Methodenartikel

Generierung und Co-Kultivierung von primären Mikroglia und kortikalen Neuronen von Mäusen

DOI:

10.3791/67078

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26. Juli 2024

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1Department of Biochemistry, Microbiology & Immunology, University of Saskatchewan

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt eine Mikroglia-neuronale Co-Kultur, die aus primären neuronalen Zellen hergestellt wurde, die an den Embryonaltagen 15-16 aus Mausembryonen isoliert wurden, und aus primären Mikroglia, die aus den Gehirnen von neugeborenen Mäusen an den postnatalen Tagen 1-2 erzeugt wurden.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroglia sind geweberesidente Makrophagen des Zentralnervensystems (ZNS), die zahlreiche Funktionen erfüllen, die die neuronale Gesundheit und die ZNS-Homöostase unterstützen. Sie sind eine wichtige Population von Immunzellen, die mit der Aktivität der ZNS-Erkrankung assoziiert sind und reaktive Phänotypen annehmen, die möglicherweise zu neuronalen Schädigungen bei chronischen neurodegenerativen Erkrankungen wie Multipler Sklerose (MS) beitragen. Die unterschiedlichen Mechanismen, durch die Mikroglia die neuronale Funktion und das Überleben während Gesundheit und Krankheit regulieren, bleiben aufgrund von Herausforderungen bei der Lösung der komplexen In-vivo-Wechselwirkungen zwischen Mikroglia, Neuronen und anderen ZNS-Umweltfaktoren begrenzt. Daher bleibt der in vitro-Ansatz der Co-Kultivierung von Mikroglia und Neuronen ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung von Mikroglia-Neuronal-Interaktionen. Hier stellen wir ein Protokoll zur Generierung und Co-Kultur von primären Mikroglia und Neuronen aus Mäusen vor. Konkret wurden Mikroglia nach 9-10 Tagen in vitro aus einer gemischten Gliakultur isoliert, die aus Gehirnhomogenaten von neugeborenen Mäusen zwischen den postnatalen Tagen 0-2 etabliert wurde. Neuronale Zellen wurden zwischen dem 16. und 18. Embryonaltag aus der Hirnrinde von Mausembryonen isoliert. Nach 4-5 Tagen in vitro wurden die neuronalen Zellen in 96-Well-Platten ausgesät, gefolgt von der Zugabe von Mikroglia, um die Co-Kultur zu bilden. Ein sorgfältiges Timing ist für dieses Protokoll von entscheidender Bedeutung, da beide Zelltypen die experimentelle Reife erreichen müssen, um die Co-Kultur zu etablieren. Insgesamt kann diese Co-Kultur für die Untersuchung von Mikroglia-Neuronen-Interaktionen nützlich sein und mehrere Messwerte liefern, einschließlich Immunfluoreszenzmikroskopie, Live-Bildgebung sowie RNA- und Protein-Assays.

Einleitung

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Mikroglia sind geweberesidente Makrophagen, die die Immunüberwachung und Homöostase im Zentralnervensystem (ZNS) erleichtern1,2,3. Sie stammen aus erythromyeloiden Vorläuferzellen des Dottersacks, die das Gehirn während der Embryonalentwicklung besiedeln 4,5,6 und während der gesamten Lebensspanne des Organismus durch Selbsterneuerung, die Proliferation und Apoptose beinhaltet, erhalten bleiben7. Im Steady-State haben ruhende Mikroglia die Morphologie verzweigt und beteiligen sich an der Gewebeüberwachung 8,9,10.

Mikroglia exprimieren zahlreiche Rezeptoren der Zelloberfläche, was es ihnen ermöglicht, schnell auf Veränderungen im ZNS zu reagieren11,12 und Entzündungsreaktionen bei Infektionen oder Gewebeverletzungen zu fördern 12,13,14 sowie bei neurodegenerativen Erkrankungen 9,15 wie z.B. Multipler Sklerose (MS)16,17. Mikroglia exprimieren auch Rezeptoren für verschiedene Neurotransmitter und Neuropeptide 18,19,20, was darauf hindeutet, dass sie auch auf neuronale Aktivität reagieren und diese regulieren können 21,22. In der Tat interagieren Mikroglia und Neuronen in verschiedenen Formen der bidirektionalen Kommunikation 8,23, wie z. B. direkte Wechselwirkungen, die durch Membranproteine vermittelt werden, oder indirekte Wechselwirkungen durch lösliche Faktoren oder Zwischenzellen23,24.

Zum Beispiel können verschiedene Neurotransmitter, die von Neuronen sezerniert werden, die neuroprotektive oder inflammatorische Aktivität von Mikroglia modulieren 25,26,27. Darüber hinaus tragen direkte Wechselwirkungen zwischen Neuronen und Mikroglia dazu bei, Mikroglia in einem homöostatischen Zustand zu halten28. Umgekehrt können direkte Wechselwirkungen von Mikroglia mit Neuronen die neuronalen Schaltkreise29 prägen und die neuronale Signalübertragungbeeinflussen 30,31,32. Da Störungen dieser Wechselwirkungen eine Übererregbarkeit der Neuronen30 und eine Mikroglia-Reaktivität 33,34 induzieren, werden fehlregulierte Mikroglia-neuronale Interaktionen als beitragender Faktor für neurologische Erkrankungen angesehen33,35. In der Tat wurde beschrieben, dass psychotische23,26 und neurodegenerative Erkrankungen dysfunktionale Mikroglia-Neuronal-Interaktionen aufweisen33. Während diese Beobachtungen die Bedeutung der Mikroglia-Neuronal-Kommunikation im ZNS unterstreichen, sind die spezifischen Mechanismen, wie diese Interaktionen die mikroglialen und neuronalen Funktionen bei Gesundheit und Krankheit regulieren, relativ unbekannt.

