Eine modifizierte Modellpräparation für die Reperfusion des Verschlusses der mittleren Hirnarterie

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt den Prozess der Vorbereitung auf die Reperfusion des Verschlusses der mittleren Hirnarterie über die Arteria carotis communis.

Zusammenfassung

Das Modell der Reperfusion des Verschlusses der mittleren Hirnarterie (MCAO/R) ist entscheidend für das Verständnis der pathologischen Mechanismen des Schlaganfalls und für die Entwicklung von Medikamenten. Unter den häufig verwendeten Modellierungsmethoden wird die Koizumi-Methode jedoch häufig unter die Lupe genommen, da sie die Halsschlagader (CCA) ligiert und nicht in der Lage ist, eine angemessene Reperfusion zu erreichen. In ähnlicher Weise wurde die Longa-Methode dafür kritisiert, dass sie die Arteria carotis externa (ECA) trennt und ligiert. Diese Studie zielt darauf ab, eine modifizierte Modellvorbereitungsmethode einzuführen, die die Integrität der ECA bewahrt, das Einführen einer monofilen Nylonnaht durch die CCA, die Reparatur des ligierten CCA-Schnitts und die Aufrechterhaltung der Reperfusion aus der CCA beinhaltet. Die Reperfusion des Blutflusses wurde mit Hilfe der Laser-Speckle-Flow-Bildgebung bestätigt. Bewertungsmethoden wie die Longa-Skala, der Modified Neurological Severity Score, die Färbung von Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) und die Immunfluoreszenzmarkierung von Neuronen zeigten, dass dieser Ansatz eine stabile Schädigung des ischämischen Nervs induzieren kann. Dieses modifizierte MCAO/R-Modellprotokoll ist einfach und stabil und bietet Praktikern eine wertvolle Orientierungshilfe auf dem Gebiet der zerebralen Ischämie.

Einleitung

Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation ist der Schlaganfall in den letzten zehn Jahren die zweithäufigste Todesursache weltweit geblieben, mit einer hohen Inzidenzrate, einer hohen Sterblichkeit und einer hohen Behinderungsrate ^1,2. Mit der Alterung der Weltbevölkerung wird erwartet, dass die Inzidenz von Schlaganfällen in den Entwicklungsländern zunehmen wird und möglicherweise zur Hauptursache für vorzeitigen Tod und Behinderung bei Erwachsenen wird. Darüber hinaus gibt es einen Trend, dass Schlaganfälle in einem jüngeren Alter auftreten³ Jahre. Auch der Verlust der Erwerbsbevölkerung nach einem Schlaganfall stellt eine schwere Belastung für Familien und die Gesellschaft^{dar 4}. Daher stellt die Entwicklung sicherer und wirksamer Therapien eine große Herausforderung in der Schlaganfallforschung dar.

Tiermodelle dienen als wichtige Werkzeuge für die Untersuchung der Prävention und Behandlung menschlicher Krankheiten. Die erfolgreiche Umsetzung von Schlaganfallbehandlungsstrategien hängt von der Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit von Schlaganfall-Tiermodellen ab ^5,6. Die mittlere Hirnarterie (MCA) ist eine häufige Stelle für klinische Schlaganfälle, was das MCAO-Modell zum Modell macht, das dem menschlichen ischämischen Schlaganfall am nächsten kommt. Das MCAO-Modell, das mit der Nahtmethode hergestellt wurde, wurde von Forschern aufgrund von Vorteilen wie dem Fehlen eines Kraniotomie und der einfachen Kontrolle der ischämischen Zeit bevorzugt. Es wurde in über 40 % der neuroprotektiven Experimente eingesetzt⁷. Trotz seiner zahlreichen Vorteile bleiben die operationellen Details dieses Modells für viele Forscher ein umstrittenes Thema.

Beim Modell des nahtinduzierten Verschlusses der mittleren Hirnarterie (MCAO) erfolgt die Reperfusion durch Zurückziehen der Naht. Derzeit werden zwei Hauptmethoden für das Einführen von Nähten verwendet: Koizumis Methode⁸ und die Methode⁹ von Longa. Bei der Koizumi-Methode tritt die Naht hauptsächlich durch den Schnitt der Arteria carotis communis (CCA) in die Arteria carotis interna (ICA) ein, während sie bei der Longa-Methode durch die durchtrennte Arteria carotis externa (ECA) in die ICA gelangt. Während der Reperfusion erfordert die Koizumi-Methode eine dauerhafte Ligatur der CCA-Inzision und stützt sich für die Reperfusion auf den Willis-Kreis¹⁰. Einige Studien deuten jedoch darauf hin, dass eine effektive Reperfusion nicht allein durch die kompensatorische Versorgung des Willis-Kreises nach Verlust der CCA-Versorgung erreicht werden kann. Darüber hinaus weist der Willis-Kreis eine hohe anatomische Variabilität auf, insbesondere bei C57Bl/6-Mäusen, was die Infarktvariabilität erhöht und die Zuverlässigkeit der experimentellen Daten verringert. Infolgedessen wurde diese Methode von Forschern zunehmend in Frage gestellt¹¹.

