochregulieren können, was wiederum die Expression von TNF-α hemmt und eine entzündungshemmende Wirkung ausübt13. Derzeit ist jedoch nicht bekannt, ob Xiaoyao-Pillen die Entwicklung von PMOM regulieren können, indem sie eine Entzündungsreaktion über IL-17 vermitteln, was das Ziel dieser Studie war.

Diese Studie sagte die Überschneidung der Ziele von Xiaoyao-Pillen und Osteoporose-bezogenen Genen durch Netzwerkpharmakologie und Bioinformatik-Analyse voraus und analysierte die sich überschneidenden Gene für Proteininteraktionen, GO und KEGG. Basierend auf den vorhergesagten Ergebnissen kann die Expression von Act1 und IL-6, den Schlüsselproteinen im IL-17-Signalweg, beobachtet werden14,15 sowie die Knochenumsatzmarker alkalische Phosphatase (ALP) und Kollagen Typ I (COL-1), um die therapeutische Wirksamkeit der Xiaoyao-Pillen im PMOM-Mausmodell zu beobachten.

Protokoll

Die Ethikkommission für Versuchstiere der Medizinischen Universität Youjiang für Nationalitäten hat das Studienprotokoll genehmigt (Zulassungsnummer: 2022101502). Weibliche C57BL/6-Mäuse im Alter von 10-12 Wochen, SPF-Klasse und Körpergewicht (22 ± 2) g, wurden im SPF Class Animal Experiment Center der Youjiang Medical University for Nationalities untergebracht. Die Versuchstiere wurden bei einer Temperatur von 24-26 °C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 55 % bis 60 % gehalten.

1. Systempharmakologie-Datenbank und Analyseplattform für traditionelle chinesische Medizin

HINWEIS: Die Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP; https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php) sind pharmakologische Plattformen für die chinesische Medizin, die Informationen über TCM-Inhaltsstoffe, ADME-bezogene Eigenschaften, Ziele und Krankheiten enthalten16,17.

  1. Greifen Sie auf die TCMSP-Weboberfläche zu. Suchen Sie nach Herbs Namen, geben Sie den Namen des chinesischen Arzneimittels ein und klicken Sie auf Suchen. Klicken Sie in den Suchergebnissen auf Lateinischer Name . Führen Sie ein Screening der Ergebnisse der Inhaltsstoffe mit den Parametern OB ≥ 30 % und DL ≥ 0,18 durch.
  2. Kopieren Sie alle Ergebnisse und speichern Sie sie im TXT-Format mit dem Namen Chinese Medicine Name_ingredients.txt.
  3. Filtern Sie auf der Registerkarte "Verwandte Ziele" unter "Zielinformationen" nach Mol-ID (d. h. dem Ergebnis in Schritt 1.2).
  4. Kopieren Sie die gefilterten Ergebnisse und speichern Sie sie im TXT-Format mit dem Namen Chinese Medicine Name_targets.txt.
    HINWEIS: Durch die obigen Schritte wurden alle in Frage kommenden Wirkstoffe und die entsprechenden Zielinformationen der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM) erhalten.
  5. Legen Sie alle oben genannten ingredients.txt Dateien und targets.txt Dateien im selben Ordner ab und legen Sie die Perl-Skripte (Supplementary Coding File 1) in diesem Ordner ab.
  6. Öffnen Sie CMD, geben Sie den Pfad des CD-Ordners ein, geben Sie ihn ein und führen Sie das Perl-Skript aus. Holen Sie sich eine neue Textdatei (allTargets.txt). Diese neue Textdatei (allTargets.txt) enthält den Namen des Kräuters, den Namen des Inhaltsstoffs, die ID der Inhaltsstoffe und das Ziel.

2. UniProt-Datenbank

HINWEIS: Die UniProt-Datenbank (https://www.uniprot.org/) enthält menschliche Proteinsequenzen, die mit funktionellen Informationen annotiert sind, und wird verwendet, um die Namen der Ziele auf ihre offiziellen Namen18 zu normalisieren.

  1. Gehen Sie zur UniProt-Weboberfläche. Klicken Sie auf die Registerkarte Suchen , wählen Sie UniProtKB aus und klicken Sie auf Suchen.
  2. Filtern Sie in der linken Seitenleiste, wählen Sie Reviewed (Swiss-Prot) für Status und Human für Popular organisms aus. Klicken Sie auf Herunterladen, wählen Sie Alle herunterladen, wählen Sie TSV als Format aus, und klicken Sie auf Herunterladen , um die Anmerkungsdatei herunterzuladen.
  3. Entpacken Sie die heruntergeladene Datei in den aktuellen Ordner, öffnen Sie die entpackte Datei, kopieren Sie sie und fügen Sie sie in eine Textdatei mit dem Namen ann.txt ein.

3. Umwandlung der Wirkstoffziel-ID

  1. Legen Sie alle in Abschnitt 1 allTargets.txt erhaltenen Wirkstoffzieldateien und die in Abschnitt 2 erhaltene UniProt-Annotationsdatei ann.txt in einen Ordner und legen Sie die Perl-Skripte (Supplementary Coding File 2) in diesen Ordner ab.
  2. Öffnen Sie CMD, geben Sie cd + Leertaste + Ordnerpfad ein, geben Sie ihn ein und führen Sie das Perl-Skript aus, um eine neue Textdatei (allTargets.symbol.txt) zu erhalten. Diese neue Textdatei (allTargets.symbol.txt) enthält den Namen des Kräuters, die ID des Inhaltsstoffs, den Namen des Inhaltsstoffs und die Gen-ID.

4. Datenbank-Suche

  1. GeneCards: Datenbank der Human Gene Database (GeneCards)
    HINWEIS: Die GeneCards-Datenbank (https://www.genecards.org/) bietet Vorhersage- und Annotationsinformationen für menschliche Gene. Es wird verwendet, um auf Krankheitsziele zuzugreifen19,20.
    1. Gehen Sie zur GeneCards-Weboberfläche. Geben Sie osteoporose in das Suchfeld ein und klicken Sie auf Suchen.
    2. Klicken Sie auf Exportieren und wählen Sie Nach Excel exportieren aus.
    3. Öffnen Sie die heruntergeladene Datei, kopieren Sie die Gene mit dem Relevanzwert ≥ 1, fügen Sie sie ein und speichern Sie sie in einer Datei mit dem Namen GeneCards.txt.
  2. OMIM-Datenbank
    HINWEIS: Die OMIM-Datenbank (https://omim.org) enthält menschliche Gene, genetische Krankheiten und Merkmale21.
    1. Rufen Sie die OMIM-Weboberfläche auf. Klicken Sie auf GENE Map, geben Sie osteoporose in das Suchfeld ein und klicken Sie auf Suchen.
    2. Klicken Sie auf Herunterladen als und wählen Sie Excel-Datei aus.
    3. Öffnen Sie die heruntergeladene Datei, kopieren Sie den Gennamen in die Spalte Genehmigtes Symbol, fügen Sie ihn ein und speichern Sie ihn in einer Datei mit dem Namen OMIM.txt.
  3. Datenbank PharmGkb
    HINWEIS: PharmGkb (https://www.pharmgkb.org), die Wissensdatenbank für Pharmakogenomik, enthält Annotationen zu Arzneimitteletiketten, arzneimittelzentrierte Signalwege, pharmakogenetische Zusammenfassungen und Beziehungen zwischen Genen, Arzneimitteln und Krankheiten22.
    1. Rufen Sie die Benutzeroberfläche der PharmGkb-Website auf. Geben Sie Osteoporose in das Suchfeld ein, klicken Sie auf Suchen und aktivieren Sie Gen in der linken Seitenleiste.
    2. Geben Sie alle Ergebnisse manuell ein und speichern Sie sie in einer Datei mit dem Namen PharmGkb.txt.
  4. TTD: Datenbank für therapeutische Zieldatenbanken (TTD)
    HINWEIS: Die TTD-Datenbank (https://idrblab.org/ttd/) enthält Informationen über Protein- und Nukleinsäureziele, Zielkrankheiten, Informationen über den Signalweg und entsprechende Arzneimittel für jedes Ziel23.
    1. Gehen Sie zur TTD-Weboberfläche. Geben Sie osteoporose in das Suchfeld ein und klicken Sie auf Suchen.
    2. Klicken Sie im Ergebnis unter Ziel-ID auf Zielinfo , kopieren Sie den Zielnamen, fügen Sie ihn ein und speichern Sie ihn in einer Datei mit dem Namen TTD.txt. Insgesamt wurden 33 Ergebnisse erzielt. Speichern Sie jedes Ergebnis auf die gleiche Weise.
  5. Datenbank DrugBank Online (DrugBank)
    HINWEIS: Die DrugBank-Datenbank (https://go.drugbank.com) enthält Informationen über Arzneimittel und Wirkstoffziele, Arzneimittelwechselwirkungen, Arzneimittelmechanismen und Arzneimittelmetabolismus24.
    1. Gehen Sie zur Benutzeroberfläche der DrugBank-Website. Wählen Sie auf der Registerkarte "Suche" die Option "Indikationen " aus, geben Sie "Osteoporose" in das Suchfeld ein und klicken Sie auf "Suchen".
    2. Klicken Sie auf den Eintrag Osteoporose in den Ergebnissen, um weitere Informationen zu erhalten, klicken Sie auf die Registerkarte MEDIKAMENTE UND ZIELE und klicken Sie auf den entsprechenden Link in der Spalte ZIEL der Tabelle.
    3. Klicken Sie in Protein auf Details, kopieren Sie den Gennamen, fügen Sie ihn ein und speichern Sie ihn in einer Datei mit dem Namen DrugBank.txt. Speichern Sie jedes Ergebnis auf die gleiche Weise.

