Integratives Protokoll zur Erzeugung von iPSC-abgeleiteten 3D-Organoiden der menschlichen Leber

Zusammenfassung

Humane iPSC-abgeleitete 3D-Leberorganoide stellen ein potenzielles Werkzeug dar, um die Wirkung des Schilddrüsenhormons auf die Leberentwicklung zu verstehen.

Zusammenfassung

Die Gewinnung stabiler Leberzellen in Kultur stellt eine große Herausforderung für Leberstudien dar. Vor diesem Hintergrund wird ein optimiertes Verfahren dargestellt, bei dem humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSCs) zur Erzeugung von 3D-Kulturen von humanen Leberorganoiden (HHOs) verwendet werden. Die Verwendung von HHOs bietet einen wertvollen Ansatz zum Verständnis der Leberentwicklung, zur Entschlüsselung von Lebererkrankungen, zur Durchführung von Hochdurchsatzstudien für die Arzneimittelentwicklung und zur Erforschung des Potenzials für Lebertransplantationen. In der ersten Untersuchung wurde die Progression durch Immunfluoreszenz und quantitative RT-PCR-Techniken überwacht, indem das Vorhandensein verschiedener Zellpopulationen, wie z. B. Hepatoblasten und der beiden Arten von Hepatoblasten-abgeleiteten Zellen: Cholangiozyten oder hepatozytenähnliche Zellen, über verschiedene Entwicklungsstadien hinweg identifiziert wurde. Dieser Bericht stellt ein einfaches 3D-Protokoll vor, das von hiPSC ausgeht und HHOs erfasst, die die Stadien der menschlichen Embryonalentwicklung widerspiegeln. Das Protokoll, das sich über 46 bis 50 Tage erstreckt, umfasst mehrere Schritte: (i) sorgfältiges Management der hiPSC-Kultur zur Erzeugung von HHOs, (ii) Initiierung der Zelldifferenzierung in 2D und den anschließenden Übergang zu 3D und (iii) eine optimierte Dissoziationsstrategie zur Zerlegung von HHOs in Einzelzellen für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung. Um die breite Anwendung dieses Ansatzes zu veranschaulichen, wurde das vorliegende Protokoll zuvor angewendet, um die Rolle der Schilddrüsenhormon-Signalübertragung bei der Entwicklung von Leberzellen zu entschlüsseln.

Einleitung

Die Leber erfüllt verschiedene Stoffwechselfunktionen, wie z.B. die Regulierung der Verfügbarkeit von leicht nutzbaren Energiesubstraten wie Glukose- und Ketonkörpern sowie die Entgiftung xenobiotischer Verbindungen. In den letzten Jahren ist ein signifikanter Anstieg der Prävalenz von Lebererkrankungen zu verzeichnen, die weitgehend auf die nichtalkoholische Steatohepatitis (NASH) zurückzuführen sind und unbehandelt zu Leberzirrhose oder Krebs führen können¹. Daher ist es unerlässlich, die Stoffwechselfunktionen der Leber und der damit verbundenen Krankheiten zu verstehen, um die Entwicklung wirksamer Behandlungen zu erleichtern ^2,3.

Das Aufkommen dreidimensionaler (3D) Kulturen hat zur Entwicklung des Organoidmodells geführt, das einen bahnbrechenden und innovativen Ansatz darstellt, um die Funktionalität und Komplexität der Organentwicklung zu untersuchen⁴. Organoide sind definiert als selbstorganisierte 3D-Aggregate differenzierter Zellen, die die Funktionen und die Zytoarchitektur des jeweiligen Organs nachahmen⁵.

In den letzten Jahrzehnten hat eine Vielzahl von Protokollen für humane Leberorganoide (HHO) ein breites Interesse geweckt, das von der Verwendung verschiedener humaner iPSC-abgeleiteter Zellen⁶ oder ausschließlich hepatozytenähnlicher Zellen⁷ bis hin zum Einbau einer Vielzahl komplizierter Mikroumgebungen von Wachstumsfaktoren oder Inhibitoren und der Differenzierung von Vorläuferzellen in Monoschicht⁷ oder 3D⁸ reicht. Diese Ansätze eignen sich für eine Vielzahl potenzieller Ziele, vom Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening⁹ bis hin zur Gewinnung weiterer Einblicke in die Mechanismen, die Lebererkrankungen zugrunde liegen¹⁰.

Hier wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll der HHO-Differenzierung auf der Grundlage der genannten chemischen Hinweise¹¹ durchgeführt, mit methodisch angepassten Variationen. Dieses Protokoll beginnt mit der angemessenen Handhabung und Kultivierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) und beschreibt Techniken für die Manipulation von extrazellulären Matrixgelen, die Zellpassage und die Differenzierung in HHOs. Der Prozess beginnt mit der Stimulierung der Differenzierung von hiPS-Zellen in ein definitives Endoderm (DE)¹² und anschließend mit der Nachahmung der In-vivo-Effekte von FGF und BMP, um die Entwicklung von Monolayer-Zellen des hinteren Vorderdarms (PFG) zu fördern¹³. Die 3D-Architektur wird an Tag 10 erreicht, wenn die PFG-Zellen in eine unreife Leberphase differenziert werden, die zu den Hepatoblasten wird, der fetalen Vorläuferzelle der Cholangiozyten und Hepatozyten². Schließlich werden die 3D-Strukturen für RNA-Sequenzierungsstudien in einzelne Zellen dissoziiert. Als Beispiel für die Anwendbarkeit dieses Protokolls wurde gezeigt, wie sich dieses HHO-Modell für die Untersuchung der Wirkung von Schilddrüsenhormonen und der Typ-2-Deiodinase (D2) auf die Entwicklung von Hepatozyten und Cholangiozyten eignet¹⁴.

Protokoll

1. Management von hiPSC

HINWEIS: hiPSCs (CS03iCTR-n3-Zelllinie) wurden kommerziell gekauft. Das richtige Management der extrazellulären Matrix-Gel-Beschichtung und des hiPS-Mediums ist der Schlüssel, um die hiPSCs an den Platten zu befestigen und ihnen zuzuführen. Hier wurden die Volumina beschrieben, die für eine 6-Well-Platte benötigt werden. Die verbleibenden hiPS-Zellen aus der 6-Well-Platte, die sich nicht in Organoide differenzieren, können zur Langzeitlagerung in flüssigem Stickstoff gelagert werden.