Bei der Longa-Methode wird eine Naht durch die durchtrennte ECA eingeführt und dann die Arteria carotis interna (ICA) dauerhaft ligiert, sobald die Naht gezogen wird. Dadurch bleibt die CCA-Durchgängigkeit erhalten und eine Blutperfusion von bis zu 100 % der Ausgangswerte möglich. Bei dieser Methode müssen jedoch die Arteria carotis externa und die kleinen arteriellen Äste getrennt, abgeschnitten oder elektrokoaguliert werden, was den Eingriff zu einer Herausforderung macht. Es stört auch die gesamte Blutflussstruktur des Gehirns, die sich vom klinischen Zustand des Patienten unterscheidet¹². Wichtig ist, dass Studien darauf hinweisen, dass das Schneiden oder Ligatieren der ECA ischämische Läsionen in den Muskeln verursachen kann, die das Kauen und Schlucken steuern, die Ernährung der Tiere beeinträchtigen und bei Ratten zum postoperativen Tod der Tiere und zu schweren sensorischen und motorischen Schäden führen^{können 13,14}.

Daher ist eine modifizierte Modellvorbereitungsmethode dringend erforderlich, um diese Probleme zu lösen. In dieser Studie wird eine modifizierte MCAO-Modellierungsmethode vorgestellt, die den CCA-Insertionsschnitt repariert und eine effektive Reperfusion erzielt. Das Verfahren ist einfach, praktisch und durchführbar, führt zu erheblichen neurologischen Schäden und replizierbaren Infarktläsionen und bietet Schlaganfallforschern eine wertvolle Orientierungshilfe.

Protokoll

Das Versuchsprotokoll wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Ausschusses für die Verwendung von Labortieren und des institutionellen Tierpflege- und -verwendungsausschusses an der Universität für Traditionelle Chinesische Medizin in Chengdu (Aktenzeichen: 2019-DL-002) durchgeführt. Alle Tierforschungsdaten wurden nach den ARRIVE-Richtlinien (Animal Research: Reporting In Vivo Experiments) dokumentiert. Für diese Studie wurden männliche Sprague Dawley (SD) Ratten mit einem Gewicht von 250 g ± 20 g und einem Alter von 6-8 Wochen verwendet. Die Einzelheiten zu den verwendeten Tieren, Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung der Tiere

1. Einleitung und Aufrechterhaltung einer Tiefenanästhesie bei Ratten mit Zoletil 50 (50 mg/kg, IM) und Xylazinhydrochlorid (40 mg/kg, IP). Stellen Sie sicher, dass die Körpertemperatur während des gesamten chirurgischen Eingriffs bei 37 ± 0,5 °C gehalten wird, indem Sie eine Rektalsone verwenden, die mit einem Heizkissen verbunden ist. Tragen Sie Veterinärsalbe auf die Augen der Ratte auf, um ein Austrocknen zu verhindern.
2. Rasieren Sie die Haare von Kopf und Hals der Ratten. Verwenden Sie Enthaarungscreme, um das Fell von Kopf und Hals zu entfernen, und waschen Sie die Creme dann mit normaler Kochsalzlösung ab. Desinfizieren Sie die Haut an der Operationsstelle, indem Sie Ethanol und Povidon-Jod dreimal mit sterilen Wattebällchen auftragen.
3. Machen Sie mit einem Skalpell einen 2 cm langen Schnitt in der Mitte des Rattenkopfes entlang der Sagittalnaht und entfernen Sie vorsichtig die Muskeln, die den Schädel bedecken.
4. Verdünne den Schädel auf der ischämischen Seite der Ratte mit einem Schädelbohrer. Verwenden Sie normale Kochsalzlösung, um sich während des Schleifvorgangs abzukühlen und Ablagerungen zu entfernen. Erfassen Sie den Ausgangsblutfluss der Ratten mit Hilfe der Laser-Speckle-Kontrastbildgebung (LSCI).
5. Tragen Sie Ethanol und Povidon-Jod dreimal mit sterilen Wattebällchen auf die Haut des Halses auf. Machen Sie mit einer chirurgischen Klinge einen 2 cm langen Schnitt entlang der Mittellinie des Halses. Verwenden Sie Retraktoren, um die Haut und die Speicheldrüsen seitlich zurückzuziehen und die Sternocleidomastoideus- und Halsmuskulatur freizulegen.
6. Trennen Sie die Muskeln sternocleidomastoideus und die Halsmuskulatur, um das Halsschlagadergebiet freizulegen. Identifizieren Sie die vaskuläre Anatomie der Arteria carotis communis (CCA), der Arteria carotis interna (ICA) und der Arteria carotis externa (ECA). Trennen Sie basierend auf der Gefäßanatomie die CCA sowie die von CCA abgeleitete ECA und ICA¹⁵.
   HINWEIS: Die anatomische Struktur der Ratte deutet darauf hin, dass die CCA-Region hauptsächlich von den Muskeln sternocleidomastoideus und der Halsmuskulatur bedeckt ist, wobei die ICA und ECA von der CCA abgeleitet sind. Nachdem die Trennung den CCA freigelegt hat, ist eine Y-förmige Gabel entlang des CCA zu sehen, die den ICA und den ECA darstellt. Seien Sie vorsichtig, um den Vagusnerv, der parallel zum CCA verläuft, nicht zu beschädigen.

