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Laserzellablation in intakten Drosophila-Larven zeigt synaptische Konkurrenz

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DOI:

10.3791/67053

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26. Juli 2024

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1Stiles-Nicholson Brain Institute, Florida Atlantic University, 2Department of Biological Sciences, Florida Atlantic University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll demonstriert die Laserzellablation einzelner Neuronen in intakten Drosophila-Larven . Die Methode ermöglicht es, die Wirkung der Verringerung der Konkurrenz zwischen Neuronen im sich entwickelnden Nervensystem zu untersuchen.

Zusammenfassung

Das Protokoll beschreibt die Ablation einzelner Neuronen mit einem 2-Photonen-Lasersystem im Zentralnervensystem (ZNS) von intakten Larven von Drosophila melanogaster . Mit dieser nicht-invasiven Methode kann das sich entwickelnde Nervensystem zellspezifisch manipuliert werden. Die Störung der Entwicklung einzelner Neuronen in einem Netzwerk kann genutzt werden, um zu untersuchen, wie das Nervensystem den Verlust des synaptischen Inputs kompensieren kann. Einzelne Neuronen wurden im Riesenfasersystem von Drosophila spezifisch abgetragen, wobei der Schwerpunkt auf zwei Neuronen lag: der präsynaptischen Riesenfaser (GF) und dem postsynaptischen tergotrochanteralen Motoneuron (TTMn). Das GF synapsiert mit dem ipsilateralen TTMn, das für die Fluchtreaktion entscheidend ist. Die Ablation eines der GFs im 3. Instar-Gehirn, kurz nachdem das GF mit dem axonalen Wachstum begonnen hat, entfernt die Zelle dauerhaft während der Entwicklung des ZNS. Das verbleibende GF reagiert mit dem fehlenden Nachbarn und bildet ein ektopisches synaptisches Terminal zum kontralateralen TTMn. Dieses atypische, bilateral symmetrische Terminal innerviert beide TTMns, wie durch Farbstoffkopplung nachgewiesen wird, und steuert beide Motoneuronen, wie elektrophysiologische Assays zeigen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ablation eines einzelnen Interneurons einen synaptischen Wettbewerb zwischen einem bilateralen Neuronenpaar zeigt, das den Verlust eines Neurons kompensieren und die normalen Reaktionen auf den Escape-Kreislauf wiederherstellen kann.

Einleitung

Die Laserablation ist ein bevorzugtes Werkzeug zum Sezieren neuronaler Schaltkreise in einer Vielzahl von Organismen. Es wurde in genetischen Modellsystemen wie Würmern und Fliegen entwickelt und im gesamten Tierreich eingesetzt, um die Struktur, Funktion und Entwicklung des Nervensystems zu untersuchen 1,2,3. Hier wurde die Einzelneuronenablation eingesetzt, um zu untersuchen, wie Neuronen während des Schaltkreisaufbaus in Drosophila interagieren. Das Fluchtsystem der Fliege ist ein beliebter Schaltkreis für die Analyse, da es die größten Neuronen und die größten Synapsen in der erwachsenen Fliege enthält, und der Schaltkreis wurde in denletzten Jahrzehnten gut charakterisiert 4. Die Rolle, die Neuron-Neuron-Interaktionen beim Aufbau des Riesenfaser-Schaltkreises spielen, ist ein Schwerpunkt dieser Forschung.

Eine Art von Interaktion, die seit der Arbeit von Hubel und Wiesel in den 1960er Jahren ein Schwerpunkt der Neurowissenschaften ist, ist der "synaptische Wettbewerb"5,6. In diesem Protokoll wurde die Laserablation verwendet, um die Rolle der Konkurrenz durch Einzelzellablation im Riesenfasersystem (GFS) von Drosophila zu überdenken, wo die molekularen Grundlagen der Phänomene entdeckt werden könnten.

Die Ablation von Neuronen in der sich entwickelnden Fliege war aus einer Vielzahl von Gründen schwierig, darunter die Visualisierung der Zielneuronen, die Präzision der Ablationsmethode und das Überleben der Probe. Um diese Probleme im GFS zu überwinden, wurde das UAS/Gal4-System7 verwendet, um die interessierenden Neuronen zu markieren, und ein Zwei-Photonen-Mikroskop wurde verwendet, um die präsynaptische Riesenfaser oder das postsynaptische Sprungmotoneuron (TTMn) zu entfernen.

Um die Rolle zu bestimmen, die benachbarte bilaterale Neuronen bei der Anpassung der synaptischen Konnektivität und der synaptischen Stärke im GFS spielen, wurde in dieser Studie eines der bilateralen Neuronenpaare (entweder präsynaptisches GF oder postsynaptisches Motoneuron) kurz vor der Puppenentwicklung deletiert. In diesem Entwicklungsstadium ist die GF-Axonogenese noch nicht abgeschlossen8. Anschließend wurden die GF-Struktur und die Funktion des synaptischen Schaltkreises beim Erwachsenen untersucht, wobei besonderes Augenmerk auf den Output des verbleibenden GF gelegt wurde.

