Methodenartikel

Abtrennung und Identifizierung von konventionellem Mikroplastik aus landwirtschaftlichen Böden

DOI:

10.3791/67064

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21. März 2025

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1State Key Laboratory of Nutrient Use and Management, College of Resources and Environmental Sciences; National Academy of Agriculture Green Development, Key Laboratory of Plant-Soil Interactions of Ministry of Education, National Observation and Research Station of Agriculture Green Development (Quzhou, Hebei), China Agricultural University, 2School of Environmental & Natural Sciences, Bangor University, 3College of Resources and Environmental Sciences, Beijing Key Laboratory of Farmland Soil Pollution Prevention and Remediation, China Agricultural University, 4Soil Physics and Land Management Group, Wageningen University & Research, 5Institute of Environment and Sustainable Development in Agriculture, Chinese Academy of Agricultural Sciences, 6College of Land and Environment, Shenyang Agricultural University, 7School of Environmental Science and Engineering, Southern University of Science and Technology, 8Institute of Quality Standard and Testing Technology, Beijing Academy of Agriculture & Forestry Sciences, 9China National Environmental Monitoring Centre, 10Key Laboratory of Prevention and Control of Residual Pollution in Agricultural Film, Ministry of Agriculture and Rural Affairs

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier wird eine Methode vorgestellt, um Mikroplastik aus dem Boden zu extrahieren und deren Polymertypen zu identifizieren. Die Methode wurde hinsichtlich Ausführung, Anwendbarkeit und Kosteneffizienz optimiert. Sie legt eine wissenschaftliche Grundlage für die Standardisierung der Analysemethode zur Identifizierung von Mikroplastik in Böden.

Zusammenfassung

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Die Verschmutzung durch Mikroplastik (MP) in der terrestrischen Umwelt hat in den letzten zehn Jahren zunehmende Aufmerksamkeit erhalten, da immer mehr Studien die Anzahl und Art von MP in verschiedenen Bodensystemen und ihre Auswirkungen auf die Boden- und Pflanzengesundheit beschreiben. Es werden jedoch unterschiedliche Methoden zur Extraktion und Analyse von MP verwendet, was die Möglichkeiten einschränkt, Ergebnisse zu vergleichen und zuverlässige Beweise für die Beratung der Industrie und politische Entscheidungsträger zu generieren. Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Methodik für die Probenahme, Trennung und chemische Identifizierung von konventionellen MP aus dem Boden beschreibt. Das Verfahren ist kostengünstig und die Materialien sind leicht verfügbar. Dies erhöht die Benutzerfreundlichkeit und kann zu einer breiten Akzeptanz beitragen. Das Protokoll enthält detaillierte Informationen über die Probenentnahme aus den oberen 0-30 cm des Bodens mit plastikfreien Utensilien; Simulation verschiedener Bodentypen durch die Verwendung verschiedener fester Medien (wie Bentonitton, Siliziumdioxid und nicht kontaminierte Böden) unter Zugabe der gleichen Masse an Polyethylen(PE)-MP für die anschließende Quantifizierung; Dichtetrennung von Kunststoffpartikeln unter Verwendung von gesättigter Natriumchlorid (NaCl)-Lösung und Aufschluss von organischen Verunreinigungen im Überstand unter Verwendung von 4 M Natriumhydroxid (NaOH)-Lösung; Quantifizierung von Partikeln mittels Fluoreszenzmikroskopie nach Nilrot-Färbung; und Polymeridentifizierung mittels Mikro-Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (μ-FTIR) oder Laser-Direktinfrarot-Spektroskopie (LDIR). Die Rückgewinnungsrate der Abgeordneten lag bei den oben genannten Medien zwischen 83 % und 90 %. Dieses Protokoll stellt eine effiziente Methode für die MP-Analyse im Boden dar, die hinsichtlich Machbarkeit, Anwendbarkeit und Kosteneffizienz optimiert ist. Darüber hinaus kann das beigefügte Video den Prozess der Analyse der Boden-MP Schritt für Schritt virtuell unterstützen. Diese Studie widmet sich der Standardisierung der Methoden für die Analyse von Boden-MP, der Verbesserung der Konnektivität und Vergleichbarkeit von Messungen und der Schaffung einer Grundlage für eine standardisiertere und wissenschaftlichere Forschung.

Einleitung

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Es wird geschätzt, dass jährlich 4,8 bis 12,7 Millionen Tonnen Plastik aus terrestrischen Quellen in den Ozean gelangen 1,2. Diese Kunststoffpartikel zerfallen als Reaktion auf ultraviolette Strahlung, mechanischen Abrieb und biologischen Abbau allmählich in kleinere Fragmente 3,4. Die Verschmutzung des Bodens durch Mikroplastik (MP) mit Kunststoffpartikeln mit einem Durchmesser von weniger als 5 mm wird zunehmend besorgniserregend, insbesondere im Hinblick auf seine potenziellen Auswirkungen auf die Gesundheit des Bodens und der Pflanzen. Er wird in erster Linie durch den kontinuierlichen Anstieg der Kunststoffproduktion und die Herausforderungen im Zusammenhang mit der angemessenen Entsorgung von Kunststoffabfällen angetrieben 5,6.