1. Dispensieren von extrazellulärem Matrixgel und hiPSC-Medium
   1. Tauen Sie die Flasche mit dem extrazellulären Matrix-Gel ordnungsgemäß auf, indem Sie sie über Nacht in ein Gefäß mit 4 °C Eis geben.
      HINWEIS: Überprüfen Sie vor der Aliquotierung das Analysezertifikat, um das Volumen für den Verdünnungsfaktor zu überprüfen. Dies stellt die Proteinkonzentration des extrazellulären Matrixgels dar; Daher variiert es von einer Charge zur anderen.
   2. Verteilen Sie das extrazelluläre Matrixgel entsprechend dem Verdünnungsfaktor (4x, 2x und 1x) in geeigneten Aliquoten mit vorgekühlten und markierten Röhrchen. Fügen Sie einen 4-fachen Verdünnungsfaktor aus extrazellulärem Matrixgel zu 25 ml kaltem DMEM/F12 hinzu, um vier 6-Well-Platten zu beschichten. Verschließen Sie die Deckel umgehend mit Labor-Siegelfolie und frieren Sie sie bei -80 °C ein. Vermeiden Sie eine längere Exposition gegenüber der Luft und die Bildung von Blasen in den Aliquoten.
   3. Tauen Sie 100 mL des hiPSC-Ergänzungsmediums über Nacht bei 4 °C auf. Geben Sie es zu 400 mL hiPSC-Basalmedium. Nach der Homogenisierung mit einer serologischen 50-ml-Pipette aliquotieren Sie das hiPSC-Medium in 40-ml-Röhrchen und frieren es bis zur Verwendung bei -20 °C ein.
2. Plattenbeschichtung für die hiPSC-Kultur
   1. Nummerieren und beschriften Sie die 6-Well-Platte(n). Bewahren Sie ein extrazelluläres Matrix-Gel aliquot in der Nähe auf und tauchen Sie es in Trockeneis.
   2. Für die Beschichtung einer 6-Well-Platte verdünnen Sie ein aliquotiertes extrazelluläres Matrixgel (1x) in 6,25 mL kaltes DMEM/F12 (2x in 12,5 mL und 4x in 25 mL DMEM/F12).
   3. Pipettieren Sie ein kleines Volumen DMEM/F12 (~500 μL) in das extrazelluläre Matrix-Gelröhrchen. Schwenken Sie auf und ab, um das extrazelluläre Matrixgel mit kaltem DMEM/F12 aufzutauen und zu homogenisieren, um die Bildung von Blasen zu verhindern, und geben Sie es mit einer serologischen Pipette in den Rest des kalten DMEM/F12-haltigen Röhrchens zurück, um es vollständig zu mischen.
   4. Betten Sie 1 ml extrazelluläres Matrixgel in DMEM/F12 in eine Vertiefung ein, um die 6-Well-Platte zu beschichten (6 mL für die gesamte Platte). Verteilen Sie den 1 ml gleichmäßig auf der Oberfläche, indem Sie die Platte ohne Schütteln bewegen, bis sie vollständig bedeckt ist.
   5. Vor Gebrauch 1 h bei Raumtemperatur (RT) ziehen lassen. Wenn die 6-Well-Platte nicht vollständig verwendet wird, verschließen Sie sie mit Labor-Siegelfolie und lagern Sie sie im Kühlschrank bei 4 °C.
      HINWEIS: Eine beschichtete Platte kann 1 Woche im Kühlschrank bei 4 °C gelagert werden.
3. Auftauen und Kultivierung von hiPSC
   1. Berechnen Sie im Voraus das Volumen von hiPSC medium und warm bei RT zusammen mit der 6-Well-beschichteten Platte 1 h vor der Verwendung (2 mL pro Well).
      HINWEIS: Bei kalten oder gefrorenen Aliquoten sollten diese 15 Minuten vor Gebrauch in einen 37 °C heißen Inkubator oder ein Wasserbad getaucht werden.
   2. 1 ml hiPS-Zellen in flüssigem N₂ aus einem Kryofläschchen in 3 Vertiefungen einer 6-Well-Platte aufteilen (Verhältnis 1:3). Für eine ganze 6-Well-Platte verwenden Sie 2 Kryoröhrchen. Hier beschreibt das Protokoll das Auftauen und die Kultivierung von hiPS-Zellen aus einem Kryofläschchen. Wiederholen Sie den Vorgang für 2 Kryoröhrchen.
   3. Das Kryofläschchen mit ca. 1 ml gefrorenen hiPS-Zellen wird eingeführt, indem es durch die Kappe gehalten und durch das oberflächliche Wasser geschoben wird, wobei der Boden des Fläschchens bis zum Auftauen in ein Wasserbad bei 37 °C getaucht wird.
   4. Nach dem Auftauen besprühen Sie das Kryofläschchen mit Ethanol und pipettieren Sie die 1 ml hiPSCs. Langsam in ein leeres konisches 15-ml-Röhrchen geben. Geben Sie Tropfen für Tropfen 5 mL warmes hiPSC-Medium hinzu und schütteln Sie das Röhrchen leicht.
   5. Das Röhrchen wird bei 300 x g für 5 min bei RT zentrifugiert. Der Überstand wird vorsichtig entfernt, indem man mit einer Glaspipette, die mit dem Vakuum verbunden ist, aspiriert, ohne das Pellet zu stören und etwas Restmedium zu hinterlassen. Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in 6 mL Medium und fügen Sie dann 2 mL pro Well in 3 Wells der 6-Well-Platte hinzu.
      HINWEIS: Lassen Sie kleine Aggregate von hiPSCs für ein korrektes Wachstum übrig.
   6. Biegen Sie die 6-Well-Platte um und aspirieren Sie das extrazelluläre Matrixgel aus der zuvor beschichteten Platte, ohne die Spitze mit dem Boden des Wells zu berühren.
   7. Übertragen Sie 2 mL des Mediums mit hiPSCs pro Well. Schütteln Sie die Platte vorsichtig nach vorne, hinten und von einer Seite zur anderen, um die hiPSC-Aggregate gleichmäßig auf der Platte zu verteilen.
   8. Stellen Sie die 6-Well-Platte bei 37 °C, 5 % CO₂ und 95 % Luftfeuchtigkeit in einen Inkubator. Wechseln Sie das Medium täglich (2 ml pro Well) und überprüfen Sie das fortschreitende Wachstum.
   9. Passage hiPSCs, wenn 80% Wachstumskonfluenz erreicht wird (nach 4-5 Tagen; siehe Abbildung 1A). Zu den Merkmalen gesunder und proliferativer hiPSCs gehören klare Grenzen und eine enge Packung großer Zellkerne im Zentrum der wachsenden Zellaggregationen.
4. Passage von hiPSC
   1. Sobald die hiPSCs eine Konfluenz von 80 % erreicht haben, was etwa 1,2 x 10⁶ Zellen pro Well anzeigt, wird in eine neue 6-Well-Platte überführt. Teilen Sie in einem Verhältnis von 1:3 (von 1 Vertiefung in 3) oder passen Sie das Verhältnis (1:4; 1:6) entsprechend den Anforderungen des Experiments an.
   2. Bereiten Sie vor dem Passaging die erforderliche extrazelluläre Matrix-Geleinbettung für die entsprechende Anzahl von 6-Well-Platten vor, wie in Schritt 1.2 beschrieben.
   3. Entfernen Sie den Überstand aus jeder Vertiefung und fügen Sie 2 ml PBS pro Vertiefung hinzu. Aspirieren Sie das PBS, gefolgt von der Zugabe von 1 ml hiPSC-Ablösemedium pro Vertiefung für 1 Minute. Entfernen Sie dann das 1 mL hiPSC-Ablösemedium.
   4. Stellen Sie die 6-Well-Platte für 7 min in einen Inkubator bei 37 °C. Fügen Sie 1 ml hiPSC-Medium pro Vertiefung hinzu. Lösen Sie es ab und sammeln Sie es, indem Sie 1 ml des hiPSC-Mediums mit den Zellen in das 15-ml-Röhrchen pipettieren.
   5. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 x g für 5 min bei RT. Um die Zellen in eine 6-Well-Platte zu plättieren, wiederholen Sie die Schritte 1.3.5-1.3.7. Stellen Sie die 6-Well-Platte bei 37 °C, 5 % CO 2 und 95 % Luftfeuchtigkeit in einen Inkubator_. Fahren Sie mit Schritt 1.5 fort. um hiPSC bei Bedarf einzufrieren.
5. Einfrieren von hiPSC (optional)
   HINWEIS: Die Anzahl der hiPSCs, die für die Beförderung in HOs erforderlich sind, kann dazu führen, dass Vertiefungen übrig bleiben, die langfristig gelagert werden können. Sollte es notwendig sein, den Durchgang für die Kryoviallagerung zu erweitern, können die hiPSCs über längere Zeiträume aufbewahrt werden.
   1. Tauen Sie das erforderliche Volumen des Kryokonservierungsmediums (1 ml pro Mulde Zellen) bei 4 °C in Eis auf. Beschriften Sie Kryoröhrchen mit der Anzahl der Durchgänge, dem Datum und der Zelllinie. Die Zellen werden mit dem hiPSC-Ablösemedium wie in Schritt 1.4 abgelöst. in einem konischen 15-ml-Röhrchen.
   2. Zentrifugieren Sie bei 300 x g für 5 min bei RT. Saugen Sie den Überstand vollständig an, wobei das Küvettenpellet vorsichtig ungestört bleibt. Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in 1 ml kaltem Kryokonservierungsmedium (pro Vertiefung), indem Sie hiPSC-Aggregate belassen.
      HINWEIS: Wenn die Vertiefungen eine niedrige Dichte von weniger als 50 % konfluent aufweisen, kann 1 ml Kryokonservierungsmedium pro 2 Vertiefungen verwendet werden.
   3. Übertragen Sie 1 ml Kryokonservierungsmedium mit den hiPSCs in das Kryoröhrchen. Bewegen Sie das Kryoröhrchen vorsichtig, um den Zellinhalt zu homogenisieren.
      HINWEIS: Wenn Sie weitere Röhrchen für die Kryokonservierung vorbereiten, lassen Sie die bereits vorbereiteten Röhrchen im Eis.
   4. Legen Sie die Röhrchen über Nacht bei -80 °C in den Gefrierbehälter mit kontrollierter Rate. Füllen Sie die Schläuche nach 24 h in den Flüssigstickstofftank.

