Method Article

In vitro Modell zur Untersuchung der Differenzierung und Veränderung von Multi-Omics an murinen Atemwegsepithelzellen, die mit Zigarettenrauchextrakt stimuliert wurden

DOI:

10.3791/67057

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July 12th, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology, School of Basic Medical Sciences, Capital Medical University, 2Department of Pulmonary and Critical Care Medicine, Center of Respiratory Medicine, China-Japan Friendship Hospital, 3National Center for Respiratory Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dieser Arbeit beschreiben wir ein in vitro Modell zur Isolierung und Differenzierung von murinen Atemwegsepithelzellen, wobei der Schwerpunkt auf ihrer Akklimatisierung an chronischen Zigarettenrauchextrakt (CSE) liegt. Das Modell könnte verwendet werden, um die Multi-Omics-Auswirkungen von CSE umfassend zu charakterisieren, was möglicherweise Einblicke in die zellulären Reaktionen unter chronischer Rauchbelastung liefert.

Abstract

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Die chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD) wird weitgehend auf die Exposition gegenüber Tabakrauch zurückgeführt. Die Untersuchung, wie sich Epithelzellen der Atemwege funktionell an Tabakrauch anpassen, ist entscheidend für das Verständnis der Pathogenese von COPD. In der vorliegenden Studie wurde ein in vitro-Modell mit primären Epithelzellen der Maus erstellt, um die Auswirkungen von Tabakrauch in der Praxis nachzuahmen. Im Gegensatz zu etablierten Zelllinien behalten Primärzellen eher in vivo-ähnliche Eigenschaften bei, einschließlich Wachstumsmuster, Alterung und Differenzierung. Diese Zellen weisen eine empfindliche Entzündungsreaktion und eine effiziente Differenzierung auf und bilden somit die physiologischen Bedingungen genau ab. In diesem Modell wurden primäre murine Atemwegsepithelzellen 28 Tage lang unter einer Luft-Flüssig-Grenzfläche mit einer optimalen Konzentration an Zigarettenrauchextrakt (CSE) kultiviert, was zur Umwandlung einer Monoschicht undifferenzierter Zellen in ein pseudostratifiziertes Säulenepithel führte, was auf eine CSE-Akklimatisierung hinweist. Umfassende Multi-Omics-Analysen wurden dann angewendet, um die Mechanismen aufzuklären, durch die CSE die Differenzierung der basalen Atemwegszellen beeinflusst. Diese Erkenntnisse ermöglichen ein tieferes Verständnis der zellulären Prozesse, die dem Fortschreiten der COPD als Reaktion auf Tabakrauch zugrunde liegen.

Introduction

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Die chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD) ist eine heterogene Lungenerkrankung mit komplexen Merkmalen, wobei Patienten mit COPD nach und nach jünger werden1. Rauchen, ein primärer Risikofaktor für COPD2, hat einen tiefgreifenden Einfluss auf die Epithelzellen der Atemwege, die als Ausgangsbarriere gegen Tabakrauch dienen. Trotz dieses bekannten Zusammenhangs sind die detaillierten Mechanismen, durch die Tabakrauch Veränderungen in den Epithelzellen der Atemwege hervorruft, nach wie vor unzureichend erforscht. Ein gründliches Verständnis dieser molekularen Veränderungen ist unerlässlich, um frühe diagnostische Marker und therapeutische Ziele für COPD zu identifizieren.

Um diese Lücke zu schließen, haben wir ein neuartiges in vitro-Modell mit murinen Atemwegsepithelzellen entwickelt. Diese Zellen wurden einer Langzeitstimulation mit Zigarettenrauchextrakt (CSE) unterzogen, was es uns ermöglichte, dynamische zelluläre Veränderungen zu beobachten und die Veränderungen in den Epithelzellen der Atemwege unter langfristiger Tabakstimulation und den zugrunde liegenden Mechanismus zu untersuchen. In diesem Modell wurde Transwell verwendet, um die Luft-Flüssig-Grenzfläche von Epithelzellen der Atemwege bereitzustellen, und Zigarettenrauchextrakt wurde im frühen Stadium der Epithelzelldifferenzierung bis zum Ende der Differenzierung nach 28 Tagen stimuliert. Frühere Studien untersuchten nur die Differenzierung und kurzfristige Stimulation von Epithelzellen der Atemwege (Zellliniendominanz). Sie waren auf einen einzigen Regulationsweg beschränkt 3,4,5,6. Das hier vorgestellte Protokoll verwendet jedoch primäre Atemwegsepithelzellen der Maus und optimiert den Zellextraktionsprozess für eine bessere Zellaktivität als frühere Epithelzellkulturmethoden der Atemwege. Dieses Modell konzentriert sich auf Veränderungen in der zellulären Differenzierung neben umfassenden transkriptomischen, proteomischen, metabolomischen und epigenomischen Analysen. Mit Hilfe von Immunfluoreszenz und fortschrittlichen Multi-Omics-Techniken wollten wir die zellulären Reaktionen von Atemwegsepithelzellen auf chronische Tabakrauchexposition aufklären und so zu einem tieferen Verständnis der COPD-Pathogenese beitragen. Dieses Modell kann verwendet werden, um die Veränderungen im Differenzierungsmuster der Epithelzellen der Atemwege und deren Mechanismus zu untersuchen, die durch die langfristige Stimulation verschiedener Schadstoffe verursacht werden.