Protokoll

Alle für das Protokoll verwendeten Tiere gehörten der Art Drosophila melanogaster an. Es gibt keine ethischen Probleme im Zusammenhang mit der Verwendung dieser Art. Eine ethische Freigabe war für die Durchführung dieser Arbeit nicht erforderlich. Die Einzelheiten zu den Drosophila-Arten , den Reagenzien und der Ausrüstung, die in der Studie verwendet wurden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Drosophila züchten und das richtige Larvenstadium auswählen

  1. Wählen Sie eine Gal4-Treiberlinie, die die Expression in den Zellen steuert, die abgetragen werden sollen, und kombinieren Sie sie mit einer UAS-GFP-Reporterlinie oder kreuzen Sie sie mit ihr. Ziehen Sie die Fliegen mit handelsüblichem Fliegenfutter bei 25 °C auf.
    HINWEIS: Für die Ablation von Riesenfasern (GF) wurde R91H05-Gal4 oder A307-Gal4 mit UAS-GFP rekombiniert. ShakB(letal)-GAL4, rekombiniert mit UAS-GFP, wurde für TTMn-Ablationen verwendet (siehe Materialtabelle).
  2. Wählen Sie Larven aus, die begonnen haben, aus dem Futter zu schlüpfen, und kriechen Sie an der Seite des Futterfläschchens nach oben. Diese Larven befinden sich im Wanderstadium, dem bevorzugten Stadium für die Durchführung der GF-Zellablation.
    HINWEIS: Die Ablation kann in jedem Larvenstadium durchgeführt werden. Das letzte Larvenstadium war wichtig für die Manipulation der Entwicklung des GFS, da die GF-Zellkörper im Gehirn leicht identifiziert werden können, die GF-Axone jedoch in diesem Stadium keine Verbindungen zu ihren Zielen hergestellt haben.

2. Vorbereitung derLarve des 3. Stadiums

HINWEIS: Die Larven wurden mit einer ähnlichen Methode wie Burra et al.9 betäubt. Um die Eingriffszeiten kurz zu halten, bereiten Sie jeweils nur eine Larve vor. Eine kurze Exposition gegenüber einem Narkosemittel verbessert das Überleben von Versuchstieren10.

  1. Bereiten Sie eine Glasschale mit dicht schließendem Deckel vor. Legen Sie einen Wattebausch in die Schüssel und fügen Sie unter einem Abzug etwa 3-5 ml Ethylether (gefährliche, brennbare Flüssigkeit, Laborkittel, Handschuhe, Schutzbrille) hinzu. Decken Sie die Form mit dem Deckel ab.
  2. Sammeln Sie einzelne Larven des 3. Stadiums aus Fliegenfläschchen. Im 3. Larvenstadium verlassen die Larven das Futtermedium und kriechen an der Seite des Futterfläschchens11 nach oben.
    1. Stellen Sie sicher, dass sich die Larven noch bewegen und nicht mit der Puppenbildung begonnen haben. Larven, die stationär sind und eine Verkürzung des Körpers aufweisen, beginnen mit der Verpuppung und sind für eine Ablation ungeeignet. Heben Sie die Larven mit einem kleinen Pinsel auf.
      HINWEIS: Das 3. Larvenstadium beginnt nach der zweiten Häutung nach 72 Stunden Entwicklung (nach der Eiablage) und dauert bis zur Puppenbildung bei Fliegen, die bei 25 °C aufgezogen werden, nach 120 Uhr.
  3. Setze eine Larve in ein kleines, offenes Gefäß um. Stellen Sie den Behälter in die Glasschale mit Ethylether und verschließen Sie die Schale fest. Wenn Sie die Glasschale öffnen, legen Sie sie unter einen Schnorchel oder in einen Abzug, um zu verhindern, dass Dämpfe entweichen.
    1. Im Abstand von 30 s den Deckel mit der Larve von der Schale nehmen und die Larve unter dem Präpariermikroskop auf Beweglichkeit untersuchen. Die Larve wird in der Regel innerhalb von 1 min ruhiggestellt. Sobald die Maulhaken aufhören zu zucken, ist die Larve bereit zum Aufsitzen. Entsorgen Sie alle Larven, die nach 3 Minuten nicht vollständig immobilisiert sind.
      HINWEIS: Die Oberseite eines umgedrehten Deckels eines Mikrozentrifugenröhrchens (Deckel vom Röhrchen entfernt) kann als Behälter verwendet werden.

3. Montage von Larven auf Objektträgern für die Ablation

  1. Legen Sie die betäubte Larve auf einen Objektträger aus Glasmikroskop. Tauchen Sie die Larve in einen Tropfen Insektensalzlösung; Dadurch werden einige der Speisereste weggespült, die an der Larve haften bleiben könnten.
  2. Entfernen Sie unter dem Präpariermikroskop den größten Teil der Kochsalzlösung mit einem Papiertuch. Positionieren Sie die dorsale Seite der Larve nach oben für die GF-Ablation oder die ventrale Seite nach oben für die TTMn-Ablation. Senken Sie langsam ein Glasdeckglas auf die Larve. Tragen Sie Kochsalzlösung an der Seite des Deckglases auf, um den Raum zwischen dem Glasobjektträger und dem Deckglas zu füllen.
  3. Bei der GF-Ablation ist die Positionierung des Gehirns unter starker Vergrößerung am Dissektionsmikroskop zu überprüfen. Achten Sie darauf, dass das Gehirn waagerecht liegt und durch die Nagelhaut sichtbar ist. Oft ist das Gehirn mit Fettgewebe bedeckt, was eine Visualisierung und Zellablation unmöglich macht.
    1. Um das Fettgewebe, das das Gehirn bedeckt, zu entfernen, üben Sie mit einer Pinzette leichten Druck auf das Deckglas aus und bewegen Sie das Deckglas von einer Seite zur anderen. Wenn das Fettgewebe auf diese Weise nicht vom Gehirn wegbewegt werden kann, verwenden Sie stattdessen eine andere Larve.

4. Auffinden der Zielzellen

HINWEIS: Das für diese Studie verwendete Multiphotonensystem wurde an einem aufrechten Mikroskop montiert. Zur Steuerung der Erfassungs- und Laserstimulationseinstellungen wurde eine systemspezifische Software verwendet. Das System wurde mit einer Epifluoreszenzlichtquelle ausgestattet, um die Proben zu lokalisieren. Bei der Objektivlinse handelte es sich um eine Wasserimmersionslinse mit 25-facher Vergrößerung, einem langen Arbeitsabstand von 2 mm und einer NA von 1,10.