2. Okklusion des MCA

1. Binden Sie einen leicht zu entwirrenden Knoten über die Arteria carotis externa (ECA) und die Arteria carotis communis (CCA) mit einem 3-0 Seidenfaden, um den Blutfluss vorübergehend zu blockieren. Positionieren Sie einen Gefäßclip ca. 0,5 cm vom ersten Knoten entfernt auf dem CCA.
   1. Färben Sie die Nadel einer 5-ml-Spritze schwarz. Machen Sie mit der schwarz gefärbten Nadel einen kleinen Einstich in den CCA und markieren Sie die Nadellöcher in schwarz.
2. Führen Sie das monofile Nylonnaht durch die schwarze Markierung in das CCA ein. Öffnen Sie den Gefäßclip und führen Sie den Nylondraht in die Arteria carotis interna (ICA), bis er mit leichtem Widerstand anhält. Ziehen Sie den zweiten Knoten fest an, um die monofile Nylonnaht in der Arterie an Ort und Stelle zu halten und ein Verschieben aus der Blockierposition zu verhindern.
3. Notieren Sie sich zu diesem Zeitpunkt den Zeitpunkt der Ischämie und messen Sie den Blutflusswert auf der ischämischen Seite mittels LSCI. Verabreichen Sie Tropfen Bupivacain auf die Halswunde zur Analgesie und zum Wundverschluss. Entfernen Sie die Anästhesiemaske und lassen Sie die Ratte sich erholen.
   HINWEIS: Wenn das monofile Nylon-Nahtmaterial Schwierigkeiten beim Eindringen in das ICA hat, ziehen Sie es leicht zurück und versuchen Sie erneut, es einzuführen.

3. Reperfusion von MCAO

1. Nach 90 Minuten Ischämie betäuben Sie die Ratten erneut mit Isofluran. Messen Sie den zerebralen Blutfluss von der ischämischen Seite mit LSCI und stellen Sie sicher, dass sich die monofile Nylonnaht nicht verschoben hat.
2. Löse die Knoten an der Arteria carotis externa (ECA), um eine Blutreperfusion zu ermöglichen. Lösen Sie den Knoten an der Arteria carotis communis (CCA), befestigen Sie die monofile Naht und ziehen Sie die Naht zurück. Legen Sie einen Gefäßclip vor die feste monofile Naht, um Blutungen zu vermeiden.
3. Ersetzen Sie den ersten CCA-Knoten durch einen Gefäßclip. Drehen Sie den Gefäßschnitt mit einer Pinzette seitlich (Abbildung 1). Klemmen Sie den Schnitt mit einer Pinzette und ligieren Sie ihn mit einem 6-0-Faden, um den Schnitt zu reparieren. Entfernen Sie den Gefäßclip, prüfen Sie, ob er undicht ist, und bestätigen Sie die vollständige Reperfusion (Video 1).
   HINWEIS: Führen Sie eine Ligatur durch, um den Schnitt zu reparieren und eine übermäßige Gefäßklemmung zu vermeiden, die zu einer CCA-Stenose führen könnte.
4. Zeichnen Sie die Werte des zerebralen kortikalen Blutflusses mit LSCI nach der Inzisionsligatur auf, um eine erfolgreiche Reperfusion zu bestätigen. Schließen Sie den Halsschnitt mit Nähten und verabreichen Sie 1.00.000 Einheiten Penicillin und 2 ml Kochsalzlösung, um Infektionen und Dehydrierung zu verhindern.
5. Halten Sie die Wärme aufrecht, bis die Ratten wieder zu Bewusstsein kommen. Bieten Sie nach der Operation weiches Futter an und überwachen Sie die Vitalfunktionen der Tiere.

