Wir verwendeten die Zellproliferationsfärbung, um ruhende Zellen im Zebrafisch-T-Modell für akute lymphatische Leukämie zu identifizieren. Die Färbung wird in nicht teilenden Zellen zurückgehalten und während der Zellproliferation reduziert, was die Selektion ruhender Zellen für die weitere Befragung ermöglicht. Dieses Protokoll bietet ein funktionales Werkzeug, um die Selbsterneuerung im Kontext der zellulären Ruhe zu untersuchen.
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Methodenartikel
Identifizierung ruhender Zellen in einem Zebrafisch-T-Zell-Modell für akute lymphatische Leukämie mittels Zellproliferationsfärbung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Zelluläre Ruhe ist ein Zustand des Wachstumsstillstands oder der verlangsamten Proliferation, der bei normalen und Krebsstammzellen (CSCs) beschrieben wird. Quiescence kann CSCs vor antiproliferativen Chemotherapeutika schützen. In T-Zell-Mausmodellen für akute lymphatische Leukämie (T-ALL) mit patientenabgeleitetem Xenotransplantat (PDX) sind ruhende Zellen mit Behandlungsresistenz und Stammzellen assoziiert. Zellproliferationsfarbstoffe sind beliebte Werkzeuge zur Verfolgung der Zellteilung. Der Fluoreszenzfarbstoff ist kovalent in Amingruppen auf der Membran und Makromolekülen im Inneren der Zelle verankert. Dies ermöglicht die Verfolgung markierter Zellen für bis zu 10 Teilungen, die durch Durchflusszytometrie aufgelöst werden können.
Letztendlich haben Zellen mit den höchsten Proliferationsraten eine geringe Farbstoffretention, da sie bei jeder Zellteilung verdünnt wird, während ruhende, sich langsamer teilende Zellen die höchste Retention aufweisen. Die Verwendung von Zellproliferationsfarbstoffen zur Isolierung ruhender Zellen wurde in T-ALL-Mausmodellen optimiert und beschrieben. Ergänzend zu den bestehenden Mausmodellen bietet das rag2:Myc-abgeleitete Zebrafisch-T-ALL-Modell aufgrund der hohen Häufigkeit leukämischer Stammzellen (LSCs) und der Bequemlichkeit des Zebrafisches für groß angelegte Transplantationsexperimente einen hervorragenden Ort, um die Selbsterneuerung bei T-ALL zu untersuchen.
Hier beschreiben wir den Arbeitsablauf für die Färbung von Zebrafisch-T-ALL-Zellen mit einem Zellproliferationsfarbstoff, die Optimierung der Konzentration des Farbstoffs für Zebrafischzellen, die Passage erfolgreich gefärbter Zellen in vivo und die Entnahme von Zellen mit unterschiedlicher Farbstoffretention durch Sortierung von lebenden Zellen aus transplantierten Tieren. Angesichts des Fehlens gut etablierter Zelloberflächenhersteller für LSCs in T-ALL bietet dieser Ansatz ein funktionelles Mittel, um ruhende Zellen in vivo zu befragen. Für repräsentative Ergebnisse beschreiben wir die Transplantationseffizienz und die LSC-Häufigkeit von Zellen mit hoher und niedriger Farbstoffretention. Diese Methode kann helfen, zusätzliche Eigenschaften ruhender Zellen zu untersuchen, einschließlich des Wirkstoffansprechens, der Transkriptionsprofile und der Morphologie.
Einleitung
Adulte Stammzellen sind für die Regeneration differenzierter Zelltypen in einem bestimmten Organ verantwortlich und liegen überwiegend in einem ruhenden, sich nicht teilenden Zustand vor 1,2. So bleiben beispielsweise hämatopoetische Stammzellen (HSCs), die das Blut erhalten, weitgehend ruhig, und nur ein kleiner Teil gelangt in den Zellzyklus, um sich selbst zu erneuern oder zu differenzieren, um reife Blutbestandteile zu erzeugen3. In ähnlicher Weise besitzt bei Krebserkrankungen eine seltene Subpopulation von Zellen, die als Krebsstammzellen (CSCs) b....