  1. Legen Sie die Probe auf den Tisch des Multiphotonenmikroskops und verwenden Sie den GFP-Filter, um die Probe im Epifluoreszenzmodus zu lokalisieren. Bei der GF-Ablation können die Zellkörper im Gehirn identifiziert werden, wie in Abbildung 1A,C,D zu sehen ist. Für die TTMn-Ablation kann ein Cluster von vier Zellen von der ventralen Seite im ventralen Nervenstrang (VNC) identifiziert werden, wie in Abbildung 1A,B gezeigt. Wenn Sie mit dem Fokussieren fertig sind, zentrieren Sie die Zellen im Sichtfeld und wechseln Sie in den 2-Photonen-Modus.

5. Einrichten der Ablationsparameter

  1. Passen Sie die Lasereinstellungen und die Detektorverstärkung an, um die GFP-exprimierenden Zellen mit dem Galvano-Scanner zu betrachten. Eine Wellenlänge von 870 nm eignet sich am besten zur Visualisierung des GFP-Signals. Zentrieren Sie die Zelle im Sichtfeld.
  2. Verwenden Sie einen kreisförmigen Interessenbereich (ROI), um den Bereich für die Ablation zu definieren. Stellen Sie sicher, dass der ROI den größten Teil der Oberfläche der Zelle bedeckt (Abbildung 1E,G).
  3. Richten Sie das Ablationsprotokoll in der Software ein. Stellen Sie einen Aufnahme-Frame ein, dann die Stimulation, gefolgt von einem weiteren Erfassungs-Frame.
  4. Starten Sie die Leistungseinstellung des Stimulationslasers auf einem niedrigeren Wert (10%-20 %) und führen Sie das Stimulationsprotokoll aus. Eine erfolgreiche Ablation ist an einem deutlichen Kreis in der Mitte des Zellsomas an der Stelle des ROI und einer Zunahme der Fluoreszenz um den ROI herum zu erkennen (Abbildung 1F).
    1. Wenn die Ablation nicht erfolgreich war und die Zelle lediglich gebleicht wurde (Abbildung 1H), erhöhen Sie die Laserleistung in Schritten von 5 % oder die Anzahl der Schleifen nacheinander und führen Sie das Protokoll erneut aus. Die angewandte Laserleistung lag zwischen 10 % und 40 % für das im Protokoll verwendete System.
      HINWEIS: Die Einstellungen für die Laserleistung für die Ablation hängen stark davon ab, wie tief sich die Zellen im Gewebe befinden und von anderen Faktoren wie der Nagelhautfaltung. Wenn die Zellen hell und deutlich sichtbar sind, liegt die Laserleistung am unteren Ende des Bereichs. Die Laserleistung ist je nach Lasermodell und Alter des Lasers für jedes System unterschiedlich.

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Abbildung 1: Identifizierung von Neuronen für die Laserablation in intakten Drosophila L3-Larven. (A) Schematische Darstellung der Lokalisation des Riesenfaser-Somas (GF) im Gehirn und eines Clusters von Motoneuronen, die das tergotrochanterale Motoneuron (TTMn) im ventralen Nervenstrang (VNC) enthalten. (B) Projektion der maximalen Intensität von shakB(letal)-Gal4, die die Expression von GFP in der VNC der Larve antreibt. Die Mittellinie wird durch die gestrichelte Linie angezeigt. Der Kreis zeigt den Cluster von Neuronen an, die das TTMn enthalten und für die Laserablation vorgesehen sind. Maßstabsbalken: 50 μm. (C) Teilprojektionsansicht des Larvengehirns, das GFP exprimiert, unter der Kontrolle von A307-Gal4. Der Kreis zeigt das GF-Soma, das für die Laserablation vorgesehen ist. Maßstabsbalken: 50 μm. (D) Projektion der maximalen Intensität des Gehirns mit R91H05-Gal4 zur Ansteuerung von UAS-GFP. Beide GFs (Kreise) sind durch Lage, Form und Größe identifizierbar. Maßstabsbalken: 50 μm. (E) GF Soma vergrößerte Ansicht vor der Laserablation. Der magentafarbene Kreis zeigt die Zielregion für die Laserablation an. Maßstabsbalken: 10 μm. (F) GF soma vergrößerte Ansicht nach Abgabe der lokalisierten Laserleistung und erfolgreicher Ablation. Maßstabsbalken: 10 μm. (G) GF soma vergrößerte Ansicht vor der Laserablation. Der magentafarbene Kreis zeigt die Zielregion für die Laserablation an. Maßstabsbalken: 10 μm. (H) GF Soma vergrößerte Ansicht nach Abgabe von lokalisierter Laserleistung und erfolgloser Ablation (Bleaching). Maßstab: 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

6. Bergung der Larven

  1. Nachdem Sie die Zelle erfolgreich abgetragen haben, entfernen Sie das Deckglas und nehmen Sie die Larven vorsichtig mit einem Pinsel vom Objektträger auf. Legen Sie die Larven in ein Futterfläschchen. Die Larven beginnen innerhalb von 30 Minuten wieder herumzukrabbeln.
    HINWEIS: Eine kurze Verfahrenszeit verbessert die Überlebensraten der Tiere. Mit viel Erfahrung kann das Experiment in knapp 10 min durchgeführt werden.
  2. Die Larven werden unter normalen Bedingungen aufgezogen, bis sie sich von der Puppenhülle lösen.

7. Testen der Funktionalität des GFS an erwachsenen Fliegen

HINWEIS: Die folgenden Schritte werden in Allan und Godenschwege12 und Augustin et al.13 ausführlich erläutert.

