Verständnis der Entwicklung von Kompensationswegen in einem mutierten Malariaparasiten mit hypomorphem Allel pflanzenähnlicher Kinasen

Summary

Die chemische Genetik beinhaltet die Substitution eines Gatekeeper-Rests durch eine Aminosäure, die eine andere Seitenkette am Zielort enthält. In dieser Arbeit haben wir einen mutierten Parasiten generiert, der ein hypomorphes Allel von cdpk1 enthält, und kompensatorische Signalwege identifiziert, die der Parasit im mutierten Hintergrund einnimmt.

Abstract

Einer der Mechanismen, um die Wirkung von Medikamenten durch den Malariaparasiten zu untergraben, ist die Neuverdrahtung seines Transkriptoms. Der Effekt ist bei Zielgenen, die zur Multigenfamilie gehören, ausgeprägter. Plasmodium falciparum Proteinkinasen aus der CDPK-Familie sind essentiell für die Entwicklung des Blutstadiums. Daher gelten CDPKs als gute Ziele für die Entwicklung von Anti-Malaria-Wirkstoffen. Der Ansatz der chemischen Genetik wurde in der Vergangenheit verwendet, um die Funktion von Proteinkinasen in höheren Eukaryoten aufzuklären. Es erfordert die Substitution von Gatekeeper-Resten durch eine andere Aminosäure mit einer anderen Seitenkette durch genetische Manipulation. Die Aminosäuresubstitution an der Gatekeeper-Position moduliert die Aktivität einer Proteinkinase und verändert ihre Anfälligkeit für eine bestimmte Klasse von Verbindungen, die als Bumped-Kinase-Inhibitoren (BKIs) bekannt sind und bei der funktionellen Identifizierung des Zielgens helfen. Hier haben wir den Ansatz der chemischen Genetik genutzt, um die Kompensationsmechanismen zu verstehen, die von einem mutierten Parasiten entwickelt werden, der ein hypomorphes Allel von cdpk1 beherbergt. Insgesamt hilft unser Ansatz bei der Identifizierung von Kompensationswegen, die gleichzeitig angesteuert werden können, um die Entwicklung von Arzneimittelresistenzen gegen einzelne Kinasen zu verhindern.

Introduction

Malaria ist eine der führenden Infektionskrankheiten, die jedes Jahr für Millionen von Todesfällen verantwortlich ist, insbesondere bei Kindern unter 5 Jahren¹. Es gibt keinen klinisch verfügbaren Impfstoff gegen Malaria. Darüber hinaus ist bekannt, dass Plasmodium falciparum, der tödlichste menschliche Malariaparasit, eine Resistenz gegen das Frontmedikament Artemisinin^{entwickelt hat 2,3,4,5}. Es besteht ein dringender Bedarf, neue Angriffspunkte für Medikamente und neuartige Strategien zu identifizieren, die schnell eingesetzt werden können, um die Ausbreitung von Artemisinin-Resistenzen weltweit zu verhindern. Ein besseres Verständnis des Wirkmechanismus und der molekularen Grundlagen der Kompensationswege kann dazu beitragen, bessere Strategien zur Vermeidung der Entwicklung von Arzneimittelresistenzen zu entwickeln.

Proteinkinasen, die zur Familie der Calciumabhängigen Proteinkinasen (CDPKs) gehören, sind in vielen Stadien der Parasitenentwicklung während der erythrozytären, sexuellen und präerythrozytären Stadien von entscheidender Bedeutung⁶. Während der asexuellen Replikation von P. Es ist bekannt, dass CDPK5 eine entscheidende Rolle beim Austritt von Merozoiten aus reifen Schizonten spielt⁷. Die bedingte Deletion von CDPK5 erlaubt es Schizonten nicht, Merozoiten in den Blutkreislauf freizusetzen, was zum Tod des Parasiten führt. Der molekulare Mechanismus des CDPK5-vermittelten Parasitenaustritts ist nicht vollständig verstanden und es wird angenommen, dass die Proteinkinase G (PKG) als vorgeschalteter Regulator beteiligt ist ^7,8. CDPK7 ist essentiell für die Reifung von Parasiten im Ringstadium zu Trophozoiten⁹. CDPK4 ist ein weiteres Mitglied der CDPK-Familie, das für die Entwicklung des sexuellen Stadiums bei Mücken entscheidend ist. Es ist an mehreren Schritten während des Exflagellationsprozesses beteiligt und daher entscheidend für die Bildung freier, beweglicher, männlicher Gameten 10,11,12,13. CDPK1-Phosphorylatkomponenten des inneren Membrankomplexes und der Rhhoperie^14,15. Darüber hinaus führt die bedingte Deletion von CDPK1 zu einer Hypophosphorylierung von Proteinen, die an der Invasion von RBC¹⁶ beteiligt sind. Es wurde gezeigt, dass CDPK1 die Entladung apikaler Organellen während des Invasionsprozesses reguliert¹⁷. CDPK1 hilft auch beim Austritt von Merozoiten aus infizierten Erythrozyten, indem es die SERA5-Protease¹⁸ phosphoryliert. Phosphoryliertes CDPK1 ist bevorzugt am apikalen Ende des Merozoiits lokalisiert, wo es mit anderen Parasitenproteinen interagieren kann, die für den Invasionsprozess benötigt werden^19,20. CDPK1 ist auch an der Bildung männlicher und weiblicher Gameten beteiligt, was ein entscheidender Schritt für die Übertragung von Malaria und die sexuelle Entwicklung des Parasiten in den Mücken ist²¹.