5. Venn-Diagramm

  1. Krankheitsassoziierte Genverschmelzung und Venn-Kartierung
    1. Legen Sie die gespeicherten txt-Dateien sowie das Skript im selben Ordner ab.
    2. Öffnen Sie den R-Code (Merge Disease-Related Genes), kopieren Sie den Pfad, in dem die obige txt-Datei gespeichert ist, und fügen Sie ihn in die Zeile ein, in der sich setwd im R-Code befindet.
    3. Öffnen Sie die R-Software, führen Sie den geänderten R-Code aus, und speichern Sie. Legen Sie das Gen fest, benennen Sie die Datei Disease.txt.
    4. Öffnen Sie die Website Draw Venn Diagram; Kopieren Sie im Eingabebereich den in den Abschnitten 4 bis 8 gespeicherten Textinhalt nacheinander in die Liste, benennen Sie ihn mit der entsprechenden Datenbank und klicken Sie auf Senden.
    5. Klicken Sie unter dem Bild auf Bild als PNG speichern und speichern Sie das Textergebnis im selben Ordner.
  2. Schnittmenge von Wirkstoffzielen und krankheitsassoziierten Genen
    1. Legen Sie die allTargets.symbol.txt Datei aus Abschnitt 3 und die Disease.txt Datei aus Schritt 5.1.3 im selben Ordner ab.
    2. Öffnen Sie den R-Code (drug target and disease-related gene take intersection), kopieren Sie den Pfad, in dem die obige txt-Datei gespeichert ist, und fügen Sie ihn in die Zeile ein, in der sich der setwd im R-Code befindet.
    3. Öffnen Sie die R-Software, führen Sie den geänderten R-Code aus, und speichern Sie. Legen Sie das Gen fest, benennen Sie die Datei Drug_Disease.txt.
    4. Öffnen Sie die Website Draw Venn Diagram. Kopieren Sie im Eingabebereich allTargets.symbol.txt und fügen Sie Disease.txt in die Liste ein und benennen Sie sie nach den entsprechenden Dateien.
    5. Klicken Sie unter dem Bild auf Bild als PNG speichern und speichern Sie die Textergebnisse im selben Ordner.

6. Aufbau des regulatorischen Netzwerks der TCM-Compoundierung

  1. Legen Sie die allTargets.symbol.txt Datei, die Sie in Abschnitt 3 erhalten haben, im selben Ordner wie die Disease.txt Datei und das entsprechende Perl-Skript (Supplementary Coding File 3) ab.
  2. Öffnen Sie CMD, geben Sie den Pfad der CD-Datei ein, drücken Sie die Eingabetaste und führen Sie das Perl-Skript aus. Holen Sie sich vier neue TXT-Dateien: net.geneLists.txt, net.molLists.txt, net.network.txt und net.type.txt. Die network.txt Datei enthält die TCM-Inhaltsstoff-ID, das Zielgen, die Zielbeziehung und den Namen des Inhaltsstoffs. net.type.txt enthält den Knotennamen, die Attribute und die Zugehörigkeit. net.geneLists.txt ist die Liste der Gene und net.molLists.txt ist die Liste der Inhaltsstoffe.
  3. Kopieren Sie die neu erhaltenen Textdateien in denselben neuen Ordner.
  4. Öffnen Sie die Cytoscape 3.9.1-Software, klicken Sie auf Datei, klicken Sie auf Importieren und wählen Sie Netzwerkformulardatei. Wählen Sie net.network.txt aus, geben Sie die erste Spalte der Komponenten-ID als Quellknoten, die zweite Spalte der Gene als Zielknoten und die dritte Spalte der Zielbeziehung als Interaktionstyp aus und klicken Sie auf OK.
  5. Importieren Sie net.type.txt aus dem Fenster Knotentabelle. Klicken Sie auf die Registerkarte Auswählen, wählen Sie Knoten aus, wählen Sie Aus ID-Listendatei, wählen Sie net.geneLists.txt aus, und klicken Sie auf Öffnen.
  6. Klicken Sie auf die Registerkarte Layout, wählen Sie Gradsortiertes Kreislayout und dann Nur ausgewählte Knoten aus. Passen Sie sowohl die Höhe als auch die Breite der Knoten auf 70 an.
  7. Klicken Sie auf das zweite Feld in der Höhe, wählen Sie degree.layout in der Spalte aus, wählen Sie Kontinuierliches Mapping unter Mapping-Typ aus und doppelklicken Sie auf das Fenster zur Höhenanpassung auf der rechten Seite von Current Mapping, um die oberen und unteren Grenzen der Höhe auf einen geeigneten Bereich einzustellen.
  8. Wiederholen Sie den Vorgang mit der Option Breite.
  9. Klicken Sie erneut auf die Registerkarte Layout und dann auf Layout-Tools > Passen Sie die Skalierung so an , dass sich die Knoten nicht überlappen.
  10. Klicken Sie auf das obere rechte Fenster der Software, um das Knotennetzwerk zu deaktivieren, klicken Sie auf die Registerkarte Auswählen , wählen Sie Knoten aus, wählen Sie Aus ID-Listendatei, wählen Sie net.molLists.txt und klicken Sie auf Öffnen.
  11. Klicken Sie auf die Registerkarte Layout, wählen Sie Layout für Gruppenattribute aus, wählen Sie Nur ausgewählte Knoten aus, und klicken Sie auf Typ.
  12. Klicken Sie in der linken Spalte auf Schriftgröße beschriften und legen Sie den Standardwert auf 12 fest. Klicken Sie in der linken Spalte auf Standardwert in Bild/Diagramm 1.
  13. Wählen Sie im Popup-Fenster Diagramme aus, klicken Sie auf Kreisdiagramm, und wählen Sie in der Spalte Verfügbare Spalten mit Ausnahme des Grads die Elemente aus. Layout in der Spalte "Ausgewählte Spalten" und klicken Sie auf "Übernehmen".
  14. Klicken Sie in der linken Spalte auf Border Paint und setzen Sie den Standardwert auf #003EF8. Klicken Sie auf die Registerkarte Kante am unteren Rand der linken Seitenleiste und stellen Sie die Breite auf 0,8 ein.
  15. Klicken Sie in der oberen Symbolleiste auf Datei, wählen Sie Exportieren und dann Netzwerk in Bild aus.
  16. Wählen Sie im Popup-Fenster das PNG-Format als Format aus, wählen Sie das Speicherverzeichnis und benennen Sie das Bildnetzwerk, stellen Sie die Bildgröße auf maximal 500 % ein, wählen Sie Transparenter Hintergrund und klicken Sie auf OK , um das Speichern des Bildes abzuschließen.

7. Konstrukte von Protein-Protein-Interaktionsnetzwerken (PPI)

  1. Öffnen Sie die STRING-Website (https://string-db.org/), klicken Sie auf Mehrere Proteine, klicken Sie auf Durchsuchen in Datei hochladen, wählen Sie die Drug_Disease.txt Datei aus, die Sie in Schritt 5.2.3 erhalten haben, und wählen Sie Homo sapiens in Organismen aus. Klicken Sie auf Suchen und dann auf Weiter.
  2. Klicken Sie auf Einstellungen, legen Sie den minimal erforderlichen Interaktionswert auf die höchste Zuverlässigkeit (0,900) fest, und aktivieren Sie in den Anzeigeoptionen des Netzwerks die Option Getrennte Knoten im Netzwerk ausblenden. Klicken Sie auf Aktualisieren.
  3. Nehmen Sie Anpassungen an den Knoten im Netzwerkdiagramm vor, sodass es keine Überlappung oder Okklusion gibt.
  4. Klicken Sie auf Exports und dann auf Als hochauflösende Bitmap herunterladen, um die Protein-Interworking-Network-Map im PNG-Format zu erhalten. Laden Sie die TSV-Datei auch als kurze tabellarische Textausgabe herunter. Speichern Sie beide Dateien in einem einheitlichen Ordner. Die TSV-Datei enthält den Gennamen, die interne STRING-ID und die Bewertungen für verschiedene Attribute.

