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Methodenartikel

In vitro Modell zur Untersuchung der Differenzierung und Veränderung von Multi-Omics an murinen Atemwegsepithelzellen, die mit Zigarettenrauchextrakt stimuliert wurden

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DOI:

10.3791/67057

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12. Juli 2024

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1Department of Immunology, School of Basic Medical Sciences, Capital Medical University, 2Department of Pulmonary and Critical Care Medicine, Center of Respiratory Medicine, China-Japan Friendship Hospital, 3National Center for Respiratory Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In dieser Arbeit beschreiben wir ein in vitro Modell zur Isolierung und Differenzierung von murinen Atemwegsepithelzellen, wobei der Schwerpunkt auf ihrer Akklimatisierung an chronischen Zigarettenrauchextrakt (CSE) liegt. Das Modell könnte verwendet werden, um die Multi-Omics-Auswirkungen von CSE umfassend zu charakterisieren, was möglicherweise Einblicke in die zellulären Reaktionen unter chronischer Rauchbelastung liefert.

Zusammenfassung

Die chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD) wird weitgehend auf die Exposition gegenüber Tabakrauch zurückgeführt. Die Untersuchung, wie sich Epithelzellen der Atemwege funktionell an Tabakrauch anpassen, ist entscheidend für das Verständnis der Pathogenese von COPD. In der vorliegenden Studie wurde ein in vitro-Modell mit primären Epithelzellen der Maus erstellt, um die Auswirkungen von Tabakrauch in der Praxis nachzuahmen. Im Gegensatz zu etablierten Zelllinien behalten Primärzellen eher in vivo-ähnliche Eigenschaften bei, einschließlich Wachstumsmuster, Alterung und Differenzierung. Diese Zellen weisen eine empfindliche Entzündungsreaktion und eine effiziente Differenzierung auf und bilden somit die physiologischen Bedingungen genau ab. In diesem Modell wurden primäre murine Atemwegsepithelzellen 28 Tage lang unter einer Luft-Flüssig-Grenzfläche mit einer optimalen Konzentration an Zigarettenrauchextrakt (CSE) kultiviert, was zur Umwandlung einer Monoschicht undifferenzierter Zellen in ein pseudostratifiziertes Säulenepithel führte, was auf eine CSE-Akklimatisierung hinweist. Umfassende Multi-Omics-Analysen wurden dann angewendet, um die Mechanismen aufzuklären, durch die CSE die Differenzierung der basalen Atemwegszellen beeinflusst. Diese Erkenntnisse ermöglichen ein tieferes Verständnis der zellulären Prozesse, die dem Fortschreiten der COPD als Reaktion auf Tabakrauch zugrunde liegen.

Einleitung

Die chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD) ist eine heterogene Lungenerkrankung mit komplexen Merkmalen, wobei Patienten mit COPD nach und nach jünger werden1. Rauchen, ein primärer Risikofaktor für COPD2, hat einen tiefgreifenden Einfluss auf die Epithelzellen der Atemwege, die als Ausgangsbarriere gegen Tabakrauch dienen. Trotz dieses bekannten Zusammenhangs sind die detaillierten Mechanismen, durch die Tabakrauch Veränderungen in den Epithelzellen der Atemwege hervorruft, nach wie vor unzureichend erforscht. Ein gründliches Verständnis dieser molekularen Veränderungen ist unerlässlich, um frühe diagnostische Marker und therapeutische Ziele für COPD zu identifizieren.