Der Ansatz der chemischen Genetik wurde in der Vergangenheit zur Identifizierung der funktionellen Rollen von Säugetierkinasen verwendet ^22,23. Der Ansatz nutzt die Substitution eines Rests an der Gatekeeper-Position durch eine Aminosäure einer anderen Seitenkette. Die Änderung des Gatekeeper-Rests moduliert die Größe einer angrenzenden ATP-Tasche, was wiederum die Zugänglichkeit chemischer Verbindungen, die als Bumped-Kinase-Inhibitoren (BKIs) bezeichnet werden, gegenüber dem mutierten Enzym im Vergleich zum Wildtyp verändert. Die Substitution eines sperrigen Rests an der Gatekeeper-Position durch einen kleineren Rest ermöglicht den Zugang zu BKIs, während die umgekehrte Substitution die Kinase resistent gegen BKIs macht. In einigen Fällen ist die Substitution von Gatekeeper-Resten mit einer Abnahme der Kinaseaktivität des Zielenzyms verbunden, so dass die Modifikation für funktionelle Studien intolerant ist ^24,25. Der negative Effekt der Gatekeeper-Substitution auf die Enzymaktivität kann durch die Erzeugung einer Suppressormutation an einer zweiten Stelle in der intoleranten Kinase²⁵ umgekehrt werden. Ein chemisch-genetischer Ansatz wurde verwendet, um die Funktion von Apicomplexan-Proteinkinasen zu untersuchen. Das Wildtyp-CDPK4, das einen kleineren Gatekeeper-Rest enthielt, wurde selektiv durch die gestoßenen Kinase-Inhibitoren BKI-1 und 1294 gehemmt, was zu einer Blockade der männlichen Gametogenese und der Oozystenentwicklung führte^11,12. Die Substitution eines kleinen Gatekeeper-Rests in CDPK4 durch einen sperrigen Methioninrest führte zu einer Abnahme der BKI-vermittelten Hemmung in der Exflagellation¹¹. Es wurde gezeigt, dass CDPK1 von Toxoplasma gondii, einem Apicomplexan-Parasiten, der eng mit dem Malariaparasiten verwandt ist, an der Motilität und Invasion von Wirtszellen durch Tachyzoiten beteiligt ist^26,27. Eine kleinere Gatekeeper-Tasche des Wildtyps TgCDPK1 wurde ausgenutzt, um spezifische Inhibitoren zu entwickeln, die die Krankheitspathogenese in Tiermodellen verringerten^28,29. Beteiligung von P. Falciparum Die Proteinkinase G (PKG) in der späten schizogonischen Entwicklung und Gametenbildung wurde durch Hemmung der Aktivität des Enzyms mit spezifischen pharmakologischen Inhibitoren nachgewiesen^30,31. Die Substitution von Threonin an der Gatekeeper-Position mit Glutamin (T618Q) verringerte die Sensitivität des mutierten Enzyms gegenüber den Inhibitoren erheblich, was zu einer normalen Gametogenese und einer Progression von Schizont zu Ring führte^30,31.

Die meisten der bisherigen Studien haben einen chemisch-genetischen Ansatz für die funktionelle Charakterisierung der Zielkinasen 11,12,22,23,26,30,31 verwendet, jedoch haben wir diesen Ansatz gewählt, um die Entwicklung von Kompensationsmechanismen in Parasiten zu verstehen, die ein hypomorphes Allel einer Proteinkinase beherbergen. Wir haben bereits gezeigt, dass die Substitution von Wildtyp-Gatekeeper-Resten in CDPK1 durch Methionin (T145M) zu einer Verringerung des Transphosphorylierungspotenzials des mutierten Enzyms³² um ~ 47% führt. Ein mutierter Parasit, der das hypomorphe Allel von cdpk1 (cdpk1t145m) enthält, ist durch transkriptionelle Neuverdrahtung anderer Mitglieder der CDPK-Familie für die verminderte Aktivität von CDPK1 präadaptiert. Wir glauben, dass diese Strategie allgemein verwendet werden kann, um die Kompensationsmechanismen in mutierten Parasiten aufzuklären, die hypomorphe Allele essentieller Proteinkinasen enthalten. Andere Kinasen, die die Funktion der Zielkinase teilweise kompensieren, können gleichzeitig zusammen mit der Zielkinase gehemmt werden, um die Entwicklung einer Arzneimittelresistenz gegen einzelne Kinasen zu verhindern. Dies könnte als bessere Strategie zur Malariakontrolle dienen.

Protocol

Die P. falciparum Parasitenstamm (NF54) wurde aus Alvaro Molina Cruz^gewonnen 21,32,33. O⁺ menschliche rote Blutkörperchen, die für die Parasitenkultur verwendet wurden, wurden vom Rotary Blood Centre in Neu-Delhi, Indien, gewonnen. Die Plasmide, pL6eGFP und pUF1, wurden von Jose-Juan Lopez-Rubio gewonnen. DSM267 wurde von Margaret A. Phillips und Pradipsinh K. Rathod bezogen. WR99210 wurde von der Jacobus Pharmaceutical Company zur Verfügung gestellt.