Die Anreicherung von MP im Boden kann auf verschiedene externe Faktoren zurückgeführt werden. Die potenziellen Quellen für MP in Böden sind komplex, einschließlich der Verwendung von plastischen Praktiken (z. B. Kunststoffmulchfolien, Bewässerungsrohre, Gewächshausfolien und zugehörige Infrastruktur)7,8,9 und des Eintrags organischer Zusatzstoffe (wie Klärschlammausbringung, landwirtschaftlicher Kompost und organischer Dünger)10. Darüber hinaus sind die unsachgemäße Entsorgung von Kunststoffabfällen11, die Zersetzung von verdauten Lebensmittelabfällen aus Kunststoffverpackungsresten12, die Verwendung von beschichteten Düngemitteln13, der Verschleiß von Gummireifen14 und die atmosphärische Ablagerung15 ebenfalls bekannte Verursacher von MP in Böden. China, der führende Hersteller und Verwender von landwirtschaftlichen Kunststoffen, insbesondere von Kunststoffmulchfolien, hat schätzungsweise eine durchschnittliche Abundanz an MP auf stark mit Plastik gemulchten landwirtschaftlichen Ackerflächen von ca. 4231 Stück kg-1 (trockener Boden)16. Im Jahr 2018 reichten die Mengen an MP in chinesischen Ackerböden in der Tiefe von 0 bis 10 cm zwischen 4,9 × 106 und 1,0 × 107 Tonnen, wobei landwirtschaftliche Mulchfolien einen erheblichen Beitrag leisteten17. Die Ausbringung von Klärschlamm auf landwirtschaftlichen Böden in Europa und Nordamerika kann über 63.000 bzw. 44.000 Tonnen MP pro Jahr aufnehmen18. Eine Studie in Deutschland zeigte, dass die Kompostausbringung auf Ackerflächen auch zu einem jährlichen Eintrag von Kunststoffpartikeln (>1 mm) auf Ackerflächen führte. Die Ausbringung von Kompost führte zu 35 Milliarden bis 2,2 Billionen Plastikpartikeln10. Der Beitrag der atmosphärischen MP zu den Böden ist noch ungewiss und bedarf einer weiteren Quantifizierung15. Zum Beispiel wird der jährliche durchschnittliche Eintrag von atmosphärischen MP in China auf 7,9 geschätzt ×10 4 items m-2 yr-1 16. Die extrem breite Palette von Quellen für MP im Boden hat die Aufmerksamkeit vieler Forscher auf sich gezogen, aber aufgrund der Vielfalt der Probenahme-, Extraktions- und analytischen Nachweismethoden ist es schwierig, die Ergebnisse verschiedener Studien zu integrieren und zu vergleichen.

Die Anhäufung von MP aus einem breiten Spektrum von Quellen stellt eine potenzielle Umweltbedrohung für die globalen Bödendar 16, was den eindeutigen Bedarf an Untersuchungen von MP im Boden unterstreicht. Einige Studien haben gezeigt, dass die Auswirkungen von MP auf landwirtschaftliche Böden die Veränderung der Bodeneigenschaften, die Behinderung des Wachstums und der Entwicklung von Pflanzen und Bodenorganismen sowie die Beeinflussung der mikrobiellen Aktivität des Bodens umfassen19,20. Andere Studien haben ergeben, dass sich MP in Organismen auf höheren trophischen Ebenen entlang der Nahrungskette anreichern können21, was zu einer potenziellen Gefahr für die menschliche Gesundheit führt22. Um die Auswirkungen von MP auf die Bodenumwelt zu klären, ist es zunächst notwendig, den aktuellen Status ihrer Kontamination zu verstehen, einschließlich ihrer Häufigkeit, der Polymeridentifikation und der Verteilungseigenschaften. Daher ist die genaue Identifizierung und Detektion von Boden-MP von größter Bedeutung.

Derzeit wird in einer wachsenden Zahl von Artikeln das weltweite Vorkommen von MP im Boden untersucht, wobei erhebliche Unterschiede bei den Extraktions- und Nachweismethoden zu beobachtensind 23. Nach der sorgfältigen Entnahme von Proben (zur Minimierung der MP-Kontamination) umfasst das Protokoll für die MP-Analyse in der Regel drei wichtige Schritte. Erstens ist die Dichtetrennung weit verbreitet, um MPS-Partikel aus der Bodenmatrix zu isolieren. Bei diesem Verfahren werden üblicherweise Reagenzien wie destilliertes (DI) Wasser (1,0 g cm-3), Natriumchlorid (NaCl, 1,2 g cm-3) oder Zinkchlorid (ZnCl2, 1,6 g cm-3) verwendet. Zweitens umfassen Verfahren zur Entfernung organischer Verunreinigungen von der Oberfläche von MP die Reinigung mit sauren und alkalischen Lösungen oder anderen Oxidationsmitteln und den enzymatischen Aufschluss24. Der Aufschluss von organischer Substanz in der Bodenmatrix oder das Anhaften an MPS-Partikeln erfolgt üblicherweise mit 30 % Wasserstoffperoxid (H2O2), 65 % Salpetersäure (HNO3) oder 50 % Natriumhydroxid (NaOH)25. Nach der Dichtetrennung und dem Aufschluss organischer Substanz ist die mikroskopische Untersuchung der MPS-Proben erforderlich, um die Anzahl der Partikel zu bestimmen. Diese Untersuchung wird ergänzt durch die Analyse der chemischen Zusammensetzung der Polymere durch Techniken wie die Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FTIR), die Raman-Spektroskopie oder andere Nahinfrarotspektroskopietechniken26.