2. Schrittweise Differenzierung von hiPSC in Leberorganoide

HINWEIS: Die Rekonstitution der Reagenzien wurde gemäß den Richtlinien des Herstellers durchgeführt und befolgt.

1. 2D-Differenzierung von hiPSC in DE (Tag 0-Tag 4 (D-0 bis D-4); Abbildung 1B)
   1. Wenn die Zellen nach 3 Passagen gesund sind und gut und schnell wachsen, fahren Sie mit der Differenzierung des hiPSC fort. Beschichten Sie eine 6-Well-Platte wie in Schritt 1.2 beschrieben. Um hiPSC in DE zu unterscheiden, verwenden Sie das DE-Kit, indem Sie den Anweisungen des Herstellers folgen.
   2. Vor Beginn der Differenzierung werden hiPS-Zellen in einem Passageverhältnis von 2:1 (von 6 Vertiefungen auf 3 zum Beginn der Differenzierung) für 24 Stunden kultiviert, um die in den DE-Anweisungen angegebene Zellkonzentration in der Vertiefung zu erreichen.
   3. Führen Sie die Unterscheidung gemäß dem Protokoll des Herstellers mit den folgenden Änderungen durch.
      1. Erhöhung der Konzentration von Y-27632, das zu hiPSC hinzugefügt wird, von 10 μM auf 50 μM (einen Tag vor Beginn der Differenzierung).
      2. Erhöhen Sie 1,5 mL pro Vertiefung des Dissoziationsreagenzes und auch das Volumen von DMEM/F12 auf die gleiche Menge pro Vertiefung wie das Dissoziationsreagenz. Geben Sie 1 ml DMEM/F12 (von 1,5) in jede Vertiefung und akkumulieren Sie weitere 0,5 ml in ein 15- oder 50-ml-Röhrchen.
2. Differenzierung von DE-Zellen in PFG-Zellen (D-4 bis D-10; Abbildung 1C)
   1. PFG-Medium (Advanced DMEM/F12 als Basalmedium, 1x Glutamax-Supplement, 1x B27-Supplement, 20 ng/mL BMP4, 10 ng/mL FGF2) für die Differenzierung der DE-Zellen Tage vor der Induktion in PFG vorbereiten und bei 4 °C lagern.
      HINWEIS: B27 enthält T3 als Teil seiner Zusammensetzung. Im Falle von Schilddrüsenhormon (TH)-Studien sollte B27 von hier an durch hausgemachtes B26¹⁵ ersetzt werden, das kein TH enthält.
   2. Erwärmen Sie das PFG-Medium (2 mL pro Well) und das erweiterte DMEM/F12 15 min lang auf 37 °C oder 1 h lang RT. Beugen Sie sich über die Platte und saugen Sie das DE-Medium mit einer Glaspipette, die mit einem Vakuum verbunden ist (oder manuell mit einer P1000-Pipette), aus den Vertiefungen ab, ohne die Zellen zu zerkratzen.
   3. Geben Sie 2 mL warmes Advanced DMEM/F12 pro Vertiefung hinzu und aspirieren Sie es. Geben Sie 2 ml warmes PFG-Medium pro Vertiefung in die 6-Well-Platte. Wechseln Sie das Medium täglich für die nächsten 6 Tage.
3. Induktion von 2D-PFG-Zellen zu 3D-unreifen Leberorganoiden (IHOs; D-10 bis D-18)
   HINWEIS: Es werden fast 30.000 bis 35.000 Zellen in 30 μl benötigt, die in jede Vertiefung der 96-Well-ULA-Platte gegeben werden. Das Durchgangsverhältnis beträgt 2:1 aus 2 Vertiefungen (6-Well-Platte) mit einer Monoschicht aus differenzierten PFG-Zellen; Es bietet eine vollständige 96-Well-ULA-Platte (Ultra-Low Attachment) (Abbildung 1D).
   1. Vor Beginn der 3D-Organoide oder in früheren Tagen, bereiten Sie zuvor das IHO-Medium vor (Advanced DMEM/F12 als Basalmedium, 1x N2 Supplement, 1x B27, 50 nM A83-01, 30 μM Dexamethason, 5 μM CHIR99021, 500 nM Valproinsäure, 50 ng/mL humaner epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), 20 ng/mL humaner Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF), 40 ng/mL Jagged-1, 300 ng/mL N-6,20-O-Dibutyryladenosin, 30,50-cyclisches 35-Monophosphat-Natriumsalz (dbCAMP), 10 μM Nicotinamid) und lagern Sie es bei 4 °C.
   2. Beschriften Sie eine 96-Well-ULA-Platte (Ultra-Low Attachment). Zum Ablösen der PFG-Zellen verwenden Sie das Zelldissoziationsenzym gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   3. Erwärmen Sie das Dissoziationsenzym, das fortschrittliche DMEM/F12 und PBS vor der Verwendung auf 37 °C. Aspirieren und entsorgen Sie das PFG-Medium aus den Vertiefungen. Fügen Sie 2 ml PBS pro Vertiefung hinzu und aspirieren Sie es.
   4. Fügen Sie 1,5 ml Zelldissoziationsenzym pro Vertiefung bei 37 °C für 7 Minuten hinzu, um die Zellen aus der Vertiefung zu lösen. Ohne das Zelldissoziationsenzym zu entfernen, fügen Sie 1 ml fortgeschrittenes DMEM hinzu. Sammeln Sie alle Zellen und geben Sie sie in ein 50-ml-Röhrchen.
   5. Zählen Sie die Anzahl der Zellen pro ml mit einem Zellzähler oder einem Hämozytometer. Bei 150 x g 8 min zentrifugieren.
   6. Geben Sie das entsprechende Volumen (3 ml IHO-Medium für eine gesamte 96-Well-ULA-Platte) und 1x extrazelluläres Matrixgel in das Pellet, um es auf die endgültige Anzahl der benötigten Zellen (30.000-35.000 Zellen) einzustellen.
   7. Stellen Sie die 96-Well-Platte in einen Inkubator, der auf 37 °C, 5 % CO₂ und 95 % Luftfeuchtigkeit eingestellt ist. Nach 24 Stunden (D-11) gruppieren sich die Zellen in einer kreisförmigen Form neu; Fügen Sie 50 μl des IHO-Mediums pro Vertiefung hinzu.