1. Aufbau eines Plasmids zur Expression von rekombinantem CDPK1 in Escherichia coli

1. Design des Oligonukleotid-Primerpaares zur Amplifikation des vollständigen CDS des cdpk1-Gens (PlasmoDB-Zugangsnr. PF3D7_0217500) Verwendung von Primer-Analysesoftware.
   1. Amplifizieren Sie das vollständige CDS mit DNA-Polymerase mit genspezifischem Oligonukleotidpaar: Pk1fpgex und Pk1rpgex (siehe Tabelle 1) unter Verwendung von cDNA, die aus Plasmodium falciparum als Template in einem Reaktionsvolumen von 20 μl hergestellt wurde. Stellen Sie die PCR-Amplifikationsbedingungen wie folgt ein: Anfängliche Denaturierung bei 98 °C für 2 min, (Denaturierung bei 98 °C für 30 s, Annealing bei 52 °C für 20 s, Ausdehnung bei 62 °C für 20 s) x 36, Endausdehnung bei 62 °C für 10 min. Lagern Sie das PCR-Produkt bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C.
2. 1 μg des amplifizierten PCR-Produkts und 1 μg des pGEX4T1-Expressionsplasmids mit BamHI (20.000 U/ml) und NotI (20.000 U/ml) Restriktionsendonukleasen für 3-4 h bei 37 °C in einem Gesamtreaktionsvolumen von 30 μl verdauen.
3. Um das doppelt verdaute PCR-Produkt und das Plasmid aufzureinigen, verwenden Sie ein säulenbasiertes PCR-Clean-up-Kit und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers.
4. Ligate 100 ng doppelt verdautes, gereinigtes pGEX4T1-Plasmid mit einem Insert in einem molaren Vektor-zu-Insert-Verhältnis von 1:5 unter Verwendung von 1 μl T4-DNA-Ligase in einem Gesamtreaktionsvolumen von 10 μl. Die Ligationsreaktion über Nacht bei 16 °C inkubieren.
5. Transformieren Sie E. Coli DH5α-kompetente Zellen mit der ligierten Mischung gemäß dem Protokoll des Herstellers und Platte auf LB-Agar-Platten, die Ampicillin (100 μg/ml) enthalten.
6. Vier aus der Transformation gewonnene bakterielle Klone werden auf das Vorhandensein des rekombinanten Plasmids untersucht, indem das Plasmid mit einem Mini-Plasmid-Aufreinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt wird. Das rekombinante Plasmid wird durch doppelten Restriktionsverdau mit BamHI und NotI bestätigt, wie oben in Schritt 1.3 beschrieben.
7. Weitere Verifizierung der Restriktionsverdau-positiven Klone für die korrekte Sequenz durch Sanger-DNA-Sequenzierung. Transformieren Sie E. Coli BLR(DE3) pLysS-kompetente Zellen mit dem sequenzverifizierten Plasmidkonstrukt für die CDPK1-Proteinexpression.

2. Expression und Aufreinigung des rekombinanten CDPK1-Proteins in E. coli

1. Expression von rekombinantem CDPK1
   1. Beimpfe einen einzelnen Klon von E. Coli BLR(DE3) pLysS-Stamm, der das sequenzverifizierte Plasmidkonstrukt enthält, in 10 mL LB-Medium, das Ampicillin (100 μg/ml) enthält. Inkubieren Sie die Kultur über Nacht bei 37 °C und schütteln Sie sie bei 200-250 U/min.
   2. Beimpfen Sie die Sekundärkultur mit 1 % der Primärkultur und lassen Sie die Bakterienzellen bis zur mittleren logarithmischen Phase bei 37 °C wachsen. Wenn die optische Dichte (OD) der Sekundärkultur bei 600 nm 0,7-0,9 erreicht, induzieren Sie die Expression des rekombinanten CDPK1 in voller Länge durch Zugabe von 1 mM Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) und inkubieren Sie für 10-12 h bei 24 °C.
   3. Nach der Inkubation ernten Sie das E. Coli-Zellen durch Zentrifugation bei 5.000 x g für 10 min. Dekantieren Sie den Überstand und halten Sie das Zellpellet zurück.
   4. Bereiten Sie den Lysepuffer mit der folgenden Zusammensetzung vor: 1 mM Dithiothreitol (DTT), 0,1 mg/ml Lysozym, 1 mM EDTA, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und einem 1x Proteasehemmer-Cocktail in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
   5. Resuspendieren Sie das Zellpellet im 10-fachen des Pelletgewichtsvolumens des Lysepuffers. Die Zellsuspension wird 15 Minuten lang in Intervallen von 9 s an und 15 s aus beschallt, um eine lokale Erwärmung zu verhindern, die zu einer Denaturierung des Proteins führen kann.
   6. Das Lysat wird 1 h lang bei 17.000 x g zentrifugiert und der klare Überstand über Nacht bei 4 °C mit Glutathionkügelchen inkubiert. Befolgen Sie das unten erwähnte Protokoll, um gereinigtes rekombinantes CDPK1-Protein zu erhalten.
2. Affinitätschromatographie mit Glutathionkügelchen zur Aufreinigung von GST-markiertem CDPK1
   1. Nehmen Sie 500 μl vollständig resuspendierte Glutathionkügelchen für 250 mL Bakterienkultur und zentrifugieren Sie bei 500 x g für 5 min bei 4 °C. Den Überstand vorsichtig dekantieren.
   2. Waschen Sie die Kügelchen mit 5 mL Bindungspuffer (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄, pH 7,3) und drehen Sie sie zum Mischen um.
   3. Bei 500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand entfernen. Wiederholen Sie das Waschen und Zentrifugieren für 3x-4x.
   4. Geben Sie die Kügelchen in das Bakterienzelllysat und inkubieren Sie sie 12 h bei 4 °C unter leichtem Schütteln (20-30 U/min).
   5. Bei 500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand entfernen. Der Überstand kann gespeichert werden, um die Menge an rekombinantem CDPK1 zu schätzen, die ungebunden bleibt.
   6. Waschen Sie die CDPK1-gebundenen Kügelchen mindestens 5-6 Mal mit PBS mit 1 mM DTT, gefolgt von einer Wäsche mit 50 mM Tris, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, pH 7,5.
   7. Eluieren Sie das gebundene Protein 2x, zuerst mit 250 μL Elutionspuffer 1 (EB1), gefolgt von 2x mit 250 μl Elutionspuffer 2 (EB2). Die Zusammensetzung von EB1 und EB2 beträgt 10 mM reduziertes Glutathion in 50 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7,5 und 20 mM reduziertes Glutathion in 50 mM Tris, 100 mM NaCl bzw. pH 7,5.
   8. Inkubieren Sie die CDPK1-gebundenen Kügelchen in den Elutionspuffern 1 und 2 bei Raumtemperatur (RT) für 5-10 Minuten unter leichtem Rühren oder End-over-End-Rotation.
   9. Bei 500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand mit dem eluierten rekombinanten Protein CDPK1 vorsichtig in ein separates Röhrchen überführen.
   10. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.8 und 2.2.9, um jeweils 2 Eluen mit EB1 und EB2 zu erhalten.