Um diese Lücke zu schließen, haben wir ein neuartiges in vitro-Modell mit murinen Atemwegsepithelzellen entwickelt. Diese Zellen wurden einer Langzeitstimulation mit Zigarettenrauchextrakt (CSE) unterzogen, was es uns ermöglichte, dynamische zelluläre Veränderungen zu beobachten und die Veränderungen in den Epithelzellen der Atemwege unter langfristiger Tabakstimulation und den zugrunde liegenden Mechanismus zu untersuchen. In diesem Modell wurde Transwell verwendet, um die Luft-Flüssig-Grenzfläche von Epithelzellen der Atemwege bereitzustellen, und Zigarettenrauchextrakt wurde im frühen Stadium der Epithelzelldifferenzierung bis zum Ende der Differenzierung nach 28 Tagen stimuliert. Frühere Studien untersuchten nur die Differenzierung und kurzfristige Stimulation von Epithelzellen der Atemwege (Zellliniendominanz). Sie waren auf einen einzigen Regulationsweg beschränkt 3,4,5,6. Das hier vorgestellte Protokoll verwendet jedoch primäre Atemwegsepithelzellen der Maus und optimiert den Zellextraktionsprozess für eine bessere Zellaktivität als frühere Epithelzellkulturmethoden der Atemwege. Dieses Modell konzentriert sich auf Veränderungen in der zellulären Differenzierung neben umfassenden transkriptomischen, proteomischen, metabolomischen und epigenomischen Analysen. Mit Hilfe von Immunfluoreszenz und fortschrittlichen Multi-Omics-Techniken wollten wir die zellulären Reaktionen von Atemwegsepithelzellen auf chronische Tabakrauchexposition aufklären und so zu einem tieferen Verständnis der COPD-Pathogenese beitragen. Dieses Modell kann verwendet werden, um die Veränderungen im Differenzierungsmuster der Epithelzellen der Atemwege und deren Mechanismus zu untersuchen, die durch die langfristige Stimulation verschiedener Schadstoffe verursacht werden.

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Protokoll

Das Gesamtprotokoll erfordert 44 Tage, davon 1 Tag für die Präparation von Atemwegsepithelzellen, die aus murinen Luftröhren isoliert wurden, 15 Tage für die Zellproliferation und 28 Tage für die CSE-Stimulation an der Luft-Flüssig-Grenzfläche. Alle Versuchstiere sind im SPF Barrier Animal Room des Tierversuchszentrums der Capital Medical University untergebracht und wurden von der Ethikkommission für Tierversuche und Labortiere der Capital Medical University (AEEI-2020-100) überprüft und genehmigt, um die Anforderungen der ANARRIVE-Richtlinien7 zu erfüllen.