In einem komplexen Milieu wie dem ZNS können mehrere Umweltfaktoren die Interaktionen zwischen Mikroglia und Neuronen beeinflussen, was die Fähigkeit einschränkt, transiente zelluläre Interaktionen in vivo zu untersuchen. Hier stellen wir ein in vitro Mikroglia-Neuronal-Co-Kultursystem vor, mit dem direkte zelluläre Interaktionen zwischen Mikroglia und Neuronen untersucht werden können. Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von primären Mikroglia und Neuronen aus der Rinde von neonatalen Mäusen zwischen den postnatalen Tagen 0-2 und embryonalen Mäusen zwischen den Tagen 16-18. Neuronen und Mikroglia werden dann in 96-Well-Platten für nachgelagerte Hochdurchsatzexperimente co-kultiviert. Wir haben diesen Ansatz bereits verwendet, um zu zeigen, dass die Mikroglia-Phagozytose Neuronen vor oxidiertem Phosphatidylcholin-vermitteltem Zelltod schützt37, was darauf hindeutet, dass diese Methode dazu beitragen kann, die Rolle von Mikroglia im Zusammenhang mit Neurodegeneration und MS zu verstehen. In ähnlicher Weise können Mikroglia-neuronale Co-Kulturen auch nützlich sein, um die Auswirkungen der Mikroglia-Neuronal-Wechselwirkung in anderen Kontexten zu untersuchen, wie z. B. bei Virusinfektionen38 oder neuronalen Verletzungen und Reparaturen39. Insgesamt ermöglichen in vitro Mikroglia-neuronale Co-Kultursysteme den Forschern, Mikroglia-neuronale Interaktionen in einer manipulierbaren und kontrollierten Umgebung zu untersuchen, was die In-vivo-Modelle ergänzt.

Protokoll

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Alle Tiere, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden mit Genehmigung des University Animal Care Committee (UACC) der University of Saskatchewan und des Canadian Council on Animal Care (CCAC) untergebracht und behandelt. Für diese Studie wurden männliche und weibliche CD1-Mäuse an den postnatalen Tagen 0-2 und Embryonen an den Tagen 16-18 (E16-18) von trächtigen CD1-Mäusen verwendet. Die Details zu den Reagenzien und den verwendeten Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Primäre Mikroglia-Kultur

HINWEIS: Es ist wichtig, die gemischten Gliazellen und neuronalen Kulturen so zu timen, dass die Mikroglia innerhalb von 2 Tagen nach der Aussaat der Neuronen in eine 96-Well-Platte reif und erntereif sind.