8. Aufbau des PPI-Netzwerkkerns

  1. Legen Sie die in Abschnitt 7 erhaltene TSV-Datei und die erforderlichen Perl-Skripte in einem neuen Ordner ab.
  2. Öffnen Sie die Cytoscape 3.9.1 Software, klicken Sie auf Datei, wählen Sie Importieren, klicken Sie auf Netzwerk aus Datei, wählen Sie die obige TSV-Datei aus, setzen Sie die erste Spalte node1 als Quellknoten und die zweite Spalte node2 als Zielknoten und klicken Sie auf OK.
  4. Klicken Sie in der oberen Symbolleiste auf APPs , klicken Sie auf CytoNCA und dann auf Öffnen.
  5. Wählen Sie in der linken Spalte unter Zwischenräume, Nähe, Grad, Eigenvektor, Lokale durchschnittliche Konnektivitätsmethode und Netzwerk die Option Ohne Gewichtung aus, und klicken Sie auf Analysieren.
  6. Wenn die Analyse abgeschlossen ist, klicken Sie im unteren rechten Fenster auf Knotentabelle , klicken Sie auf Exportieren, speichern Sie sie im Ordner und nennen Sie sie Punktzahl 1.
    HINWEIS: Das CytoNCA-Plugin muss in der Cytoscape-Software installiert sein. Klicken Sie dazu in der oberen Symbolleiste auf Apps , klicken Sie auf APP-Manager, geben Sie CytoNCA in das Suchfeld ein, aktivieren Sie CytoNCA in der mittleren Spalte der zurückgegebenen Ergebnisse und klicken Sie auf Installieren.
  7. Öffnen Sie score1, passen Sie die Namensspalte an die erste Spalte an, kopieren Sie die Informationen in der Tabelle, fügen Sie sie in eine neue Textdatei ein, nennen Sie sie score1.txt, und speichern Sie sie.
  8. Öffnen Sie den R-Code, kopieren Sie den Pfad, in dem sich die score1.txt Datei befindet, und fügen Sie ihn in die Zeile ein, in der sich setwd im R-Code befindet.
  9. Öffnen Sie die R-Software, und führen Sie den geänderten Code aus, um zwei neue Dateien score2.txt und score2.gene.txt abzurufen. Die score2.txt Datei enthält die Gene, für die alle Programmwerte größer als der Median waren, und die spezifischen Punktzahlen für jedes Programm. score2.gene.txt enthält die Gene, die bei allen Elementen besser als der Median bewertet wurden.
  10. Um in Cytoscape fortzufahren, klicken Sie im unteren rechten Fenster auf AnalysisPanel 1 , klicken Sie auf der linken Seite des Fensters auf Aus Datei hochladen , wählen Sie das score2.gene.txt aus, klicken Sie auf Öffnen und tippen Sie im Popup-Fenster auf OK .
  11. Klicken Sie unten auf Knoten auswählen und dann im Popup-Fenster auf OK .
  12. Klicken Sie in der oberen Symbolleiste auf Datei , wählen Sie Exportieren aus, klicken Sie auf Netzwerk in Bild, stellen Sie den Zoom (%) in der Bildgröße auf maximal 500 % ein, aktivieren Sie Transparenter Hintergrund und speichern Sie die Datei im selben Ordner, nennen Sie ihn network1.
  13. Klicken Sie in der rechten Seitenleiste des unteren Fensters auf Subnetzwerk erstellen , um ein Subnetzwerk zu erstellen, analysieren Sie das Subnetzwerk, klicken Sie in der Symbolleiste oben auf APPs , klicken Sie auf CytoNCA und klicken Sie auf Öffnen.
  14. Wählen Sie in der linken Seitenleiste unter "Zwischen", "Nähe", "Grad", "Eigenvektor", "Lokale durchschnittliche Konnektivitätsmethode" und "Netzwerk" die Option "Ohne Gewichtung " aus und klicken Sie auf "Analysieren".
  15. Wenn die Analyse abgeschlossen ist, klicken Sie im unteren rechten Fenster auf Knotentabelle , klicken Sie auf Exportieren und speichern Sie sie in einem neuen Ordner mit dem Namen score2.
  16. Öffnen Sie score2, passen Sie die Namensspalte an die erste Spalte an, kopieren Sie die Informationen in der Tabelle, fügen Sie sie in eine neue Textdatei ein, nennen Sie sie score2.txt und speichern Sie sie.
  17. Öffnen Sie den R-Code, kopieren Sie den Pfad, in dem sich die score2.txt-Datei befindet, und fügen Sie ihn in die Zeile ein, in der sich setwd im R-Code befindet.
  18. Öffnen Sie die R-Software, und führen Sie den geänderten Code aus, um zwei neue Dateien abzurufen: score3.txt und score3.gene.txt. Die score3.txt Datei enthält die Gene, die für alle Elemente besser als der Median bewertet wurden, sowie die spezifischen Punktzahlen für jedes Element. score3.gene.txt enthält die Gene, die für alle Elemente besser als der Median bewertet wurden.
  19. Um in Cytoscape fortzufahren, klicken Sie im unteren rechten Fenster auf AnalysisPanel 1 , klicken Sie auf der linken Seite des Fensters auf Aus Datei hochladen , wählen Sie das score3.gene.txt aus, klicken Sie auf Öffnen und tippen Sie im Popup-Fenster auf OK .
  20. Klicken Sie unten auf Knoten auswählen und dann im Popup-Fenster auf OK .
  21. Klicken Sie in der oberen Symbolleiste auf Datei , wählen Sie Exportieren aus, klicken Sie auf Netzwerk in Bild, passen Sie den Zoom (%) in der Bildgröße auf 500 % an, aktivieren Sie Transparenter Hintergrund, und speichern Sie die Datei im selben Ordner wie in diesem Schritt, und nennen Sie ihn network2.
  22. Klicken Sie in der rechten Seitenleiste des Fensters unten auf Subnetzwerk erstellen , um ein Subnetzwerk zu erstellen.
  23. Klicken Sie in der Symbolleiste oben auf Datei , wählen Sie Exportieren aus, klicken Sie auf Netzwerk in Bild, passen Sie den Zoom (%) in der Bildgröße auf maximal 500 % an, aktivieren Sie Transparenter Hintergrund, und speichern Sie die Datei im selben Ordner wie in diesem Schritt und nennen Sie ihn network3.

9. Umwandlung der Gen-ID

  1. Platzieren Sie die Drug_Disease.txt Datei im selben neuen Ordner wie die erforderliche Codedatei.
  2. Öffnen Sie den R-Code (Supplementary Coding File 4), kopieren Sie den Pfad, in dem sich die Drug_Disease.txt Datei befindet, und fügen Sie ihn in die Zeile ein, in der sich setwd im R-Code befindet.
  3. Öffnen Sie die R-Software, und führen Sie den geänderten Code mit der Organisation aus. Hs.eg.db Paket, um die Gen-ID zu konvertieren, und führen Sie es nach Fertigstellung einer neuen Datei id.txt aus. Die id.txt enthält das Symbol des Gens und die entsprechende ID.

10. GO-Anreicherungsanalyse

  1. Platzieren Sie die id.txt Datei aus dem vorherigen Schritt im selben Ordner wie den Code für die GO-Anreicherungsanalyse.
  2. Öffnen Sie den R-Code (Supplementary Coding File 5) und setzen Sie das Arbeitsverzeichnis auf id.txt und den Pfad, in dem der GO-Code gespeichert ist.
  3. Öffnen Sie die R-Software, führen Sie den geänderten Code aus, und verwenden Sie clusterProfiler, org. Hs.eg.db, das Diagramm anreichern, ggplot2-Diagramm, die Histogramme der GO-Anreicherungsanalyse und Blasendiagramme. Rufen Sie drei neue Dateien (GO.txt, barplot.pdf und bubble.pdf ab, nachdem die Ausführung abgeschlossen ist.
    HINWEIS: Bei der GO.txt handelt es sich um die Anreicherungsergebnisdatei, die die Anreicherungsklassifizierung (BP, CC, MF), GO-ID, GO-Name, Genanteil, Hintergrundanteil, p-Wert für die Anreicherungsbedeutung, den korrigierten p-Wert (p.adjust, Wert), die Gen-ID (Name) und die Anzahl der Gene enthält, die auf jedem GO angereichert wurden. barplot.pdf ist das Histogramm, Blase. PDF ist ein Blasendiagramm.

11. Analyse der KEGG-Anreicherung

  1. Legen Sie die id.txt Datei im selben Ordner wie den KEGG-Anreicherungsanalysecode ab.
  2. Öffnen Sie den R-Code (Supplementary Coding File 6) und setzen Sie das Arbeitsverzeichnis auf den Pfad, in dem id.txt und der KEGG-Code gespeichert sind.
  3. Öffnen Sie die R-Software, führen Sie den geänderten Code aus, und verwenden Sie clusterProfiler, org. Hs.eg.db, enrichplot, ggplot2 Paket zum Plotten von GO-Anreicherungsanalyse-Histogrammen, Blasendiagrammen und Pfaddiagrammen. Der Lauf wird mit der Produktion von drei neuen Dateien abgeschlossen: KEGG.txt, barplot.pdf und bubble.pdf.
    HINWEIS: Bei der KEGG.txt-Datei handelt es sich um eine Anreicherungsergebnisdatei, die die Pfad-ID, die Beschreibung des Signalwegs, den Genanteil, den Hintergrundanteil, den p-Wert der Anreicherungsbedeutung, den korrigierten p-Wert (p.adjust, qvalue), die Gen-ID (Name) und die Anzahl der Gene enthält, die in jedem Signalweg angereichert sind. barplot.pdf handelt sich um ein Balkendiagramm und bubble.pdf um ein Blasendiagramm.
  4. Suchen Sie IL-17 in der Datei KEGG.txt; Das Ergebnis zeigt, dass es nur einen Weg gibt; Kopieren Sie die Pfad-ID.
  5. Öffnen Sie den R-Code, fügen Sie die IL-17-Pfad-ID in KEGGID ein, und verwenden Sie das pathview-Paket, um die Pfadkarte zu beschriften. Führen Sie den geänderten R-Code aus, und rufen Sie zwei neue Dateien ab, hsa04657.pathview.png und hsa04657.png.
    HINWEIS: Die hsa04657.png Datei ist die Signalwegkarte, hsa04657.pathview.png ist die beschriftete Signalwegkarte, und die rot beschrifteten sind die Gene, die im Interaktionsnetzwerk vorhanden sind.

12. Zubereitung von Xiaoyao Pillen

HINWEIS: Für die verwendete Zubereitungsmethode siehe Chinesisches Arzneibuch5.