1. Isolierung von primären murinen Atemwegsepithelzellen aus murinen Luftröhren

  1. Präparat
    1. Bereiten Sie das vollständige Expansionsmedium vor, indem Sie 1 ml 50x Supplement und 0,05 mL Hydrocortison-Stamm mit 48,95 mL Basalmedium kombinieren. Bei 4 °C lagern und innerhalb von 4 Wochen verbrauchen.
    2. Lösen Sie 7,5 mg Proteinase und 5 mg Desoxyribonuklease I in 5 ml Ham's F-12, um eine Proteinaselösung herzustellen. Zum Sterilisieren filtrieren und bei 4 °C lagern und innerhalb von 4 Wochen verbrauchen.
    3. Bereiten Sie Antibiotikalösungen vor, indem Sie 0,05 ml 100x Penicillin/Streptomycin und 0,01 ml 500x Gentamicin/Amphotericin zu 5 ml vollständigem Expansionsmedium, PBS und Proteinaselösung (100 U/ml Penicillin, 100 U/ml Streptomycin, 10 μg/ml Gentamicin und 0,25 μg/ml Amphotericin B) hinzufügen. Bei 4 °C lagern und innerhalb von 4 Wochen verbrauchen.
    4. Sterilisieren Sie chirurgische Instrumente und bereiten Sie die biologische Sicherheitswerkbank für die Zellisolierung vor. Stellen Sie gleichzeitig sicher, dass die Standard-Zellkulturgeräte einsatzbereit sind.
    5. Bereiten Sie mit Rattenschwanzkollagen beschichtete Schalen zu, indem Sie Rattenschwanzkollagen (100 μg/ml in 0,02 N Essigsäure) in 100-mm-Kulturschalen und 24-mm-Transwells (0,05 ml/cm2) geben. Zur Sterilisation über Nacht unter UV-Licht offen lassen.
  2. Isolierung von primären murinen Atemwegsepithelzellen
    1. Verwenden Sie C57BL/6-Mäuse (6-8 Wochen alt, männlich, SPF-erhöht) für die Isolierung von Trachealepithelzellen. Euthanasieren Sie mit einer Überdosierung von 1% Pentobarbital-Natriumlösung (ca. 200 mg/kg). Verwenden Sie fünf Mäuse für eine ausreichende Zellausbeute.
    2. Sterilisieren Sie die Maus durch Eintauchen in 75%ige Ethanollösung und tauchen Sie Nase und Mund nicht in Alkohol, um zu verhindern, dass Alkohol in die Luftröhre fließt.
    3. Sezieren Sie die Maus.
      1. Verwenden Sie chirurgische Klingen und Pinzetten, einen Satz Geräte zum Schneiden und Öffnen der Epidermis vom Unterkiefer bis zur Bauchhöhle der Maus.
      2. Verwenden Sie ein weiteres chirurgisches Instrumentarium, um die Schilddrüse auf beiden Seiten auseinander zu reißen und die Verbindungen zwischen der Luftröhre, dem umgebenden Muskelgewebe und der Speiseröhre zu entfernen.
      3. Schneiden Sie danach vorsichtig in die Brust, dringen Sie mit einer Zange tiefer in die Brusthöhle ein, nehmen Sie die gesamte Lunge heraus und finden Sie das Ende der Luftröhre.
    4. Verarbeiten Sie die Luftröhre.
      1. Schneiden Sie die Luftröhre vom Schilddrüsenknorpel bis zum tracheobronchialen Ast heraus und legen Sie sie in ein vorkaltes Expansionsmedium, das vier Antibiotika enthält.
      2. Schütteln Sie den Schlauch, um so viel Blut wie möglich von der Oberfläche der Luftröhre zu spülen, halten Sie ihn auf Eis und beginnen Sie dann mit der Operation für die nächste Maus.
    5. Übertragen Sie alle gesammelten Luftröhren zur Vorbehandlung vor der Verdauung in einen vorkalten PBS-Puffer, der vier Antibiotika (200 μg/ml Penicillin, 200 μg/ml Streptomycin, 20 μg/ml Gentamicin und 0,5 μg/ml Amphotericin B) enthält.
    6. Verwenden Sie einen Satz chirurgischer Instrumente, um Gerinnsel und anderes Gewebe von den Oberflächen der Luftröhre zu entfernen, und schneiden Sie sie dann in eine Größe von 1 cm2 .
    7. Inkubieren Sie das Trachealgewebe in Proteinaselösung bei 37 °C für 40 Minuten.
    8. Nach 40 min schütteln Sie das Röhrchen mehrmals und verwenden Sie ein 40 μm Zellsieb, um das restliche Gewebe zu entfernen. Die gehackten Luftröhren werden auf einem Sieb mit 5 ml Expansionsmedium gespült, die Zellsuspension bei 400 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand verworfen.
    9. Resuspendieren Sie die erhaltenen Zellen in 8 ml Expansionsmedium.
    10. Zählen Sie die lebensfähigen Zellen mit Trypanblau und einem Hämozytometer.
    11. P0-Zellsuspension auf 100-mm-Schalen (1 x 104 lebende Zellen/cm 2) mit Rattenschwanzkollagen vorbeschichtet und die Zellen in einem Inkubator bei 37 °C, 5 % CO2 kultivieren.

2. Expansionskultur und Passage von primären murinen Atemwegsepithelzellen

  1. Tauschen Sie das Medium für die P0-Zellkultur alle 3 Tage aus, bis die Zellen eine Konfluenz von 70 % bis 80 % erreicht haben, normalerweise innerhalb von 6 Tagen. Zu diesem Zeitpunkt können murine Trachealepithelzellen eine intakte Monoschicht mit einem Kopfsteinpflaster-Aussehen bilden (Abbildung 1A-D).
  2. Ausreichende Mengen PBS, vollständiges Expansionsmedium und tierkomponentenfreies (ACF) Zelldissoziationskit auf 37 °C vorwärmen.
  3. Spülen Sie die Zellen vorsichtig mit 3 ml PBS.
  4. Führen Sie eine enzymatische Dissoziation durch.
    1. 3 mL enzymatische ACF-Dissoziationslösung in die Schale geben und 5 Minuten lang bei 37 °C inkubieren. Nach dem Pipettieren die Zellen vorsichtig entfernen und die Zellsuspension in 3 ml ACF-Enzymhemmungslösung überführen.
    2. Wiederholen Sie die Zugabe von 3 ml enzymatischer ACF-Dissoziationslösung und inkubieren Sie erneut 5 Minuten lang, um eine maximale Zellablösung zu gewährleisten.
  5. Die Zellsuspension bei 400 x g für 5 min bei 4 °C schleudern. Entsorgen Sie den Überstand.
  6. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml Expansionsmedium.
  7. Zählen Sie die lebensfähigen Zellen mit Trypanblau und einem Hämozytometer.
  8. P1-Zellsuspension auf mehreren 100-mm-Schalen (5 x 104 lebende Zellen/cm 2) mit Rattenschwanzkollagen vorbeschichtet und die Zellen in einem Inkubator bei 37 °C, 5 % CO2 kultivieren.