3. Ortsgerichtete Mutagenese zur Erzeugung rekombinanter CDPK1-Gatekeeper-mutierter Proteine

1. Verwenden Sie das pGEX4T1-Plasmid, das ein sequenzverifiziertes cdpk1-Gen enthält. Wir bevorzugen es, das gleiche Plasmid zu verwenden, das für die Transformation des E. coli BLR(DE3) pLysS-Stammes verwendet wurde.
2. Entwerfen Sie die Primer so, dass sie eine Gatekeeper-Mutation in die Wildtyp-cdpk1-Gensequenz einführen. Der Wildtyp-Gatekeeper-Rest (T145) wird durch ein ACC-Codon im cdpk1-Gen kodiert. Ersetzen Sie den Threonin-Gatekeeper durch kleine (Serin, T145S) und sperrige (Methionin, T145M) Gatekeeper-Reste, die von AGC- bzw. ATG-Codons kodiert werden.
3. Befolgen Sie die unten aufgeführten Richtlinien, um die Vorwärts- und Rückwärtsprimer für die ortsgerichtete Mutagenese zu entwerfen.
   1. Stellen Sie sicher, dass beide Grundierungen zueinander komplementär sind. Behalten Sie 15-20 Nukleotide mit unveränderter Sequenz auf beiden Seiten der Mutation. Stellen Sie sicher, dass Tm für die Sequenz zwischen 50 °C und 55 °C liegt, ohne die mutierte Stelle.
4. Verwenden Sie das Site-Directed Mutagenese Kit, um die Gatekeeper-Mutantenkonstrukte von cdpk1 zu generieren. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, um die gewünschte Mutation einzuführen. Die für die ortsgerichtete Mutagenese verwendeten Primer sind in Tabelle 1 aufgeführt.
5. Behandeln Sie das Reaktionsgemisch mit 0,5 μl DpnI (20.000 U/ml) Enzym, um das parentale, methylierte Plasmid zu verdauen. Das Reaktionsgemisch wird 3 h lang bei 37 °C inkubiert. E . coli DH5α-kompetente Zellen werden mit dem DpnI-behandelten Reaktionsgemisch transformiert.
6. Screenen von jeweils vier Klonen von T145M- und T145S-Plasmidkonstrukten, um die Einführung der gewünschten Mutation in der cdpk1-Gensequenz durch DNA-Sequenzierung zu überprüfen.
7. Transformieren Sie die sequenzverifizierten Plasmide im E. coli BLR(DE3) pLysS-Stamm für die Expression der rekombinanten CDPK1 T145M/S-Proteine, wie in Schritt 1.5 beschrieben.
8. Exprimieren und reinigen Sie die CDPK1-Gatekeeper-mutierten Proteine gemäß den in Abschnitt 2 für das Wildtyp-CDPK1-Protein beschriebenen Schritten.

4. In-vitro-Kinase-Aktivitätsassay von CDPK1

HINWEIS: Die Kinaseaktivität von rekombinantem Wildtyp-CDPK1 und den Gatekeeper-mutierten Proteinen wird durch einen semisynthetischen Epitop-Tagging-Ansatz bewertet, wie von Allen et ^al.34 beschrieben.