4. Beurteilung der Nervenfunktion und der zerebralen ischämischen Schädigung

1. Sobald die Ratten vollständig erwacht sind, wird ihre neuronale Funktion von Forschern bewertet, die die Tiergruppe nicht kennen. Verwenden Sie die Longa-Score-Skala (Tabelle 1) und die modifizierte mNSS-Skala (Severity Score) (Tabelle 2), um die neurologische Funktion aller Ratten zu bewerten.
2. Nach 24 Stunden nach der Operation werden die Ratten unter Isofluran-induzierter Anästhesie (4 % Isofluran bei 4 l/min Sauerstoff) mittels Zervixdislokation¹⁶ eingeschläfert (gemäß den institutionell anerkannten Protokollen). Spülen Sie das Gehirn mit Eiswasser ab, um das restliche Blut zu entfernen.
3. Teilen Sie das Hirngewebe in 5 Abschnitte und färben Sie diese mit TTC. Nehmen Sie Bilder von beiden Seiten der Hirngewebeschnitte auf, messen Sie den ischämischen Bereich der Vorder- und Rückseite mit der Image J-Software und berechnen Sie die Infarktrate mit der folgenden Formel:
   
   HINWEIS: S₁ und S₂ stellen den Infarktbereich des proximalen Vorderhirns bzw. der proximalen Hirnstammseite der Hirnschnitte dar. Die Infarktfläche jedes Hirnschnitts wird mit der Swanson-Formel korrigiert, wobei h die Dicke des Hirnschnitts darstellt. Diese Formel, die der Autor bereits in früheren Forschungen¹⁷ skizziert hat, ermöglicht eine genauere Berechnung der Größe der Infarktläsion.
4. Analysieren Sie die Daten mit Hilfe von Statistik- und Grafiksoftware, um die Erfolgsquote und Stabilität des Modells zu bewerten.
5. Die Immunfluoreszenzmethode wird zur Markierung kortikaler Neuronen bei Ratten eingesetzt, um die durch diese Methode verursachten neuronalen Schäden weiter zu validieren. Nach 24 Stunden Ischämie-Reperfusion bei Ratten wurde eine Herzperfusion mit vorgekühltem PBS durchgeführt, um Hirngewebe zu gewinnen.
6. Betten Sie das Hirngewebe ein und frieren Sie es in Abschnitte ein. Verwenden Sie neuronale Antikörper wie den unreifen neuronalen Marker Doublecortin (DCX)¹⁸, den neuronalen Kernmarker Neuronale Kerne (NeuN)¹⁸ und den dendritischen Neuronenmarker Microtubuli-associated protein-2 (MAP-2)¹⁹. Beobachten Sie die Expression ischämischer Neuronen mit der konfokalen Lasermikroskopie.

Ergebnisse

Die Laser-Speckle-Flow-Bildgebung zeigte, dass vor dem Verschluss der monofilen Nylonnaht ein reichlicher Blutfluss im Bereich der mittleren Hirnarterie (MCA) vorhanden war, und die Ausgangswerte des Blutflusses der Ratten wurden aufgezeichnet. Nach dem Verschluss des MCA nahm der Blutflusswert auf der ischämischen Seite des Gehirns rapide ab. Vor dem Ziehen der Naht wurden die Blutflusswerte auf der ischämischen Seite erneut überprüft, um zu bestätigen, ob die Naht das MCA verschließt. Die Ergebnisse zeigten nur eine geringe Veränderung des Blutflusses. Nach dem Ziehen der Naht stellte sich die Durchblutung des Blutflusses schnell wieder her (Abbildung 2). Video 1 zeigt auch den robusten Füllpuls der Arteria carotis communis, was darauf hindeutet, dass mit dieser Methode eine ausreichende Durchblutungsperfusion nach zerebraler Ischämie erreicht werden kann.