  1. Testadulte Fliegen im Alter von 2-5 Tagen nach der Eklosion. Betäuben Sie Fliegen mit CO2 und montieren Sie sie auf Zahnwachs, indem Sie die Beine in das Wachs drücken. Spreizen Sie die Flügel im 90°-Winkel und fixieren Sie sie mit dem Wachs. Sichern Sie den Kopf, indem Sie den Rüssel in das Wachs schieben.
  2. Legen Sie Stimulationsdrähte in beide Augen, einen Erdungsdraht in den Bauch und Aufzeichnungselektroden aus Glas in die Sprungmuskulatur (TTMs) auf jeder Seite.
  3. Stimulieren Sie den GF-Schaltkreis mit einzelnen Stimuli, um die Reaktionslatenz für beide Muskeln zu messen. Stimulieren Sie den Zirkel mit 100 Hz bzw. 200 Hz Reizfolgen, um die folgende Frequenz für beide Muskeln zu messen.

8. Dissektion und Markierung des Riesenfasersystems für die konfokale Bildgebung

HINWEIS: Die Fliegen-ZNS-Dissektion und die Farbstoffinjektion sind in Boerner und Godenschwege14 ausführlich beschrieben.

  1. Entfernen Sie die Fliege vorsichtig mit einer Pinzette aus dem Zahnwachs und übertragen Sie sie in eine mit Silikonelastomer ausgekleidete Petrischale unter einem Dissektionszielfernrohr.
  2. Entfernen Sie die Beine, Flügel und den Rüssel mit einer Schere und befestigen Sie die Stirnseite mit Insektennadeln in der Elastomerbeschichtung.
  3. Machen Sie einen seitlichen Schnitt entlang der Mittellinie vom Mittelbauch durch den gesamten Brustkorb und den Hals hinauf, um den Brustkorb mit dem Kopf zu verbinden. Öffnen Sie den Hosenschlitz mit Insektenstecknadeln. Entfernen Sie Organe und Drüsen aus der Fliege, ohne das Nervensystem zu schädigen.
    ANMERKUNG: Zu diesem Zeitpunkt können GF-Axone mit Farbstoffen injiziert werden, um die GFs und elektrisch gekoppelten Neuronen13 zu markieren.
  4. Entferne die Kopfkapsel vom Kopf, um das Gehirn freizulegen.

9. Immunhistochemie des Nervensystems

  1. Fixieren Sie die Fliege nach der ZNS-Dissektion 45 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) in 4% PFA in PBS. 20 min in PBS bei RT waschen (3 Mal).
  2. Die Probe wird 1 h lang bei RT in 3 % BSA in PBS mit 0,5 % Detergenzienlösung blockiert.
  3. 2-3 Nächte bei 4 °C in 3 % BSA in PBS mit 0,3 % Detergenzlösung und Kaninchen-Anti-GFP (1:500) inkubieren. 20 min in PBS bei RT waschen (6 Mal).
  4. Über Nacht bei 4 °C in PBS mit Anti-Kaninchen Alexa 488 inkubieren. 20 min in PBS bei RT waschen (6 Mal).
  5. Dehydrieren Sie die Proben mit einer aufsteigenden Ethanolreihe (50 %, 70 %, 90 %, 100 % Ethanol) für 10 Minuten pro Schritt. Entferne die Stecknadeln und schneide den Bauch und die Flugmuskulatur ab. Übertragen Sie den Rest des Thorax, der das Nervensystem enthält, auf einen Objektträger und bedecken Sie ihn mit einem Eindeckmedium wie Methylsalicylat. Legen Sie ein Deckglas auf die Probe und versiegeln Sie sie mit Nagellack.
  6. Stellen Sie das Nervensystem auf einem konfokalen Mikroskop dar, um die Anatomie des GF-Terminals zu analysieren.

Ergebnisse

Mit dieser Methode kann die Entwicklung spezifischer neuronaler Netzwerke im Nervensystem von Drosophila manipuliert werden. Die primäre Forschungsfrage dabei war die Bildung synaptischer Verbindungen. Die Entfernung des präsynaptischen GF oder des postsynaptischen TTMn ermöglichte die Untersuchung der reaktiven Synaptogenese an dieser zentralen Synapse und der molekularen Mechanismen, die für die synaptische Funktion und Entwicklung entscheidend sind. Wie im Protokoll beschrieben, wurde eine Laserzellenablation eines der GFs oder eines der TTMns durchgeführt und die Auswirkungen auf die Synapse nach der Puppenentwicklung bei der adulten Fliege analysiert.

Um sicherzustellen, dass sich das Verfahren nicht negativ auf das Überleben der Tiere auswirkt, wurden parallel Scheinablationen durchgeführt. Bei Mock-Ablationen wurden die Tiere genauso behandelt wie die Versuchstiere, aber die Laserpulse wurden mit einer Laserleistung von 0 % abgegeben. In 82,4 % der Fälle entwickelten sich Tiere aus Scheinablationen zu adulten Fliegen. GFs von Mock Ablation Fliegen waren in der Lage, mit einer Latenz von unter 1 ms zu reagieren und einer 100 Hz-Stimulation für 79,3% der Stimuli zu folgen. Die Anatomie der GF war von unbehandelten Fliegen nicht zu unterscheiden.

Für jedes Versuchstier wurde die Ablation anatomisch verifiziert. Bei GF-ablierten Tieren wurde das nicht ablierte GF farbinjiziert und abgebildet (siehe unten). War nur ein GF-Axon im zervikalen Konnektiv (CvC) sichtbar, wurde eine Ablation des anderen GF angenommen. Die Ablation konnte auch durch das Fehlen eines GFP-markierten Somas auf der ablierten Seite des Gehirns verifiziert werden (Abbildung 2A, Kreis). Um die TTMn-Ablation zu beurteilen, wurde das GFP-Signal im adulten VNC analysiert, wo das TTMn-Soma und der Dendrite leicht identifiziert werden können. Das Fehlen des TTMn auf einer Seite war aufgrund des Fehlens von Soma und Dendriten leicht zu erkennen (Abbildung 2B, Kreis).