1. 50 ng rekombinantes Protein werden in dem Puffer inkubiert, der 50 mM Tris, 50 mM MgCl₂, 1x Phosphatinhibitor-Cocktail mit 2 μg Myelin-Basisprotein (MBP) als exogenes Substrat von CDPK1 in der Gesamtreaktionsmischung von 50 μL enthält.
2. Abhängig von den Bedingungen, die das Vorhandensein oder Fehlen von Kalzium erfordern, fügen Sie CaCl₂ bzw. EGTA hinzu, um die Endkonzentration von jeweils 2,5 mM im Kinase-Assay-Puffer zu erreichen. Geben Sie ATPγS bis zu einer Endkonzentration von 100 μM in den Puffer, um ihn als Quelle für die übertragbare terminale Phosphatgruppe zu verwenden.
3. Das Reaktionsgemisch wird 1 h lang bei 30 °C in einem Wasserbad inkubiert, gefolgt von der Beendigung der Reaktion durch Zugabe von 5 mM EGTA. 5 μl 50 mM p-Nitrobenzylmesylat (PNBM) in das Reaktionsgemisch geben und bei 20 ΰC im Wasserbad 2 h zur Alkylierung der phosphorylierten Serin- und Threoninreste in der Transphosphorylierung MBP und autophosphoryliertem CDPK1 inkubieren lassen.
4. Zu den insgesamt 55 μl Reaktionsgemisch werden 19 μl 4x SDS-Probenpuffer hinzugefügt und 5 min lang auf 95 °C erhitzt.

5. Western-Blot-Analyse zum Nachweis der thiophosphorylierten Produkte des In-vitro-Kinase-Assays

1. Bereiten Sie 12 % SDS-PAGE-Gel vor und laden Sie 15 μl jeder Probe. Trennen Sie das Reaktionsgemisch, um autophosphoryliertes CDPK1 und transphosphoryliertes MBP sichtbar zu machen.
2. Die abgetrennten Proteine aus dem SDS-PAGE-Gel werden unter Verwendung des Nasstransferverfahrens³² auf eine PVDF-Membran übertragen.
3. Blockieren Sie die unspezifischen Stellen auf der PVDF-Membran, indem Sie sie mit 5 % Magermilch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (20 mM Tris-HCL, pH 7,5, 150 mM NaCl) mit 0,05 % Tween 20 für 1 h bei RT inkubieren.
4. Inkubieren Sie die PVDF-Membran mit dem Kaninchen-Primärantikörper gegen alkylierte thiophosphorylierte Addukte in einer Verdünnung von 1:2.500 über Nacht bei 4 °C im Blockierungspuffer.
5. Nach der Inkubation über Nacht den Blot 3x mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,05% Tween 20 für jeweils 10 min waschen.
6. Inkubieren Sie den Blot weiter mit Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper in Blockpuffer bei einer Verdünnung von 1:5.000 für 1 h bei RT, gefolgt von einem Waschen mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,05 % Tween 20.
7. Überlagern Sie den Blot mit chemilumineszierendem Substrat, indem Sie einen gleichen Anteil von Lösung A und Lösung B gemäß den Anweisungen des Herstellers mischen und in einem dunklen Raum auf Röntgenfilm belichten, um Signale der CDPK1-Autophosphorylierung und der MBP-Transphosphorylierung zu erhalten.

6. Klonierung der Guide-Sequenz für das Targeting des  cdpk1-Locus zur Einführung der Gatekeeper-Substitution

HINWEIS: Die Leitsequenz von 20 Nukleotiden wurde durch manuelle Kuration ausgewählt und in einem pL6eGFP-Plasmid an der BtgZI-Stelle kloniert, indem die folgenden Schritte durchgeführt wurden.

1. Verdau von pL6eGFP mit dem BtgZI-Enzym
   1. 1 μg pL6eGFP-Plasmid³⁵ mit 1 μl BtgZI-Enzym (5.000 Einheiten/ml) für 4 h bei 60 °C in einem Reaktionsgemisch von 20 μl verdauen, gemäß dem Protokoll des Enzymherstellers für Reaktionsbedingungen.
   2. Nach der 4-stündigen Inkubationszeit wird das verdaute Plasmid auf ein 1%iges Agarosegel aufgetragen und das Gelstück (~ 9,8 kb), das das verdaute Plasmid enthält, herausgeschnitten. Reinigen Sie das verdaute Plasmid mit einem säulenbasierten Gel-Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
2. Glühen von Oligos
   1. Rekonstituieren Sie die Oligonukleotide (Ck1GUIDEFWD und Ck1GUIDEREV) in DNase/RNase-freiem Wasser, um eine 100 μM-Stammlösung herzustellen.
   2. Kombinieren Sie 20 μM jedes Oligonukleotids in einer Lösung, die 10 mM Tris (pH 8,0), 50 mM NaCl und 1 mM EDTA enthält. Die Mischung wird bei 95 °C in einem trockenen Bad 5 Minuten lang inkubiert und die Reaktion auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. In der Regel dauert es 1 h, bis die Temperatur des Reaktionsgemisches RT erreicht.
   3. Verdünnen Sie die geglühten Oligonukleotide auf 0,5 μM in Tris pH 8,0, was zu einem Gesamtvolumen des Reaktionsgemisches von 100 μl führt.
3. In-Fusions-Reaktion
   1. Kombinieren Sie 1,5 μl verdünnte Oligonukleotide mit 100 ng BtgZI-verdautem linearisiertem Plasmid in einer 5x In-Fusion-Enzymvormischung in einem Gesamtreaktionsvolumen von 10 μl, um einen CDPK1-Leitfaden zu erzeugen, der das pL6CK1G-Plasmid enthält.
   2. Die Reaktion wird 15 Minuten lang bei 50 °C inkubiert. Die Reaktion wird bei 4 °C gelagert, bis mit der Umwandlung von E fortgefahren wird. coli.
      HINWEIS: Für die Langzeitlagerung kann das Reaktionsgemisch bei -20 °C gelagert werden.
4. Verwandlung von E. Coli Stellare kompetente Zellen
   1. Geben Sie 2,5 μl des Reaktionsgemisches zum E. Coli Stellar kompetente Zellen und fahren Sie mit dem Transformationsprozess gemäß dem Protokoll des Herstellers fort.
   2. Plattieren Sie die transformierten kompetenten Zellen auf LB-Ampicillin-Platte (100 μg/ml) und lassen Sie die transformierten Bakterien über Nacht bei 37 °C wachsen.
   3. Wählen Sie die transformierten Kolonien aus und extrahieren Sie das Plasmid mit einem kommerziell erhältlichen Plasmid-Miniprep-Kit. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für die Plasmidaufreinigung. Validieren Sie die Insertion des Guides in das Plasmid durch Sanger-DNA-Sequenzierung.