3. Differenzierung und CSE-Stimulation von primären murinen Atemwegsepithelzellen an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche

  1. Bestätigen Sie den Zelltyp.
    1. Verifizieren Sie den epithelialen Ursprung isolierter Zellen mit einem Immunfluoreszenz-Assay (IFA) mit Antikörpern gegen Cytokeratine. Samenzellen auf Objektträgern, die mit Rattenschwanzkollagen beschichtet sind, und verwenden Paraformaldehyd, um sie für mindestens 12 Stunden zu fixieren, nachdem die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreicht haben.
    2. Waschen Sie die Objektträger 3 Mal 5 Minuten lang mit PBS-Lösung und inkubieren Sie sie mit 3 % BSA und 0,1 % Triton X-100 in PBS-Lösung bei Raumtemperatur (RT) für 1 h.
    3. Die Objektträger werden über Nacht bei 4 °C mit handelsüblichen Anti-Pan-Cytokeratin-Antikörpern in einer Verdünnung von 1:500 inkubiert.
    4. Am nächsten Tag die Objektträger 3 Mal 5 Minuten lang mit PBS-Lösung waschen und mit sekundärem Antikörperpuffer in einer Verdünnung von 1:1000 bei RT für 2 h im Dunkeln inkubieren.
    5. Nach der Inkubation die Objektträger 3 Mal mit PBS waschen (5 min pro Waschgang) und DAPI in einer Verdünnung von 1:1000 hinzufügen. Nach der Inkubation bei RT für 15 min die Objektträger einmal mit PBS für 5 min waschen.
    6. Betrachten Sie Objektträger unter einem Fluoreszenzmikroskop und vergleichen Sie die Expressionsmuster mit einer Positivkontrolle (A549-Zelllinie) und einer Negativkontrolle (Raw264.7-Zelllinie) (Abbildung 2).
  2. Säen Sie die Zellen für die Differenzierung aus.
    1. Die P2-Zellen werden wie zuvor beschrieben abgenommen und zentrifugiert, und das Zellpellet wird in einem geeigneten Volumen des Expansionsmediums resuspendiert, um die Beschichtung von 1 x 104 lebenden Zellen/cm2 zu erleichtern.
    2. Pipettieren Sie 1 ml Zellsuspension in die apikale Kammer des Transwell-Polycarbonat-Membraneinsatzes. In das basale Kompartiment des Transwells werden 1,5 ml Proliferationsmedium gegeben.
  3. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und wechseln Sie alle 3 Tage das gesamte Medium in der basalen und apikalen Kammer mit dem Expansionsmedium, bis die Konfluenz erreicht ist. Dies dauert in der Regel 3-6 Tage.
  4. Bereiten Sie 50 ml vollständiges Differenzierungsmedium vor, indem Sie 5 ml ALI 10x Supplement, 500 μl ALI Maintenance Supplement, 100 μl Heparinlösung und 250 μl Hydrocortison-Stammlösung zu 44,15 mL ALI Basalmedium hinzufügen.
  5. Bereiten Sie CSE vor.
    1. Blasen Sie eine Zigarette durch 12,5 ml Differenzierungsmedium und filtrieren Sie sie dann durch einen 0,22 μm Porenfilter, um CSE zuzubereiten. Um die Standardisierung zwischen Experimenten und CSE-Chargen zu gewährleisten, messen Sie die Extinktion bei 320 nm mit einem Spektralphotometer und definieren Sie die optische Dichte (OD) von 1 als 100 %8.
  6. Verwenden Sie das Differenzierungsmedium, das eine angemessene Konzentration an CSE enthält, um primäre murine Atemwegsepithelzellen zu stimulieren und Auswirkungen auf die Differenzierung der Zellen zu erkennen.
  7. Lassen Sie die Zellen 28 Tage lang differenzieren, während derer das Basalkammermedium gewechselt und die apikale Seite zweimal pro Woche gewaschen wird, indem Sie das apikale Kammermedium entfernen und das Basalkammermedium durch das Differenzierungsmedium ersetzen, das die entsprechende CSE-Konzentration enthält.
  8. Analysieren Sie die Zellen nach der Exposition.
    1. Nach der Exposition gegenüber einem CSE-haltigen Differenzierungsmedium sind die Zellen und die Kulturüberstände zu einem beliebigen Zeitpunkt (d. h. 0-28 Tage) zum Nachweis morphologischer Veränderungen (z. B. Immunfluoreszenz-Assay (IFA) oder Hämatoxylin-Eosin-Färbung (HE)) oder für bioinformatische Analyseverfahren (z. B. Transkriptomik, Proteomik, Metabolomik usw.) zu ernten.