  1. Präparat
    1. Vollständiges Glia-Kulturmedium vorwärmen, das Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) mit hohem Glukosegehalt, ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum, 50 U/ml Penicillin/Streptomycin mit 2,92 mg/ml L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 1x nicht-essentielle Aminosäuren und 20 mM HEPES in einem 37 °C Wasserbad enthält.
    2. 5 ml 10 μg/ml Poly-L-Ornithin (PO)-Hydrobromid in jeden T-75-Kolben geben. Schwenken Sie den Kolben vorsichtig, um sicherzustellen, dass PO den Boden des Kolbens vollständig bedeckt. Bei 37 °C in einem 5 % CO2 -Inkubator für mindestens 1 h inkubieren.
      HINWEIS: Dieser Beschichtungsschritt ist erforderlich, um die Zelladhäsion an den T-75-Kolben zu erleichtern.
  2. Isolierung von Gehirnen aus P0-P2-neugeborenen Mäusen
    HINWEIS: Sterilisieren Sie alle Präparierwerkzeuge und bewahren Sie die Sterilität der Reagenzien. Stellen Sie sicher, dass die aseptischen Techniken durchgehend eingehalten werden.
    1. Sprühen Sie vor Beginn des Sezierens die Arbeitsplatte mit 70%igem Ethanol oder Desinfektionsspray ein, wo die Dissektion stattfinden soll. Stellen Sie das Präpariermikroskop auf und stellen Sie die Petrischale unter das Mikroskop. Gießen Sie 20 mL des L-15-Mediums von Leibovitz in die Petrischale. Lassen Sie den Deckel der Petrischale auf, während das Mikroskop nicht verwendet wird, um Kontaminationen zu reduzieren.
    2. Legen Sie mehrere Lagen Papiertuch darauf und besprühen Sie die Papiertücher gründlich mit 70% Ethanol. Bereiten Sie die Sezierwerkzeuge (Präparierschere, Mikrozange und Gewebezange) vor, indem Sie sie gründlich mit 70% Ethanol besprühen und auf die Papiertücher legen.
    3. Übertragen Sie die Maus nach der Geburt 0-2 auf die Papiertücher und besprühen Sie die Maus gründlich mit 70% Ethanol. Enthaupten Sie die Maus mit einer Separierschere (nach institutionell anerkannten Protokollen).
    4. Während Sie den Kopf sanft halten, setzen Sie einen Mittellinienschnitt im Schädel, beginnend vom Hals bis zur Nase. Schälen Sie den Schädel mit einer Gewebezange zurück, um das Gehirn freizulegen.
    5. Schöpfen Sie das Gehirn mit einer Gewebezange vorsichtig heraus, indem Sie die Pinzette unter das Gehirn einführen und das Gehirn aus dem Kopf herausheben. Setzen Sie das Gehirn sofort in die Petrischale ein, die 20 ml des L-15-Mediums von Leibovitz enthält.
    6. Unter einem Präpariermikroskop wird der Hirnstamm und die Hirnhäute vorsichtig mit einer Mikrozange entfernt. Sammeln Sie die Gehirne in einem konischen 50-ml-Röhrchen, das 5 ml des L-15-Mediums von Leibovitz enthält.
  3. Dissoziation des Gehirns, Aussaat und Aufrechterhaltung der gemischten Gliakultur
    HINWEIS: Führen Sie alle nachfolgenden Schritte in einer Biosicherheitswerkbank durch.
    1. Schneiden Sie das Gehirn mit einer sterilen Einweg-Skalpellklinge in ca. 1 mm2 Stücke. Übertragen Sie die zerkleinerten Gehirne vorsichtig in ein neues steriles 50-ml-Röhrchen.
    2. Zu den zerkleinerten Gehirnen eine Endkonzentration von 0,25 % Trypsin geben und das Gewebe in einem 37 °C warmen Wasserbad für 20 min inkubieren. Mischen Sie die Lösung alle 2-3 Minuten, indem Sie das Röhrchen vorsichtig umdrehen, um die Dissoziation des Gewebes zu unterstützen.
    3. Aus dem 5%igen CO2 -Inkubator werden die T-75-Kolben mit 5 ml PO in die Biosicherheitswerkbank überführt. Entsorgen Sie die PO und spülen Sie die Kolben 3 Mal mit steriler 1x Phosphatpufferlösung (PBS) aus. Achten Sie darauf, die Kolben gründlich zu spülen, da überschüssiges PO für die Zellen giftig ist.
    4. Übertragen Sie das verdaute Gewebe aus dem 37 °C warmen Wasserbad in die Biosicherheitswerkbank. Fügen Sie 5 ml vollständiges Glia-Kulturmedium hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren. Mischen Sie die Gewebesuspension vorsichtig mit einer 10-ml-Pipette.
    5. Legen Sie ein steriles 70-μm-Nylonnetz-Zellsieb auf ein steriles konisches 50-ml-Röhrchen und befeuchten Sie das Netz, indem Sie etwa 5 ml L-15 einfüllen. Dekantieren Sie die Zellsuspension vorsichtig durch das Zellsieb. Entfernen Sie den Kolben von einer sterilen 1-ml-Spritze, mahlen Sie das Gewebe mit dem Kolben in das Netz, um Gewebeklumpen zu entfernen, und erzeugen Sie eine homogenisierte Zellsuspension.
    6. Gießen Sie in regelmäßigen Abständen ca. 5 mL L-15-Medium von Leibovitz in das 70 μm Nylonnetz und schleifen Sie das Gewebe auf dem Netz mit dem 1 ml-Spritzenkolben weiter. Wenn wenig bis gar kein sichtbares Gewebe mehr auf dem Netz verbleibt, entsorgen Sie das Netz und legen Sie die Zellsuspension beiseite.
    7. Mischen Sie die Zellsuspension, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren. Zu jedem Kolben werden gleiche Volumina der Zellsuspension mit 1-2 Gehirnen mit Glia-Kulturmedien bis zu einem Endvolumen von 15 ml gegeben.
    8. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem 5%igen CO2 -Inkubator über Nacht. Waschen Sie die Kolben am nächsten Tag zweimal mit sterilem 1x PBS, um nicht anhaftende Zellen und Ablagerungen zu entfernen.
    9. Geben Sie 15 ml frische, vollständige Glia-Nährmedien in die Kultur und inkubieren Sie sie bei 37 °C in einem 5 % CO2 -Inkubator. Wechseln Sie nach 3 Tagen die Hälfte des Mediums durch 10 ml frisches Glia-Kulturmedium, das mit 40 ng/ml Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (MCSF) ergänzt wird.
      HINWEIS: Danach wird die Hälfte des Mediums durch 10 ml frisches Glia-Kulturmedium ersetzt, das alle 3 Tage mit 40 ng/ml MCSF ergänzt wird. Die Kultur wird 8-10 Tage lang aufbewahrt, bevor Mikroglia geerntet werden.