7. Klonierung eines Homologiearms zur Reparatur des Cas9-Endonuklease-restriktiven cdpk1-Locus

HINWEIS: Ein Homologiearm, der die SNPs umfasst, die in den Ziellocus eingeführt werden sollen, wird kommerziell synthetisiert. Normalerweise nehmen wir einen Homologiearm von 400-1000 bp Länge. Der Homologiearm enthält stille Mutationen in der Guide-RNA-Region und PAM, um das erneute Schneiden des modifizierten Locus nach dem Einbau der gewünschten SNPs zu verhindern. Der Homologiearm (entsprechend den Nukleotiden 133 bis 553 von CDPK1), der Met- oder Ser-Gatekeeper-Mutationen und stille Mutationen enthält, wird von AflII- und SpeI-Restriktionsstellen flankiert.

1. 1 μg pL6CK1G und das Plasmid, das den Homologiearm enthält, werden unter Verwendung von jeweils 0,5 μl Restriktionsenzymen AflII (20.000 U/ml) und SpeI (20.000 U/ml) für 4 h bei 37 °C in einem Reaktionsgemisch von 20 μl doppelt verdaut.
2. Führen Sie die vollständige Reaktion von doppelt verdauten Plasmiden auf 1,5 % Agarosegel durch und reinigen Sie die Banden, die dem Homologiearm und dem Plasmidrückgrat von pL6CK1 entsprechen, mit einem Gelextraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
3. Ligatieren Sie den verdauten Homologiearm mit 100 ng pL6CK1-Plasmid in einem Vektor-zu-Insert-Verhältnis von 1:5 in einem Gesamtreaktionsvolumen von 10 μL unter Verwendung von T4-DNA-Ligase. Die Ligationsreaktion über Nacht bei 16 °C inkubieren. Transformieren Sie E. coli DH5α-kompetente Zellen mit der vollständigen Ligationsmischung gemäß den Anweisungen des Herstellers.
4. Die transformierten Zellen werden auf LB-Agarplatten mit Ampicillin (100 μg/ml) plattiert, um positive Transformanten auszuwählen. Wählen Sie einzelne Kolonien aus der LB-Ampicillinplatte aus und reinigen Sie das Plasmid mit einem Plasmid-Extraktionskit.
5. Bestätigen Sie den Klon auf das Vorhandensein des Homologiearms, indem Sie das gereinigte Plasmid mit AflII- und SpeI-Enzymen unter Verwendung der gleichen Verdauungsbedingung wie in Schritt 7.3 beschrieben verdauen. Bestätigen Sie die positiven Klone mit doppeltem Verdau weiter durch Sanger-DNA-Sequenzierung, um die vollständige Sequenz des Homologiearms zu validieren.

8. Aufreinigung von pL6CK1Met-, pL6CK1Ser- und pUF1-Plasmiden für die Transfektion von Malariaparasiten

1. 5 ml Primärkulturen mit sequenzverifizierten Klonen von pL6CK1Met, pL6CK1Ser und pUF1 in LB-Medien mit Ampicillin (100 μg/ml) setzen und 10 Stunden lang inkubieren. Übertragen Sie die Primärkultur in die Sekundärkultur im Verhältnis 1:1000 und inkubieren Sie weitere 12 Stunden.
2. Die Bakterienkultur wird durch Zentrifugation bei 5000 x g für 10 min in einer Zentrifugenflasche pelletiert.
3. Isolieren Sie die Plasmide mit einem Plasmidaufreinigungskit gemäß dem Protokoll des Herstellers. Löse die Plasmid-DNA in DNase/RNase-freiem Wasser auf, um den Parasiten direkt zu transfizieren.

9. In-vitro-Kultivierung von Plasmodium falciparum und Sorbit-Synchronisation für die Transfektion

HINWEIS: Die In-vitro-Kultur von P. falciparum in menschlichen roten Blutkörperchen (RBCs) wird nach der von Trager und Jensen beschriebenen Methode durchgeführt³⁶.