Jeder Schritt im Extraktions- und Nachweisprozess von MP birgt jedoch das Potenzial für eine Über- oder Unterschätzung des Auftretens von MPS. Trotz der weit verbreiteten Verwendung von DI-Wasser als Reagenz für die Dichtetrennung aufgrund seiner Kosteneffizienz und des Mangels an gefährlichen Eigenschaften kann es beispielsweise zum Ausschluss von MPS-Partikeln mit höherer Dichte führen27. Umgekehrt kann die weit verbreitete Anwendung von Reagenzien mit hoher Dichte durch Umweltgefahren und erhöhte Kosten eingeschränkt werden28. Darüber hinaus haben bestimmte Reagenzien, die für den organischen Aufschluss verwendet werden, das Potenzial, die MPS-Partikelzu schädigen 29. Darüber hinaus ist die visuelle Klassifizierung mit optischer, stereoskopischer und anatomischer Mikroskopie nicht ohne Herausforderungen 26,30. Die Bestimmung von MPS-Teilchen hängt stark von der Expertise und dem Betrieb der Analytiker sowie von den Geräteeinstellungen ab. Diese Ergebnisse unterstreichen die Schwierigkeit, Konsistenz und Genauigkeit bei der Anwendung verschiedener Methoden zu erreichen, was den Vergleich der Ergebnisse zwischen verschiedenen Studien erschwert.

Um die Zuverlässigkeit und Vergleichbarkeit der Daten über Studien hinweg zu gewährleisten, ist es unerlässlich, ein standardisiertes Protokoll für die Extraktion und Detektion von MP im Boden zu etablieren. Diese Standardisierung wird nicht nur die Genauigkeit der Bewertung des Vorkommens von MP verbessern, sondern auch ein umfassenderes und einheitlicheres Verständnis der Umweltauswirkungen von MP auf Bodenökosysteme ermöglichen. Um die Einschränkungen von Extraktions- und Nachweismethoden zu umgehen, sollten die ausgewählten Reagenzien für standardisierte Methoden leicht verfügbar sein, die Integrität oder chemische Zusammensetzung der MPS-Partikel nicht beeinträchtigen und das geringstmögliche Umweltrisiko darstellen. Darüber hinaus sollten standardisierte Methoden eine hohe Effizienz sowohl bei der Rückgewinnung von MP als auch bei der Entfernung organischer Substanz aus der Bodenmatrix aufweisen.

Ein leicht verständliches Protokoll ist für eine breite Akzeptanz in verschiedenen Forschungsumgebungen von entscheidender Bedeutung. Unter Berücksichtigung der MP-Wiederfindungsraten und der Kosteneffizienz ist gesättigtes NaCl die optimale Wahl für die großflächige Dichtetrennung von Bodenproben. Für den Aufschluss von organischem Material wurde NaOH verwendet, da vorläufige Isolationsexperimente gezeigt haben, dass 4 M NaOH-Lösung Verunreinigungen in Bodenproben, wie z. B. Pflanzenreste, effektiv zersetzt, ohne die MP signifikant zu schädigen. Im Allgemeinen werden bei dieser experimentellen Methode leicht verfügbare und kostengünstige Materialien verwendet, die Betriebskomplexität gering ist und eine zuverlässige Extraktionsrate gewährleistet ist.

Wir empfehlen, die von der Chinesischen Akademie der Agrarwissenschaften vorgeschlagene Methode der schnellen und wirtschaftlichen Trennung zu verwenden, um die auf landwirtschaftlichen Feldern gesammelten MPszu bestimmen 31. Stellen Sie bei allen folgenden Schritten sicher, dass alle Behälter, Instrumente und Glaswaren vor dem Gebrauch mit DI-Wasser gereinigt werden, um eine Kontamination zu minimieren. Stellen Sie außerdem sicher, dass Sie regelmäßig Leerproben neben den Proben laufen lassen, um Kontaminationen zu berücksichtigen, die durch die Entnahme- und Extraktionsverfahren verursacht werden.

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Protokoll

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HINWEIS: Die folgenden Lösungen müssen vor dem Extraktionsprozess bei Umgebungstemperatur hergestellt werden: 1) Gesättigte NaCl-Lösung (5,7 M) - 1 kg NaCl in 3 L DI H2O auflösen; 2) 4 M NaOH - lösen 480 g NaOH in 3 L DI H2O; 3) Nilrot (100 μg ml-1) - 10 mg Nilrot in 100 ml geeignetem Lösungsmittel (z. B. Methanol, Aceton) auflösen.