2. Primäre Neuronenkultur

  1. Präparat
    1. Tauen Sie B-27 plus Ergänzung aus B-27 plus neuronalem Kultursystem auf. Neurobasal plus Medium aus B-27 plus neuronalem Kultursystem, 1x Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) und hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum (FBS) bei 37 °C in einem Wasserbad vorwärmen.
    2. Die T-25-Kolben werden mit 5 mL 10 μg/mL PO bestreicht und die Kolben mindestens 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Bereiten Sie Instrumente und Verbrauchsmaterialien für das Sezieren vor.
      HINWEIS: Dieser Beschichtungsschritt erleichtert die Zelladhäsion an den T-25-Kolben.
  2. Isolierung des Gehirns aus E16-E18-Mausembryonen
    HINWEIS: Sterilisieren Sie alle Präparierwerkzeuge und bewahren Sie die Sterilität der Reagenzien. Stellen Sie sicher, dass die aseptischen Techniken durchgehend eingehalten werden.
    1. Sprühen Sie vor Beginn des Sezierens die Arbeitsplatte mit 70%igem Ethanol oder Desinfektionsspray ein, wo die Dissektion stattfinden soll. Stellen Sie das Präpariermikroskop auf und stellen Sie die Petrischale unter das Mikroskop. Gießen Sie 20 mL 1x HBSS in die Petrischale. Lassen Sie den Deckel der Petrischale auf, während das Mikroskop nicht verwendet wird, um Kontaminationen zu reduzieren.
    2. Legen Sie mehrere Lagen Papiertuch darauf und besprühen Sie die Papiertücher gründlich mit 70% Ethanol. Bereiten Sie die Sezierwerkzeuge (Federschere, Mikrozange und Gewebezange) vor, indem Sie sie gründlich mit 70% Ethanol besprühen und auf die Papiertücher legen.
    3. Betäuben Sie eine trächtige Maus zwischen dem 16. und 18. Schwangerschaftstag mit Isofluran und euthanasieren Sie die Maus durch Gebärmutterhalsluxation (gemäß institutionell anerkannten Protokollen).
    4. Legen Sie die Maus auf den Rücken auf ein Stück Papiertuch, das mit 70% Ethanol getränkt ist. Desinfizieren Sie den Bauchbereich mit 70% Ethanol. Heben Sie die Haut des Unterbauchs mit einer Gewebezange an und führen Sie von diesem Punkt aus mit einer Präparierschere einen V-förmigen Schnitt zum unteren Brustkorb durch.
    5. Fassen Sie die Gebärmutterhörner, in denen sich die Embryonen befinden, mit einer Gewebezange und entfernen Sie die Embryonen vorsichtig aus der Bauchhöhle. Desinfizieren Sie die Gebärmutterhörner, die Embryonen enthalten, kurz mit 70% Ethanol.
    6. Sezieren Sie jeweils einen Embryo aus seinem einzelnen Sack. Machen Sie mit einer Federschere einen Mittellinienschnitt an der Oberseite des Schädels, beginnend vom Nacken bis zur Nase. Heben Sie dann den Schädel von der Inzisionsstelle weg, um das Gehirn freizulegen. Schöpfen Sie das Gehirn vorsichtig mit einer Gewebezange aus und übertragen Sie das Gehirn in eine 10 cm große Petrischale, die 15 mL 1x HBSS enthält.
    7. Entfernen Sie unter einem Präpariermikroskop vorsichtig den Hirnstamm und die Hirnhäute auf beiden Seiten der Hirnrinde mit einer Mikrozange. Übertragen Sie die Hirnrinde in ein konisches 50-ml-Röhrchen, das 10 mL 1x HBSS enthält, und legen Sie es auf Eis.
  3. Dissoziation und Aussaat von kortikalen Neuronen im Gehirn in Zellkultur
    HINWEIS: Führen Sie alle nachfolgenden Schritte in einer Biosicherheitswerkbank durch.
    1. Zerkleinern Sie das Gehirn in ca. 1 mm2 Stücke in dem konischen 50-ml-Röhrchen mit einer sterilen Einweg-Skalpellklinge. Übertragen Sie die zerkleinerten Gehirne in ein neues steriles konisches 50-ml-Röhrchen.
    2. Geben Sie Trypsin mit einer Endkonzentration von 0,25% in das Röhrchen. Tauchen Sie das Röhrchen für 15 min in ein 35-38 °C heißes Wasserbad und mischen Sie das Röhrchen alle 2-3 min vorsichtig, um das Gewebe zu homogenisieren.
    3. Nehmen Sie den Schlauch aus dem Heißwasserbad. Pipettieren Sie die Gewebesuspension vorsichtig auf und ab, um die Zellen weiter zu dissoziieren, und fügen Sie dann 0,5 ml hitzeinaktiviertes FBS zur homogenisierten Suspension hinzu, um die Trypsinaktivität zu neutralisieren. Vermeiden Sie Luftblasen, um die Toxizität für neuronale Zellen zu minimieren.
    4. Legen Sie ein steriles 70-μm-Nylonnetz-Zellsieb auf ein steriles konisches 50-ml-Röhrchen und befeuchten Sie das Netz mit etwa 5 ml neurobasalem Medium. Filtern Sie die Zellsuspension durch das 70 μm Nylon-Mesh-Zellsieb. Mahlen Sie das Gewebe mit einem 1-ml-Spritzenkolben vorsichtig in das Zellsieb. Gießen Sie regelmäßig ca. 5 ml 1x HBSS ein, während Sie weiter mahlen, um das Zellsieb zu waschen.
    5. Das konische Röhrchen bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Während dieser Zeit verdünnen Sie B-27 plus Supplement in neurobasalen plus Medien auf 1x Endkonzentration, um es als vollständiges neurobasales Medium zu verwenden.
    6. Entsorgen Sie den PO in den T-25-Kolben und spülen Sie die Kolben dreimal mit 5 mL 1x PBS.
    7. Dekantieren Sie vorsichtig, um den Überstand zu entfernen, und resuspendieren Sie das Zellpellet, indem Sie vorsichtig 2-3 ml des vollständigen neurobasalen Mediums auf und ab pipettieren. Bestimmen Sie die Zellkonzentration und die Gesamtzellzahl mit einem Hämozytometer und Trypanblau. Erwarten Sie bis zu 1,0 x 107 Zellen pro Embryo.
    8. Die Zellen in den PO-beschichteten T-25-Kolben werden mit ca. 2,0 x 107 Zellen pro Kolben in 5 ml vollständigem neurobasalem Medium plattiert. Inkubieren Sie die Zellkultur bei 37 °C in einem 5% CO2 -Inkubator.
    9. Führen Sie alle 2-3 Tage einen halben Medienwechsel durch, indem Sie 2,5 ml Medium aus dem Kulturkolben durch frisch hergestellte vollständige neurobasale Medien ersetzen.