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Protokoll
In diesem Protokoll verwenden wir GFP-markierte Zebrafisch-T-ALL-Zellen, die zuvor im CG1-Stamm erzeugt wurden und daher direkt in den syngenen CG1-Zebrafisch15 des Empfängers injiziert werden können. Kurz gesagt, Leukämie wurde durch DNA-Mikroinjektion von rag2:Myc und rag2:GFP in einzellige CG1-Zebrafischembryonen erzeugt. Die Tiere wurden ab 3 Wochen nach der Injektion mittels Fluoreszenzmikroskopie auf die Entwicklung von Leukämie überwacht. GFP-positive Leukämiezellen wurden FACS isoliert und seriell in den Empfänger-CG1-Zebrafisch transplantiert, um Klone mit einer hohen LSC-Häufigkeit zu erzeugen. Einzelheiten des gesam....
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Ergebnisse
Wir folgten dem oben beschriebenen Protokoll, um Zellen zu sortieren, die den Zellproliferationsfarbstoff CT-FR beibehalten haben, und verwendeten sie für einen Limiting Dilution Assay (LDA) zur Abschätzung der LSC-Häufigkeit in den CT-FR High- und CT-FR Low-Populationen. Um das Gating für das Durchflusszytometrie-Experiment einzustellen, verwendeten wir zusätzlich zu den einfarbigen Kontrollen eine Kontrolle ohne Fluorophor (ohne Farbe ) (Abbildung 2A). Diese Quadranten wur.......
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Diskussion
Es ist bekannt, dass LSCs resistent gegen konventionelle, antiproliferative Chemotherapien sind, und die Suche nach gezielten Therapien gegen diese Zellen ist vielversprechend, um das Auftreten von Rückfällen zu reduzieren und die Patientenprognose zu verbessern20. Frühere Forschungen beschrieben die Verwendung von fluoreszierenden Zellproliferationsfärbungen zur Identifizierung einer kleinen Population ruhender Zellen, die mit Arzneimittelresistenz und Stammzelle.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Danksagungen
Die Finanzierung dieser Forschung erfolgte durch das National Cancer Institute (R37CA227656 to JSB). Diese Forschung wurde auch durch die gemeinsamen Ressourcen für Durchflusszytometrie und Immunüberwachung des Markey Cancer Center (P30CA177558) der University of Kentucky unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 26 G/2" Mikrospritze | Hamilton | 87930 | NA |
| 35 & Mikrospritze; m Filterkappe FACS Schläuche | Falcon | 352235 | NA |
| 40 µ m Zellsieb | CELLTREAT | 229482 | NA |
| PCR-Platte mit 96-Well-Rand | Thermo Fisher Scientific | AB0800 | NA |
| Zellsortierer | Sony Biotechnology | SY3200 | NA |
| CellTrace Far Red | Thermo Fisher Scientific | C34564 | NA |
| Konische Röhrchen | VWR | 10026-078 | NA |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62248 | NA |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4818 | NA |
| Dulbecco'sPhosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Caisson Labs | 22110001 | NA |
| Epifluoreszenz-Stereomikroskop | Nikon | SMZ25 | NA |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Sigma-Aldrich | 12306C | NA |
| Fischsystem Wasser | N/A | N/A | 0,03-0,05 % Salzgehalt, pH 6,5-8, gepuffert mit Natriumbicarbonat |
| Mikrozentrifugenröhrchen | Thermo Fisher Scientific | C2171 | NA |
| MS-222 | Pentaire | TRS-1 | Tricainmesylat, ein Anästhetikum |
| Petrischalen | Corning | 07-202-011 | NA |
| Rasierklingen | American Line | 66-0089 | NA |
| Trypan Blue | Thermo Fisher Wissenschaftlich | T10282 | NA |
Referenzen
- Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
- Arai, F., et al. Tie2/angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche. Cell.
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Nachdrucke und Genehmigungen