1. Bodenprobenahme und -aufbereitung

  1. Entnahme einer repräsentativen Bodenprobe mit einer Fünf-Punkte-Probenahmemethode in einer "W"-Form über das Untersuchungsgebiet (Abbildung 1). Verwenden Sie für das Sammelverfahren eine 30 cm lange Erdschnecke aus Edelstahl. Sammeln und lagern Sie die Proben in einem Nicht-Plastikbehälter, z. B. Aluminiumfolie.
    HINWEIS: Die Bodenproben können in verschiedene gewünschte Tiefen aufgeteilt werden (z. B. 0-10, 10-20 und 20-30 cm). Um die Kontamination von Kunststoffen zu minimieren, vermeiden Sie die Verwendung von Probenahmegeräten und Lagerbehältern aus Kunststoff. Stattdessen werden nicht-plastische Behälter wie Aluminiumfolie verwendet, um die Proben zu sammeln und zu lagern. Diese Proben können entweder in großen Mengen zu einer Mischprobe zusammengefasst oder als unabhängige Replikate aufbewahrt werden.
  2. Trocknen Sie die Erde bei Raumtemperatur ohne direkte Sonneneinstrahlung.
    1. Wenn ein Bodentrockner zur Verfügung steht, können Sie damit mehrere Bodenproben gleichzeitig verarbeiten, da der Filter in den einzelnen Kammern das Risiko einer Kreuzkontamination minimiert.
    2. Andernfalls verwenden Sie einen auf 40 °C eingestellten Ofen und trocknen Sie den Boden mindestens 24 Stunden lang, bis er vollständig trocken ist.
    3. Mahlen und sieben Sie die trockene Erde mit einem 2-5 mm Metallsieb. Entfernen Sie sichtbares Pflanzenmaterial, Steine und andere inerte Materialien.
      HINWEIS: Decken Sie den Boden locker mit Alufolie ab, um die Kontamination in der Luft im Ofen/Trockner zu minimieren. Sammeln Sie sichtbare Plastikreste (> 5 mm) mit einer Metallpinzette aus dem Boden und legen Sie sie in einen plastikfreien Vorratsbehälter, falls später eine Analyse von Makroplastik durchgeführt werden soll.
  3. Wiegen Sie mit einer 2-Dezimalstellen-Waage 5,0 g ± 0,05 g der Bodenprobe auf ein plastikfreies Wiegepapier oder eine Alufolie ab. Verwenden Sie ein neues Wägepapier für verschiedene Proben, um Kreuzkontaminationen zu minimieren. Die Proben können in plastikfreien Behältern (z. B. Glasfläschchen) aufbewahrt werden.

2. Dichte-Flotation

  1. Übertragen Sie die 5,0 g getrocknete Bodenprobe in ein sauberes 600 mL Glasbecherglas (Becher A). Stellen Sie eine genaue Etikettierung aller Vorratsbehälter und Becher sicher.
  2. Geben Sie 230 mL gesättigte NaCl-Lösung in das Becherglas A. Stellen Sie das Becherglas A auf eine magnetische Rührplatte und fügen Sie einen Glasmagnetrührer hinzu. Rühren Sie die Lösung 30 Minuten lang bei 260 U/min, bis sie vollständig homogenisiert ist.
  3. Sobald die Lösung vollständig homogenisiert ist, nehmen Sie den Magnetrührer aus der Lösung und spülen Sie sie mit gesättigter NaCl-Lösung, um zu verhindern, dass Kunststoffpartikel aus der Lösung herausgetragen werden. Stellen Sie das Becherglas auf eine ebene Fläche ohne direkte Sonneneinstrahlung und lassen Sie es über Nacht stehen, bis die vollständige Dichtetrennung erfolgt ist.
    HINWEIS: Bei der Durchführung des gesamten Verfahrens ist es notwendig, ihn vollständig mit Aluminiumfolie abzudecken, um Kunststoffverunreinigungen aus der Luft zu vermeiden.

3. Verdauung von Verunreinigungen

  1. Sobald sich der Inhalt des Bechers A vollständig abgetrennt hat, wird der Überstand vorsichtig in ein neues, sauberes 600-ml-Glasbecherglas (Becher B) umgefüllt. Die Innenwände des Becherglases A werden vorsichtig mit gesättigter NaCl-Lösung gespült. Übertragen Sie den Überstand in das Becherglas B. Führen Sie diesen Vorgang 2-3 Mal durch.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, dass insgesamt 200 ml Überstand vorhanden sind. Im nächsten Schritt ist sicherzustellen, dass das Gesamtüberstandsvolumen konstant ist, während die gleiche Konzentration der Aufschlusslösung beibehalten wird.
  2. Geben Sie 4 M NaOH-Lösung in die Probe im Becherglas B, um ein festes Volumen von 500 ml zu erreichen. Becherglas B auf eine Magnetrührplatte stellen, einen Glasmagnetrührer hinzufügen und die Lösung 30 Minuten lang bei 260 U/min rühren, bis sie vollständig homogenisiert ist. Halten Sie den Becher während dieses Vorgangs mit Aluminiumfolie bedeckt, um eine Kontamination in der Luft zu minimieren.
  3. Sobald die Lösung vollständig homogenisiert ist, nehmen Sie den Magnetrührer aus der Lösung und spülen Sie ihn mit gesättigter NaCl-Lösung ab, um anhaftende Partikel zu entfernen. Becherglas B wird auf eine ebene Fläche ohne direkte Sonneneinstrahlung gestellt und über Nacht stehen gelassen, bis die vollständige Dichtetrennung und der Aufschluss der organischen Substanz stattgefunden haben.
    HINWEIS: Bei der Durchführung des gesamten Verfahrens ist es notwendig, die Lösung vollständig mit Aluminiumfolie abzudecken, um zu vermeiden, dass Kunststoffverunreinigungen aus der Luft in die Lösung gelangen. Die Dauer des Aufschlusses hängt von der Menge und der Art des organischen Materials ab. Verlängern Sie bei Bedarf die Aufschlusszeit, um einen vollständigen Aufschluss der organischen Substanz zu gewährleisten. Nach erfolgreicher Verdauung sollte der Überstand klar aussehen und keine sichtbaren organischen Stoffe im Becherglas schwimmen.