Um die Funktion des GFS bei behandelten Fliegen zu testen, wurden synaptische Potentiale aus den Sprungmuskeln12,13, die vom TTMn innerviert werden, aufgezeichnet (Abbildung 3A). Die GFs bilden eine gemischte elektrisch-chemische Synapse mit dem medialen DendritenTTMn 15. Das GF-Terminal ist unverzweigt und zeigt eine typische laterale Biegung, die dem TTMn-Dendriten im synaptischen Bereich entgegengesetzt ist (Abbildung 3D, Abbildung 4A Pfeilspitze). Bei Kontrollfliegen innerviert jedes GF ausschließlich sein ipsilaterales Motoneuron. In Aufzeichnungen von den TTM-Fasern wurde die Stärke der Verbindung durch Analyse der Reaktionslatenz bei 1-Hz-Stimulation und der Folgefrequenz bei 100-Hz-Stimulation bewertet (Abbildung 3B, C). Kontrollfliegen zeigten eine durchschnittliche Reaktionslatenz von weniger als 1 ms und konnten einer 100-Hz-Stimulation für 78,1% der Stimuli folgen (Abbildung 3B). Nachdem physiologische Aufzeichnungen durchgeführt worden waren, wurde die Probe präpariert, um das ZNS und die GFs freizulegen, die mit einer Mischung aus TRITC-Dextran und Neurobiotin gefärbt wurden. Das große Dextran-Molekül markiert das GF-Axon und das Terminal, passiert aber keine Gap-Junctions. Neurobiotin kann die Gap Junctions zwischen GF und TTMn überqueren, und das Neurobiotin-Signal wurde im postsynaptischen Dendriten nachgewiesen (Abbildung 3E, F, Pfeilspitzen). Diese Neurobiotin-Farbstoff-Kopplung bestätigte die elektrische Kopplung zwischen den beiden Neuronen. Neurobiotin kann auch in vielen anderen Neuronen im VNC nachgewiesen werden, die über Gap Junctions mit dem GF16 verbunden sind (Abbildung 3E,F).

Die gleichen physiologischen und anatomischen Tests wurden durchgeführt, nachdem ein GF in L3 abgetragen worden war. Das Axon der meisten (13/15) der verbleibenden GFs in Ablationsfliegen weist eine Teilung des terminalen Bereichs in zwei Äste auf: einen in der üblichen ipsilateralen Position und einen in der Kreuzung der Mittellinie zu einer homologen Position kontralateral zum intakten GF (Abbildung 3G, Pfeil). Jeder Zweig war farbstoffgekoppelt an einen der TTMn-Dendriten (Abbildung 3H,I, Pfeilspitzen). Physiologische Ableitungen der TTMs bestätigten diese synaptische Verbindung eines GF zu beiden TTMns, wenn auch schwächer als normal. Die TTM-Antwortlatenzen betrugen auf beiden Seiten mehr als 1 ms, und die folgenden Frequenzen bei 100 Hz betrugen 37,1 % für die TTMn ipsilateral zum intakten GF und 28 % für die kontralaterale TTM (Abbildung 3C).

Da die Ablation eines GF dazu führte, dass das verbleibende GF beide Zielneuronen innervierte, zielte das nächste Experiment darauf ab, die Reaktion benachbarter GFs zu beobachten, wenn einem ein normales ipsilaterales Ziel-Motoneuron fehlte. Für dieses Experiment wurde eines der postsynaptischen Neuronen deletiert und die Anatomie und Funktion des verbleibenden TTMn sowie die Morphologie der GF-Terminals untersucht. Bei der Visualisierung sowohl der TTMns als auch der GFs bei adulten Kontrolltieren war die Region des vermuteten synaptischen Kontakts deutlich sichtbar (Abbildung 4A, Pfeilspitzen). Jeder TTMn-mediale Dendrit wurde an das ipsilaterale präsynaptische GF-Terminal appliziert. Kleine Projektionen von TTMn-Dendriten von beiden Seiten berührten die Mittellinie (Abbildung 4C; Einschub). Die Farbstoffkopplung mit Neurobiotin war bei beiden TTMn deutlich sichtbar (Abbildung 4D, Pfeilspitzen).

Wenn ein TTMn abliert wurde, veränderte sich die Morphologie des verbleibenden medialen TTMn-Dendriten. Der mediale Dendrit erstreckte sich bei diesen Exemplaren über einen langen, dicken Ast über die Mittellinie (Abbildung 4I,K; gelbe Pfeile). Zusätzlich erstreckten sich dünnere Vorsprünge zu beiden GF-Terminalien nach vorne (Abbildung 4E,G; gelbe Pfeilspitzen). Der GF, ipsilateral zum TTMn, zeigte seine übliche Anatomie mit einem terminalen Terminal, das entlang des TTMn-Dendriten vorsteht.

Die Reaktion des "verwaisten" GF, dem ein Ziel-Motoneuron fehlte, war von primärem Interesse. In den meisten Fällen (61,5 % der Tiere) wies das verwaiste GF ein geteiltes Terminal auf, wobei ein Terminal auf der ipsilateralen Seite lag und das andere Terminal die Mittellinie kreuzte und in Richtung des kontralateralen TTMn-Dendriten projizierte (Abbildung 4J, Pfeile). Diese gekreuzten Äste des GF waren immer kleiner als diejenigen, die im komplementären Experiment zu sehen waren, als der benachbarte GF abgetragen wurde (Abbildung 3F). Das ipsilaterale Terminal berührte den TTMn-Ast, der sich über die Mittellinie erstreckte (Abbildung 4I, gelber Pfeil). In 23% der Proben überquerte der verwaiste GF die Mittellinie (Abbildung 4F, Pfeil) und projizierte entlang eines der vorderen Äste von TTMn (Abbildung 4E, gelbe Pfeilspitzen) und war mit dem restlichen TTMn farbstoffgekoppelt (Abbildung 4H, Pfeilspitze).