1. Vermehren Sie den NF54-Stamm von P. Falciparum durch Kultivierung in O⁺ humanen Erythrozyten mit einem Hämatokrit von 2 % in vollständigem RPMI (cRPMI) Medium, das RPMI 1640 enthält, ergänzt mit L-Glutamin, 25 mM HEPES, 25 mM Natriumbicarbonat und 50 μg/ml Hypoxanthin. Ergänzen Sie das Medium mit 0,5 % AlbuMAX II und 10 μg/ml Gentamicin und halten Sie die Kultur bei 37 °C unter einer Atmosphäre von 5 % O₂, 5 % CO₂ und 90 % N₂.
2. Für die Sorbit-Synchronisation zur Gewinnung von Ringstadien-Parasiten werden die asynchronen Parasiten in einem konischen 50-ml-Röhrchen durch Zentrifugation bei 2.300 x g für 3 min bei RT pelletiert. Der Überstand wird verworfen.
3. Inkubieren Sie die parasitierten Erythrozyten mit 9 Volumina von 5 % Sorbit für 10 min bei 37 °C. Nach der Inkubation werden die Erythrozyten durch Zentrifugation bei 2.300 x g für 3 Minuten pelletiert und das Sorbit verworfen.
4. Waschen Sie die mit Sorbit behandelten Parasiten mit unvollständigem RPMI, iRPMI (RPMI-Medien ohne Albumax und Natriumbicarbonat) und inkubieren Sie sie anschließend in cRPMI. Verwenden Sie die Parasiten im Ringstadium im nächsten Zyklus für die Plasmidtransfektion.

10. Transfektion eines Ringstadienparasiten mit pL6CK1Met-, pL6CK1Ser- und pUF1-Plasmiden

HINWEIS: Die folgenden Schritte werden für die direkte Transfektion von Parasiten im Ringstadium mit Plasmid-DNA angewendet.

1. Bereiten Sie 2x Cytomix-Puffer³⁷ vor, indem Sie in 30 mL Wasser, 240 mM KCl, 0,3 mM CaCl₂, 4 mM EGTA, 10 mM MgCl₂, 20 mM K₂HPO₄/KH₂PO₄ und 50 mM HEPES auflösen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,6 ein. Stellen Sie das endgültige Volumen auf 50 ml ein. Filter: Sterilisieren Sie den Puffer mit einem 0,22 μm Spritzenfilter. Verdünnen Sie dann den 2x Cytomix-Puffer mit sterilem Wasser, um einen 1x Cytomix-Puffer zu erhalten.
2. In ein steriles konisches 15-ml-Röhrchen geben Sie 100 μl gepackte ringgestrige parasitierte Erythrozyten und waschen Sie sie 2x mit 5 mL 1x Cytomix-Puffer. Führen Sie die Wäschen durch Zentrifugieren bei 994 x g für 3 min bei RT durch.
3. Entfernen Sie nach dem Waschen den Puffer und fügen Sie 50 μg jedes Plasmids (pL6CK1Met/pUF1 zur Erzeugung der T145M-Mutation und pL6CK1Ser/pUF1 zur Erzeugung der T145S-Mutation) in die gepackten parasitierten Erythrozyten hinzu. Fügen Sie dann 2x Puffer entsprechend dem Volumen des Plasmids hinzu und stellen Sie das Volumen auf 400 μl mit 1x Pufferkonzentration ein.
4. Für jede Transfektion werden 400 μl der obigen Lösung in 0,2 cm Küvetten überführt. Elektroporate unter den folgenden Bedingungen: 0,31 kV, 950 μF und Widerstand auf unendlich eingestellt.
5. Entfernen Sie nach der Elektroporation die transfizierten Parasiten aus der Küvette, mischen Sie sie mit cRPMI und überführen Sie sie in einen T25-Kolben mit einem Gesamtvolumen von 15 ml. Inkubieren Sie die Parasiten 2 Stunden lang unter den in Schritt 9.1 genannten Bedingungen.
6. Nach der Inkubation werden die transfizierten Parasiten in ein konisches 50-ml-Röhrchen überführt und 3 Minuten lang bei 994 x g zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Parasiten mit 10 ml unvollständigem RPMI. Kulturieren Sie sie 2 Tage lang mit frischem cRPMI und füllen Sie das Nährmedium nach 24 Stunden wieder auf.
7. Nach 48 Stunden wird das cRPMI aus jedem Kolben entfernt und die Kultur in cRPMI, das 2 nM WR99210 und 150 nM DSM267³⁸ enthält, wieder suspendiert. Übertragen Sie dann die Kultur in einen T75-Kolben, indem Sie 400 μl frische Erythrozyten hinzufügen. Füllen Sie das Medium täglich mit cRPMI auf, das WR99210 und DSM267 für 7 Tage enthält. Fügen Sie anschließend jeden zweiten Tag bis zum 14. Tag nach der Transfektion cRPMI hinzu, das beide Arzneimittel enthält.
8. Aliquotieren Sie an Tag 14 200 μl der transfizierten Kultur in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen (MCT) für die Vorbereitung des Objektträgers. Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 500 x g für 5 min bei RT pelletiert. Der Überstand wird aspiriert und die Zellen werden auf den Objektträger übertragen. Machen Sie einen Abstrich mit einer anderen Folie, indem Sie sie in einem Winkel von 45° platzieren.
9. Fixieren Sie den Objektträger in Methanol und bereiten Sie die Giemsa-Beize vor, indem Sie sie 1:10 in Reinstwasser verdünnen. Dann färben Sie den Objektträger, indem Sie ihn 20 Minuten lang vollständig in den Giemsa-Fleck eintauchen. Waschen Sie die Rutsche unter fließendem Wasser und trocknen Sie sie gründlich ab. Betrachten Sie dann den Objektträger unter einem Lichtmikroskop bei 100-facher Vergrößerung, indem Sie Immersionsöl auftragen.
10. Sobald die Parasiten sichtbar sind, füllen Sie das Medium täglich auf und lassen Sie sie 2-3 Tage lang wachsen. Entfernen Sie dann die Parasiten, um die gewünschte Modifikation in der Zielgensequenz am Zielort zu überprüfen.
    HINWEIS: Wenn die Parasiten an Tag 14 nicht sichtbar sind, füllen Sie das Medium (das beide Arzneimittel enthält) nach 4 Tagen auf. Reduzieren Sie den Parasiten um 30 % und fügen Sie alle 7 Tage frisches Blut hinzu, um 2 % Hämatokrit zu erhalten, bis die Parasiten wieder auftreten.