4. Färbung mit Nilrot-Lösung

  1. Sobald sich der Inhalt des Bechers B vollständig getrennt hat, wird der Überstand vorsichtig in ein neues, sauberes 600-ml-Glasbecherglas (Becher C) umgefüllt. Spülen Sie die Innenwände des Becherglases B mit DI-Wasser, um einen maximalen Partikeltransfer zu gewährleisten.
    1. Wenn das Volumen im Becherglas C weniger als 500 ml beträgt, füllen Sie den Wert mit VE-Wasser auf 500 mL auf, um das Lösungsvolumen zu vereinheitlichen.
  2. Die Nilrote Lösung wird in das Becherglas C gegeben, um eine maximale Endkonzentration von 0,5 M zu erreichen. Die Lösung wird mit einem Glasstab umgerührt, bis sie vollständig homogenisiert ist, und dann die Lösung 30 Minuten lang im Dunkeln inkubieren lassen, indem das Becherglas mit Alufolie abgedeckt wird.

5. Vakuumfiltration

  1. Richten Sie die Vakuumfiltrationsgeräte in der folgenden Reihenfolge ein: Glastrichter, Metallklemme, Vakuumfiltrationsbasis, Auffangbecher, Anschlussschlauch, Feuchtigkeitsfalle und Vakuumpumpe. Entnehmen Sie eine neue Membran (0,2 μm Porengröße, 47 mm Durchmesser) vorsichtig mit einer Metallzange aus dem Vorratsbehälter. Platzieren Sie die Filtermembran mittig und flach auf der Oberseite des Vakuumfiltrationsbodens.
    HINWEIS: Sorgen Sie für eine sichere Verbindung, indem Sie den Vakuumfiltersockel mit dem Glastrichter ausrichten und mit einer Metallklemme befestigen.
  2. Aktivieren Sie die Vakuumfiltration und gießen Sie die Flüssigkeit aus dem Becherglas C langsam in den Glastrichter. Spülen Sie das Becherglas C mehrmals mit DI-Wasser, um die Partikelrückgewinnung zu maximieren. Spülen Sie die Seiten des Glastrichters nach der Probenfiltration mit DI-Wasser, um einen minimalen Partikelverlust zu gewährleisten.
    HINWEIS: Decken Sie den Glastrichter mit Aluminiumfolie ab, um die Kontamination in der Luft während des Filtrationsprozesses zu minimieren. Wenn die Probe eine hohe Partikelzahl aufweist und die Filtrationsgeschwindigkeit abnimmt, können mehrere Membranen für dieselbe Probe verwendet werden. Dies gewährleistet eine gleichmäßige Verteilung der Partikel auf der Membran und minimiert das Risiko, dass sich die Partikel für eine spätere Quantifizierung aggregieren und überlappen.
  3. Sobald die Filtration abgeschlossen ist, nehmen Sie die Filtermembran vorsichtig mit einer Pinzette aus der porösen Platte und legen Sie jede Membran in eine einzelne Petrischale aus Glas. Lassen Sie die Membran vollständig trocknen, bevor Sie die Petrischale verschließen und in Alufolie einwickeln. Lagern Sie es bis zur weiteren Analyse an einem trockenen und dunklen Ort.