Die Ergebnisse der neurologischen Funktionsscores (Abbildung 3) zeigten, dass der Longa-Score der Modellgruppe im Vergleich zur Schein-OP-Gruppe 1,80 ± 0,27 (p < 0,05) und der mNSS-Score 7,4 ± 0,89 (p < 0,05) betrug. Diese Werte deuten darauf hin, dass das mit dieser Methode erstellte Modell für den Verschluss/die Reperfusion der mittleren Hirnarterie (MCAO/R) zu signifikanten neurologischen Schäden führte. Video 2 zeigt das charakteristische Verhalten von Modellgruppenratten, die sich beim Krabbeln drehen, ein Kennzeichen für schlaganfallinduzierte Verletzungen, was die Validität dieser Methode weiter bestätigt.

Die TTC-Färbung zeigte, dass die Infarktrate in der Modellgruppe Ratten 5,58 ± 1,79 (p < 0,05) betrug, wobei der Infarktbereich hauptsächlich das Striatum und den Kortex betraf und die Infarktgröße relativ stabil blieb. Die Immunfluoreszenzfärbung veranschaulichte den Verlust kortikaler Neuronen nach Ischämie-Reperfusion (Abbildung 4). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese Methode ein stabiles MCAO/R-Modell etablieren kann, das für die Bewertung der präklinischen Wirksamkeit von Arzneimitteln geeignet ist.

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Connectorligation von CCA. Der gelbe Kreis markiert den Einstichpunkt und die Ligaturstelle des Drahtsteckers, während die Ligaturposition (gelber Pfeil) anzeigt, wo die Arteria carotis communis (CCA) mit dem Draht ligiert wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Laser-Speckle-Blutflussbilder zu Zeiten von Ratten auf der ischämischen Seite vor, nach der Okklusion sowie vor und nach der Reperfusion. (A) Zerebrale Blutflussbilder von Ratten, wobei blaue Bereiche niedrige Blutflusswerte und rote Bereiche hohe Blutflusswerte anzeigen. Maßstabsbalken: 200 mm. (B) Veränderungen der zerebralen Ischämie-Reperfusion bei Ratten, dargestellt als mittlere ± Standardabweichung, bei einer Stichprobengröße von n = 5. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Ergebnisse der Infarktareale und der neurologischen Funktionswerte in der Scheingruppe und der Modellgruppe. (A) Die TTC-Färbung stellte die infarzierten Bereiche des Hirngewebes sowohl in der Scheingruppe als auch in der Modellgruppe dar, wobei weiße Bereiche auf infarziertes Gewebe und rote Bereiche auf normales Gewebe hindeuteten. (B) Die quantitativen Ergebnisse der Longa- und mNSS-Scores sowie der Infarktrate werden vorgestellt. Die statistische Signifikanz im Vergleich zur Scheingruppe wird mit *p < 0,05 angegeben, bei einer Stichprobengröße von n = 5. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Ergebnisse der Schädigung kortikaler Neuronen in der Scheingruppe und Modellgruppe. Expression von NeuN (A), DCX (B) und MAP-2 (C) in kortikalen Neuronen. Maßstabsbalken: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Diagramm der MCA-Okklusion und -Reperfusion durch Koizumi, Longa und die modifizierte Methode. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Motortests/stark>	Punkte
Ratte am Schwanz aufziehen	3
1 Beugung der Vordergliedmaße
1 Beugung der Hintergliedmaße
1 Kopf innerhalb von 30 s > 10° zur vertikalen Achse bewegt
Ratte auf den Boden setzen	3
0 Normaler Spaziergang
1 Unfähigkeit, geradeaus zu gehen
2 Kreisen zur paretischen Seite
3 Fallen Sie auf die paretische Seite
Sensorische Tests	2
1 Platzierungstest (visueller und taktiler Test)
2 Propriozeptiver Test (tiefes Gefühl, die Pfote gegen die Tischkante drücken, um
stimulieren die Gliedmaßenmuskulatur)
Balkenausgleich-Tests	6
0 Gleichgewichte mit ruhiger Haltung
1 Greift die Seite des Balkens
2 Umarmt den Balken und ein Ast fällt vom Balken herunter
3 Umarmt den Balken und zwei Gliedmaßen fallen vom Balken herunter oder drehen sich auf dem Balken (>60 s)
4 Versucht auf dem Balken zu balancieren, fällt aber herunter (>40 s)
5 Versucht auf dem Balken zu balancieren, fällt aber herunter (>20 s)
6 Stürze ab: Kein Versuch, das Gleichgewicht zu halten oder sich am Balken festzuhalten (<20 s)
Fehlende Reflexe und abnormale Bewegungen	4
1 Ohrmuschelreflex (Kopfschütteln bei Berührung des Gehörgangs)
1 Hornhautreflex (Augenblinzeln bei leichter Berührung der Hornhaut mit Watte)
1 Schreckreflex (motorische Reaktion auf ein kurzes Geräusch beim Knacken eines Klemmbrettpapiers
1 Krampfanfälle, Myoklonus, Myodystonie
Maximale Punktzahl	18

Tabelle 1: Modifizierter neurologischer Schweregrad.