   8. Am nächsten Tag (D-12) auf 100 μl IHO-Medium pro Vertiefung erhöhen. Bei D14 werden ~100-120 μl aus jeder Vertiefung entnommen, entweder mit der Glaspipette, die an ein Vakuum angeschlossen ist, oder mit einer Pipette nacheinander. Achten Sie darauf, die Organoide nicht abzugasen. 100 μl IHO-Medium an D-14 und D-16 zugeben.
      HINWEIS: Nach D-16 tritt aufgrund der Nicht-Bewegung ein übermäßiges Wachstum auf, das nach D18 verschwindet.
4. Hepatoblast-Organoide (HBOs, D-18 bis D-26)
   HINWEIS: In diesem Schritt werden IHOs von der 96-Well-ULA-Platte in eine 6-Well-ULA-Platte umgelagert. Für 96 IHOs aus der vorherigen Phase wurden 10 Organoide pro Vertiefung platziert, was insgesamt 1 1/2 6-Well-ULA-Platten entspricht, um mit der Reifung fortzufahren (Abbildung 1E).
   1. Wie in den vorherigen Schritten der Differenzierung vorbereitet, bereiten Sie das HBO-Differenzierungsmedium in den vorangegangenen Tagen vor.
      1. Der Cocktail von Reagenzien, der zur Unterscheidung in HBOs verwendet wird, wird in Schritt 2.3 beschrieben. Entfernen Sie die Valproinsäure und fügen Sie dem Cocktail die folgenden Biochemikalien hinzu: BMP7, BMP4 und FGF7. Die endgültige Zusammensetzung besteht aus Advanced DMEM/F12 als Basalmedium, 1x N2-Supplement, 1x B27, 50 nM A83-01, 30 μM Dexamethason, 5 μM CHIR99021, 500 nM Valproinsäure, 50 ng/ml humaner epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), 20 ng/ml humaner Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF), 40 ng/mL Jagged-1, 300 ng/mL N-6,20-O-Dibutyryladenosin 30,50-cyclisches 35-Monophosphat-Natriumsalz (dbCAMP), 10 μM Nicotinamid, 25 ng/ml FGF7, 50 ng/mL BMP4, 20 ng/ml BMP7.
   2. Erwärmen Sie zuvor HBO-Medium (3 mL pro Well) und Advanced DMEM/F12 (3 mL pro Well) bei 37 °C. Geben Sie 3 mL warmes Advanced DMEM/F12 in jede Vertiefung.
   3. Verteilen Sie 10 IHO-Organoide pro Vertiefung aus der 96-Well-Platte mit einer 200 ml breiten Bohrungsspitze. Entfernen Sie das fortschrittliche DMEM/F12, indem Sie sich über die Platte beugen und es mit der Glaspipette, die an das Vakuum angeschlossen ist, (oder manuell mit einer P1000) absaugen.
   4. Fügen Sie 3 ml warmes HBO-Medium pro Vertiefung hinzu. Schalten Sie die 6-Well-ULA-Platten ein und platzieren Sie sie auf einem Multiplattform-Shaker bei 65 U/min im Inkubator, der auf 37 °C, 5 % CO₂ und 95 % Luftfeuchtigkeit eingestellt ist. Ersetzen Sie nach 4 Tagen (D-22) und 6 Tagen (D-24) das HBO-Medium (3 mL pro Well).
5. Reifung zu Leberorganoiden (HO) durch 2 verschiedene Phasen (D-26 bis D-46)
   HINWEIS: Dies ist der letzte Reifungsprozess, der in zwei Differenzierungsperioden aufgrund des Inhalts und der Art der Reagenzien im Medium stattfindet.
   1. Bereiten Sie im Voraus das erste HO (HO1)-Medium vor und lagern Sie es bei 4 °C. Entfernen Sie Jagged1 und verringern Sie die Konzentration von CHIR99021 im Vergleich zum HBO-Medium. Die endgültige Zusammensetzung ist: Advanced DMEM/F12 als Basalmedium, 1x N2 Supplement, 1x B27, 500 nM A83-01, 30 μM Dexamethason, 2 μM CHIR99021, 50 ng/mL humaner epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), 20 ng/ml humaner Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF), 300 ng/mL N-6,20-O-Dibutyryladenosin 30,50-cyclisches 35-Monophosphat-Natriumsalz (dbCAMP), 10 μM Nicotinamid, 25 ng/ml FGF7, 20 ng/ml BMP4, 20 ng/ml BMP7.
   2. Advanced DMEM/F12 und HO1 medium vor Gebrauch bei 37 °C erwärmen. Aspirieren Sie in derselben 6-Well-ULA-Platte vorsichtig das vorherige HBO-Medium, indem Sie sich über die Platte beugen und die Spitze der Glaspipette, die mit einem Vakuum verbunden ist, an die Wand legen (oder manuell mit einer P1000-Pipette).
   3. Geben Sie 3 mL warmes Advanced DMEM/F12 pro Vertiefung hinzu und aspirieren Sie es. Fügen Sie 3 ml warmes HO1-Medium pro Vertiefung hinzu. Wechseln Sie das HO1-Medium alle 3 Tage (D-29, D-32, D-35, D-38) zusammen mit der Probenentnahme.
   4. Bei D 38 wird der Reagenziencocktail für die zweite Periode von HO (HO2) modifiziert, indem CHIR99021, BMP4, dbcAMP und FGF7 entfernt und durch FGF19 und DAPT ersetzt werden. Die endgültige Zusammensetzung des Mediums besteht aus Advanced DMEM/F12 als Basalmedium, 1x N2-Supplement, 1x B27, 500 nM A83-01, 30 μM Dexamethason, 50 ng/ml humanem epidermalem Wachstumsfaktor (EGF), 20 ng/ml humanem Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF), 10 μM Nicotinamid, 20 ng/mL BMP7, 25 ng/mL FGF19, 5 μM DAPT.
   5. Advanced DMEM/F12 und HO2 medium vor Gebrauch bei 37 °C erwärmen. Fahren Sie mit der gleichen 6-Well-ULA-Platte fort und saugen Sie vorsichtig das vorherige HO1-Medium an. Fügen Sie 3 mL Advanced DMEM/F12 pro Vertiefung hinzu und entfernen Sie es.
   6. Fügen Sie 3 ml warmes HO2-Medium pro Vertiefung hinzu. Wechseln Sie das HO2-Medium alle 4 Tage (D-42, D-46, D-50, ...) und entnehmen Sie Proben an den gleichen Tagen, an denen das Medium gewechselt wird.