  1. Nehmen Sie 100 g Chai Hu, 100 g Angelica sinensis, 100 g White Paeonia lactiflora, 100 g gebratene Atractylodes macrocephala, 100 g Poria cocos, 80 g Radix glycyrrhizae preparate und 20 g Menthae herba.
  2. Mit einer Steinmühle oder einer Pudermaschine die Kräuter zu einem feinen Pulver zerkleinern; Mehrere Kräuter werden in den oben genannten Anteilen kombiniert und zu einem feinen Pulver pulverisiert, um sich auf natürliche Weise miteinander zu vermischen. Verwenden Sie ein 80-Mesh-Medikamentensieb mit einem Innendurchmesser von 180 μm ± 7,6 μm und sieben Sie das pulverisierte Pulver. Gründlich mischen.
  3. Nimm 100 g Ingwer, füge Wasser hinzu und koche es jedes Mal 2x für 20 Minuten. Abseihen und beiseite stellen.
  4. Nehmen Sie eine medizinische Plaque, tauchen Sie einen kleinen Besen in Ingwerwasser, streichen Sie damit auf die Plaque, nehmen Sie das obige Pulver, streuen Sie es auf das Ingwerwasser und drehen Sie die Plaque so, dass das gesamte Pulver nass ist und sie in eine Kugelform geformt werden kann.
    HINWEIS: Die Bildung der medizinischen Plaque ist ein wesentlicher Schritt bei der Herstellung von TCM-Pillen. Der größte Teil des Moso-Bambus wird in Streifen gespalten und zu einem Skelett verwoben. Die Bambushaut oder Tengpi wird in die Oberfläche eingewebt und wird abgerundet. Die Oberfläche der Plaque sollte dünn mit Tungöl überzogen und anschließend mit einer Schicht Lack bestrichen werden. Dieser wird getrocknet, um wasserdicht zu werden. Die auf diese Weise hergestellten Pillen sind rund und glatt.
  5. Bürsten Sie das Ingwerwasser erneut auf, streuen Sie das Pulver und drehen Sie die Plaque, so dass das Medikament allmählich abgerundet und vergrößert wird. Zum Trocknen an einen kühlen Ort stellen.

13. Etablierung des Tiermodells

  1. Nach 7 Tagen Akklimatisierung teilen Sie die Versuchsmäuse nach dem Zufallsprinzip in 4 Gruppen ein, nämlich die Scheinoperationsgruppe (Sham, bei der nur das Fett um die Eierstöcke entfernt wurde) und drei Gruppen von ovariektomierten Mäusen, bestehend aus einer Modellgruppe (OVX) sowie Verabreichungsgruppen mit niedrig- und hochkonzentrierten Xiaoyao-Pillen.
  2. Betäuben Sie die Mäuse mit 3% Natrium-Pentobarbital (40 mg/kg), das intraperitoneal injiziert wird. Überprüfen Sie, ob die Mäuse in den Narkosezustand eintreten, indem Sie eine generalisierte Muskelentspannung, eine tiefe und langsame Atmung und eine verlangsamte Bewegung beobachten. Tragen Sie vor der Operation Augensalbe auf die Augen der Mäuse auf.
  3. Legen Sie die Tiere in Bauchlage und rasieren Sie die Nierenregion des Rückens mit einem Tierrasierer. Führen Sie eine lokale Desinfektion mit 75% Ethanol durch.
  4. Machen Sie einen beidseitigen Längsschnitt von ca. 1 cm in der Nähe des dorsalen Bereichs der Niere und schneiden Sie die Faszie ein, um die Muskeln und das Bauchfell zu trennen.
  5. Lokalisieren Sie den oberen Teil des Gebärmutterhorns und die Eileiter für die Ligatur. Führen Sie eine Pinzette zur Erkundung in den Schnitt ein und lokalisieren Sie den Eierstock, der von Fettgewebe in einem leuchtend roten Blumenkohlmuster umhüllt ist, mit spiralförmig angeordneten Eileitern unterhalb des Eierstocks, die den Eierstock mit dem Gebärmutterhorn verbinden25. Entfernen Sie die Eierstöcke mit einer chirurgischen Schere und Naht.
  6. Entnahme einer kleinen Menge Fettgewebe in der Nähe des Eierstocks als Kontrolle in der Scheinoperationsgruppe. Beobachte Tiere, bis sie wieder zu Bewusstsein kommen. Setzen Sie postoperative Tiere bis zur vollständigen Genesung in getrennte Käfige.
  7. Um eine Infektion zu verhindern, versorgen Sie Mäuse 3 Tage postoperativ mit Gentamicin. Achten Sie nach der Operation auf eine normale Ernährung und ein gutes Wachstumsklima entsprechend dem tatsächlichen Zustand der Mäuse. Bei Auffälligkeiten, wie z.B. Wundinfektionen oder Appetitlosigkeit, wenden Sie sich sofort an den Ausbilder des Versuchstierzentrums.

14. Verabreichung von Medikamenten

HINWEIS: Gemäß der pharmakologischen experimentellen Methodik26 betrug die Umrechnung der verwendeten Dosierungen für Mensch und Tier 9 g Xiaoyao-Pillen für einen 70 kg schweren Erwachsenen, was einer Dosis (Dosierung für eine einmalige Verabreichung) entspricht.

  1. Für die Gruppen mit niedriger und hoher Dosis ist 0,683 g/kg bzw. 2,73 g/kg für eine Gruppe von 8 Tieren zu verwenden. Verwenden Sie die linke Hand, um die Maus ruhig zu stellen, so dass sich der Mund der Maus in einer geraden Linie mit der Speiseröhre befindet. Halten Sie die Sondennadel in der rechten Hand und führen Sie sie vorsichtig entlang der hinteren Wand des Rachens vom Mundwinkel der Maus in die Speiseröhre ein.
  2. Zu diesem Zeitpunkt kann die Richtung der Sondennadel leicht verändert werden, um eine induzierte Schluckwirkung zu stimulieren. Injizieren Sie das Medikament. Führen Sie dies 12 Wochen lang einmal täglich durch.
  3. Für die scheinoperierte Gruppe und die Modellgruppe ist 12 Wochen lang einmal täglich Kochsalzlösung in einer Menge zu verabreichen, die durch das Gewicht des Tieres bestimmt wird.
  4. Euthanasieren Sie Mäuse durch Gebärmutterhalsluxation und schneiden Sie ihre Hintergliedmaßen. Häuten Sie die Gliedmaßen, um den Muskel vom Oberschenkelknochen zu trennen. Behandeln Sie Oberschenkelknochen von Mäusen 1 Monat lang mit EDTA-Entkalkungslösung und ersetzen Sie sie täglich durch frische Lösung.

15. Hämatoxylin-Eosin-Färbung (HE)

  1. Entwachsen Sie das Femurgewebe für 8 Minuten und legen Sie es dann für 3 Minuten in Gradientenethanol; 1 Min. unter fließendem Wasser abspülen.
  2. Geben Sie Hämatoxylin-Färbelösung tropfenweise auf die Abschnitte, um das Gewebe vollständig zu bedecken, färben Sie es 5 Minuten lang und waschen Sie es mit Leitungswasser
  3. Geben Sie die Salzsäure-Differenzierungslösung in das Gewebe auf dem Objektträger und stellen Sie sicher, dass sie das Gewebe vollständig bedeckt. Stoppen Sie, wenn eine Verfärbung des Gewebes beobachtet wird. Mit Leitungswasser abspülen.
  4. Geben Sie die Eosin-Farbstofflösung tropfenweise hinzu und lassen Sie das Gewebe vollständig einwirken, wobei Sie 30 s bis 2 min einwirken. Spülen Sie den überschüssigen Farbstoff mit fließendem Wasser ab.
  5. Führen Sie eine Gradienten-Ethanol-Dehydratisierung mit 75 % wasserfreiem Ethanol für 5 Minuten durch, gefolgt von wasserfreiem Ethanol für 5 Minuten und klären Sie es 3 Minuten lang mit Entparaffinierungslösung.
  6. Tropfen Sie eine angemessene Menge neutralen Kaugummis auf den Objektträger, je nach Größe des Gewebes, und senken Sie das Deckglas vorsichtig ab, um Luftblasen zu vermeiden.

16. Mikro-CT und immunhistochemische Analyse

  1. Entfernen Sie überschüssige Muskeln und Bänder um die Oberschenkelproben von verschiedenen Gruppen von Mäusen und fixieren Sie das Probengewebe für 24 Stunden in 4% Paraformaldehyd.
  2. Trocknen Sie das Knochengewebe an der Luft und führen Sie eine Mikro-CT durch Knochengewebe-Scan durch, um dreidimensionale Mikro-CT-Daten zu erhalten.
  3. Aus den konservierten Mauswachsblöcken diese in 6 μm dicke durchgehende Abschnitte schneiden und die Scheiben bei 70 °C -72 °C 30-60 min backen.
  4. Entwachsung für 8 Minuten, gefolgt von einer 75%igen Behandlung mit wasserfreiem Ethanol für 5 Minuten, wasserfreiem Ethanol für 5 Minuten und PBS-Spülung für 5 Minuten für 3x.
  5. Führen Sie eine EDTA-Hochdruckreparatur für 15 Minuten durch, gefolgt von einer PBS-Wäsche für 5 Minuten für 3x.
  6. Geben Sie 3% Wasserstoffperoxid tropfenweise in das Gewebe, inkubieren Sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur und waschen Sie es 3x lang 5 Minuten lang mit PBS.
  7. Zeichnen Sie mit einem immunhistochemischen Stift einen Kreis. Mit PBS-Wäsche 3 min für 3x waschen.
  8. Färben Sie den Primärantikörper (Anti-ALP Kaninchen-pAb (1:200), Anti-COL-1 Kaninchen-pAb (1:200), Anti-IL-17 Kaninchen-pAb (1:275), Anti-Act1 (1:500), Anti-IL-6 Kaninchen-pAb (1:500)) über Nacht, gefolgt von einer PBS-Pufferspülung für 5 Minuten für 3x.
  9. Den Sekundärantikörper (HRP-konjugiertes Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L; 1:2000)) tropfenweise zugeben und 60 min bei Raumtemperatur inkubieren. Mit PBS-Puffer 3x 3 min lang waschen.
  10. In DAB gebrauchsfertig 3-5 Minuten inkubieren, dann mit PBS spülen.
  11. Führen Sie eine erneute Hämatoxylin-Färbung für 3 Minuten durch, gefolgt von einer PBS-Spülung.
  12. Verwenden Sie die Differenzierungslösung für ca. 10 s, gefolgt von einer PBS-Spülung.
  13. Geben Sie 10 s lang die blaue Rücklauflösung hinzu, gefolgt von einer PBS-Spülung.
  14. Führen Sie eine Behandlung mit 75 % wasserfreiem Ethanol für 5 Minuten, wasserfreiem Ethanol für 5 Minuten und klarem Ethanol für 3 Minuten durch. Verwenden Sie neutrales Harz zum Versiegeln von Objektträgern.