3. Co-Kultur von primären Neuronen und Mikroglia

HINWEIS: Alle nachfolgenden Schritte sind in einer sterilen Biosicherheitswerkbank durchzuführen.

  1. Aussaat von Neuronen in 96-Well-Platten
    1. Geben Sie 100 μl 10 μg/ml PO pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Kolben mindestens 1 h bei 37 °C, um die Vertiefungen mit PO zu beschichten. Waschen Sie die Platte 3 Mal mit 1x PBS, bevor Sie die Zellen säen, und saugen Sie die verbleibende Flüssigkeit nach dem letzten Waschen ab.
    2. Neuronen, die in T-25-Kolben gezüchtet werden, werden nach 2-5 Tagen in Kultur für die Co-Kultur geerntet. Das Medium wird durch 5 ml 1x Versene-Lösung mit 0,25 % Trypsin und 1 mg/ml DNase I ersetzt, um Neuronen aus dem Kolben zu lösen. Legen Sie die Kolben für 5-6 Minuten zur Verdauung in den Inkubator und schwenken Sie den Kolben alle 2-3 Minuten vorsichtig, um die Zellablösung zu unterstützen.
    3. Nehmen Sie den Kolben aus dem Inkubator und prüfen Sie, ob sich die Zellen unter dem Mikroskop abgelöst haben. Fügen Sie 0,5 ml hitzeinaktiviertes FBS hinzu, um das Trypsin und DNase I zu neutralisieren. Übertragen Sie die Zellen in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Waschen Sie den Kolben einmal mit 5 ml vollständigem neurobasalem Medium, um die gesammelten Neuronen zu maximieren. Sammeln Sie alle Zellen im selben konischen 15-ml-Röhrchen.
    4. Die Zellsuspension bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig in 2-3 ml vollständigem neurobasalem Medium.
    5. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und fügen Sie vollständige neurobasale Medien hinzu, um eine Endkonzentration von 7,5 x 105 Neuronen/ml zu erreichen. 100 μl der Zellsuspension in jede Vertiefung in der PO-beschichteten 96-Well-Platte aussäen, um 7,5 x 104 Neuronen/Vertiefung zu erhalten. Es wird eine Ausbeute von 5-6 Millionen Neuronen pro Kolben erwartet.
    6. Inkubieren Sie die Neuronen über Nacht in einer 96-Well-Platte. Geben Sie am nächsten Tag 100 μl des kompletten neurobasalen Mediums in jede Vertiefung.
      HINWEIS: Sobald die Neuronen ein angemessenes Wachstum des Neuritenprozesses aufweisen (etwa Tag 3-4 nach der Aussaat in 96-Well-Platten), sind sie bereit für die Co-Kultur mit Mikroglia.
  2. Isolation und Mikroglia-neuronale Co-Kultur
    1. Sammeln Sie zwischen 8 und 10 Tagen gemischter Gliakultivierung Mikroglia, indem Sie die T-75-Kolben in jedem Kolben mit einer 10-ml-Pipette vorsichtig mit Glia-Kulturmedien waschen und die Zellen und Medien in ein steriles konisches 50-ml-Röhrchen überführen. Waschen Sie die Kolben erneut mit 10 mL frischem Glia-Kulturmedium, um zusätzliche Mikroglia von den Kolben zu lösen und das Medium zu sammeln. Es wird eine Ausbeute von 7,5 x 105 Mikroglia pro Kolben erwartet.
    2. 20 ml frisches Glia-Kulturmedium, ergänzt mit 20 ng/ml MCSF, werden in jeden Kolben gegeben. Mikroglia können ein- oder zweimal mehr geerntet werden, wenn die gemischte Gliakultur beibehalten wird.
    3. Zentrifugieren Sie die Zellsammlung bei 300 x g für 5 min bei 4 °C. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in 2 ml vollständigem neurobasalem Medium.
    4. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und Trypanblau. Geben Sie das komplette neurobasale Medium zu einer Endkonzentration von 2,5 x 105 Zellen/ml.
    5. Entfernen Sie 100 μl des neurobasalen Mediums aus der 96-Well-Kulturplatte und fügen Sie 100 μl 2,5 x 105 Zellen/ml Zellsuspension hinzu, um 2,5 x 104 Mikroglia pro Vertiefung mit 7,5 x 104 Neuronen zu säen. Die Kultur wird über Nacht bei 37 °C in einem 5 % CO2 -Inkubator inkubiert, damit sich die Mikroglia absetzen können. Die Co-Kultur kann nun für nachgelagerte Experimente genutzt werden.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ein Flussdiagramm, das die wichtigsten Schritte der gemischten Gliakultur für Mikroglia zeigt, ist in Abbildung 1A dargestellt. Insgesamt werden an Tag 1 spärliche Zellen und übermäßige Zelltrümmer erwartet (Abbildung 1B). Bis zum 4. Tag sollte eine erhöhte Zellzahl beobachtet werden, insbesondere bei der Bildung adhärenter Astrozyten, was durch ihre längliche Morphologie angezeigt wird (Abbildung 1C). Einige Mikroglia können auf den Astrozyten oder als kleine runde Zellen beobachtet werden, die in Medien schwimmen. Am 8. Tag bildet eine konfluente Schicht von Astrozyten die adhärenten Zellschichten, während Mikroglia als runde und helle Zellen erscheinen, die halb an den Astrozyten befestigt sind oder in Medien schwimmen (Abbildung 1D). Wenn die Mikrogliadichte am 8. Tag niedrig ist, kann die Kultur vor der Ernte weitere Tage inkubiert werden.

