Humane iPSC-abgeleitete 3D-Leberorganoide stellen ein potenzielles Werkzeug dar, um die Wirkung des Schilddrüsenhormons auf die Leberentwicklung zu verstehen.
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Methodenartikel
Humane iPSC-abgeleitete 3D-Leberorganoide stellen ein potenzielles Werkzeug dar, um die Wirkung des Schilddrüsenhormons auf die Leberentwicklung zu verstehen.
Die Gewinnung stabiler Leberzellen in Kultur stellt eine große Herausforderung für Leberstudien dar. Vor diesem Hintergrund wird ein optimiertes Verfahren dargestellt, bei dem humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSCs) zur Erzeugung von 3D-Kulturen von humanen Leberorganoiden (HHOs) verwendet werden. Die Verwendung von HHOs bietet einen wertvollen Ansatz zum Verständnis der Leberentwicklung, zur Entschlüsselung von Lebererkrankungen, zur Durchführung von Hochdurchsatzstudien für die Arzneimittelentwicklung und zur Erforschung des Potenzials für Lebertransplantationen. In der ersten Untersuchung wurde die Progression durch Immunfluoreszenz und quantitative RT-PCR-Techniken überwacht, indem das Vorhandensein verschiedener Zellpopulationen, wie z. B. Hepatoblasten und der beiden Arten von Hepatoblasten-abgeleiteten Zellen: Cholangiozyten oder hepatozytenähnliche Zellen, über verschiedene Entwicklungsstadien hinweg identifiziert wurde. Dieser Bericht stellt ein einfaches 3D-Protokoll vor, das von hiPSC ausgeht und HHOs erfasst, die die Stadien der menschlichen Embryonalentwicklung widerspiegeln. Das Protokoll, das sich über 46 bis 50 Tage erstreckt, umfasst mehrere Schritte: (i) sorgfältiges Management der hiPSC-Kultur zur Erzeugung von HHOs, (ii) Initiierung der Zelldifferenzierung in 2D und den anschließenden Übergang zu 3D und (iii) eine optimierte Dissoziationsstrategie zur Zerlegung von HHOs in Einzelzellen für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung. Um die breite Anwendung dieses Ansatzes zu veranschaulichen, wurde das vorliegende Protokoll zuvor angewendet, um die Rolle der Schilddrüsenhormon-Signalübertragung bei der Entwicklung von Leberzellen zu entschlüsseln.
Die Leber erfüllt verschiedene Stoffwechselfunktionen, wie z.B. die Regulierung der Verfügbarkeit von leicht nutzbaren Energiesubstraten wie Glukose- und Ketonkörpern sowie die Entgiftung xenobiotischer Verbindungen. In den letzten Jahren ist ein signifikanter Anstieg der Prävalenz von Lebererkrankungen zu verzeichnen, die weitgehend auf die nichtalkoholische Steatohepatitis (NASH) zurückzuführen sind und unbehandelt zu Leberzirrhose oder Krebs führen können1. Daher ist es unerlässlich, die Stoffwechselfunktionen der Leber und der damit verbundenen Krankheiten zu verstehen, um die Entwicklung wirksamer Behandlu....
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1. Management von hiPSC
HINWEIS: hiPSCs (CS03iCTR-n3-Zelllinie) wurden kommerziell gekauft. Das richtige Management der extrazellulären Matrix-Gel-Beschichtung und des hiPS-Mediums ist der Schlüssel, um die hiPSCs an den Platten zu befestigen und ihnen zuzuführen. Hier wurden die Volumina beschrieben, die für eine 6-Well-Platte benötigt werden. Die verbleibenden hiPS-Zellen aus der 6-Well-Platte, die sich nicht in Organoide differenzieren, können zur Langzeitlagerung in flüssigem Stickstoff gelagert werden.