Ergebnisse

Wirkstoffe und Wirkungsziele der Xiaoyao-Pillen
Durch die Suche in der TCMSP-Datenbank und das Screening nach den Kriterien der oralen Bioverfügbarkeit (OB) ≥ 30% und der arzneimittelähnlichen Eigenschaften (DL) ≥ 0,18 wurden 125 Wirkstoffe in Xiaoyao-Pillen gefunden. Die Zutaten 6, 4, 9, 13, 2, 6, 83 und 2 stammten von White Paeonia lactiflora, Atractylodes macrocephala, Menthae herba, Chaihu, Angelica sinensis, Poria cocos, Süßholz und Ingwer. Einige der Wirkstoffe sind in Tabelle 1 aufgeführt. Darüber hinaus wurden insgesamt 879 Ziele mit wirksamen Wirkstoffen aus der TCMSP-Datenbank gewonnen, und 232 Ziele blieben nach ID-Konvertierung und Löschung doppelter Werte übrig.

Netzwerkanalyse der TCM - Wirkstoff - Schnittpunkt - Krankheit
Mehrere Datenbanken wurden unter dem Stichwort Osteoporose nach Genen durchsucht, die mit der Krankheit in Verbindung stehen. In der GeneCards-Datenbank wurden 1692 Gene nach dem Relevanz-Score ≥1 gefiltert. Insgesamt wurden 35 Gene in der OMIM-Datenbank erfasst. Es gab 3, 33 bzw. 386 Gene in den Datenbanken PharmGkb, TTD und DrugBank. Anschließend wurde die Schnittmenge der Ergebnisse dieser fünf Datenbanken für die weitere Analyse verwendet (Abbildung 1A). Eines der Gene, das in vier Datenbanken vertreten war, war CALCR. Insgesamt wurden 102 sich überschneidende Gene erhalten, nachdem die krankheitsbezogenen Gene kombiniert und die Schnittmenge mit dem Wirkstoffziel genommen wurden (Abbildung 1B). Basierend auf den Wechselwirkungen zwischen den Krankheitszielen und den Wirkstoffen des Medikaments wurde mit der Cytoscape-Software ein TCM-Wirkstoff-überschneidendes Ziel-Krankheitsnetzwerk konstruiert. Als Ergebnis wurden Beziehungen zwischen den Komponenten des Medikaments und der polymorphen Regulation von krankheitsbezogenen Genscans erhalten (Abbildung 2A).

In der String-Datenbank wurden Proteininteraktionen an der Schnittstelle von Krankheitsgenen und Wirkstoffzielen analysiert, um ihre Interaktionsnetzwerkdiagramme zu erhalten (Abbildung 2B), und diese wurden dann auf die zentralsten Proteine gescreent (Abbildung 2C-D). Die Ergebnisse zeigten die stärksten Wechselwirkungen zwischen FOS, ESR1, MAPK3, TP53, MAPK1 und STAT3 unter den Krankheitsgenen und Wirkstoffzielen (Abbildung 2E).

GO-Funktion und Analyse der KEGG-Signalanreicherung
Die GO-Anreicherungsanalyse ergab insgesamt 2177 Einträge, darunter 1990 Einträge zu biologischen Prozessen (BP), 58 Einträgen zu Zellkomponenten (CC) und 129 Einträgen zu molekularen Funktionen (MF). Bei BP konzentrierten sich die Gene hauptsächlich auf die Reaktion auf den Nährstoffgehalt, die Reaktion auf oxidativen Stress und die zelluläre Reaktion auf oxidativen Stress. MF konzentrierte sich auf die Bindung von DNA-bindenden Transkriptionsfaktoren, die RNA-Polymerase II-spezifische DNA-bindende Transkriptionsfaktor-Bindung, die Kernrezeptoraktivität, die ligandenaktivierte Transkriptionsfaktoraktivität und die Zytokinaktivität (Abbildung 3A-B).

In der Analyse der Anreicherung des KEGG-Signalwegs wurden insgesamt 168 verwandte Signalwege erhalten, wobei die signifikantesten der AGE-RAGE-Signalweg, der IL-17-Signalweg, der TNF-Signalweg, der HIF-1-Signalweg und die Th17-Zelldifferenzierung waren (Abbildung 3C-D). Es wird vermutet, dass Xiaoyao-Pillen auf verschiedene Weise therapeutische Wirkungen auf PMOM ausüben können. Entzündungen sind stark mit Osteoporose assoziiert und können durch die Menopause beschleunigt werden, und IL-17 ist ein wichtiger Entzündungsfaktor7. Daher ist der nächste Plan zu untersuchen, ob Xiaoyao-Pillen Osteoporose aus einer entzündlichen Perspektive in Bezug auf IL-17 behandeln könnten.

Strukturelle Veränderungen im Knochengewebe vor und nach der Entnahme von Eierstockgewebe
Die HE-Färbung zeigte, dass in den Femuren von Shammäusen die Trabekel eng angeordnet waren, mit guter Kontinuität, kleinen Lücken zwischen den Trabekeln, seltenen Frakturen und normaler Größe der Knochenmarkhöhle. Im Vergleich zur Sham-Gruppe waren die Femure der OVX-Gruppe spärlich angeordnet, mit schweren Frakturen der Trabekel, gestörter Kontinuität und einer deutlich vergrößerten Knochenmarkhöhle, die typische osteoporotische Veränderungen aufwies (Abbildung 4A).

Mikro-CT-Vergleich zwischen den Gruppen
Die Femure von Mäusen in der OVX-Gruppe zeigten ein unvollständiges Trabekelwerk, eine teilweise leere Knochenmarkhöhle und eine Ausdünnung der Knochenrinde im Vergleich zu denen von Mäusen in der Sham-Gruppe. Die Sham-Gruppe von Mäusen zeigte eine Fülle von Trabekeln, eine gute Kontinuität und eine Verengung der Knochenmarkhöhle in ihren Femuren (Abbildung 4B).

Verhaltenseffekte von Xiaoyao-Pillen auf Mäuse
Während des Studienzeitraums hatten mit Ausnahme der OVX-Gruppe alle Mäuse in den anderen Gruppen bessere Lebensgewohnheiten, eine normale Haarfarbe, eine hohe Mobilität und eine gute Gesundheit. Der Urin und der Kot jeder Maus normalisierten sich innerhalb von 1 Woche nach der Behandlung mit Xiaoyao-Pillen wieder. Es gab keine Bisse, Wundinfektionen, Magen-Darm-Obstruktion, Nahtablösung, Hautnekrose des Schnitts oder Tod einer der Mäuse. Die Mäuse in der OVX-Gruppe waren anfällig für Haarausfall, Verdunkelung der Haarfarbe, eingeschränkte Mobilität, längere Reflexe, erhöhte Ausscheidung und vermindertes Fressen und Trinken.

HE-Färbung pathologischer Schnitte von Mäusen nach medikamentöser Intervention
In der Sham-Gruppe war das Oberschenkelgewebe dicht, retikulär und regelmäßig angeordnet. Die Größe und Kontinuität der Knochenmarkhöhle war normal und der Abstand zwischen den angrenzenden Knochentrabekeln war relativ klein. Im Vergleich zur Sham-Gruppe zeigten die Femurrinde und der spongiöse Knochen in der OVX-Gruppe offensichtliche Defekte, verminderte Trabekel, vergrößerte Lücken, unterbrochene Kontinuität, Ausdünnung der Struktur, Erweiterung der Markhöhle und Ausdünnung der Knochenrinde. Im Vergleich zur OVX-Gruppe schienen die Femurtrabekel der Mäuse in den medikamentös behandelten Gruppen (niedrige und hohe Dosen) strukturell intakt zu sein, mit reduzierten Abständen, erhöhter Konnektivität, verengten Knochenmarkhöhlen und dichteren Strukturen (Abbildung 5A).

Detektion von Bildgebungsindizes bei Mäusen nach medikamentöser Intervention
Im Vergleich zur Sham-Gruppe wiesen die Femure der Mäuse in der OVX-Gruppe spärliche und gebrochene Knochentrabekel und eine ausgedünnte Knochenrinde auf. Im Vergleich zur OVX-Gruppe wiesen die Mäuse in der Gruppe der hochdosierten Xiaoyao-Pillen weniger frakturierte Knochentrabekel, eine wiederhergestellte Retikulation und ein signifikantes Maß an teilweiser Verkleinerung der Knochenmarkhöhle auf. Die Mäuse, die mit niedrig dosierten Xiaoyao-Pillen behandelt wurden, hatten jedoch immer noch frakturierte Knochentrabekel, obwohl es zu einer Zunahme der Knochentrabekel und einer Verkleinerung der Knochenmarkhöhle kam. Die trabekuläre Struktur der Knochentrabekel der scheinoperierten Gruppe zeigte mehr Kontinuität und Vollständigkeit (Abbildung 5B).