Ein Flussdiagramm, das die wichtigsten Schritte der neuronalen Kultur zeigt, ist in Abbildung 2A dargestellt. In einer gesunden Kultur binden sich Neuronen an und bilden nach 1-3 Tagen in vitro Neuritenprozesse (Abbildung 2B). In ähnlicher Weise erscheinen Neuronen beim Aussäen in eine 96-Well-Platte zunächst rund, aber an Tag 3 sollten die Neuronen adhärent werden und Neuritenprozesse bilden, die sich mit benachbarten Neuronen verbinden (Abbildung 2C). Umgekehrt enthalten ungesunde Neuronenkulturen Zellklumpen und Zelltrümmer, die aus einer mangelnden Zelldissoziation oder einer falschen Handhabung von Neuronen resultieren können (Abbildung 2D).

Ein Flussdiagramm, das die wichtigsten Schritte des Mikroglia-Neuronal-Co-Kulturprotokolls zeigt, ist in Abbildung 3A dargestellt. Nach der Zugabe von 2,5 x 104 Mikroglia zu 7,5 x 104 Neuronen sollten runde und große Mikroglia über oder zwischen den Neuronen und Neuritenfortsätzen erscheinen (Abbildung 3B). Um die Mikroglia-Neuronen-Co-Kultur weiter sichtbar zu machen, wurden Mikroglia und Neuronen allein oder in Co-Kultur mit ionisierten Calcium-bindenden Adaptermolekülen 1 (IBA-1, rot) und Tubulin βIII (TUJ1, grün) Antikörpern37 für die Immunfluoreszenzmikroskopie markiert (Abbildung 3C-F).

Zellkulturprozess: Einzelzellsuspension aus der Rinde von Mäusen; die im Diagramm gezeigten Schritte; Mikroskop-Aufnahmen.
Abbildung 1: Überblick über die primäre Mikrogliakultur. (A) Flussdiagramm der wichtigsten Schritte bei der Erzeugung einer gemischten Gliakultur. (B-D) Repräsentative 10x Hellfeldmikroskopische Bilder von gemischten Gliakulturen an Tag 1 (B), Tag 4 (C) und Tag 8 (D). Maßstabsbalken: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diagramm des neuronalen Kulturprozesses; Präparation und Bildgebung embryonaler Mauszellen in T25, 96-Well-Platten.
Abbildung 2: Überblick über die Kultur der primären Neuronen. (A) Flussdiagramm der wichtigsten Schritte bei der Erzeugung von Neuronen. (B) Repräsentative 10-fach-Hellfeldmikroskopbilder, die Neuronen zeigen, die in T-25-Kolben kultiviert wurden. (C) Repräsentatives 10-fach-Hellfeldmikroskop von Neuronen, die in einer 96-Well-Platte kultiviert wurden. (D) Repräsentatives 10-fach-Hellfeldmikroskop eines ungesunden neuronalen Clusters in einer 96-Well-Platte. Maßstabsbalken: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Arbeitsablauf für die Isolierung von Mikroglia und Mikroskopieanalyse; Immunfluoreszenzbilder zeigen zelluläre Marker.
Abbildung 3: Überblick über die Mikroglia-Neuronen-Kokultur. (A) Flussdiagramm der wichtigsten Schritte für die Mikroglia-Neuronen-Kokultur. (B) Repräsentative 10x Hellfeldmikroskop-Bilder von Mikroglia-Neuronal-Co-Kultur in 96-Well-Platten. Maßstabsbalken: 100 μm. (C,D) Repräsentative Immunfluoreszenzmikroskopie-Bilder von Neuronen allein (C), Mikroglia allein (D), Tag-2-Neuronen- und Mikroglia-Kokultur (E) oder 12-Tage-Neuronen- und Mikroglia-Kokultur (F) in einer 96-Well-Platte. Mikroglia und Neuronen sind mit IBA-1 (rot) bzw. Tubulin βIII (grün) markiert. Die Zellkerne werden mit DAPI (blau) gefärbt. Die Immunfluoreszenzbilder wurden mit einem 25-fachen Wasserimmersionsobjektiv mit 0,8 NA und einem Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop aufgenommen. Maßstabsstäbe: 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die Isolierung und Kultivierung von primären Mausneuronen und primären Mikroglia, die anschließend verwendet werden, um eine Mikroglia-Neuronal-Co-Kultur zu etablieren, mit der untersucht werden kann, wie Mikroglia- und Neuroneninteraktionen ihre zelluläre Gesundheit und Funktion regulieren. Dieser relativ einfache und zugängliche Ansatz kann wichtige Einblicke in die Mechanismen und funktionellen Ergebnisse von Mikroglia-Neuroneninteraktionen im ZNS liefern.