Zea-Longa punktet
Punktzahl	Symptom
0 Punkte	Keine neurologischen Ausfälle
1 Punkt	Leicht: Die rechte Vorderpfote kann nicht vollständig ausgestreckt werden, wenn der Schwanz angehoben wird
2 Punkte	Mittel: Kreist beim Gehen nach rechts/links
3 Punkte	Schwer: stürzt beim Gehen nach rechts/links
4 Punkte	Unfähigkeit, spontan zu gehen, mit Bewusstlosigkeit

Tabelle 2: Zea-Longa-Ergebnisse.

Video 1: Wichtige Schritte für die Ligaturreparatur der CCA-Inzision während der Reperfusion bei Ratten. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Video 2: Verhaltensvideos von Ratten, die sich MCAO/R unterziehen. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Diskussion

Das Modell des Verschlusses der mittleren Hirnarterie (MCAO), das durch eine monofile Nylonnaht induziert wird, ist die gebräuchlichste Methode zur Vorbereitung von MCAO-Modellen. Dieser Ansatz wird in präklinischen Studien häufig übernommen und hat aufgrund seiner Einfachheit, der fehlenden Notwendigkeit einer Kraniotomie, des minimalen chirurgischen Traumas und der Fähigkeit, eine Reperfusion zu erreichen, von vielen Praktikern Anerkennung gefunden.

Es gibt zwei klassische Operationstechniken für die intraluminale Filament-MCAO: die Koizumi-Methode⁸ und die Longa-Methode⁹. Der Hauptunterschied zwischen diesen Methoden liegt in der Art und Weise, wie die Naht eingeführt wird, um das MCA zu verschließen. Bei der Koizumi-Methode wird die Naht durch den Schnitt der Arteria carotis communis (CCA) in die Arteria carotis interna (ICA) eingeführt. Das vordere Ende der Naht ist mit Silikon beschichtet, um den Startpunkt des MCA zu blockieren. Umgekehrt wird bei der Longa-Methode die Naht durch die durchtrennte Arteria carotis externa (ECA) in die ICA eingeführt. Das vordere Ende der Naht wird zu einer kugelförmigen Form erweitert, um den Startpunkt der MCA zu blockieren (Abbildung 5). Bei der Reperfusion wird die Naht sanft zurückgezogen, um den Blutfluss wiederherzustellen.

Bei der Longa-Methode wird die Naht durch die durchtrennte Arteria carotis externa (ECA) in die Arteria carotis interna (ICA) eingeführt. Dieser Prozess erfordert das Trennen und Trennen der ECA sowie das Trennen und Entfernen von kleinen Ästen, die dann mit einem Elektrokoagulationsstift abgeschnitten werden, um ein Ausbluten zu verhindern. Folglich erfordert diese Methode eine sorgfältige und präzise Bedienung. Darüber hinaus kann das kurze Restende der durchtrennten ECA das Abrutschen der Naht während des Einführens erleichtern, was die Komplexität des Eingriffs weiter erhöht. Diese Herausforderung ist besonders ausgeprägt bei der Vorbereitung eines Mausmodells für zerebrale Ischämie, da sie oft den Einsatz eines Mikroskops erfordert, um die Genauigkeit zu gewährleisten, was die Gesamtkomplexität der Operation erhöht.

Das Hauptanliegen der Koizumi-Methode liegt in der Ligatur der Arteria carotis communis (CCA), die zu einer kompensatorischen Reperfusion des Hirngewebes auf der ischämischen Seite allein durch den Circle of Willis führt. Die CCA ist ein wichtiger Ast des Aortenbogens vom Herzen und dient als Hauptarterie für die Durchblutung des zerebralen Blutflusses. Daher kommt es bei dem nach der Koizumi-Methode erstellten zerebralen Ischämie-Reperfusionsmodell häufig zu einem Zustand der Hypoperfusion. Diese Minderdurchblutung ist nicht auf die mittlere Hirnarterie beschränkt, sondern erstreckt sich auf die gesamte ischämische Hemisphäre auf derselben Seite. Selbst nach 35-tägiger Modellierung kehrt der Blutflusswert nicht zum Ausgangswert zurück, was darauf hindeutet, dass die Koizumi-Methode eher als ischämisches Modell mit chronischer Hypoperfusion als als Ischämie-Reperfusionsmodell angesehen werden sollte¹⁰.