Immunhistochemische Ergebnisse von Geweben in den Gruppen nach medikamentöser Intervention
Act1 und IL-6 sind Schlüsselproteine im IL-17-Signalweg, und ALP und COL-1 sind osteogene Gene. Die Expression von ALP-, COL-1-, IL-6-, IL-17- und Act1-Proteinen führt zur Bildung von hellbraunen oder gelben Granulaten auf dem Knochengewebe. Die immunhistochemischen Ergebnisse zeigten, dass die mittleren optischen Dichtewerte von ALP und COL-1 in der Wirkstoffgruppe höher waren als die in der OVX-Gruppe nach Behandlung mit Xiaoyao-Pillen, und der Unterschied war statistisch signifikant (p < 0,05). Die mittleren optischen Dichtewerte von IL-17, Act1 und IL-6 in der Wirkstoffgruppe waren niedriger als die in der OVX-Gruppe, und der Unterschied war statistisch signifikant (p < 0,05; Abbildung 6). Xiaoyao-Pillen kehrten den durch die Ovariektomie verursachten Rückgang von ALP und COL-1 um, während sie die Expression mehrerer Schlüsselproteine IL-17, IL-6 und Act1 im IL-17-Signalweg verringerten, was darauf hindeutet, dass das Medikament seine therapeutische Wirkung über diesen Signalweg ausüben kann.

figure-results-1
Abbildung 1: Netzwerkanalyse der Schnittstelle von Wirkstoffen der chinesischen Kräutermedizin und krankheitsbezogenen Genen. (A) Die Überschneidung von krankheitsbezogenen Genen, die aus den Datenbanken GeneCards, OMIM, PharmGkb, TTD und DrugBank stammen. Diese werden durch blaue, rote, grüne, gelbe und braune Farben mit den Genen 1692, 35, 3, 33 bzw. 386 dargestellt. Die Schnittmenge besteht aus den krankheitsassoziierten Genen in den fünf Datenbanken, und der überlappende Teil gibt die Anzahl der sich überschneidenden Gene in jeder Datenbank an. (B) Die Überschneidung der Wirkstoffziele (wobei die blaue Farbe diesen Datensatz kennzeichnet, d. h. die Menge der medikamentenwirkenden Zielgene, die in der TCMSP-Datenbank nach der ID-Transformation und der Entfernung von Duplikaten gesammelt wurden) und krankheitsbezogene Gene (wobei die rote Farbe diesen Datensatz anzeigt, der alle Gene aus den fünf oben genannten Datenbanken enthält) wird angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Interaktion von Wirkstoffen der TCM mit krankheitsbezogenen genregulatorischen Netzwerken und Kernproteinen. (A) Das regulatorische Netzwerk von Wirkstoffen und krankheitsbezogenen Genen in der TCM zeigt die genregulatorischen Beziehungen, die jedem Wirkstoff in den Xiaoyao-Pillen entsprechen, wobei jeder Inhaltsstoff mit dem Gen verknüpft ist, das er reguliert. (B) Die Ergebnisse der Protein-Protein-Interaktionsanalyse von sich überschneidenden Genen in STRING (die Netzwerkknoten repräsentieren Proteine, Kanten repräsentieren Protein-Protein-Assoziationen und multiple Verknüpfungen weisen auf multiple Wechselwirkungen zwischen zwei Proteinen hin). (C-E) Die mit String erhaltenen Proteininteraktionen wurden mehrfach gescreent. (C) Das Proteininteraktionsnetzwerk wurde nach dem ersten Screening erhalten, und der hervorgehobene Teil ist sein Kernteil. (D) Das Ergebnis des zweiten Screenings und der hervorgehobene Teil ist der Kernteil. (E) Das zentralste Protein-Interaktionsnetzwerk im Protein-Interaktionsnetzwerk. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: GO- und KEGG-Anreicherungsanalyse. (A-B) Die Ergebnisse der GO-Anreicherungsanalyse sich überschneidender Gene sind in 3 Einträge unterteilt: Biologischer Prozess (BP), Zelluläre Komponente (CC) und Molekulare Funktion (MF), und jeder Eintrag zeigt nur die Top 10 der am stärksten angereicherten Gene. (C-D) Die Ergebnisse der KEGG-Anreicherungsanalyse der sich überschneidenden Gene (zeigen die Top 30 der am stärksten angereicherten Gene). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Etablierung und Evaluierung des ovariektomierten Mausmodells. (A) Vergleich der metaphysären Knochenmorphologie zwischen der scheinoperierten und der ovariektomierten Gruppe (10x). In der OVX-Gruppe waren die Trabekelfrakturen schwerwiegend, die Kontinuität war gestört und die Knochenmarkhöhle war signifikant vergrößert, während in der Scheingruppe die Trabekelfrakturen selten waren und die Knochenmarkhöhle normal groß war. (B) Mikro-CT-Scans des Femurs in der scheinoperierten und der ovariektomierten Gruppe. In der OVX-Gruppe war das Trabekelwerk unvollständig und die Knochenmarkhöhle teilweise leer. In der Sham-Gruppe waren die Trabekel reichlich vorhanden und kontinuierlich, und die Knochenmarkhöhle war eng. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: HE- und Mikro-CT-Assay nach Behandlung mit den Xiaoyao-Pillen. (A) HE-Färbung (10x) von Femurschnitten von Mäusen in jeder Gruppe nach der Behandlung mit Xiaoyao-Pillen. In der OVX-Gruppe waren die Knochentrabekel verkleinert, die Kontinuität unterbrochen, die Struktur spärlich und die Knochenmarkhöhle vergrößert. In der Sham-Gruppe wiesen die Knochentrabekel eine gute Kontinuität auf, das Oberschenkelgewebe war strukturell dicht und die Knochenmarkhöhle war normal. Im Vergleich zur OVX-Gruppe erschienen die Knochentrabekel in der Wirkstoffgruppe strukturell intakt, mit erhöhter Konnektivität, einer reduzierten Knochenmarkhöhle und einer dichteren Struktur als in der Modellgruppe. (B) Vergleich der Mikro-CT von Oberschenkelknochen von Mäusen in jeder Gruppe nach Behandlung mit Xiaoyao-Pillen. Die Knochentrabekel in den Femuren der Mäuse der ovariektomierten Gruppe waren spärlich und gebrochen, während die Sham-Gruppe kontinuierlichere und intaktere Trabekel aufwies. Im Vergleich zur ovariektomierten Gruppe hatten Mäuse in der hochdosierten medikamentös behandelten Gruppe weniger gebrochene Knochentrabekel, eine wiederhergestellte retikuläre Struktur und eine teilweise reduzierte Knochenmarkhöhle, während die Tiere in der niedrig dosierten Wirkstoffgruppe mehr Knochentrabekel und eine reduzierte Knochenmarkhöhle aufwiesen, aber die gebrochenen Knochentrabekel blieben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 6: Immunhistochemie zum Nachweis der Wirkung von Xiaoyao-Pillen auf den IL-17-Signalweg und die Expression osteogener Markergenproteine in osteoporotischen Mäusen (40x). Positive Reaktionen auf das Vorhandensein von ALP-, COL-1-, IL-6- sowie IL-17- und Act1-Proteinen äußerten sich durch das Auftreten von hellbraunen oder gelben Granulaten auf dem Knochengewebe. Die Expression von ALP und COL-1 in der Wirkstoffgruppe war höher als in der OVX-Gruppe (p < 0,05). Die Expression von IL-17, Act1 und IL-6 in der Wirkstoffgruppe war niedriger als in der OVX-Gruppe (p < 0,05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Name der Traditionellen Chinesischen MedizinMolekulare IDName des Moleküls
Weiße Paeonia lactifloraMOL001918Paeoniflorgenon
Weiße Paeonia lactifloraMOL000211Mairin
Atractylodes macrocephalaMOL00002214-Acetyl-12-senecioyl-2E,8Z,10E-atractylentriol
Atractylodes macrocephalaMOL0000493β-Acetoxyatractylon
Menthae HerbaMOL000471Aloe-Emodin
Menthae HerbaMOL005190Eriodictyol
Chai HuMOL000354Isorhamnetin
Chai HuMOL013187Würfel
Angelica sinensisMOL000449Stigmasterol
Angelica sinensisMOL000358Beta-Sitosterol
Poria KokosnüsseMOL000282ergosta-7,22E-dien-3beta-ol
Poria KokosnüsseMOL000283Ergosterolperoxid
LakritzeMOL002311Glycyrol
LakritzeMOL0049907,2',4'-trihydroxy - 5-methoxy-3-arylcoumarin
Frischer IngwerMOL0061296-Methylgingdiacetat2
Frischer IngwerMOL001771poriferast-5-de-3beta-ol

Tabelle 1: Wirkstoffe in ausgewählten chinesischen Arzneimitteln. Die erste Spalte listet die Namen der traditionellen chinesischen Medizin auf, die zweite Spalte ist die ID des Wirkstoffs der chinesischen Medizin und die dritte Spalte ist der Name des Wirkstoffs der chinesischen Medizin.

Ergänzende Codierungsdatei 1: Fusionscode für den Kräuternamen, die Zutat und die Ziel-ID. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Codierungsdatei 2: Umwandlung der Wirkstoffziel-ID. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Codierungsdatei 3: Dateien für die Netzwerkanalyse. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Kodierungsdatei 4: Umwandlung von Symbol-zu-Gen-ID. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Codierungsdatei 5: GO-Anreicherungsanalyse. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Kodierungsdatei 6: KEGG-Anreicherungsanalyse. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Laut Statistik verursacht Osteoporose in den Vereinigten Staaten jedes Jahr 1,5 Millionen Frakturen, und die überwiegende Mehrheit davon tritt bei postmenopausalen Frauen auf27. Mit der Zunahme der alternden Bevölkerung wird prognostiziert, dass die Mehrheit der zukünftigen Hüftfrakturen weltweit in Asien auftreten wird und dass bis 2050 die Gesamtzahl dieser Frakturen weltweit 8,2 Millionen erreichen wird28. Die Kosten für die Vorbeugung von Frakturen sind fast gleich hoch wie die für deren Behandlung, und der Einsatz von Medikamenten wird unweigerlich einige Nebenwirkungen haben29. Daher besteht ein dringender Bedarf an einem kostengünstigeren Weg, um dieses Problem in einer verantwortungsvollen Gesellschaft anzugehen.