Protocol

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Das Gesamtprotokoll erfordert 44 Tage, davon 1 Tag für die Präparation von Atemwegsepithelzellen, die aus murinen Luftröhren isoliert wurden, 15 Tage für die Zellproliferation und 28 Tage für die CSE-Stimulation an der Luft-Flüssig-Grenzfläche. Alle Versuchstiere sind im SPF Barrier Animal Room des Tierversuchszentrums der Capital Medical University untergebracht und wurden von der Ethikkommission für Tierversuche und Labortiere der Capital Medical University (AEEI-2020-100) überprüft und genehmigt, um die Anforderungen der ANARRIVE-Richtlinien7 zu erfüllen.

1. Isolierung von primären murinen Atemwegsepithelzellen aus murinen Luftröhren

  1. Präparat
    1. Bereiten Sie das vollständige Expansionsmedium vor, indem Sie 1 ml 50x Supplement und 0,05 mL Hydrocortison-Stamm mit 48,95 mL Basalmedium kombinieren. Bei 4 °C lagern und innerhalb von 4 Wochen verbrauchen.
    2. Lösen Sie 7,5 mg Proteinase und 5 mg Desoxyribonuklease I in 5 ml Ham's F-12, um eine Proteinaselösung herzustellen. Zum Sterilisieren filtrieren und bei 4 °C lagern und innerhalb von 4 Wochen verbrauchen.
    3. Bereiten Sie Antibiotikalösungen vor, indem Sie 0,05 ml 100x Penicillin/Streptomycin und 0,01 ml 500x Gentamicin/Amphotericin zu 5 ml vollständigem Expansionsmedium, PBS und Proteinaselösung (100 U/ml Penicillin, 100 U/ml Streptomycin, 10 μg/ml Gentamicin und 0,25 μg/ml Amphotericin B) hinzufügen. Bei 4 °C lagern und innerhalb von 4 Wochen verbrauchen.
    4. Sterilisieren Sie chirurgische Instrumente und bereiten Sie die biologische Sicherheitswerkbank für die Zellisolierung vor. Stellen Sie gleichzeitig sicher, dass die Standard-Zellkulturgeräte einsatzbereit sind.
    5. Bereiten Sie mit Rattenschwanzkollagen beschichtete Schalen zu, indem Sie Rattenschwanzkollagen (100 μg/ml in 0,02 N Essigsäure) in 100-mm-Kulturschalen und 24-mm-Transwells (0,05 ml/cm2) geben. Zur Sterilisation über Nacht unter UV-Licht offen lassen.
  2. Isolierung von primären murinen Atemwegsepithelzellen
    1. Verwenden Sie C57BL/6-Mäuse (6-8 Wochen alt, männlich, SPF-erhöht) für die Isolierung von Trachealepithelzellen. Euthanasieren Sie mit einer Überdosierung von 1% Pentobarbital-Natriumlösung (ca. 200 mg/kg). Verwenden Sie fünf Mäuse für eine ausreichende Zellausbeute.
    2. Sterilisieren Sie die Maus durch Eintauchen in 75%ige Ethanollösung und tauchen Sie Nase und Mund nicht in Alkohol, um zu verhindern, dass Alkohol in die Luftröhre fließt.
    3. Sezieren Sie die Maus.
      1. Verwenden Sie chirurgische Klingen und Pinzetten, einen Satz Geräte zum Schneiden und Öffnen der Epidermis vom Unterkiefer bis zur Bauchhöhle der Maus.
      2. Verwenden Sie ein weiteres chirurgisches Instrumentarium, um die Schilddrüse auf beiden Seiten auseinander zu reißen und die Verbindungen zwischen der Luftröhre, dem umgebenden Muskelgewebe und der Speiseröhre zu entfernen.
      3. Schneiden Sie danach vorsichtig in die Brust, dringen Sie mit einer Zange tiefer in die Brusthöhle ein, nehmen Sie die gesamte Lunge heraus und finden Sie das Ende der Luftröhre.
    4. Verarbeiten Sie die Luftröhre.
      1. Schneiden Sie die Luftröhre vom Schilddrüsenknorpel bis zum tracheobronchialen Ast heraus und legen Sie sie in ein vorkaltes Expansionsmedium, das vier Antibiotika enthält.
      2. Schütteln Sie den Schlauch, um so viel Blut wie möglich von der Oberfläche der Luftröhre zu spülen, halten Sie ihn auf Eis und beginnen Sie dann mit der Operation für die nächste Maus.
    5. Übertragen Sie alle gesammelten Luftröhren zur Vorbehandlung vor der Verdauung in einen vorkalten PBS-Puffer, der vier Antibiotika (200 μg/ml Penicillin, 200 μg/ml Streptomycin, 20 μg/ml Gentamicin und 0,5 μg/ml Amphotericin B) enthält.
    6. Verwenden Sie einen Satz chirurgischer Instrumente, um Gerinnsel und anderes Gewebe von den Oberflächen der Luftröhre zu entfernen, und schneiden Sie sie dann in eine Größe von 1 cm2 .
    7. Inkubieren Sie das Trachealgewebe in Proteinaselösung bei 37 °C für 40 Minuten.
    8. Nach 40 min schütteln Sie das Röhrchen mehrmals und verwenden Sie ein 40 μm Zellsieb, um das restliche Gewebe zu entfernen. Die gehackten Luftröhren werden auf einem Sieb mit 5 ml Expansionsmedium gespült, die Zellsuspension bei 400 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand verworfen.
    9. Resuspendieren Sie die erhaltenen Zellen in 8 ml Expansionsmedium.
    10. Zählen Sie die lebensfähigen Zellen mit Trypanblau und einem Hämozytometer.
    11. P0-Zellsuspension auf 100-mm-Schalen (1 x 104 lebende Zellen/cm 2) mit Rattenschwanzkollagen vorbeschichtet und die Zellen in einem Inkubator bei 37 °C, 5 % CO2 kultivieren.