3. Einzelzell-Dissoziation

HINWEIS: Dieser Schritt ist für die Einzelzell-RNA-Sequenzierungstechnik von entscheidender Bedeutung. Die Anzahl der Organoide kann je nach Größe variieren, und je älter der Tag der Dissoziation ist, desto größer ist die Anzahl der Zellen in den Organoiden. In früheren Zeiten nahm die Anzahl der dissoziierten Organoide zu, und die Dissoziationszeiten verkürzten sich bei gleichen Mengen. Die Dissoziation wurde mit 10 Organoiden an D-14 und D-17, 8 Organoiden an D-23 und D-26 und 6 Organoiden an D-30 und D-45 durchgeführt. Die Verfahren für einen Cluster von Organoiden sind detailliert beschrieben (Abbildung 1F).

1. Vorbereitung der Reagenzien
   1. Advanced-DMEM mit einer Endkonzentration von 7,5 % Rinderalbuminfraktion V (BSA) herstellen und nach dem Homogenisieren filtrieren.
   2. Bereiten Sie 1 ml des Dissoziationsenzymmediums mit 1 ml Trypsin 0,5 % - EDTA (10x) als Basalmedium, 50 μM Y-27632, 40 U/μl RNase-Inhibitor und 1 U/μl DNase I vor.
   3. Bereiten Sie das Trypsin-Inaktivierungsmedium mit 2 ml Advanced DMEM/F12 + 7,5 % BSA als Basalmedium, 50 μM Y-27632, 40 U/μl RNase-Inhibitor und 1 U/μl DNase I vor.
   4. Erwärmen Sie sowohl das Medium als auch PBS auf 37 °C, bevor Sie beginnen.
2. Dissoziation von HHOs
   1. Reinigen Sie den Arbeitsplatz und die Werkzeuge mit RNase Cleaner. Sammeln Sie die Anzahl der Organoide entsprechend dem Tag der Differenzierung in einem 15-ml-Polypropylen-Röhrchen mit weit geöffneter Spitze.
   2. Mit PBS 2x-3x waschen. Geben Sie 1 ml Dissoziationsenzymmedium in das 15-ml-Röhrchen mit den gesammelten Organoiden und halten Sie es 5 Minuten lang bei 37 °C in einer Wippe bei 30 U/min.
      ACHTUNG: Achten Sie darauf, den Schlauch nicht von der Wippe fallen zu lassen.
   3. Überprüfen Sie nach 5 Minuten zuerst die Kappe auf verbleibende Organoide und brechen Sie die Organoide dann mechanisch mit einem P1000 auf, indem Sie 10x pro Organoid auf und ab wirbeln (insgesamt 60 Mal). Wiederholen Sie die gleiche Unterbrechung mit einem P200. Überprüfen Sie den Röhrchendeckel, falls die Organoide daran hängen bleiben.
   4. Legen Sie das 15 mL Röhrchen wieder auf die Wippe und stellen Sie es für weitere 5 min in den Inkubator. Wiederholen Sie den Vorgang von Punkt 4, indem Sie zunächst einen P200 auf und ab schwenken und mit einer serologischen 1-ml-Pipette fortfahren, die mit einer P10-Spitze verbunden ist.
   5. Legen Sie das 15 mL Röhrchen wieder auf die Wippe in den Inkubator für die letzten 5 min. Falls keine Dissoziation besteht, lassen Sie es weitere 5 Minuten und wiederholen Sie die manuelle Unterbrechung.
   6. Fügen Sie 1 ml Trypsin-Inaktivierungsmedium hinzu und homogenisieren Sie es. Setzen Sie ein neues 15-ml-Polypropylen-Röhrchen mit einem 40-μm-Zellsieb darauf auf. Die 2 mL (Zellen mit dem Dissoziationsenzymmedium und dem Trypsin-Inaktivierungsmedium) werden durch ein 40 μm Zellsieb in das 15 mL Röhrchen filtriert.
   7. Fügen Sie weitere 1 ml Trypsin-Inaktivierungsmedium hinzu, um alle verbleibenden Zellen aus dem 40-μm-Zellsieb zu gewinnen.
   8. Nehmen Sie 5 μl einzelliges Medium, gemischt mit 5 μl einer Farbstofflösung, um die Anzahl der dissoziierten Zellen zu zählen, um mit ihrer Fixierung fortzufahren. Zählen Sie die Zellen nach der Zentrifugation und Resuspension mit dem ersten Reagenz des Fixierkits und führen Sie die Zellfiltration mit einem 40-μm-Zellsieb durch.