Xiaoyao-Pillen bestehen aus acht Inhaltsstoffen. Studien über die Auswirkungen seiner Inhaltsstoffe auf Osteoporose sind im Gange. Poria cocos hemmt die Osteoklastogenese und osteolytische Aktivität in einem ovariektomierten Osteoporose-induzierten Mausmodell30. Die Kombination von zwei Komponenten, Süßholz und Shu-di-huang, kann eine antioxidative Wirkung ausüben, indem sie den NF-κB-Signalweghemmt 31. Das traditionelle chinesische Kräutertonikum, Danggui buxue tang, kann bei der Behandlung von Osteoporose nützlich sein, da es den Knochenumsatz hemmt und die Regulation der Hypothalamus-Hypophysen-Gonaden-Achse (HPG) moduliert und dadurch den Knochenverlust bei ovariektomierten Ratten verhindert32. All diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Xiaoyao-Pillen eine therapeutische Wirkung auf Osteoporose haben können. Die Ergebnisse dieser Studie deuten auch darauf hin, dass Xiaoyao-Pillen eine Anti-Osteoporose-Wirkung ausüben können, indem sie die Aktivität des IL-17-Signalwegs auf entzündungshemmende Weise modulieren.

Insgesamt wurden 168 relevante Signalwege aus dem regulatorischen Netzwerk von Wirkstoffzielen und Osteoporose-verwandten Genen gewonnen, die in dieser Studie konstruiert wurden, und diese Studie untersuchte den IL-17-Signalweg weiter. Die IL-17-Familie besteht aus sechs Mitgliedern, darunter IL-17A-F, von denen IL-17A das erste und wichtigste war, das entdeckt wurde33. In frühen Studien ging man davon aus, dass IL-17 mit Entzündungs- und Autoimmunerkrankungen beim Menschen in Verbindung gebracht wird. Spätere Studien deuteten darauf hin, dass es eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der Barriereintegrität spielte, und es wurde auch festgestellt, dass es mit Krebs in Verbindung gebracht wurde15. Obwohl es keine physiologische Rolle beim Knochenumbau spielt, verhält es sich bei abnormalen Knochenbedingungen anders. Darüber hinaus kann IL-17 als schwacher Aktivator wirken und mit anderen Zytokinen synergistisch wirken, um die Energieabgabe zu erhöhen. Dies wird durch seine Koaktivierung mit TNFα15,34 gezeigt.

Invitro-Experimenten haben gezeigt, dass IL-17 die Proliferation und Differenzierung osteoblastischer MSCsinduzieren kann 35 und dass es auch die BMP-2-induzierte Differenzierung primärer Rattenosteoblasten hemmen kann36. IL-17 kann Osteoblasten dazu anregen, RANKL zu exprimieren, was wiederum die Osteoklastogenese fördert, aber dieser Effekt scheint von der Anwesenheit von Osteoblasten abhängig zu sein37,38. In dieser Studie zeigten die unterschiedlichen Konzentrationen der Xiaoyao-Pillen therapeutische Effekte auf PMOM-Modellmäuse, insbesondere wenn sie in höheren Konzentrationen verwendet wurden. IL-17, Act1 und IL-6, die mit dem IL-17-Signalweg korrelieren, waren bei diesen Mäusen im Vergleich zu den Kontrollen signifikant verringert. Als die Ergebnisse der Anreicherungsanalyse ausgewertet wurden, deuteten diese auf eine Beteiligung des IL-17-Signalwegs hin, wenn die Tiere mit Xiaoyao-Pillen behandelt wurden.

In dieser Studie wurden auch einige der Knochenumwandlungsmarker getestet. ALP ist ein tetrameres membrangebundenes Enzym, das von Osteoblasten sezerniert werden kann und eine wichtige Rolle bei der knochenähnlichen Bildung und Mineralisierung spielt, indem es den Mineralisationshemmer Pyrophosphat39 abbaut. Etwa 90 % der organischen Fraktion in der extrazellulären Matrix des Knochengewebes besteht aus COL-1, und während der Knochenmineralisierung spielt Kollagen eine Schlüsselrolle in diesem Prozess40. Im Ergebnis dieser Studie waren die Expressionsniveaus der ALP- und COL-1-Proteine, wie sie von der Immunhistochemie von Mäusen in der Wirkstoffgruppe beobachtet wurden, höher als die in der Modellgruppe, was darauf hindeutet, dass die Wirkung von Xiaoyao-Pillen bei der Linderung von Osteoporose durch Erhöhung der Indikatoren der osteogenen Gene erreicht werden könnte. Einige Wissenschaftler haben gezeigt, dass die Expression und transkriptionelle Aktivität des Hepatozyten-Östrogenrezeptors (ERα) durch Xiaoyao san41 hochreguliert werden kann. Es wurde gezeigt, dass die Extrakte von Angelica sinensis, White Paeonia lactiflora und Süßholz im Xiaoyao san eine östrogenähnliche Aktivität aufweisen. Die gleichen Inhaltsstoffe sind auch in den in dieser Studie verwendeten Xiaoyao-Pillen enthalten, die nach der Verschreibung von Xiaoyao san nach modernen Zubereitungsmethoden hergestellt werden. Daher kann die Hypothese aufgestellt werden, dass Xiaoyao-Pillen auch die Expression von osteogenen Genen wie ALP und COL-1 erhöhen können, indem sie östrogenähnliche Wirkungen auf Osteoblasten ausüben, um ihre Aktivität zu erhöhen und die Knochenqualität zu verbessern.

In dieser Studie wurde erfolgreich ein Modell der PMOM bei Mäusen etabliert, indem beide Eierstöcke durch dorsale Ovariektomie entfernt wurden. Das Tiermodell ist die Grundlage für alle nachfolgenden Versuche in dieser Studie. Bei der chirurgischen Entfernung der Eierstöcke der Mäuse war es wichtig sicherzustellen, dass die Eierstöcke der Mäuse in der OVX- und Medikamentengruppe vollständig entfernt wurden, während in der Scheingruppe nur das Fett in der Nähe der Eierstöcke entfernt wurde, und es war auch wichtig, Wundinfektionen zu vermeiden.

Die Anzahl der Knochentrabekel und die Verbindungsdichte von Mäusen wurden nach der Behandlung von Eierstöcken, die mit Xiaoyao-Pillen behandelt wurden, verbessert, was darauf hindeutet, dass dieses Medikament eine therapeutische Wirkung auf Osteoporose hat. Immunhistochemie und Immunzytochemie wurden verwendet, um die Wirksamkeit der Behandlung in dieser Studie zu bewerten; Die Einwirkzeit verschiedener Reagenzien ist nicht absolut, insbesondere im Prozess der Farbentwicklung, der eine Echtzeitbeobachtung und eine rechtzeitige Reaktion erfordert, um die besten Ergebnisse zu erzielen. Während der Antikörperinkubation wird zunächst der Antikörperkonzentrationsgradient eingestellt und nach Beobachtung und Vergleich die am besten geeignete Konzentration für die nachfolgenden Experimente ausgewählt.

In dieser Studie gab es jedoch einige Einschränkungen. Die Web-Pharmakologie-Daten hatten nur eine einzige Datenquelle, und die Analyse in Bezug auf die Wirkstoffzusammensetzung stammte nur aus einer Datenbank. Darüber hinaus wurde die Wirksamkeit von Xiaoyao-Pillen in dieser Studie nicht mit positiven Medikamenten verglichen, und es war nicht möglich, die spezifischen Unterschiede zwischen Xiaoyao-Pillen und aktuellen Behandlungsmodalitäten zu beurteilen.

Bei PMOM sind Bisphosphonate die verfügbare Erstlinienbehandlungsoption. Die Einnahme dieser Medikamente kann jedoch zu gastrointestinalen Kontraindikationen und noch schwerwiegenderen atypischen Femurfrakturen und Osteonekrosen des Kiefers führen42,43. Zu den Zweitlinien-Behandlungsoptionen gehören der Einsatz von Denosumab und die Hormontherapie. Es wurde gezeigt, dass Denosumab Hüft-, Wirbel- und nicht-vertebrale Frakturen reduziert. Ein Rebound kann jedoch auftreten, sobald das Medikament abgesetzt wird, und je länger die Dauer des Absetzens ist, desto größer ist der Verlust der Knochendichte 42,44,45. Die Hormontherapie in den Wechseljahren verringert das Risiko von osteoporotischen Frakturen der Wirbelsäule, aber ihre Auswirkungen sind altersbegrenzt, und ihre langfristigen Risiken scheinen die Vorteile zu überwiegen46. Die sequentielle Therapie ist eine langfristige Behandlungsoption für PMOM, bei der der Einsatz von knochenbildenden Medikamenten, gefolgt von antiresorptiven Medikamenten, die größte Zunahme der Knochenmasse erzielen kann. Spezifische Medikationen werden in der Regel von Patient zu Patient festgelegt42.