6. MPS-Partikelquantifizierung durch Fluoreszenzmikroskopie

  1. Wenn die genaue Position der fluoreszierenden Partikel auf der Membran für eine spätere Polymeridentifizierung (z. B. durch Verwendung von FTIR) erforderlich ist, befolgen Sie bitte die folgenden Schritte:
    1. Markieren Sie mit einem schwarzen Gelstift vorsichtig die Anfangsposition und 10 Markierungen auf der Filtermembran, wobei Sie der Form des "Z" folgen (Abbildung 2). Legen Sie die Membran vorsichtig mit einer Pinzette auf die Objektträger auf dem Mikroskoptisch und sorgen Sie für eine ebene Probenoberfläche.
    2. Aktivieren Sie das Fluoreszenzmessgerät in der folgenden Reihenfolge: Wirt, Fluoreszenzquellen, Monitor und Fluoreszenzmikroskop. Schalten Sie das Instrument ein und stellen Sie den Lichtknopf der Quelle auf maximale Helligkeit. Verwenden Sie die Schalttasten für Hellfeld (BF) und Leuchtstoffröhrenlicht (FL), um BF- bzw. FL-Bilder aufzunehmen.
    3. Nehmen Sie mit der Software für die Probenbeobachtung und -aufzeichnung (z. B. DP2-BSW) Hellfeldbilder unter der BF-Position auf. Drehen Sie den Knopf in die FL-Position und fotografieren Sie mit dem Fluoreszenzfilter im Dunkeln. Stellen Sie sicher, dass die Beobachtungssequenz des Sichtfelds von 1 bis 10 verläuft. Stellen Sie sicher, dass die FL- und BL-Bilder in derselben Position aufgenommen wurden.
      HINWEIS: Die fluoreszenzmikroskopische Analyse sollte innerhalb von 24-48 Stunden nach der Filtration durchgeführt werden, um eine optimale Fluoreszenz der Partikel zu gewährleisten. Stellen Sie sicher, dass die BF- und FL-Bilder an derselben Position aufgenommen wurden (Abbildung 3). Stellen Sie sicher, dass alle Membranen mit der gleichen Vergrößerung und den gleichen Instrumenteneinstellungen analysiert werden.
  2. Führen Sie für die Polymeridentifizierung mit LDIR die folgenden Mikroskopschritte aus:
    1. Richten Sie das Mikroskopiesystem wie folgt ein: Kamera, Filter, Vergrößerungen und Mikroskoptisch sowie Computer. Wählen Sie den geeigneten Filtermodus aus, der für die gewünschten Anregungs- und Emissionswellenlängen (z. B. 470 nm bzw. 495 nm) in Abhängigkeit von der Proben- und Hintergrundfluoreszenz am besten geeignet ist.
    2. Wischen Sie die Filtermembranhalter mit staubfreien Tüchern ab, befestigen Sie die Membran dann in der Halterung und schieben Sie sie auf den Mikroskoptisch. Scannen Sie die gesamte Membran visuell, um eine gleichmäßige Verteilung der Partikel zu gewährleisten.
    3. Stellen Sie sicher, dass die Kamera angeschlossen ist und die Mikroskopvergrößerung für alle Probentypen geeignet und für alle Proben aus demselben Set konsistent ist. Bestimmen Sie die Größe des mit der Kamera aufgenommenen Bereichs in mm, bevor Sie die Analyse starten, indem Sie ein Maßband verwenden.
      HINWEIS: Wenn die Partikel gleichmäßig verteilt sind, analysieren Sie mindestens 10 % der gesamten Membranfläche, indem Sie die erforderliche Anzahl von Probenahmepunkten auf der Membran auswählen. Machen Sie mit der Kamera ein Foto von jedem Probenahmepunkt.