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Jede Stufe dieses Protokolls der schrittweisen Differenzierung von hiPSC in HHOs wurde unter Verwendung quantitativer Messungen mittels qPCR und Immunfluoreszenz von stadienspezifischen bekannten Markern aus der Bibliographie definiert (Abbildung 2). Die Schritt-für-Schritt-Vorgehensweise beider Techniken und die erzielten Ergebnisse in Bezug auf die korrekte Differenzierung in HOs wurden in14 dargestellt. In der vorangegangenen Untersuchung wurden hiPSCs über die mRN.......
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Das aktuelle Protokoll bietet verschiedene methodische Details zum Umgang mit hiPS-Zellen und den anschließenden 3D-Organoidkulturen. Dazu gehören die beiden wichtigsten kritischen Schritte: (i) das Ablösen der 2D-Kulturen und ihre Entwicklung zu 3D-Leberorganoiden nach 10 Tagen sowie (ii) die zarte Dissoziation einer 3D-Struktur in einzelne Zellen. Basierend auf den verfügbaren Informationen ist dies der erste Bericht über ein 3D-HHO-Modell zur Untersuchung der Wirkung von Schilddrüsenh.......
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Antonio C. Bianco ist Berater für Abbvie, Acella, Aligos und Synthonics. Die anderen Autoren haben keine relevanten Angaben.
Diese Arbeit wurde unterstützt vom National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK -DK58538, DK65066, DK77148; ACB).
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 10 & Mikro; L Universal-Pipettenspitzen Gefiltert, geringe Rentabilität, vorsteril | VWR | 613-6462 | Alle Verfahren |
| 1000 & Mikro; L Universal-Pipettenspitzen Gefiltert, geringe Rentabilität, vorsteril | VWR | 613-6470 | Alle Verfahren |
| 15 mL Polypropylen Konisches Röhrchen | Falcon (Corning) | 352097 | Dissoziation Leber-Organoide |
| 200 & Mikro; L Universal-Pipettenspitzen Gefiltert, geringe Rentabilität, vorsteril | VWR | 613-6465 | Alle Verfahren |
| 3,3',5-Trijod-L-Thyronin | Sigma | T2877-100 | Leber-Organoid-Differenzierung |
| 40 μ m Zell-Sieb | Corning | 431750 | Dissoziation Leberorganoide |
| 50 mL Röhrchen | Falcon (Corning) | 352070 | Alle Verfahren |
| Nunc Zellkultur-behandelte Multischalen mit 6-Well-Platten | Thermo fisher wissenschaftliche | 140675 | hiPSC-Wartung |
| A83-01 | Forschung & Forschung D Systems | 2939/10 | Differenzierung von Leberorganoiden |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | Differenzierung von Leberorganoiden |
| ART Filtrierte Pipettenspitzen mit breiter Bohrung | ART | 2069GPK | Alle Verfahren |
| B27 Ergänzung | Gibco | 17504044 | Differenzierung von hepatischen Organoiden |
| BMP7 | Forschung & Forschung D Systems | 354-BP-010/CF | Leber-Organoid-Differenzierung |
| Rinderalbumin-Fraktion V (7,5%ige Lösung) | Gibco | 15260037 | Dissoziation Leber Organoide |
| BSA, Fraktion V, fettsäurefrei für Gewebekultur | GoldBio | A-421-100 | Dissoziation Leber Organoide |
| CHIR99021 | R& D Systems | 4423/10 | Differenzierung von hepatischen Organoiden |
| Corning 96-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment | Corning | 3474 | Differenzierung von hepatischen Organoiden |
| Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment | Corning | 3471 | Hepatische Organoid-Differenzierung |
| CS03iCTR-n3 humane induzierte pluripotente Stammzelllinie | Cedar-sinai | hiPSC Wartung | |
| DAPT | R& D Systems | 2634/10 | Differenzierung von hepatischen Organoiden |