Im Gegensatz dazu kann mit der Longa-Methode bei MCAO/R-Tieren ein Blutflusswert von 100 % erreicht werden. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass das Erreichen einer vollständigen Rekanalisation nicht unbedingt bedeutet, dass die Koizumi-Methode aufgegeben werden sollte. Wenn eine klinische Translation in Betracht gezogen wird, könnte die Koizumi-Methode besser für Patienten mit spontaner langsamer Rekanalisation nach Arterienverschluss geeignet sein. In der klinischen Praxis ist dieses Phänomen jedoch relativ selten. Nur ein kleiner Prozentsatz der Patienten mit ischämischem Schlaganfall erfüllt die Kriterien für eine Thrombolyse und erhält innerhalb des Behandlungszeitfensters eine wirksame Behandlung^20,21. Darüber hinaus kommt es bei einigen Patienten auch nach thrombolytischer Therapie nicht zu einer vollständigen Revaskularisation²². Daher kann die Koizumi-Methode verwendet werden, um den Zustand solcher Patienten zu simulieren.

Auf der anderen Seite ermöglicht die Longa-Methode eine schnelle Rekanalisation der Gefäße nach dem Verschluss, wodurch sie sich besser für die Simulation von Patienten eignet, die in der klinischen Praxis eine wirksame thrombolytische Therapie oder Thrombektomie erhalten. Für die Simulation von Patienten, die sich keiner thrombolytischen Therapie unterzogen haben, kann das nach der Koizumi-Methode hergestellte Modell der permanenten zerebralen Ischämie einen vollständigeren Verschluss und ein einfacheres chirurgisches Verfahren bieten.

Die Longa-Methode zur Induktion eines Verschlusses/einer Reperfusion der mittleren Hirnarterie (MCAO/R) kann zu einer signifikanteren Reperfusionsschädigung führen, indem die von der Arteria carotis communis (CCA) abgeleitete vaskuläre Rekanalisation erhalten bleibt^23,24. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass die Arteria carotis externa (ECA) während der Longa-Methode abgeschnitten und dauerhaft ligiert werden muss, was die gesamte Blutflussstruktur des Gehirns stört und nicht mit klinischen Patienten übereinstimmt. Darüber hinaus sind die Arteria lingualis, die Arteria maxillaris und die Arteria occipitalis Äste der ECA¹³. So kann das Schneiden oder dauerhafte Litieren der ECA zu Ess- und Trinkstörungen führen, die zu Gewichtsverlust führen²⁵. Frühere Studien haben gezeigt, dass der Tod von Mäusen nach MCAO-Modellierung in erster Linie auf eine unzureichende Nahrungs- oder Wasseraufnahme und nicht auf eine zerebrale ischämische Schädigung zurückzuführen ist^14,26. Darüber hinaus kann die Ligatur des ECA den Blutfluss der Netzhaut verringern und Netzhautschäden in Form von Zelltod induzieren²⁷.

Darüber hinaus ist der wichtigste Indikator für die Schlaganfallforschung das Infarktvolumen; Es hat sich jedoch gezeigt, dass das Volumen der durch die Nahtmethode induzierten Infarkte eine signifikante Standardabweichung aufweist, selbst wenn strenge Operations- und Datenerfassungsprotokolle eingehalten werden. In früheren Berichten war das Infarktvolumen mit dem Grad der Reperfusion^{assoziiert 28}, und die Reperfusion des Schlaganfallmodells, das nach Koizumis Methode erstellt wurde, hängt von der Willis-Zirkulation^{ab 29,30,31}. Es wurde jedoch nachgewiesen, dass der Willis-Zyklus eine hohe anatomische Variabilität aufweist, insbesondere bei C57Bl/6-Mäusen, bei denen 90 % der Tiere eine oder zwei posteriore kommunizierende Arterien fehlen^{können 32}, was die Schlüsseldeterminante für eine hohe Variabilität bei ischämischen Verletzungen^{ist 33}. Daher kann die Erhaltung der Perfusion von CCA die Variabilität des Infarktvolumens^{verringern 34}. Es wurde berichtet, dass der durchschnittliche Variationskoeffizient der Infarktgröße in Schlaganfallstudien 29,5 %³¹ betrug, was zur geringen statistischen Aussagekraft von Schlaganfallstudien beitrug. Es stellt auch eine große Herausforderung für die potenzielle Wirkstoffforschung dar. Dies erhöht zweifellos die Kosten für die Entwicklung und klinische Umsetzung und kann dazu führen, dass Forschern potenziell wirksame Medikamente fehlen. Außerdem erhöht sich dadurch die Anzahl der Tiere, die in die statistische Auswertung des Versuchs einbezogen werden sollen, was weiter gegen das 3R-Prinzip der Tierethik verstößt.