2. Expansionskultur und Passage von primären murinen Atemwegsepithelzellen

  1. Tauschen Sie das Medium für die P0-Zellkultur alle 3 Tage aus, bis die Zellen eine Konfluenz von 70 % bis 80 % erreicht haben, normalerweise innerhalb von 6 Tagen. Zu diesem Zeitpunkt können murine Trachealepithelzellen eine intakte Monoschicht mit einem Kopfsteinpflaster-Aussehen bilden (Abbildung 1A-D).
  2. Ausreichende Mengen PBS, vollständiges Expansionsmedium und tierkomponentenfreies (ACF) Zelldissoziationskit auf 37 °C vorwärmen.
  3. Spülen Sie die Zellen vorsichtig mit 3 ml PBS.
  4. Führen Sie eine enzymatische Dissoziation durch.
    1. 3 mL enzymatische ACF-Dissoziationslösung in die Schale geben und 5 Minuten lang bei 37 °C inkubieren. Nach dem Pipettieren die Zellen vorsichtig entfernen und die Zellsuspension in 3 ml ACF-Enzymhemmungslösung überführen.
    2. Wiederholen Sie die Zugabe von 3 ml enzymatischer ACF-Dissoziationslösung und inkubieren Sie erneut 5 Minuten lang, um eine maximale Zellablösung zu gewährleisten.
  5. Die Zellsuspension bei 400 x g für 5 min bei 4 °C schleudern. Entsorgen Sie den Überstand.
  6. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml Expansionsmedium.
  7. Zählen Sie die lebensfähigen Zellen mit Trypanblau und einem Hämozytometer.
  8. P1-Zellsuspension auf mehreren 100-mm-Schalen (5 x 104 lebende Zellen/cm 2) mit Rattenschwanzkollagen vorbeschichtet und die Zellen in einem Inkubator bei 37 °C, 5 % CO2 kultivieren.

3. Differenzierung und CSE-Stimulation von primären murinen Atemwegsepithelzellen an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche

  1. Bestätigen Sie den Zelltyp.
    1. Verifizieren Sie den epithelialen Ursprung isolierter Zellen mit einem Immunfluoreszenz-Assay (IFA) mit Antikörpern gegen Cytokeratine. Samenzellen auf Objektträgern, die mit Rattenschwanzkollagen beschichtet sind, und verwenden Paraformaldehyd, um sie für mindestens 12 Stunden zu fixieren, nachdem die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreicht haben.
    2. Waschen Sie die Objektträger 3 Mal 5 Minuten lang mit PBS-Lösung und inkubieren Sie sie mit 3 % BSA und 0,1 % Triton X-100 in PBS-Lösung bei Raumtemperatur (RT) für 1 h.
    3. Die Objektträger werden über Nacht bei 4 °C mit handelsüblichen Anti-Pan-Cytokeratin-Antikörpern in einer Verdünnung von 1:500 inkubiert.
    4. Am nächsten Tag die Objektträger 3 Mal 5 Minuten lang mit PBS-Lösung waschen und mit sekundärem Antikörperpuffer in einer Verdünnung von 1:1000 bei RT für 2 h im Dunkeln inkubieren.
    5. Nach der Inkubation die Objektträger 3 Mal mit PBS waschen (5 min pro Waschgang) und DAPI in einer Verdünnung von 1:1000 hinzufügen. Nach der Inkubation bei RT für 15 min die Objektträger einmal mit PBS für 5 min waschen.
    6. Betrachten Sie Objektträger unter einem Fluoreszenzmikroskop und vergleichen Sie die Expressionsmuster mit einer Positivkontrolle (A549-Zelllinie) und einer Negativkontrolle (Raw264.7-Zelllinie) (Abbildung 2).
  2. Säen Sie die Zellen für die Differenzierung aus.
    1. Die P2-Zellen werden wie zuvor beschrieben abgenommen und zentrifugiert, und das Zellpellet wird in einem geeigneten Volumen des Expansionsmediums resuspendiert, um die Beschichtung von 1 x 104 lebenden Zellen/cm2 zu erleichtern.
    2. Pipettieren Sie 1 ml Zellsuspension in die apikale Kammer des Transwell-Polycarbonat-Membraneinsatzes. In das basale Kompartiment des Transwells werden 1,5 ml Proliferationsmedium gegeben.
  3. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und wechseln Sie alle 3 Tage das gesamte Medium in der basalen und apikalen Kammer mit dem Expansionsmedium, bis die Konfluenz erreicht ist. Dies dauert in der Regel 3-6 Tage.
  4. Bereiten Sie 50 ml vollständiges Differenzierungsmedium vor, indem Sie 5 ml ALI 10x Supplement, 500 μl ALI Maintenance Supplement, 100 μl Heparinlösung und 250 μl Hydrocortison-Stammlösung zu 44,15 mL ALI Basalmedium hinzufügen.
  5. Bereiten Sie CSE vor.
    1. Blasen Sie eine Zigarette durch 12,5 ml Differenzierungsmedium und filtrieren Sie sie dann durch einen 0,22 μm Porenfilter, um CSE zuzubereiten. Um die Standardisierung zwischen Experimenten und CSE-Chargen zu gewährleisten, messen Sie die Extinktion bei 320 nm mit einem Spektralphotometer und definieren Sie die optische Dichte (OD) von 1 als 100 %8.
  6. Verwenden Sie das Differenzierungsmedium, das eine angemessene Konzentration an CSE enthält, um primäre murine Atemwegsepithelzellen zu stimulieren und Auswirkungen auf die Differenzierung der Zellen zu erkennen.
  7. Lassen Sie die Zellen 28 Tage lang differenzieren, während derer das Basalkammermedium gewechselt und die apikale Seite zweimal pro Woche gewaschen wird, indem Sie das apikale Kammermedium entfernen und das Basalkammermedium durch das Differenzierungsmedium ersetzen, das die entsprechende CSE-Konzentration enthält.
  8. Analysieren Sie die Zellen nach der Exposition.
    1. Nach der Exposition gegenüber einem CSE-haltigen Differenzierungsmedium sind die Zellen und die Kulturüberstände zu einem beliebigen Zeitpunkt (d. h. 0-28 Tage) zum Nachweis morphologischer Veränderungen (z. B. Immunfluoreszenz-Assay (IFA) oder Hämatoxylin-Eosin-Färbung (HE)) oder für bioinformatische Analyseverfahren (z. B. Transkriptomik, Proteomik, Metabolomik usw.) zu ernten.

Results

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Differenzierung
Die Epithelzellen der murinen Atemwege differenzierten sich erfolgreich, nachdem sie 28 Tage lang an einer Luft-Flüssig-Grenzfläche mit einem Differenzierungsmedium kultiviert worden waren. Das Vorhandensein von Flimmer- und Becherzellen wurde durch Immunfluoreszenz-Assay des Zilienmarkers acetyliertes α-Tubulin nachgewiesen (grün; Abbildung 3A) bzw. der Becherzellmarker Mucin5AC6 (rot; Abbildung 3B).

Bestimmung der CSE-Konzentration für die Zelldifferenzierung
Stimulieren Sie die isolierten Epithelzellen mit unterschiedlichen CSE-Konzentrationen für 24 h. Die Ergebnisse zeigten, dass die Lebensfähigkeit der Epithelzellen abnahm, wenn die CSE-Konzentration höher als 6% war (p <0,05, Abbildung 4A). Um die Zellaktivität unter langfristiger Stimulation aufrechtzuerhalten, wurden Kultursubstrate mit 2%, 4% und 6% CSE verwendet, um die Differenzierung der Epithelzellen für 28 Tage zu stimulieren. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse, dass es mit dem Anstieg der CSE-Konzentration keinen signifikanten Zelltod in den Epithelzellen gab (Abbildung 4B), sondern eine allmähliche Veränderung der Anzahl der interzellulären Transmembranresistenz (TEER) (Abbildung 4C) und der exfoliierten Zellen (Abbildung 4D). Darüber hinaus wurde eine allgemeine Verringerung der differenzierten Zellen und Flimmerzellen festgestellt, wenn murine Atemwegsepithelzellkulturen chronisch CSE ausgesetzt waren (Abbildung 4E-H). Daher wurde das Differenzierungsmedium mit 6% CSE gewählt, um die epitheliale Barrierefunktion zu dysregulieren und die Anzahl der Flimmerzellen zu reduzieren, ohne die Zellviabilität zu verringern, während die Epithelzellen 28 Tage lang differenziert wurden.