Um eine optimale Co-Kultur zu erreichen, erfordern mehrere kritische Aspekte in diesem Protokoll besondere Sorgfalt. Während der Isolierung des Gehirns (Schritte 1.2.6 und 2.2.7) sollten die Hirnhäute, die an der Oberfläche sowohl des embryonalen als auch des postnatalen Gehirns befestigt sind, vollständig entfernt werden, bevor das Gewebe entnommen wird. Wie bei anderen Neuroglia-Protokollen kann eine unvollständige Entfernung der Hirnhäute dazu führen, dass die Zellkultur mit Endothelzellen oder Blutzellen kontaminiert wird 40,41,42. Darüber hinaus ist es bei der Kultivierung von primären Neuronen (Schritte 2.3.7 und 3.1.4) entscheidend, eine Einzelzellsuspension zu erzeugen und Zellklumpen zu vermeiden, bevor Neuronen in Flaschen oder 96-Well-Platten ausgesät werden. Neuronale Aggregate haften in Kultur nicht richtig und führen zu übermäßigem neuronalem Stress und Zelltod. Darüber hinaus kann eine längere Behandlung von Neuronen mit Trypsin beim Versuch, sie von T-25-Kolben zu dissoziieren, zu unerwünschtem Zelltod führen (Schritt 3.1.2). Um dies zu mildern, können Neuronen nach der Dissoziation vom embryonalen Gehirn direkt in 96-Well-Platten mit der gewünschten Zelldichte ausgesät werden (Schritt 2.3.7). Darüber hinaus wurde in diesem Protokoll ein Neuron:1-Verhältnis von Neuronen zu Mikroglia ausgewählt, um teilweise eine erhöhte Menge an Mikroglia darzustellen, die während der Neuroinflammation in der ZNS-Mikroumgebung vorhanden sein kann. Alternativ kann das Verhältnis der Zellen in der Co-Kultur je nach experimentellem Bedarf angepasst werden. Darüber hinaus kann der für Co-Kultur-Neuronen gewählte Zeitpunkt verlängert werden, wenn man darauf abzielt, reifere neuronale Zustände zu beurteilen.

Insbesondere bei der Dissoziation von Neuronen aus T-25-Kolben auf 96-Well-Platten kann die alleinige Verwendung von Trypsin zu einer unvollständigen Dissoziation und zur Bildung von Zellklumpen anstelle einer Monolayer-Kultur in 96-Well-Platten führen (Abbildung 2D). Um dieses Problem zu lösen, können Neuronen mit 1x Versene-Lösung, die 1 mg/ml DNase I enthält, aus dem T-25-Kolben dissoziiert werden. Weitere Faktoren, die zur neuronalen Aggregation und verminderten Lebensfähigkeit beitragen, sind eine unvollständige Verreibung der Zellsuspension, eine unzureichende Neutralisierung von Trypsin mit hitzeinaktiviertem FBS, eine übermäßige Zentrifugation oder eine verlängerte Zellpelletbildung. Daher sind die Sicherstellung einer ordnungsgemäßen Gewebedissoziation und die Erzeugung einer Einzelzellsuspension entscheidend für die Etablierung einer gesunden Mikroglia- und Neuronen-Cokultur.

Dieses Protokoll zielt darauf ab, mikroglia-neuronale Interaktionen in vitro zu rekapitulieren, um die funktionelle Bedeutung ihrer Interaktionen im ZNS besser zu verstehen. Während andere Arten von Co-Kultursystemen entwickelt wurden, wie z. B. die Kultivierung einzelner Zellpopulationen auf verschiedenen Oberflächen, um eine unabhängige Behandlung von zwei Zellpopulationen zu ermöglichen43,44, ermöglicht dieses Mischkultursystem einen direkten und engen Kontakt von Mikroglia und Neuronen. Darüber hinaus kann dieses Mischkultursystem bei ordnungsgemäßer Aufrechterhaltung durch halbe Medienwechsel alle 3 Tage von 12 Tagen (Abbildung 3F) bis möglicherweise 3 Wochen gesund bleiben, was Langzeitstudien zu neuronalen Mikroglia-Wechselwirkungen ermöglicht45.

Während die relative Einfachheit des Co-Kultursystems für die Zugänglichkeit von Vorteil ist, besteht eine wesentliche Einschränkung dieses Ansatzes darin, dass die zweidimensionale Zellkultur die ZNS-Gewebeumgebung nicht vollständig abbildet. Tatsächlich hat sich gezeigt, dass eine Trikultur aus Mikroglia, Neuronen und Astrozyten die neuroinflammatorische Reaktion in vivo zuverlässiger nachahmt als Mikroglia oder Astrozyten-Neuronal-Co-Kultur46,47. Darüber hinaus eignen sich die jüngsten Entwicklungen in organoiden Systemen des Gehirns mit Mikroglia und anderen Gliazellen, einschließlich Astrozyten und Oligodendrozyten, besser für die Untersuchung der dreidimensionalen (3D) Gewebearchitektur und der Wechselwirkungen des ZNS48. In ähnlicher Weise hat sich gezeigt, dass ein menschliches 3D-Trikultursystem, das Neuronen, Mikroglia und Astrozyten umfasst, bei der Modellierung des Zustands der Alzheimer-Krankheit wirksam ist49. Andere humane Mikroglia-Neuronen-Cokulturen könnten physiologisch relevanter für Studien zu neurodegenerativen Erkrankungen sein. Zum Beispiel kann die Co-Kultur von Mikroglia und Motoneuronen, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen50 stammen, für die Untersuchung von Krankheiten wie der amyotrophen Lateralsklerose51 nützlich sein. Angesichts der relativen Häufigkeit und der geringen Kosten für die Erzeugung von primären Neuronen und Mikroglia aus Mäusen kann die Bewertung der Mikroglia-Neuronal-Co-Kultur in 96-Well-Platten jedoch ein Hochdurchsatzansatz zur Untersuchung der Mechanismen und funktionellen Implikationen von Mikroglia-Neuronal-Interaktionen sein. Nachgelagerte Assays können die Verwendung von Lebendzell-Imaging zur Bestimmung zellulärer funktioneller Veränderungen in Echtzeit, RNA-Sequenzierung zur Bestimmung zellulärer Transkriptionsänderungen, Immunfluoreszenzmikroskopie zur Bestimmung zellulärer phänotypischer Veränderungen, Massenspektrometrie zur Bestimmung zellulärer und proteomischer Veränderungen oder enzymgebundener Immunsorbent-Assay und Western Blot zur Messung von Proteinen, die in den Co-Kultur-Überstand sezerniert werden, umfassen.