Ergebnisse

Jede Stufe dieses Protokolls der schrittweisen Differenzierung von hiPSC in HHOs wurde unter Verwendung quantitativer Messungen mittels qPCR und Immunfluoreszenz von stadienspezifischen bekannten Markern aus der Bibliographie definiert (Abbildung 2). Die Schritt-für-Schritt-Vorgehensweise beider Techniken und die erzielten Ergebnisse in Bezug auf die korrekte Differenzierung in HOs wurden in¹⁴ dargestellt. In der vorangegangenen Untersuchung wurden hiPSCs über die mRNA-Spiegel von POU5F1 (auch bekannt als OCT4) und SOX2 definiert, zwei bekannte Yamanaka-Faktoren¹⁶, die im Laufe der Zeit abnahmen (Abbildung 2A). Anschließend wurden die mRNA-Spiegel von DE^11-Markern wie OTX2, CER1 und FOXA2 sowie die PFG^11-Marker HNF4A, CDX2 und TBX3 zusammen mit der lokalisierten Expression von OTX2, HNF4A und TBX3 durch Immunfluoreszenz gemessen (Abbildung 2A,B). Nach der 3D-Promotion, um die Progression der Immunfluoreszenz von Albumin und HNF4a zu verfolgen (Abbildung 2C); die proliferativen Marker MKI67¹⁷ und TBX3, die für die Regulation von Hepatoblast¹⁸ wichtig sind (Abbildung 2D), wurden von D-18 bis D-46 durchgeführt. Bemerkenswert ist, dass Albumin mit HNF4a kolokalisiert ist (Abbildung 2C); in der Zwischenzeit tauchte MKI67 sporadisch bei D-46 auf (Abbildung 2D). Auch Hepatozyten- und Cholangiozyten-ähnliche Zellen wurden durch die mRNA-Spiegel und die Immunfluoreszenz von HNF4A¹⁹ und KRT7¹⁸ an D-46 identifiziert (Abbildung 2E).

Das Volumen der sich entwickelnden Organoide nahm progressiv von D-14 bis D-38 zu, wie der ~2-fache Anstieg der mRNA-Spiegel für den proliferativen Marker MKI67 auf D-22 im Vergleich zu D-10 zeigt. Das Fehlen von T4 im Medium führte zu einem Anstieg der MKI67-mRNA-Spiegel um ~20 % bzw. ~75 % an D-14 bzw. D-18 im Vergleich zu Tag 10 (Abbildung 3A). Um die Funktionalität des Leberorganoids nachzuweisen, wurden die Konzentrationen von Albumin, Apolipoprotein B und A1¹⁴ aus den Medien der Leberorganoide mittels ELISA gemessen. Auf D-42 und D-46 blieben die ALB-mRNA-Spiegel in den T4-HOs im Vergleich zu T3-HOs oder V-Hos um das 3,0- bzw. 2,5-fache höher (Abbildung 3B). Auf der anderen Seite waren die APOB-Spiegel ~10-fach und 3-fach höher (Abbildung 3C), und die APOA1-Spiegel waren ~3-fach bzw. ~2-fach höher (Abbildung 3D) bei D-42 bzw. D-46.