Daher wurden in dieser Studie Modellierungsmethoden modifiziert, um die Integrität der Blutflussstruktur des Hirngewebes und eine ausreichende Reperfusion nach zerebraler Ischämie zu gewährleisten. Die wichtigsten Modifikationen umfassen zwei Schritte: (1) Einführen der Naht in CCA mit einer 5-ml-Spritzennadel anstelle eines kleinen Schnitts; Dieser Schritt reduziert die Inzision der CCA und ist förderlicher für die Ligatierung der Inzision; (2) Ziehen Sie die Naht zurück und verwenden Sie feinere Seidenfäden, um die Nadelöffnung des CCA zu ligieren, ohne die Durchblutung des CCA zu beeinträchtigen. Dies erfordert natürlich auch einen sorgfältigen chirurgischen Eingriff, unterscheidet sich aber von der Einführung der Naht über ECA; Diese Methode bewahrt die Integrität der zerebralen Blutflussstruktur und ermöglicht gleichzeitig eine vollständige Reperfusion des Blutflusses durch CCA, was das Operationsverfahren vereinfacht und die Variabilität des Infarktvolumens reduziert. Einige Forscher haben ähnliche Forschungsmethoden verwendet, um Schnitte mit Gewebekleber zu reparieren, aber dies birgt das Potenzial für Thrombosen, die unkontrollierbare Auswirkungen haben werden. Und es dauert länger, den Schnitt zu stabilisieren²⁵.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie einen modifizierten Ansatz für die Erstellung des zerebralen Ischämie-Reperfusionsmodells bietet, das eine adäquate Blutperfusion nach Filamententnahme ermöglicht und zu signifikant reproduzierbaren Infarktvolumina und neurologischen Schäden führen kann. Alle oben genannten Ergebnisse zeigen, dass die modifizierte Methode praktikabel und reproduzierbar ist und Praktikern als Referenz dienen kann, um Modelle zur Erleichterung der effektiven klinischen Translation von zerebralen ischämischen Arzneimitteln vorzubereiten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Tieranästhesiesystem	Rayward Life Technology Co., Ltd	R500IE
Tiertemperaturhalter	Rayward Life Technology Co., Ltd	69020
Cy3 Sekundärantikörper	Wuhan Saiweier Biotechnology Co., Ltd	GB21303
DAP1 Antikörper	Wuhan Saiweier Biotechnology Co., Ltd	G1012
DCX Antikörper	Wuhan Saiweier Biotechnology Co., Ltd	GB13434
Ziegenserum	Beyotime Biotechnology Co., Ltd	C0265
GraphPad Prism	GraphPad Software	GraphPad Prism 8.0
ImageJ	National Institutes of Health	ImageJ Software
Isofluran	Rayward Life Technology Co., Ltd	R510-22
Laser Speckle Blut Flow-Imaging-System	Rayward Life Technology Co., Ltd	PeriCam PSI NR
MAP-2 Antikörper	Wuhan Saiweier Biotechnology Co., Ltd	GB11128
Miniatur-Handheld Schädelbohrer	Rayward Life Technology Co., Ltd	87001
monofile Naht	Rayward Life Technology Co., Ltd	250-280g
NeuN Antikörper	Wuhan Saiweier Biotechnology Co., Ltd	GB11138
OCT Einbettungsmittel	BIOSHARP	BL557A
Penicillin-Natrium	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	17121709-2
Schnelle Antigen-Entnahmelösung für Frozen Sections	Beyotime Biotechnology Co., Ltd	P0090
SD Ratten	SPF ( Peking ) Biotechnology Co., Ltd.	250-280g
Triton X-100	Beyotime Biotechnology Co., LTD	ST795
TTC	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.