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Ergebnisse

Differenzierung
Die Epithelzellen der murinen Atemwege differenzierten sich erfolgreich, nachdem sie 28 Tage lang an einer Luft-Flüssig-Grenzfläche mit einem Differenzierungsmedium kultiviert worden waren. Das Vorhandensein von Flimmer- und Becherzellen wurde durch Immunfluoreszenz-Assay des Zilienmarkers acetyliertes α-Tubulin nachgewiesen (grün; Abbildung 3A) bzw. der Becherzellmarker Mucin5AC6 (rot; Abbildung 3B).

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Diskussion

COPD ist eine häufige chronische Entzündungserkrankung der Atemwege. Die Exposition gegenüber Tabakrauch führt zu chronischen Entzündungen der Atemwege, einem Umbau der Atemwege und einer strukturellen Zerstörung der Lunge, die das Ergebnis des Zusammenspiels verschiedener Strukturzellen und Immunzellen ist10. Als Frontlinie des angeborenen Immunsystems in der Lunge spielen Epithelzellen der Atemwege eine sehr wichtige Rolle bei der Entwicklung der Krankheit11. Vor diesem G...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (82090013) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
100x Penicillin/Streptomycin LösungGibco15140122
24 mm Transwell mit 0,4 &; Mikro; m Pore Polyester Membraneinlage, sterilBIOFILTCS016012
40 & micro; m Cell StrainerFalcon352340
500x Gentamicin/Amphotericin LösungGibcoR01510
acetyliert α-TubulinCST#5335
Acetyl-α-Tubulin (Lys40) (D20G3)XP Kaninchen mAb cellsignal#5335
Dissoziationskit für tierische Komponenten ohne ZelldissoziationStammzelle05426
Anti-Pan-Cytokeratin-Antikörperabcamab7753
ZigaretteMarlboro
Claudin3ImmunowayYT0949
Desoxyribonuklase I aus der Bauchspeicheldrüse des RindersSigma-AldrichDN25
Desoxyribonuklas I aus der Bauchspeicheldrüse des RindersSigmaDN25
Schinken" s F-12Sigma-AldrichN6658
Heparin-Lösung Stammzelle07980
Hydrocortison StammlösungStammzelle 07925
Mucin 5ACabcamab212636
Occludinproteintech27260-1-AP
PBSCytosciCBS004S-BR500
Penicillin-Streptomycin-LösungGibco15140122
PneumaCult-ALI
Basalmedium		Stammzelle05002 
PneumaCult-ALI 10x NahrungsergänzungsmittelStammzelle05003 
PneumaCult-ALI ErhaltungszusatzStammzelle05006
PneumaCult-Ex Plus 50x NahrungsergänzungsmittelStammzelle05042
PneumaCult-Ex Plus BasalmediumStammzelle05041
Pronase ESigma-AldrichP5147
Rattenschwanz KollagenCorning354236
Trypan BlauStammzelle07050 

Referenzen

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