Multi-Omics-Analyse
Zwei Gruppen der Zellen, die 28 Tage lang mit einem Differentialmedium mit 0 % oder 6 % CSE stimuliert wurden, wurden geerntet. Die Gesamt-mRNA wurde für die Transkriptomik-Analyse extrahiert. Nach der Vorbereitung der Bibliothek, der Sequenzierung, der Qualitätskontrolle, der Zuordnung der Reads zum Referenzgenom und der Quantifizierung der Genexpression wurde die differentielle Expression von Genen zwischen den beiden Gruppen analysiert. Das clusterProfiler R-Paket wurde verwendet, um eine Anreicherungsanalyse der Gene Ontology (GO) für Gene durchzuführen, die eine differentielle Expression zeigten, wobei Anpassungen vorgenommen wurden, um Genlängendiskrepanzen zu berücksichtigen (Abbildung 5A). Die Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) dient als umfassende Datenbank, die das Verständnis komplexer biologischer Systemfunktionalitäten und -rollen auf verschiedenen Ebenen, einschließlich zellulärer, organismischer und ökologischer, erleichtert, indem Daten auf molekularer Ebene integriert werden, die aus umfangreichen Datensätzen stammen, wie sie z. B. durch Genomsequenzierung und experimentelle Hochdurchsatzmethoden gewonnen wurden (Abbildung 5B). Für die Proteomik wurden Gesamtproteine aus zwei Zellgruppen 28 Tage nach Kulturen mit differentiellen Medien mit 0 % oder 6 % CSE extrahiert. Nach dem Proteinqualitätstest, der Salzentfernung, der enzymatischen Hydrolyse des Proteins, der Markierung von Peptiden mit Tandem-Mass-Tags (TMT), der Trennung von Fraktionen, der LC-MS-Analyse, der Proteinidentifizierung und der Proteinquantifizierung können differentiell exprimierte Proteine zwischen zwei Gruppen definiert werden. Die GO-Analyse wurde mit dem Interproscan-Programm gegen die nicht-redundante Proteindatenbank durchgeführt (Abbildung 6A), und KEGG wurde verwendet, um den Signalweg zu analysieren (Abbildung 6B). Für die Metabolomik wurden die Kulturüberstände aus zwei Gruppen von Atemwegsepithelzellen 28 Tage nach Kulturen mit einem Differenzierungsmedium mit 0 % oder 6 % CSE entnommen. Nach der HPLC-MS/MS-Analyse, Identifizierung und Quantifizierung der Metaboliten können die Differentialmetaboliten zwischen den beiden Gruppen definiert werden. Zur Annotation aller Metaboliten wurden die KEGG-Datenbank (Abbildung 7A), die Humanmetabolom-Datenbank (Abbildung 7B) und die Lipidmaps-Datenbank (Abbildung 7C) verwendet. Die KEGG-Datenbank wurde verwendet, um die Funktionen dieser Differentialmetaboliten und Stoffwechselwege zu analysieren (Abbildung 7D). Für die Epigenomik wurde ATAC-seq wie zuvor berichtet durchgeführt9. Die Zellkerne wurden 28 Tage nach der Kultur aus zwei Zellgruppen mit einem Differentialmedium mit 0 % oder 6 % CSE extrahiert, und das Kernpellet wurde in der Tn5-Transposase-Reaktionsmischung resuspendiert. Die Transpositionsreaktion wurde bei 37 °C für 30 min inkubiert. Nach dem Hinzufügen eines Adapters, der Bibliotheksvorbereitung, der Qualitätsbewertung, des Clusterings und der Sequenzierung kann eine differentielle Epigenomik zwischen zwei Gruppen definiert werden. Die GO-Anreicherungsanalyse von differentiell Peak-bezogenen Genen spiegelt direkt die Anzahlverteilung von differentiell Peak-bezogenen Genen in GO-Items wider, die in biologischen Prozessen, zellulären Komponenten und molekularen Funktionen angereichert sind (Abbildung 8A). Die KEGG-Datenbank wurde verwendet, um die Funktionen dieser differentiellen Gene und Signalwege zu analysieren (Abbildung 8B).

Gene, die für Tight-Junction-Proteine kodieren
Transkriptomische Daten zeigten, dass nach langfristiger Stimulation von CSE die Expression zahlreicher Gene, die für Tight-Junction-Proteine kodieren, vermindert war, darunter Cgn, Cldn2, Cldn3, Cldn8, Cldn10, Cldn20, Cldn23, Jam2 und Ocln (Abbildung 9A), wobei eine verminderte Expression von Cldn3 und Ocln durch Western-Blot und Immunhistochemie (IHC) weiter bestätigt wurde (Abbildung 9B-E). Diese Daten deuten darauf hin, dass die Exposition gegenüber CSE die Expression von Tight-Junction-Proteinen von Epithelzellen der Atemwege deutlich reduziert.

Zytokin- und Chemokinexpression
Neben dem Zusammenbruch enger Verbindungen zeigte die Transkriptomik auch, dass nach langfristiger Stimulation von CSE die Expression einiger Zytokine und Chemokine, einschließlich Cxcl5, Csf3, Il1a, Il34, Ccl20 und Il33, zunahm, aber die Expression von Ccl5 abnahm (Abbildung 10A). Der Luminex-Test bestätigte ferner, dass es erhöhte Konzentrationen von CXCL-5, CSF-3 und IL-1α (Abbildung 10B-D), aber verringerte CCL-5 (Abbildung 10E) im Überstand von murinen Atemwegsepithelzellen gab. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Exposition gegenüber CSE selektiv auf die Expression von Zytokinen und Chemokinen wirkt.