Abbildung 1: Differenzierungsstadien von hiPSC zu hepatischen Organoiden. (A) Übergangswachstum von hiPSC (CS03iCTR-n3-Linie) von 0 h bis 96 h, wobei etwa 70%-80% Konfluenz in den Vertiefungen einer Platte erreicht werden. Maßstabsbalken: 125 μm. (B) Progression des Anfangsstadiums der hiPSC-Differenzierung zum definitiven Endoderm (DE) mit 100%iger Konfluenz am Vortag (D minus 1) nach 24 h und Differenzierung bis D4 (D-0 bis D-4). Maßstabsbalken: 300 μm. (C) Differenzierung von DE (D-4) in den hinteren Vorderdarm (PFG; D-10) mit T4 und B26 ergänzt. Maßstabsbalken: 300 μm. (D) Transformation von 2D-PFG in 3D-unreife Leberorganoide (IHO) mit T4-zugesetztem B26 von D-10 als Einzelzellen bis D-18, ohne D-13. Maßstabsbalken: 300 μm. (E) Erhaltung und Wachstum von Hepatoblast-Organoiden (HBO) mit T4-zugesetztem B26 an D-20, D-22, D-24 und D-26. Maßstabsbalken: 300 μm. (F) Dissoziation von HBO an D-26 (~2,5 x 10⁵ Zellen in 750 μL; links) und HO1 an D-30 (~4 x 10⁵ Zellen in 750 μL; rechts) in Einzelzellen mit T4-zugesetztem B26. Der Einsatz zeigt die Quadratgröße von 1 mm in Neuebauers Kammer, wobei das kleinere Quadrat 250 μm misst. Die Bilder wurden zu HHOs gebracht, deren freie Konzentration von T4 in den Medien ~15 pM betrug. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Überwachung und Charakterisierung der Differenzierung der HHOs. (A) Expression der mRNA-Spiegel von hiPSC-Markern (POU5F1, SOX2), definitiven Endoderm (DE; OTX2, CER1, FOXA2) und hinterer Vorderdarm (PFG; TBX3, HNF4A, CDX2). (iPSC, n=8; DE und PFG n=7; HNF4A in PFG, n=6). (B) Immunfluoreszenz an hiPSC, DE und PFG von OTX2 (oben, rot), HNF4A (Mitte, grün) und TBX3 (unten, rot). (C) "Immunfluoreszenz an D-18, D-26 und D-46 von Albumin (rot) und HNF4A (grün). (D) Immunfluoreszenz an D-18, D-26 und D-46 von MKI67 (grün) und TBX3 (rot). (E) Immunfluoreszenz von Albumin (Hepatozytenmarker; rot) und KRT7 (Cholangiozytenmarker; grün) an D-46. Die Zellkerne sind mit 4′,6-Diamidino-2-fenilindol (DAPI) dargestellt. Diese Abbildung wurde von¹⁴ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Analyse der Reifung des HHO. (A) Relative mRNA-Spiegel des proliferativen Markers MKI67 in Abwesenheit von TH (schwarz) versus freies T4 bei ~15 pM (rot) im Medium von D-10 bis D-46 (n=4 außer T4-HOs bei D-42, n=2; und bei D-46, n=3). (B) Die Albuminspiegel wurden im Medium von D-35 bis D-50 unter drei Bedingungen gemessen: Abwesenheit von TH (schwarz), mit freiem T4 bei ~15 pM (rot) und freiem T3 bei ~10 pM (blau; n=4). (C, D) Die Apolipoprotein B (APOB) und A1 (APOA1) Spiegel wurden im Medium von D-35 bis D-50 unter drei Bedingungen gemessen: Abwesenheit von TH (schwarz); und mit freiem T4 bei ~15 pM (rot). Daten von 10 Organoiden pro Vertiefung (n=4). Für mehrere Vergleiche wurden der zweiseitige Student t-Test zum Vergleich von V-HOs mit T4-HOs-Tagen und der One-Way-ANOVA- und Tukey-Test verwendet. Die Daten sind der Mittelwert von Duplikaten, dargestellt als ausgerichtete Punktdiagramme und deren Mittelwert. *: S<0,05; **: S<0,01; : S<0,001; : S<0.0001. Die x-Achse zeigt die Tage der Differenzierung an. Diese Abbildung wurde von¹⁴ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Das aktuelle Protokoll bietet verschiedene methodische Details zum Umgang mit hiPS-Zellen und den anschließenden 3D-Organoidkulturen. Dazu gehören die beiden wichtigsten kritischen Schritte: (i) das Ablösen der 2D-Kulturen und ihre Entwicklung zu 3D-Leberorganoiden nach 10 Tagen sowie (ii) die zarte Dissoziation einer 3D-Struktur in einzelne Zellen. Basierend auf den verfügbaren Informationen ist dies der erste Bericht über ein 3D-HHO-Modell zur Untersuchung der Wirkung von Schilddrüsenhormonen, das eine Spitzenexpression von DIO2 in Hepatoblasten-ähnlichen Zellen¹⁴ zeigt, wie sie ursprünglich in P1-Lebermäusen identifiziert wurde²⁰.

Wie bei vielen anderen Techniken, bei denen Gerüste auf Zellen angewendet werden, wurde extrazelluläres Matrixgel verwendet, um die extrazelluläre Matrix²¹ nachzuahmen, wodurch der Zusammenbau in die charakteristische 3D-Struktur der Organoide erleichtert wurde. Die wärmeempfindliche Natur dieses Reagenzes unterstreicht, wie wichtig es ist, es zu manipulieren, um es gefroren und während der Handhabung in Eis getaucht zu halten. Folglich ist die Verwendung eines anderen extrazellulären Matrixgels möglich²², obwohl hiPS-Zellen in diesem Protokoll nicht an eine Gerüst-Abwesenheits-Platte anhefteten und sich dort vermehrten, was die korrekte Behandlung zu Beginn des Protokolls neben der Erzeugung von 3D-Organoiden zu einem entscheidenden Aspekt machte.

Nachdem die Differenzierung der HOs abgeschlossen war, stellte eine lebensfähige Dissoziation von Organoiden in einzelne Zellen eine weitere große Hürde dar, die es zu überwinden galt, da eine mechanische Störung den Zelltod provozieren kann, da dann die RNA-Sequenzierungsdaten von geringer Qualität^{waren 23}. Um optimale Ergebnisse zu gewährleisten, zeigte das vorliegende Protokoll, dass eine Einzelzellviabilität von über 70 % erreicht werden konnte, wobei die Dissoziation von über 10⁵ Zellen vor und nach der Fixierung für die anschließende Barcodierung erreicht werden konnte.

Im Gegensatz zu anderen Manuskripten, die nur einen Zelltyp in den Organoiden⁷ beschreiben, umfasst die Differenzierung des HHO mindestens zwei von Hepatoblasten abgeleitete Zellen: Hepatozyten- und Cholangiozyten-ähnliche Zellen. Der Einbau von zwei Reagenzien, die für ihre Bildung verantwortlich sind, HFG²⁴ und EGF²⁵, und zusammen mit Dexamethason²⁶, das die Reifung der Hepatozyten fördert, und Jagged-1¹⁸ , das den Notch-Signalweg aktiviert, der zu den Cholangiozyten führt. Dieses verflochtene Signalnetzwerk bei der Entwicklung von HOs ermöglicht es uns, die 3D-Struktur zu erreichen und In-vivo-Experimente nachzuahmen, zusätzlich zur Überwindung des Nachteils des Rückgangs in der Differenzierung von Langzeitkulturen primärer Hepatozyten²⁷. Es ist bemerkenswert, dass trotz der Expression typischer adulter Lebermarker das Vorhandensein von fetalen Markern in fortgeschrittenen Phasen der Organoide²⁸ immer noch nachgewiesen werden kann, wie dieses Protokoll zeigt. Dies spiegelt in der Tat die normale Leberentwicklung beim Menschen wider, bei dem fetale Lebermarker normalerweise bis zu einem Lebensjahr nachgewiesen werden können²⁹.

Ein seltenes Ereignis, das während der Entwicklung von hiPSCs zu HHOs beobachtet wurde (insbesondere während der unreifen Perioden der HOs, wie z.B. in den letzten Tagen von IHO und einigen HBO und HO1), war das Auftreten von überentwickelten zystischen Strukturen, die schließlich verblassten, sobald die Platten auf den Shaker gelegt wurden. Dieses überproportionale Fortschreiten der zystischen Strukturen deutet darauf hin, dass bis dahin ein nekrotischer Kern erforderlich ist, die Notwendigkeit einer höheren Spülung³⁰ mit häufigeren Mediumwechseln oder der Zugabe geringer Volumina an extrazellulärem Matrixgel, um übermäßiges Zystenwachstum zu beseitigen.