7. MPS-Polymeridentifizierung mittels FTIR- oder LDIR-Spektroskopie

  1. Wenn FTIR zur Identifizierung von Polymerpartikeln verwendet wird, befolgen Sie bitte die folgenden Schritte.
    1. Schalten Sie das FTIR-Spektrometer und die entsprechende Software für die Probenbeobachtung und -aufzeichnung ein. Reinigen Sie die Sonde, bevor Sie jede Probe messen.
    2. Identifizieren Sie die Partikel für die Überwachung durch Echtzeit-Bildschirmaufzeichnung. Passen Sie Position und Schärfe an, indem Sie die Wippe manipulieren. Bringen Sie die Bedienplattform in die Mitte und erfassen Sie das aktuelle Lufthintergrundspektrum.
      HINWEIS: Zielt auf Partikel ab, die sowohl BF- als auch FL-Bildern entsprechen.
    3. Messen Sie 3-5 Fixpunkte an jedem Partikel, um Spektren im infraroten Wellenzahlbereich von 400-4.000 cm-1 zu erhalten. Speichern Sie auf der Ergebnisseite die Originaldaten, rufen Sie das Spektrum ab und vergleichen Sie es mit dem Kunststoffspektrum in der Standardbibliothek, um den Trefferqualitätsindex der Probe zu bestätigen (Abbildung 4).
      HINWEIS: In dieser Studie wurden aufgrund der geringen Größe der MP und der Herausforderungen bei der Quantifizierung über den gesamten Filter 5-7 repräsentative Partikel aus jeder Probe für die FTIR-Analyse ausgewählt. Um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten, wurden Partikel ausgewählt, die einem "Z-förmigen" Muster über den Filter folgen. Es ist jedoch zu beachten, dass eine gewisse Unsicherheit auftreten kann, da die Partikel nach dem Zufallsprinzip ausgewählt wurden und nicht durch Scannen des gesamten Filters.
    4. Eine Übereinstimmung wird akzeptiert, wenn der Trefferqualitätsindex (HQI) 0,7 ≥. Abbildung 4 zeigt ein Beispiel für Partikel, die durch FTIR-Spektroskopie in einer Bodenprobe identifiziert wurden, die mit 0,04 % PE-MP versetzt war.
  2. Wenn LDIR für die Identifizierung von Polymerpartikeln verwendet wird, führen Sie die folgenden Schritte aus:
    1. Sobald die Schritte des Fluoreszenzmikroskops abgeschlossen sind, resuspendieren Sie die Partikel für die Analyse auf dem LDIR. Setzen Sie die Filtermembran in ein neues Glasfläschchen ein und fügen Sie 20 mL reines Ethanol hinzu. Verschließen Sie die Fläschchen fest und umwickeln Sie die Deckel mit Paraffinfolie, um ein Auslaufen zu verhindern.
    2. Die Proben werden mindestens 1 h lang in einem Ultraschallbad beschallt, bis alle Partikel resuspendiert sind. Entfernen Sie die Membran von der Durchstechflasche aus Glas und entsorgen Sie sie.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Membranseite mit den Partikeln nach innen, d. h. von der Fläschchenwand weg, zeigt. Die Beschallungszeit hängt vom verwendeten Membrantyp ab. Die Membran kann Farbe auslaugen, aber dies beeinträchtigt die Polymeridentifikation nicht.
    3. Bestätigen Sie die erfolgreiche Partikelresuspension, indem Sie die Membranen unter dem Fluoreszenzmikroskop erneut analysieren und sicherstellen, dass die Partikelentfernung > 95 % beträgt.
    4. Stellen Sie die Glasfläschchen mit der Ethanollösung auf eine magnetische Rührplatte und geben Sie einen kleinen magnetischen Glasrührer in das Fläschchen. Lassen Sie das Ethanol auf weniger als 5 ml verdampfen, indem Sie die Temperatur der Platte auf 100 °C einstellen und mit niedriger Geschwindigkeit rühren, um die Partikel in der Schwebe zu halten.
      HINWEIS: Decken Sie die Fläschchen leicht mit Aluminiumfolie ab, um eine Kontamination der Proben in der Luft zu minimieren. Optional kann die Lösung unter einem sanften Stickstoffstrahl zur Ethanolverdampfung getrocknet werden.
    5. Übertragen Sie die Probe in ein kleines 8-ml-Glasfläschchen und spülen Sie das 20-ml-Glasfläschchen mit neuem Ethanol, um die Partikelrückgewinnung zu maximieren.
      HINWEIS: Geben Sie bei Bedarf neues Ethanol in das kleine Glasfläschchen, um genau 5 ml zu erreichen.
    6. Um die Probe für die Analyse auf dem LDIR vorzubereiten, schütteln Sie die Probe gründlich, bis alle Partikel homogen in der Lösung suspendiert sind, pipettieren Sie schnell 10 μl der Probe auf den Objektträger und lassen Sie das Ethanol verdampfen. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zwei weitere Male, um 3 Replikate pro Probe auf jedem Objektträger zu analysieren.
    7. Verwenden Sie das Partikelanalysewerkzeug in der zugehörigen Software, um die Infrarotspektren jedes Partikels innerhalb des eingestellten Größenbereichs zu messen und sie mit der internen Bibliothek zur Polymeridentifizierung abzugleichen.
      HINWEIS: Ein Punkt auf jedem Partikel wird automatisch im infraroten Wellenzahlbereich von 800-1800 cm-1 gemessen, und die Partikel werden automatisch mit bekannten Bibliotheksspektren von Polymeren und anderen organischen und anorganischen Materialien abgeglichen.
    8. Wenn der Trefferqualitätsindex (HQI) 0,8 ≥, wird die Übereinstimmung akzeptiert. Abbildung 5 zeigt ein Beispiel für Partikel, die durch LDIR-Spektroskopie in einer Bodenprobe identifiziert wurden, die mit 0,04 % PE-MP dotiert war.
      HINWEIS: Das Probenvolumen kann bei Proben mit geringer Partikelzahl erhöht werden.

8. Partikelquantifizierung von fluoreszierenden Membranbildern mit ImageJ

  1. Öffnen Sie ImageJ32 (Version 1.54f) und laden Sie Bilder in die Software. Stellen Sie den Maßstab des Bildes auf die korrekten Maße ein, die der tatsächlichen Bildgröße entsprechen. Verwenden Sie die Funktionen Analysieren > Maßstab auf Eingabe von Bildpixel- und -größenwerten (mm) festlegen und wählen Sie dann Global , um diese Einstellungen während der Sitzung auf alle Bilder anzuwenden.
  2. Wandeln Sie das Bild in ein binäres Bild um und konvertieren Sie es in 8-Bit, indem Sie die Funktionen > Binär verarbeiten bzw. Bild > Typ > 8-Bit verwenden. Um die Parameter für die Partikelanalyse auszuwählen, verwenden Sie die Funktionen Analysieren > Messungen einstellen und wählen Sie die gewünschten Parameter, z. B. Fläche, Formdeskriptoren und Feret-Durchmesser. Wählen Sie Zu Overlay hinzufügen aus, und legen Sie die Anzahl der Dezimalstellen für die Datenausgabe fest.
  3. Um Partikel zu analysieren, wählen Sie Analysieren > Partikel analysieren und bestimmen Sie den gewünschten Partikelgrößenbereich. Legen Sie die Rundheit auf 0-1 fest, deaktivieren Sie die Pixeleinheiten, aktivieren Sie die Anzeige von Überlagerung, und aktivieren Sie die folgenden Kontrollkästchen: Ergebnisse anzeigen, Kanten ausschließen, Ergebnisse löschen, Löcher einschließen, Zusammenfassen und Überlagern. Exportieren Sie die Ergebnisse als .csv Dateien aus dem Ergebnisfenster.
    HINWEIS: Die Analyse von Fluoreszenzbildern liefert nur Informationen über die Partikelzahl, nicht über die Polymerzahl. Daher ist ein zusätzliches Identifizierungsverfahren erforderlich, z. B. mit Hilfe von IR-Spektroskopie-Techniken.