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Abbildung 1: Wachstum von primären murinen Atemwegsepithelzellen. (A) Neu isolierte Zellen erscheinen rund und transparent. (B) Am Tag 2 nach der Isolierung bildeten sich die expandierten Zellen zu kleinen Zellinseln. (C) Bis zum 4. Tag die Bildung größerer Zellinseln. (D) Bis zum 6. Tag über 90 % Fusion mit der Kopfsteinpflastermorphologie. (4-fache Vergrößerung; Maßstab: 250 μm). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Immunfluoreszenz-Assay von Epithelzellmarkern. Cytokeratin-Expression in primären murinen Atemwegsepithelzellen, A549 (Positivkontrolle) und Raw264.7 (Negativkontrolle). Zellkerne, die mit DAPI gefärbt wurden (63-fache Vergrößerung; Maßstabsbalken: 40 μm). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Immunfluoreszenz-Assay für Marker von Flimmer- und Becherzellen. Die verwendeten Marker waren acetyliertes (A) α-Tubulin und (B) Mucin 5AC zur Bestätigung von Zilienzellen bzw. Becherzellen (100-fache Vergrößerung; Maßstabsbalken: 10 μm in Panel A und 50 μm in Panel B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Einfluss der CSE-Konzentrationen auf Epithelzellen. (A) Zellviabilität nach 24 Stunden bei unterschiedlichen CSE-Konzentrationen. (B) Zellviabilität nach 28 Tagen. (C) TEER-Messung. (D) Anzahl der exfolierten Zellen. (E-H) Immunfluoreszenz für Flimmerzellen (grün) und Becherzellen (violett) bei 0 %, 2 %, 4 % und 6 % CSE-Konzentrationen (20-fache Vergrößerung; Maßstabsbalken: 50 μm). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: GO- und KEGG-Anreicherungsanalysen für die Genexpression. (A) Bedeutung des GO-Begriffs in angereicherten biologischen Prozessen, zellulären Komponenten und molekularen Funktionen. (B) Anteil differentiell exprimierter Gene in KEGG-Signalwegen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 6: Analyse der Proteinexpression. (A) GO-Anreicherungsbalkendiagramm, das die differentielle Proteinexpression zeigt. (B) Analyse des KEGG-Signalwegs auf der Grundlage differentiell exprimierter Proteine. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 7: Analyse des Metaboliten-KEGG-Signalwegs. (A) Annotation aller Metaboliten unter Verwendung der KEGG-Datenbank. (B) Annotation aller Metaboliten unter Verwendung der Human Metabolome Database. (C) Annotation aller Metaboliten unter Verwendung der Lipidmaps-Datenbank. (D) Die Verteilung differentiell exprimierter Metaboliten in verschiedenen KEGG-Signalwegen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 8: Differentielle Peak-bezogene Genexpressionsanalyse. (A) GO-Anreicherungsbalkendiagramm, das die differentielle Proteinexpression zeigt. (B) Analyse des KEGG-Signalwegs auf der Grundlage differentiell exprimierter Proteine. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 9: Expression von Tight Junction Protein in murinen Atemwegsepithelzellen mit oder ohne CSE-Stimulation. (A) Heatmap der Tight Junction Proteinexpression im Transkriptom. (B-E) Die Expressionsniveaus von (B,C) Cldn3 und (D,E) Ocln in murinen Atemwegsepithelzellen wurden mittels Western Blot und Immunhistochemie für Cldn3 und Ocln nachgewiesen (80-fache Vergrößerung; Maßstabsbalken: 50 μm). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 10: Analyse der Zytokinexpression. (A) Transkriptom-Heatmap der Zytokinexpression. (B-E) Luminex-Assay für CXCL-5-, CSF-3-, IL-1α- und CCL-5-Spiegel in Zellen mit/ohne CSE-Stimulation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

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COPD ist eine häufige chronische Entzündungserkrankung der Atemwege. Die Exposition gegenüber Tabakrauch führt zu chronischen Entzündungen der Atemwege, einem Umbau der Atemwege und einer strukturellen Zerstörung der Lunge, die das Ergebnis des Zusammenspiels verschiedener Strukturzellen und Immunzellen ist10. Als Frontlinie des angeborenen Immunsystems in der Lunge spielen Epithelzellen der Atemwege eine sehr wichtige Rolle bei der Entwicklung der Krankheit11. Vor diesem Gesichtspunkt ist die Aufklärung, wie sich Epithelzellen unter der Stimulation durch Schadstoffe verändern und die nachgeschalteten Zellen regulieren, ein wissenschaftliches Problem, das dringend gelöst werden muss.