| dbCAMP | Millipore Sigma | D0627-100MG | Differenzierung von hepatischen Organoiden |
| Dexamethason | R& D Systems | 1126/100 | Hepatische Organoid-Differenzierung |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | hiPSC-Erhaltungs-DNAse |
| I, RNase-frei, HC | Thermo Fisher scientific | EN0523 | Dissoziation Leber-Organoide |
| Falcon 10 mL Serologischer Pipet, Polystyrol, 0,1 Inkremente, einzeln verpackt, steril | Corning | 357551 | Alle Verfahren |
| Falcon 5 mL Serologische Pipette, Polystyrol, 0,1 Schritte, einzeln verpackt, steril | Corning | 357543 | Alle Verfahren |
| Falcon 50 mL Serologische Pipette, Polystyrol, 1,0 Schritte, einzeln verpackt, steril | Corning | 357550 | Alle Verfahren |
| Reagenz für sanfte Zelldissoziation (GCDR) | Stemcell Technologies | 100-0485 | Differenzierung von Leberorganoiden |
| Glutamax Ergänzung | Gibco | 35050061 | Differenzierung von Leberorganoiden |
| L-Thyroxin | Sigma | T1775-1G | Differenzierung von Leberorganoiden |
| Matrigel hESC-qualifizierte Matrix, LDEV-frei, 5 mL | Corning | 354277 | Extrazelluläres Matrixgel |
| mFreSR | Stemcell Technologies | 5855 | hiPSC Kryokonservierungsmedium |
| mTeSR 5x Ergänzung | Stemcell Technologies | 100-0276 | hiPSC medium |
| mTeSR Plus | Stemcell Technologies | 100-0276 | hiPSC medium |
| Multi-Plattform-Schüttler | Fisherbrand (Thermo Fisher Technologien) | 88861021 | Differenzierung von Leberorganoiden |
| Gibco | 17502048 | Differenzierung von Leberorganoiden | |
| Nicotinamid | Forschung & Forschung D Systems | 4106/50 | Leber-Organoid-Differenzierung |
| PBS, pH 7,4 | Gibco | 10010023 | hiPSC Erhaltung |
| Rekombinantes humanes BMP4 | Forschung & Forschung D Systems | 314-BP-010/CF | Differenzierung von Leberorganoiden |
| Rekombinante humane EGF | F& T & D Systems | 236-EG-200 | Hepatische Organoid-Differenzierung |
| Rekombinante humane FGF basisch/FGF2/bFGF | F& D Systems | 233-FB-010/CF | Leber-Organoid-Differenzierung |
| Rekombinante humane FGF19 | F& Technik D Systems | 959-FG-025/CF | Leber-Organoid-Differenzierung |
| Rekombinantes humanes HGF | F& T & D Systems | 294-HG-005/CF | Hepatische Organoid-Differenzierung |
| Rekombinante humane Zacken-1 Fc-Chimäre | Forschung & Forschung D Systems | 1277-JG-050 | Hepatische Organoid-Differenzierung |
| Rekombinantes humanes KGF/FGF7 | F& T & D Systems | 251-KG-010/CF | Leber-Organoid-Differenzierung |
| ReLeSR | Stemcell Technologies | 100-0483 | hiPSC-Ablösungsmedium |
| RNAse Inhibitor Ambion, kloniert, 40 U/μ L | Invitrogen | AM2682 | Dissoziation Leberorganoide |
| RNase Zap | Invitrogen | AM9780 | Dissoziation Leberorganoide |
| Sorvall Legend XT/XF Zentrifuge Serie | Thermo Fisher Scientific | 75004539 | Alle Verfahren |
| STEMdiff Definitive Endoderm Kit | Stemcell Technologies | 5110 | Hepatische Organoid-Differenzierung |
| Trypanblau-Lösung (0,4%) | Gibco | 15250061 | Farbstoff |
| Lösung TrypLE Express Enzym | Gibco | 12604013 | Zelldissoziationsenzym |
| Trypsin 0,5% - EDTA (10X) | Gibco | 15400054 | Dissoziation Leberorganoide |
| Valproinsäure, Natriumsalz | R& D Systems | 2815/100 | Leber-Organoid-Differenzierung |
| Vari-Mix Plattformwippe | Thermo Fisher wissenschaftliche | M79735Q | Dissoziation Leberorganoide |
| Y-27632 Dihydrochlorid | R& D Systems | 1254 | Differenzierung von hepatischen Organoiden |
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