Im Gegensatz zur ursprünglichen Publikation, die sich auf eine erhöhte Anzahl von Organoiden in der letzten Differenzierungsphase für das Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening^{konzentrierte 11}, führte die nun vorgestellte Methode die Verwendung von ULA-Platten ein, um die frühe Bildung von großformatigen 3D-Organoiden zu fördern und den Umgang mit den HHOs zu erleichtern. Diese Anpassungen zeigen die Flexibilität und die große Bandbreite an Studien, die mit diesem unkomplizierten Protokoll durchgeführt werden können.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10 & Mikro; L Universal-Pipettenspitzen Gefiltert, geringe Rentabilität, vorsteril	VWR	613-6462	Alle Verfahren
1000 & Mikro; L Universal-Pipettenspitzen Gefiltert, geringe Rentabilität, vorsteril	VWR	613-6470	Alle Verfahren
15 mL Polypropylen Konisches Röhrchen	Falcon (Corning)	352097	Dissoziation Leber-Organoide
200 & Mikro; L Universal-Pipettenspitzen Gefiltert, geringe Rentabilität, vorsteril	VWR	613-6465	Alle Verfahren
3,3',5-Trijod-L-Thyronin	Sigma	T2877-100	Leber-Organoid-Differenzierung
40 μ m Zell-Sieb	Corning	431750	Dissoziation Leberorganoide
50 mL Röhrchen	Falcon (Corning)	352070	Alle Verfahren
Nunc Zellkultur-behandelte Multischalen mit 6-Well-Platten	Thermo fisher wissenschaftliche	140675	hiPSC-Wartung
A83-01	Forschung & Forschung D Systems	2939/10	Differenzierung von Leberorganoiden
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634010	Differenzierung von Leberorganoiden
ART Filtrierte Pipettenspitzen mit breiter Bohrung	ART	2069GPK	Alle Verfahren
B27 Ergänzung	Gibco	17504044	Differenzierung von hepatischen Organoiden
BMP7	Forschung & Forschung D Systems	354-BP-010/CF	Leber-Organoid-Differenzierung
Rinderalbumin-Fraktion V (7,5%ige Lösung)	Gibco	15260037	Dissoziation Leber Organoide
BSA, Fraktion V, fettsäurefrei für Gewebekultur	GoldBio	A-421-100	Dissoziation Leber Organoide
CHIR99021	R& D Systems	4423/10	Differenzierung von hepatischen Organoiden
Corning 96-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment	Corning	3474	Differenzierung von hepatischen Organoiden
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment	Corning	3471	Hepatische Organoid-Differenzierung
CS03iCTR-n3 humane induzierte pluripotente Stammzelllinie	Cedar-sinai		hiPSC Wartung
DAPT	R& D Systems	2634/10	Differenzierung von hepatischen Organoiden
dbCAMP	Millipore Sigma	D0627-100MG	Differenzierung von hepatischen Organoiden
Dexamethason	R& D Systems	1126/100	Hepatische Organoid-Differenzierung
DMEM/F12	Gibco	11320033	hiPSC-Erhaltungs-DNAse
I, RNase-frei, HC	Thermo Fisher scientific	EN0523	Dissoziation Leber-Organoide
Falcon 10 mL Serologischer Pipet, Polystyrol, 0,1 Inkremente, einzeln verpackt, steril	Corning	357551	Alle Verfahren
Falcon 5 mL Serologische Pipette, Polystyrol, 0,1 Schritte, einzeln verpackt, steril	Corning	357543	Alle Verfahren
Falcon 50 mL Serologische Pipette, Polystyrol, 1,0 Schritte, einzeln verpackt, steril	Corning	357550	Alle Verfahren
Reagenz für sanfte Zelldissoziation (GCDR)	Stemcell Technologies	100-0485	Differenzierung von Leberorganoiden
Glutamax Ergänzung	Gibco	35050061	Differenzierung von Leberorganoiden
L-Thyroxin	Sigma	T1775-1G	Differenzierung von Leberorganoiden
Matrigel hESC-qualifizierte Matrix, LDEV-frei, 5 mL	Corning	354277	Extrazelluläres Matrixgel
mFreSR	Stemcell Technologies	5855	hiPSC Kryokonservierungsmedium
mTeSR 5x Ergänzung	Stemcell Technologies	100-0276	hiPSC medium
mTeSR Plus	Stemcell Technologies	100-0276	hiPSC medium
Multi-Plattform-Schüttler	Fisherbrand (Thermo Fisher Technologien)	88861021	Differenzierung von Leberorganoiden
	Gibco	17502048	Differenzierung von Leberorganoiden
Nicotinamid	Forschung & Forschung D Systems	4106/50	Leber-Organoid-Differenzierung
PBS, pH 7,4	Gibco	10010023	hiPSC Erhaltung
Rekombinantes humanes BMP4	Forschung & Forschung D Systems	314-BP-010/CF	Differenzierung von Leberorganoiden
Rekombinante humane EGF	F& T & D Systems	236-EG-200	Hepatische Organoid-Differenzierung
Rekombinante humane FGF basisch/FGF2/bFGF	F& D Systems	233-FB-010/CF	Leber-Organoid-Differenzierung
Rekombinante humane FGF19	F& Technik D Systems	959-FG-025/CF	Leber-Organoid-Differenzierung
Rekombinantes humanes HGF	F& T & D Systems	294-HG-005/CF	Hepatische Organoid-Differenzierung
Rekombinante humane Zacken-1 Fc-Chimäre	Forschung & Forschung D Systems	1277-JG-050	Hepatische Organoid-Differenzierung
Rekombinantes humanes KGF/FGF7	F& T & D Systems	251-KG-010/CF	Leber-Organoid-Differenzierung
ReLeSR	Stemcell Technologies	100-0483	hiPSC-Ablösungsmedium
RNAse Inhibitor Ambion, kloniert, 40 U/μ L	Invitrogen	AM2682	Dissoziation Leberorganoide
RNase Zap	Invitrogen	AM9780	Dissoziation Leberorganoide
Sorvall  Legend XT/XF Zentrifuge Serie	Thermo Fisher Scientific	75004539	Alle Verfahren
STEMdiff Definitive Endoderm Kit	Stemcell Technologies	5110	Hepatische Organoid-Differenzierung
Trypanblau-Lösung (0,4%)	Gibco	15250061	Farbstoff
Lösung TrypLE Express Enzym	Gibco	12604013	Zelldissoziationsenzym
Trypsin 0,5% - EDTA (10X)	Gibco	15400054	Dissoziation Leberorganoide
Valproinsäure, Natriumsalz	R& D Systems	2815/100	Leber-Organoid-Differenzierung
Vari-Mix Plattformwippe	Thermo Fisher wissenschaftliche	M79735Q	Dissoziation Leberorganoide
Y-27632 Dihydrochlorid	R& D Systems	1254	Differenzierung von hepatischen Organoiden