In jüngster Zeit wurden mehrere Tiermodelle von COPD berichtet, die einige Einschränkungen überwunden haben12. In diesen Modellen können moderate Entzündungswerte der neutrophilen Atemwege, eine Th1/Th17-Entzündungssignatur, eine ausgeprägte Schleimhyperproduktion, ein erhöhter Umbau der Atemwege, eine verminderte Lungenfunktion und vergrößerte Lufträume beobachtet werden. Obwohl diese Modelle nur 1 Monat benötigen, um COPD-ähnliche Veränderungen zu etablieren, ist noch unklar, was bei den Mäusen passierte, die innerhalb eines Monats Zigarettenrauch ausgesetzt waren. Die Verwendung einer langfristigen CSE-Stimulation hat den Vorteil, dass sie leichter kalibriert werden kann, was bedeutet, dass Atemwegsepithelzellen so starken Zigarettenreizen wie möglich ausgesetzt werden können, ohne zu sterben, genau wie Atemwegsepithelzellen bei Rauchern. In diesem Fall ist die Überwachung dynamischer pathologischer Veränderungen, die zu Atemwegsentzündungen und der Bildung von Emphysemen führen, entscheidend für das weitere Verständnis der Pathogenese von COPD, die für das Rauchen relevant ist. Daher haben wir ein in vitro Modell zur Nachahmung des Rauchstatus etabliert und versucht, dynamische Veränderungen während der Exposition von CSE gegenüber Atemwegsepithelzellen zu überwachen. Darüber hinaus erleichtern relativ gereinigte Epithelzellen der Atemwege die Multi-Omics-Studie als die von ganzen Geweben, was uns helfen kann, die molekularen und zellulären Reaktionen in Atemwegsepithelzellen zu finden, die CSE ausgesetzt sind, und die Schlüsselwege und therapeutischen Ziele von COPD im Hochdurchsatz zu identifizieren.

Hier wurde das Protokoll, das die Isolierung von murinen Trachealepithelzellen beschreibt, von den Protokollen von Hilaire et al.13 und You et al.14 mit einigen Modifikationen adaptiert. In dem in dieser Studie verwendeten Protokoll wurden murine Atemwegsepithelzellen vermehrt und in eine pseudostratifizierte Struktur mit Flimmer- und Becherzellen unter Verwendung einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche und eines CSE-haltigen Mediums differenziert, wodurch ein chronisches CSE-Akklimatisierungsmodell etabliert wurde. Die folgenden Ereignisse sind die Kernpunkte des vorliegenden Modells.

In Anbetracht der Tatsache, dass eine zervikale Luxation den Hals mechanisch belasten und die Epithelzellen physisch schädigen könnte, und eine Chloralhydrat-Anästhesie auch die Atemwege beeinträchtigen könnte, wurde Pentobarbital-Natrium zur Euthanasie verwendet15. Bei chirurgischen Eingriffen an Mäusen könnte das Eintauchen nur des Halses und der unteren Bereiche, um zu verhindern, dass Alkohol in die Nase gelangt, die Lebensfähigkeit der Epithelzellen der Atemwege erhöhen16. Vorläufige Daten aus der vorliegenden Studie zeigten, dass Atemwegsepithelzellen, die einer trachealen Intubation oder Alkoholimmersion unterzogen wurden, eine geringe Lebensfähigkeit aufwiesen und sich nicht ausdehnen konnten. Um Epithelzellen der Atemwege ohne Erythrozyten zu erhalten, muss man außerdem bei chirurgischen Eingriffen darauf achten, eine Blutkontamination bei der Isolierung der Hauptatemwege zu vermeiden.

Selbst bei Mäusen, die frei von spezifischen Krankheitserregern sind, besiedelten die Atemwege signifikante Mikroben. Die Zugabe geeigneter Antibiotika in das Expansionsmedium von P0-primären murinen Atemwegsepithelzellen ist unerlässlich, um eine Kontamination durch bakterielle oder pilzliche Krankheitserreger zu vermeiden. Eine Cocktaillösung aus Penicillin, Streptomycin, Amphotericin B und Gentamicin17 gewährleistet effektiv die Expansion von P0-Atemwegsepithelzellen der Maus in einer sterilen In-vitro-Umgebung . Vorläufige Experimente zeigten, dass die P0-Epithelzellen der Atemwege vor der ersten Passage absterben, wenn die bakterielle Kontamination nicht wirksam gehemmt wird.

Bei den Aufschlussmethoden wurden sowohl 4 °C als auch 37 °C getestet. Die Ergebnisse vorläufiger Experimente zeigten, dass der Aufschluss bei 37 °C in Bezug auf Zeiteffizienz, Zellviabilität und Zellausbeute 4 °C übertraf.

Vor der Aussaat von Epithelzellen wurde Rattenschwanzkollagen in Essigsäure gelöst und für die Beschichtung von Kulturschalen verwendet, um die Adhäsion der Epithelzellen zu verbessern18. Die Dichte der Kollagenbeschichtung sollte jedoch weder zu hoch noch zu niedrig sein; Eine unzureichende Dichte bietet keine ausreichenden Adhäsionsbedingungen, während eine zu hohe Dichte zu kristallinen Rückständen auf der Kulturoberfläche führt.