Da Mikroglia wichtige Mediatoren für die Gesundheit und Erkrankungen des ZNS sind, kann diese Co-Kultur auch verwendet werden, um die Wirkung von krankheitsbezogenen Molekülen und Verbindungen auf die bidirektionale Kommunikation zwischen Mikroglia und Neuronalen zu untersuchen. Im Rahmen der MS können aktivierte Mikroglia eine destruktive Rolle einnehmen und zur Verschlechterung der Pathologie beitragen52,53. Zum Beispiel können sie proinflammatorische Zytokine und reaktive Sauerstoffspezies sezernieren sowie die Aktivierung von Astrozyten fördern45. Dieses Protokoll kann dazu beitragen, die schädliche Rolle von Mikroglia weiter zu hinterfragen, indem es Mikroglia in der Co-Kultur mit entzündlichen Zytokinen behandelt, die bei MS als erhöht befunden wurden, und die Ergebnisse der Neuronengesundheit bewertet. Alternativ wurde diese Mikroglia-Neuronal-Co-Kultur verwendet, um die schützende Wirkung von Mikroglia auf Neuronen als Reaktion auf oxidiertes Phosphatidylcholin, ein oxidatives Produkt, das in MS54 entdeckt wurde, zu zeigen. Darüber hinaus verändert die neuronale Apoptose die Genexpression von Mikroglia während der Entwicklung, indem sie das Überleben der Mikroglia und die Phagozytose fördert55. Daher kann dieses Protokoll auch dazu beitragen, den Einfluss des neuronalen Absterbens auf den Phänotyp und die Funktion der Mikroglia zu bestimmen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll die Erzeugung und Co-Kultivierung von primären Maus-abgeleiteten Neuronen und Mikroglia in vitro beschreibt. Die Mikroglia-Neuronal-Co-Kultur, die in 96-Well-Platten aufgebaut ist, kann ein Hochdurchsatzansatz sein, um die Mechanismen und Funktionen von Mikroglia-Interaktionen mit Neuronen im Kontext der Gesundheit und Krankheit des ZNS, einschließlich MS, zu untersuchen.

Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

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JP bedankt sich für die finanzielle Unterstützung durch den Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada und das University of Saskatchewan College of Medicine. YD bedankt sich für die finanzielle Unterstützung durch den University of Saskatchewan College of Medicine Startup Fund, den Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (RGPIN-2023-03659), den MS Canada Catalyst Grant (1019973), den Saskatchewan Health Research Foundation Establishment Grant (6368) und den Brain Canada Foundation Future Leaders in Canadian Brain Research Grant. Abbildung 1A, Abbildung 2A und Abbildung 3A wurden mit BioRender.com erstellt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10 cm Petrischale Fischer 07-202-011steril
1x VerseneGibco15040-066
B-27 Plus Neuronales Kultursystem Gibco 
PräpariermikroskopVWR
DNase IRoche11284932001
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco11960-044
Fötales Rinderserum ThermoFisher Sci12483-020
HBSS (10x)Gibco14065-056
HämazytometerHausser Scientific1475
HEPES ThermoFisher Sci15630080
Leibovitz' s L-15 Medium (1x)Fisher Scientific 
Stimulierender Faktor für Makrophagen-KolonienPeprotech315-02
MikrozangeRWDF11020-11Autoklaviert/steril
Nicht-essentielle AminosäurenCytivaSH3023801
PBS (10x)ThermoFisher SciAM9625
Penicillin Streptomycin Glutamin (100x)Gibco103780-16
Poly-L-Ornithin-Hydrobromid SigmaP3655-100MG
Natriumpyruvat (100 mM)Gibco11360-070
FederschereRWDS11008-42Autoklaviert/steril
Chirurgische KlingeFeather08-916-5DSterile
T-25 KolbenFisher10-126-9
T-75 Kolben Fisher13-680-65
GewebezangeCodman30-4218Autoklavierte/sterile
GewebeschereRWDS12052-10Autoklaviert/steril
Trypan blau Thermofisher Sci 15250-061
Trypsin (2,5%)ThermoFisher Sci15090046
Weitfeld-ImmunfluoreszenzmikroskopZeiss
A365340121083027

Referenzen

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