Insofern kann davon ausgegangen werden, dass traditionelle chinesische Kräuter ein vorteilhaftes Potenzial bei der Behandlung von Osteoporose haben können. Die Wirkungsweise der pflanzlichen Medizin ist multipathway und multi-target, anstatt über einen einzigen Mechanismus zu wirken47. Einige Wissenschaftler haben die Wirksamkeit und Sicherheit einiger chinesischer pflanzlicher Arzneimittel untersucht und gezeigt, dass die Anzahl der Frakturen bei der Verwendung einer Kombination aus chinesischen und westlichen Arzneimitteln im Vergleich zur ausschließlichen Verabreichung chinesischer Medizin geringer war als bei der alleinigen Verabreichung chinesischer MedizinGruppe 48. Im Vergleich zu chemischen Arzneimitteln haben chinesische pflanzliche Heilmittel weniger Nebenwirkungen, sind relativ kostengünstig und eignen sich für den Langzeitgebrauch. Chinesische pflanzliche Heilmittel können nicht nur die Knochenmikrostruktur reparieren und das Knochenvolumen erhöhen, sondern sie können auch die Symptome der Schwäche der Lendenwirbelsäule und der Rückenschmerzen reduzieren oder beseitigen49. Die aktuelle Studie könnte dazu beitragen, einen möglichen Ansatz zur Aufdeckung neuartiger Medikamente und Behandlungen zu finden.

Die Anwendung von Xiaoyao-Pillen zur Behandlung von PMOM scheint vielversprechend zu sein. In der vorliegenden Studie können die Pillen die Knochenmasse und die Knochenqualität in einem Mausmodell der PMOM verbessern, indem sie Entzündungen unterdrücken. Einige Wissenschaftler haben sogar vorgeschlagen, dass eine Kombination aus chinesischer Medizin und Akupunktur bei der Behandlung von PMOM50 wirksam sein kann. Gleichzeitig hat sich eine Kombination aus chinesischer und westlicher Medizin als wirksam erwiesen51. Beide möglichen Heilmittel sind gültig, obwohl jede empfohlene Behandlung mit den Xiaoyao-Pillen in Verbindung mit Akupunktur und westlicher Medizin durch klinische Studien validiert werden sollte. Die klinische Bedeutung der Osteoporose liegt bei Knochenbrüchen, und die zukünftige Forschung sollte sich auch auf deren Prävention konzentrieren.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie durch Netzwerkpharmakologie und Tierversuche zeigte, dass PMOM-Mäuse nach der Behandlung mit Xiaoyao-Pillen eine signifikante Verbesserung des Knochenstoffwechsels und eine erhöhte Knochenmasse zeigten. Der Wirkmechanismus für dieses Phänomen könnte mit der Hemmung des IL-17-Signalwegs und der Erhöhung der osteogenen Faktoren, der ALP- und COL-1-Aktivität zusammenhängen. Diese Studie legt eine theoretische Grundlage und experimentelle Grundlage für die klinische Anwendung von Xiaoyao-Pillen bei der Behandlung von Osteoporose-assoziierten Erkrankungen.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Danksagungen

Das Baise City Scientific Research and Technology Development Program (20224128) unterstützte diese Arbeit. Die Autoren danken Dr. Dev Sooranna vom Imperial College London und YMUN für die Bearbeitung des Manuskripts. YYX und ZYW trugen zu gleichen Teilen zu dieser Studie bei.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1ml ProbenehmerGuangxi Beilunhe Medical Industrial Group Co.JYQ001Für die Anästhesie bei Mäusen
4% PolyformaldehydBeijing Solarbio Science & Verifizierter Lieferant - Technology Co., Ltd.P1110Für die Gewebefixierung
6-0 resorbierbares Nahtmaterial (abgewinkelte Nadel)Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co.HZX-06Für postoperatives Nähen
Saugfähiger WattebauschWinnerMIANQIU-500gFür Sterilisation und Blutstillung
Selbstklebende ObjektträgerJiangsu Shitai Experimental Equipment Co.188105Für Gewebeschnitte
AmobarbitalSigma Aldrich (Shanghai) Trading Co.A-020-1MLFür die Anästhesie bei Mäusen
BläuelösungBeijing Solarbio Science & Germany Verifizierter Lieferant - Technology Co., Ltd.G1866Blaue Färbung der Zellkerne nach der Wirkung von Hämatoxylin-Differenzierungslösung
C57BL/6 MäuseBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.(SCXK 2033-0063)Zur Verwendung in Tierversuchen
Chirurgische Klingen aus KohlenstoffstahlPremier Medical Equipment Co.SP239Für die Mauschirurgie
CIKS/TRAF3IP2 Kaninchen pAbBIOSS ANTIKÖRPERbs-6202RBindet an Act1 in
Geweben Cole's Hämatoxylin-Lösung (für konventionelle Färbung)Beijing Solarbio Science & Verifizierter Lieferant - Technology Co., Ltd.G1140Zum Färben von Paraffinschnitten
Kollagen Typ I Polyklonaler Antikörperproteintech14695-1-APBindet an COL-1 in Geweben
DAB Substrat Kit, 20xBeijing Solarbio Science & Verifizierter Lieferant - Technology Co., Ltd.DA1010Für die Entwicklung der Gewebefarbe
Einweg-OP-Blatt 50 * 60CMNanchang Xuhui Medical Equipment Co.SP4529777Für die Mauschirurgie
EDTA-Entkalkungslösung (pH 7,2)Beijing Solarbio Science & Verifizierter Lieferant - Technology Co., Ltd.E1171-500mlZur Entkalkung des Gewebes
Enhanced Endogenous Peroxidase Bloching BufferBeyotime BiotechnologyP0100BSequestrierung von Gewebe- oder zellulären endogenen Peroxidasen
Umweltfreundliche EntparaffinierungsflüssigkeitServicebioG1128-1LZur Entparaffinierung
EthylalkoholCHRON CHEMICALS64-17-5 (CAS)Zur Deparaffinierung Paraffinabschnitte
Allzweck-AntikörperverdünnungsmittelEpizyme BiotechPS119LZur Antikörperverdünnung
Hämatoxylin-DifferenzierungslösungServicebioG1039-500MLZur Differenzierung nach Hämatoxylin-Färbung und Entfernung von übermäßig gebundenen und unspezifisch adsorbierten Farbstoffen aus Geweben
Hämatoxylin-Eosin (HE)-FärbekitBeijing Solarbio Science & Verifizierter Lieferant - Technology Co., Ltd.G1120-3 * 100mlFür die Gewebefärbung
Hochwertiger chirurgischer Messergriff aus EdelstahlPremier Medical Equipment Co.SP0088die Mauschirurgie
HRP-konjugiertes Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)proteintechSA00001-2bindet an primären Antikörper und amplifiziert das Signalsignal
IL-17A Polyklonaler Antikörperproteintech13082-1-APbindet an IL-17 in Geweben
IL-6 Polyklonaler Antikörperproteintech21865-1-APan IL-6 in Geweben
Immunhistochemie PenPeking Zhongshan Jinqiao Biotechnologie Co.ZLI-9305 (YA0310)Zum Zeichnen von Kreisen in der Immunhistochemie
Medizinisches chirurgisches Nahtmaterial Nicht absorbierend (Kugel) 5-0 3,5 mYangzhou Yuanlikang Medical Equipment Co.FHX-5-2Für postoperatives Nähen
Medizinische Nahtnadeln Winkelnadeln 4 * 10 3/8Chaohu Binxiong Medical Equipment Co.FHZ612-4Für die postoperative Naht
Neutral BalsamBeijing Solarbio Science & Verifizierter Lieferant - Technology Co., Ltd.G8590Als Scheibenversiegelungsmittel
PBS (1X)Shenzhen Mohong Technology Co., LtdB0015Puffer zum Waschen von Objektträgern und zur teilweisen Lösungsverdünnung
Proteinfreier Schnellblockierungspuffer (1X)Epizyme BiotechPS108PVermeidung unspezifischer Bindungen von
Proteinen Kaninchen Anti-Knochen Alkalische Phosphatase AntikörperBIOSS ANTIKÖRPERbs-6292RBindet an alkalische Phosphatase im Gewebe
SalineAffiliated Hospital Youjiang Medical University Für NationalitätenLHN500Für Tiere durch Sonde
Rasieren / Elektrische SchermaschinenHANGZHOU HUAYUAN PET PRODUCTS CO., LTD.DTJ-002Zum Rasieren von Mäusen
Edelstahl Medizinischer Nadelhalter 14cm GrobnadelPremier Medical Equipment Co.SP784Für die Mauschirurgie
Edelstahl-Augenzange 10,5 cm gebogen (ohne Haken)ZhuoyouyueYKNWW-10.5Für die Mauschirurgie
Edelstahl-Augenschere / chirurgische Schere 10 cm gerade SpitzePremier Medical Equipment Co.ZYJD-10-ZJFür die Mauschirurgie
Edelstahlspitze Magennadel 12 Gauge 55mm EllbogenGWJ-12-55WZur Verwendung bei Mäusen durch Sonde
Tris-EDTA Antigen Repair Fluid (50x)proteintechPR30002Für die Antigenreparatur von Paraffinabschnitten
Hölzernes Präparierbrett 25 * 16cmJP16 * 24Für die Mauschirurgie
Xiaoyao PillenJiuzhitang Co., Ltd.YPG-041Für die Verabreichung von Tierarzneimitteln
Others
R 4.3.1Datenverarbeitung
Cytoscape3.9.1Nationale Ressource für NetzwerkbiologieAufbau eines regulatorischen Netzwerks für traditionelle chinesische Medizin
ImageJ 1.54fNational Institutes of HealthBildverarbeitung für Ergebnisse der Immunhistochemie
Adobe Photoshop 24.0.0AdobeFür die Bildkombination
GraphpadPrism 9.5GraphPad SoftwareStatistische Analyse von Datenzellen
DimensionOLYMPUSZum Schneiden und Fotografieren
OLYMPUS BX53OLYMPUSFür HE-Färbung und immunhistochemische Schnittfotografie
Für bindet

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