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Ergebnisse

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Um die Wiederfindungsraten dieser Methode zu validieren, wurden Proben aus drei verschiedenen festen Matrices (Siliziumdioxid (SD), Bentonitton (BT) und Boden) in Sätzen von drei Replikaten analysiert. Die Proben wurden mit und ohne Zusatz von 0,04 Gew. -% Mikroplastik aus weißem Polyethylen (PE) (Partikelgrößenbereich 40-48 μm) analysiert. Bodenproben wurden aus dem Distrikt Haidian, Peking, China (China Agricultural University West Campus) entnommen, und der Boden wurde als Umbraboden klassifiziert. Darüber hi...

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Diskussion

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Die Strategie der Bodenprobenahme im Feld, einschließlich Ansätzen wie einfacher Stichproben oder systematischer Rasterprobenahme, sowie der Probenahmebereich und die Probenahmetiefe müssen auf die spezifischen Forschungsfragen zugeschnitten und vor der Probenentnahme klar definiert werden. Einige Studien konzentrierten sich auf die Oberbodenschicht von 0-10 cm 34,37, während andere Bodenproben mit einer Tiefe von 0-40 cm

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Dieses Projekt wurde unterstützt durch das Science and Technology Major Project von Ordos, China [ZD20232320]; der UKRI Global Challenges Research Fund (GCRF) und das Projekt des Natural Environment Research Council mit dem Titel "Do agricultural microplastics under mine food security and sustainable development in less economic developed countries?" im Rahmen von Grant [NE/V005871/1]; und die National Natural Science Foundation of China unter Grant [42277097]; das High-Level-Team-Projekt der China Agricultural University, die Professorenstation der China Agricultural University am Xinzhou Center for Disease Control and Prevention and Basic Research Program in Xinzhou, Provinz Shanxi [20230515] und die internationale Zusammenarbeit und der Austausch der National Natural Science Foundation of China unter Grant [NSFC-UNEP: 32261143459].

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2-Dezimal-Saldon/an/aStandard 2-Dezimal-Saldo
40 ° C-Ofenn/an/aStandardmäßiger großer Umluftofen mit einer Temperatureinstellung von 40 °; C
8700LDIR Agilent Technologiesn/aLDIR zur Identifizierung von Partikeln
Aluminiumbehältern/an/aStandard-Aluminiumbehälter zum
Mitnehmen Aluminiumfolien/an/aStandard-Hochleistungs-Aluminiumfolie
Axioplan 2Zeissn/aDie Fluoreszenzmikroskopie dient zur Beobachtung von Mikroplastikpartikeln im fluoreszierenden Zustand
Bentonit-TonSigma Aldrich285234Bentonit-Ton wird für Erholungstests verwendet
BX53Olympusn/aDie Fluoreszenzmikroskopie dient zur Beobachtung von Mikroplastikpartikeln im fluoreszierenden Zustand
Glasbecher (600 ml)n/an/aStandard-Glasbecher
Glasflasche (1 l)n/an/aStandard-Glasflasche
Glas magnetisch Rührstabn/an/aStandard glasbeschichteter magnetischer Rührstab
Glasmesszylinder (500 ml)n/an/aStandard-Glasmesszylinder
Glaspipette (10 ml)
Glas-VakuumfiltrationsgerätPyrex (über Sigma Aldrich erhältlich)SLW5809/KITGlasfiltrationsgerät mit 500 ml Trichter, poröser Platte und 1 l Auffangbecher
LUMOS Alpha IIBrukern/aFTIR zur Analyse von verdächtigem Mikroplastik.
Magnetrührplatten/an/aStandard Magnetrührplatte
MCE FiltermembranFirma JintengJTMF0441/0442Weiße MCE Membranen, 0,2 & Mikro; m Porengröße, 50 mm Durchmesser, mit FTIR-Methode
Nile RedFisher Scientific10464311Nile Red Pulver zur Herstellung einer Stammlösung aus Nilrot-Farbstoff unter Verwendung eines geeigneten Lösungsmittels (z. B. Aceton)
PCTE-FiltermembranSterlitech Corporation1270060Schwarze PCTE-Membranen, PVP-frei, 0,2 & Mikro; m Porengröße, 47 mm Durchmesser, mit LDIR-Methode
SiliziumdioxidSigma Aldrich18649Siliziumdioxid für Wiederfindungstests
NatriumchloridSigma AldrichS9888Natriumchlorid für die Dichtetrennung
NatriumhydroxidFisher Scientific10675692Natriumhydroxid für den Aufschluss organischer Stoffe
Erdschnecken/an/aLänge 30 cm; Durchmesser 2 cm; Material Edelstahl
Mikroplastikpulver aus Polyethylen mit ultrahohem MolekulargewichtSigma Aldrich434272Polyethylen-Mikroplastik zum Aufspießen von Siliziumdioxid-, Bentonit-Ton- und Bodenproben für Rückgewinnungstests Vakuumpumpe
Vacuubrand GmBH Co KGME 2C NTVakuumpumpe für die Vakuumfiltration

Referenzen

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Microplastics SeparationSoil MicroplasticsDensity FlotationPolymer IdentificationVacuum FiltrationFluorescent MicroscopySodium Chloride SeparationFourier Transform InfraredLaser Direct InfraredSoil Sampling

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