Zwei weitere Phänotypen wurden bei TTMn-Ablationsfliegen beobachtet (Abbildung 4M). Bei einer von 13 Fliegen machten beide GFs die normale Biegung und blieben auf ihren jeweiligen Seiten des Nervensystems. In einem anderen Fall zeigte der verwaiste GF den bendlosen Phänotyp, bei dem der verwaiste GF kein Terminal bildete und vor dem Bereich stoppte, in dem er sich normalerweise biegt. Für alle vier Phänotypen waren die TTM-Aufzeichnungen auf der Seite des intakten TTMn vergleichbar mit der Wildtyp-Physiologie (WT) mit einer Reaktionslatenz von unter 1 ms und einer nachfolgenden Frequenz bei 100 Hz bei 100 % oder nahe 100 %. Das Entfernen eines Ziels kann es beiden GFs ermöglichen, sich das verbleibende Ziel-TTMn zu teilen. In den meisten Fällen stellen beide GFs eine Verbindung mit dem verbleibenden TTMn her. In der Regel wird das verwaiste GF ein bilaterales Terminal ausstellen. Bei Kontrollfliegen überqueren GFs niemals die Mittellinie; bei etwa 85% der TTMn-Ablationsfliegen überquerte jedoch ein GF die Mittellinie, um mit dem kontralateralen TTMn in Kontakt zu kommen. Die Innervation von einem TTMn durch zwei GF beeinflusste die synaptische Funktion nicht negativ.

Bemerkenswert ist, dass das Fehlen des benachbarten GF einen größeren Effekt hat als das Fehlen des Ziel-Motoneurons. Das bilaterale Terminal, das in Abwesenheit des kontralateralen GF gebildet wird, ist viel größer und offensichtlicher funktionsfähig als die Veränderungen, wenn das Ziel entfernt wird.

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Abbildung 2: Beispiele für erfolgreiche Ablationen im adulten ZNS. (A) Projektion der maximalen Intensität eines adulten Fliegengehirns nach Larven-GF-Ablation. GFP (grün) wird von der A307-GAL4 angetrieben. Der Kreis zeigt den Bereich an, in dem der abgetragene GF fehlt. Die Pfeilspitze zeigt auf den verbleibenden GF, der GFP auf der anderen Seite des Gehirns exprimiert. Der GF wurde mit TRITC-Dextran (rot) gefüllt. Das Axon projiziert nach hinten in Richtung VNC. Maßstabsbalken: 20 μm. (B) Projektion der maximalen Intensität eines VNC bei Erwachsenen, bei dem ein TTMn in L3 abliert wurde. Die verbleibende TTMn (Pfeilspitze) exprimiert GFP unter dem shakB(letal) Treiber. Die Fläche des fehlenden TTMn wird durch den Kreis angezeigt. Maßstab: 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Die Larvenablation einer Riesenfaser (GF) führt zu einer bilateralen Verzweigung des präsynaptischen Terminals der verbleibenden GF. (A) Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus zur Überprüfung der Struktur und Funktion des adulten Riesenfasersystems (GFS). Die Aufzeichnungselektrode misst die Latenz und die folgende Frequenz der Ausgänge des tergotrochanteralen Motoneurons (TTMn) an den tergotrochanteralen Muskeln (TTM) nach Stimulation des Gehirns beim intakten Tier. Nach der Dissektion des Nervensystems wurde der Farbstoff in die GF-Axone am zervikalen Bindeglied (CvC) injiziert. (B,C) Beispielkurven für die TTM-Antwortlatenz und die Folgefrequenz bei 100 Hz (n steht für die Anzahl der TTM, die in jeder Situation mit der angezeigten mittleren Latenz und Folgefrequenz aufgezeichnet wurden). (B) Kontrolltiere mit zwei intakten GF zeigen TTM-Latenzen unter 1 ms und folgende Frequenzen nahe 100 % bei 100 Hz. (C) Der einzige verbleibende GF bei ablierten Tieren innerviert beide TTMns. Die Latenzen für beide TTMns sind länger als bei Kontrollen, und bei 100 Hz ist die Frequenz signifikant verringert. (D-I) Maximale Intensitätsprojektion von konfokalen Bildstapeln für farbstoffgefüllte GFs. TRITC-Dextran (D,G,F,I in rot) und Neurobiotin (E,H,F,I in grau) wurden gemeinsam injiziert. Neurobiotin kann Gap Junctions zwischen dem GF und dem TTMn überqueren und die postsynaptischen Neuronen markieren. Die gestrichelten Linien zeigen die Mittellinie an. (D) Typische GF-Anatomie von Kontrolltieren mit der terminalen Biegung. (E,F) Neurobiotin markiert viele postsynaptische Neuronen, die elektrisch an die GFs gekoppelt sind. Die transsynaptisch markierten TTMn-Dendriten sind durch Pfeilspitzen gekennzeichnet. (G) Nach der Ablation bildet der verbleibende GF ein zusätzliches Terminal (Pfeil), das die Mittellinie kreuzt, um das kontralaterale TTMn zu innervieren. (H,I) Beide TTMn (Pfeilspitzen) sind an denselben GF gekoppelt. Maßstabsbalken: 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4. Die Larvenablation eines tergotrochanteralen Motoneurons (TTMn) bewirkt eine Innervation des verbleibenden TTMn durch beide Riesenfasern (GF). (A-L) Projektionen der maximalen Intensität von konfokalen Bildstapeln von TTMns, die mit GFP (grün) markiert waren, unter der Kontrolle von shakB(lethal)-Gal4 und den GFs wurden mit TRITC-Dextran (magenta) und Neurobiotin (rot) gefärbt. Die gestrichelte Linie zeigt die Mittellinie des Nervensystems an. (A-D) Kontrollproben mit intakten TTMns. Die GFs machen ihre typische terminale Biegung von der Mittellinie weg, um das TTMn (A,B) zu kontaktieren, und jedes GF berührt ein TTMn. TTMn-Dendriten treffen sich an der Mittellinie (C). Jeder GF ist an seinen TTMn (D, weiße Pfeilspitzen) gekoppelt. (E-H) Das linke TTMn wurde abgetragen. Der mediale Dendrit des restlichen TTMn ragt über die Mittellinie (G, gelber Pfeil). Der verwaiste GF kreuzt die Mittellinie (weißer Pfeil) in der synaptischen Region und berührt den kontralateralen TTMn-Dendriten (E,F). Die GFs sind an das verbleibende TTMn (H, Pfeilspitze) farbgebunden. (I-L) Beispiel für einen anderen GF-Phänotyp, bei dem das linke TTMn abgetragen wurde. Der mediale Dendrit des restlichen TTMn ragt über die Mittellinie (I und K, gelber Pfeil). Der linke verwaiste GF bildet ein bilaterales Terminal; ein Ast projiziert kontralateral, der andere bleibt ipsilateral (J, Pfeile), um sich mit dem TTMn zu verbinden. Maßstabsbalken: 20 μm. (M) Schematische Darstellung der vier verschiedenen GF-Phänotypen bei TTMn-Ablationstieren. n gibt die Anzahl der Tiere in jeder Klasse an. Angegeben sind die Durchschnittswerte mit Standardfehler für die TTM-Antwortlatenz und die Folgefrequenz (FF) bei 100 Hz für die Seite des intakten TTMn. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Die Zellablation mit einem 2-Photonen-Mikroskop erwies sich als sehr erfolgreiche Methode, um die Entwicklung neuronaler Schaltkreise in Drosophila zu manipulieren. Da diese Methode nicht-invasiv ist, verursacht sie nur minimalen Schaden für das Tier. Die Daten unterstützen die Nützlichkeit dieser zellspezifischen Manipulation bekannter Schaltkreise.