Ein entscheidender Schritt besteht darin, mehr Epithelzellen am Leben zu erhalten und eine Kontamination mit Fibroblasten zu vermeiden. Um dies zu erreichen, empfehlen wir, dass 1) die Verwendung des tierfreien Zelldissoziationskits Epithelzellen schonend isolieren und unnötige Zellschäden reduzieren kann und 2) die Verwendung von Differentialmedium, das Hydrocortison enthält, das Wachstum von Fibroblasten hemmen und die Proliferation von Epithelzellen fördern kann.

Traditionelle subgetauchte Monolayer-Kulturen von Epithelzellen der Atemwege sind ein Grundnahrungsmittel in der Atemwegsforschung und in toxikologischen Studien. Diese Methoden sind jedoch nicht in der Lage, die differenzierten Eigenschaften von Epithelgeweben der Atemwege, wie sie in vivo gefunden werden, genau zu replizieren. Um diese Einschränkung zu beheben, haben wir uns für ein alternatives Epithelmodell der Atemwege entschieden. Dieses Modell basiert auf der Kultivierung von primären Atemwegszellen auf mikroporösen Membrangerüsten, wie sie von Transwell-Systemen bereitgestellt werden, an einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche19. Die Exposition der apikalen Oberfläche gegenüber der Umgebungsluft in diesem ALI-Kulturaufbau trägt maßgeblich zur Förderung der zellulären Differenzierung bei und ahmt dadurch die in vivo-Bedingungen besser nach20.

Wenn die Differenzierung nicht effektiv ist, ist es entscheidend, mögliche Gründe zu bewerten. Dies schließt die Möglichkeit ein, dass die Epithelzellen der Atemwege übermäßig passagiert wurden, was ihre Differenzierungsfähigkeit beeinträchtigen kann. Darüber hinaus ist es unbedingt erforderlich, dass die Ansammlung von Schleim und Flüssigkeit in der apikalen Kammer während des zweiwöchentlichen Medienaustauschs vollständig eliminiert wird, da der Restgehalt den Differenzierungsprozess behindern kann.

Obwohl dieses Modell gewisse Einschränkungen aufweist, bleibt es ein wertvolles Werkzeug für die Forschung. Eine Einschränkung besteht darin, dass die Verwendung eines CSE-haltigen Mediums zur Stimulation von Atemwegsepithelzellen möglicherweise nicht vollständig die In-vivo-Bedingungen repliziert, die die Atemwegsepithelzellen bei Rauchern erfahren. Darüber hinaus ist die Lebensfähigkeit differenzierter Flimmerepithelzellen in vitro in der Regel auf einen Monat begrenzt. Trotz dieser Einschränkungen integriert das Modell effektiv mehrere Schlüsselaspekte: Es erleichtert die Untersuchung der Differenzierung von Epithelzellen der Atemwege an der Grenzfläche zwischen Luft und Flüssigkeit, die langfristige Akklimatisierung an CSE und die Anwendung von Multi-Omics-Analysen über einen bestimmten Zeitrahmen. Dieser umfassende Ansatz bietet einen ausgefeilten und ganzheitlichen Rahmen für zukünftige Untersuchungen der physiologischen und pathologischen Mechanismen von Epithelzellen der Atemwege. Darüber hinaus hilft es bei der Identifizierung potenzieller Biomarker und therapeutischer Ziele für Atemwegserkrankungen. Wir hoffen, dass unsere Erfahrungen nützliche Informationen für diejenigen liefern werden, die dieses Modell für relevante Studien verwenden möchten.

Disclosures

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgements

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Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (82090013) unterstützt.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100x Penicillin/Streptomycin LösungGibco15140122
24 mm Transwell mit 0,4 &; Mikro; m Pore Polyester Membraneinlage, sterilBIOFILTCS016012
40 & micro; m Cell StrainerFalcon352340
500x Gentamicin/Amphotericin LösungGibcoR01510
acetyliert α-TubulinCST#5335
Acetyl-α-Tubulin (Lys40) (D20G3)XP Kaninchen mAb cellsignal#5335
Dissoziationskit für tierische Komponenten ohne ZelldissoziationStammzelle05426
Anti-Pan-Cytokeratin-Antikörperabcamab7753
ZigaretteMarlboro
Claudin3ImmunowayYT0949
Desoxyribonuklase I aus der Bauchspeicheldrüse des RindersSigma-AldrichDN25
Desoxyribonuklas I aus der Bauchspeicheldrüse des RindersSigmaDN25
Schinken" s F-12Sigma-AldrichN6658
Heparin-Lösung Stammzelle07980
Hydrocortison StammlösungStammzelle 07925
Mucin 5ACabcamab212636
Occludinproteintech27260-1-AP
PBSCytosciCBS004S-BR500
Penicillin-Streptomycin-LösungGibco15140122
PneumaCult-ALI
Basalmedium		Stammzelle05002 
PneumaCult-ALI 10x NahrungsergänzungsmittelStammzelle05003 
PneumaCult-ALI ErhaltungszusatzStammzelle05006
PneumaCult-Ex Plus 50x NahrungsergänzungsmittelStammzelle05042
PneumaCult-Ex Plus BasalmediumStammzelle05041
Pronase ESigma-AldrichP5147
Rattenschwanz KollagenCorning354236
Trypan BlauStammzelle07050 

References

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