Entscheidend für den Erfolg der Ablation war die Auswahl des am besten geeigneten Gal4-Treibers. Da das GFS gut untersucht ist, wurden viele spezifische Gal4-Treiberlinien beschrieben7. Die meisten Gal4-Treiber sind sehr eingeschränkt, werden aber immer noch in vielen anderen Neuronen exprimiert. Eine Herausforderung bestand darin, die Zielzellen im intakten Tier zuverlässig zu identifizieren. Bei Tieren mit einer deutlich sichtbaren GFP-Markierung konnte die Ablation mit geringer Laserleistung durchgeführt werden und erforderte oft nur einen Versuch. Bei Tieren, bei denen das Fettgewebe das Gehirn bedeckte oder die GFP-Expression schwach war, erforderte die Deletion von Zielzellen eine höhere Laserleistung und mehrere Schleifen der Laserexposition. Die GF-Zellkörper befanden sich etwa 100 μm tief von der dorsalen Seite des Gehirns entfernt. Bei Experimenten, bei denen sich die Zielzellen in einer tieferen Tiefe befinden, kann es nützlich sein, die Ablation in früheren Larvenstadien durchzuführen, wenn das Nervensystem kleiner ist.

In vorangegangenen Experimenten im Labor wurden verschiedene Methoden zur Zellablation erforscht. Die Verwendung des UAS/Gal4-Systems zur Steuerung der Expression von Toxinen führte auch zur Deletion spezifischer Neuronen. Es ist jedoch viel schwieriger, die Deletion einzelner Zellen zu kontrollieren und Off-Target-Effekte zu vermeiden. Die andere Schwierigkeit besteht darin, den genauen Zeitpunkt des Zelldeletionsereignisses zu kontrollieren. Die Laserzellablation ermöglichte eine präzise Kontrolle über den Zielort und den Zeitpunkt der Deletion, aber es gab noch einige Herausforderungen zu bewältigen, bevor die Methode perfektioniert und Erfolgsraten von über 80% (Überleben der Tiere und erfolgreiche Zellablation) erreicht wurden. Die Überlebensrate der Tiere wurde durch die lange Exposition gegenüber Ethylether und die langen Eingriffszeiten negativ beeinflusst. Studien haben gezeigt, dass bei einer 3,5-minütigen Exposition von L3-Drosophila-Larven gegenüber Ethylether10 hohe Überlebensraten bei Verpuppung (78%) und Eklosion bei Erwachsenen (67%) erreicht werden können. Eine Exposition von 3,5 Minuten stellt sicher, dass das Tier bis zu 8 Stunden lang unbeweglich bleibt. Für die Laserzellenablation müssen die Tiere 30 Minuten oder weniger unbeweglich sein. Daher kann die Einwirkzeit gegenüber Ethylether deutlich unter 3,5 min gehalten werden. In den meisten Fällen waren die Larven innerhalb von 1 min vollständig unbeweglich.

Die Ergebnisse der Laserablation zeigen, dass der GF sauber abgetragen werden kann und die Wirkung auf den kontralateralen Nachbar-GF leicht beurteilt werden kann. Das Ablationsergebnis war eindeutig und konsistent. Bei 13 von 15 einzelligen Ablationen weisen die übrigen GF Partner ein bilaterales Terminal auf, das bei Kontrolltieren noch nie zu sehen ist. Dieses bilateral symmetrische Terminal ist leicht zu erkennen, und der ungewöhnliche kontralaterale Ast ist ähnlich groß wie ein normales Terminal und mit dem kontralateralen Ziel-Motoneuron farbstoffgekoppelt. Das bilaterale Terminal ist an beide Ziel-Motoneuronen gekoppelt und funktioniert in den meisten Proben nahezu wildtypisch, wobei sowohl das normal-ipsilaterale Ziel- als auch das kontralaterale Ziel-Motoneuron mit Latenzen und Folgefrequenzen in der Nähe der Kontrollwerte gesteuert werden.

Das komplementäre Experiment, eine einseitige Ablation eines Ziel-Motoneurons, bietet einen interessanten Vergleich. Das verbleibende Motoneuron zeigt oft ein reaktives dendritisches Wachstum, das einen Prozess über die Mittellinie in den Raum ausdehnt, der normalerweise vom gelöschten Nachbarn besetzt ist. Obwohl dieser Dendrit nicht so groß ist wie der deletierte, zeigt er eine ähnliche Reaktion wie die GFs, denen ihr bilateraler Partner fehlt. Im Gegensatz dazu reagiert das nun ziellose GF nur moderat auf das fehlende Ziel und dehnt kleinere Prozesse über die Mittellinie und entlang der verbleibenden Motoneuronen-Dendriten aus. Diese bescheidene Reaktion steht in scharfem Kontrast zu der dramatischen Reaktion der GF auf eine fehlende bilaterale homologe GF, bei der ein großes kontralaterales Terminal gebildet wird, um das normale Terminal zu ergänzen und ein bilaterales Terminal zu bilden.

Ein paralleles Ablationsexperiment wurde kürzlich mit den präsynaptischen Inputs an den GF im Gehirn durchgeführt, bei dem eine ähnliche Art von "Konkurrenz" um den synaptischen Raum festgestellt wurde17. Visuelle Eingaben an die GF-Kachel, den Glomerulus, wo die visuellen Projektionsneuronen (VPN) die GF-Dendriten erreichen. Das Löschen einer Gruppe der VPNs (in diesem Fall genetisch) zeigt, dass die verbleibenden VPNs einen Teil des synaptischen Raums des abwesenden Nachbarn übernehmen und innervieren und eine kompensatorische physiologische Wiederherstellung der visuellen Reaktion auf drohende Reize erzeugen. Wenn die ersten ankommenden Afferenzen gelöscht werden, belegen die späteren ankommenden Afferenzen Platz und werden nicht mehr belegt. Die größte phänomenologische Ähnlichkeit mit der vorliegenden Arbeit ist die offensichtliche Rolle, die die physische Besetzung bei der Bestimmung des Gleichgewichts zwischen den verschiedenen Eingaben spielt. Die Ausgangsanschlüsse der beiden GFs scheinen miteinander um den physikalischen synaptischen Raum zu konkurrieren.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die Experimente am 2-Photonen-Mikroskop wurden im Advanced Cell Imaging Core des Stiles-Nicholson Brain Institute der FAU durchgeführt. Wir danken der Jupiter Life Science Initiative für die finanzielle Unterstützung.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Alexa Fluor 488 AffiniPure Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L)Jaxkson ImmunoResearch111-545-003
Anti-Grün fluoreszierendes Protein, KaninchenFisher ScientificA111221:500 Konzentration
Apo LWD 25x/1.10W ObjektivNikonMRD77220Wasserimmersion langer Arbeitsabstand
Rinderserum Albumin (BSA)SigmaB4287-25G
Chamäleon Ti:Sapphire Vision II LaserCoherent
Cotton BallGenesee Scientific51-101
Dextra, Tetramethylrhodamin, 10.000 MW, Lysin Fixierbar (Fluor-Rubin)Fisher ScientificD1817
Drosophila KochsalzlösungRezept von Gu und O'Dowd, 2006
EthyletherFisher ScientificE134-1Gefahr, Entzündbare Flüssigkeit
Fliegenfutter B (Bloomington-Rezept)LabExpress7001-NV
MethylsalicylatFisher ScientificO3695-500
Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 mLEppendorf22363204
Mikroskop Deckglas 18x18 #1,5Fisher Scientific12-541A
Neurobiotin TracerVektor LaboratorienSP-1120
Nikon A1R MultiphotonenmikroskopNikonauf einem aufrechten FN1-Mikroskopstativ
NIS Elements Advanced ResearchNikonErfassungs- und Datenanalysesoftware
Paraformaldehyd (PFA)Fisher ScientificT353-500
PBS (Phosphatgepuffertes Salin)Fisher BioReagentsBP2944-100Tabletten
R91H05-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center40594
shakB(lethal)-GAl4Bloomington Drosophila Stock Center51633
Superfrost Mikroskop ObjektträgerFisher Scientific12-550-143
Triton X-100Fisher Scientific422355000Waschmittellösung
UAS-10xGFPBloomington Drosophila Lager Center32185

Referenzen

  1. Chung, S. H., Mazur, E. Femtosecond laser ablation of neurons in C. elegans for behavioral studies. Appl Phys A Mater Sci Process. 96 (2), 335-341 (2009).
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  17. Mcfarland, B. W., et al. Axon arrival times and physical occupancy establish visual projection neuron integration on developing dendrites in the Drosophila optic glomeruli. bioRxiv. , (2024).

Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

Zwei Photonen Mikroskopieneuronale SchaltkreisbildungRiesenfasersystemOptogenetikEinzelneuron AblationFluchtverhaltenGFP exprimierende Zellen
Laserzellablation in intakten Drosophila-Larven zeigt synaptische Konkurrenz
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