11. PCR-Nachweis eines transgenen Parasiten mit gewünschter Modifikation des cdpk1-Locus

1. Nach 2-3 Tagen Parasitenwachstum nehmen Sie 500 μl Kultur heraus und überführen Sie sie in ein 1,5 ml MCT.
2. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 2.400 x g für 5 min. Lysieren Sie dann die Erythrozyten durch Saponinbehandlung.
   1. Für die Saponinbehandlung 10 μl 10%ige Saponinlösung zu 1 ml resuspendiertem Parasitenpellet geben und 5 Minuten lang bei 4 °C halten. Die Zellen werden bei 2.400 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand verworfen. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis die Rötung vollständig verschwunden ist und ein schwarzes Parasitenkügelchen erhalten wird.
3. Waschen Sie das Parasitenpellet mit 1 mL 1x PBS durch Zentrifugation bei 2.400 x g für 5 min. Anschließend wird das Pellet in 50 μl DNase/RNase-freiem Wasser resuspendiert. Das resuspendierte Parasitenpellet 5 min lang auf 95 °C erhitzen, anschließend 10 min bei 4 °C auf 16.200 x g zentrifugieren. Übertragen Sie den Überstand mit der Parasiten-DNA in ein frisches Röhrchen.
4. Verwenden Sie das oben genannte genetische Material zur PCR-Amplifikation des Gens in voller Länge unter Verwendung der Primersätze ck1f1 und ck1r3wt (siehe Tabelle 1), wobei spezifisch auf die Region außerhalb des Homologiearms abzielt, wie oben in Schritt 1.2 beschrieben. Sequenzieren Sie die Homologieregion, die die T145M-Mutation enthält, mit dem ck1f1-Primer .

12. Begrenzung der Verdünnung zur Gewinnung klonaler transgener Parasiten

1. Nach der Sequenzverifizierung verdünnen Sie die transfizierte Parasitenkultur, um eine Endkonzentration von 1 Parasiten pro 200 μl zu erreichen. Geben Sie dann 100 μl der verdünnten Kultur in die Vertiefungen einer 96-Well-Gewebekulturplatte. Führen Sie die folgenden Schritte (12.2-12.4) durch, um 1 Parasit/200 μl zu erreichen.
2. Bereiten Sie 10 ml parasitierte Erythrozyten mit 2 % Hämatokrit vor. Schätzen Sie den prozentualen Anteil der Parasitämie der Kultur unter Verwendung der oben beschriebenen Giemsa-Färbemethode. Zählen Sie dann die Gesamtzahl der Erythrozyten in einer verdünnten Kultur im Maßstab 1:100 mit einem Hämozytometer.
   Gesamtzahl der Erythrozyten/ml = Durchschnittliche Anzahl der gezählten Erythrozyten x Verdünnungsfaktor x 10⁴
   Anzahl der parasitierten Erythrozyten/ml = (Prozent der Parasitämie x Gesamtzahl der Erythrozyten/ml)/100
3. Bereiten Sie eine Verdünnung von parasitierten Erythrozyten im Verhältnis 1:10.000 vor, indem Sie die Anfangskultur 2x seriell verdünnen (jeweils 1:100 Verdünnung).
4. Fügen Sie ein geeignetes Volumen (in Mikrolitern) aus der verdünnten Kultur hinzu, um insgesamt 50 Parasiten in 10 ml Medium zu erhalten, wobei ein Hämatokrit von 2 % gewährleistet ist. Geben Sie dann 100 μl des Mediums mit 50 Parasiten in jede Vertiefung der 96-Well-Platte. Die Platte wird in einen luftdichten, mit Mischgas gespülten Behälter (Zusammensetzung wie oben in Schritt 9.1 beschrieben) gestellt und bei 37 °C inkubiert. Tauschen Sie das Medium alle 2 Tage aus.
5. Ersetzen Sie das Medium jeden 7^. Tag durch cRPMI mit 2 % Hämatokrit, bis die Parasiten auftreten.
   1. Kippen Sie die 96-Well-Platte in einem Winkel von 45° und lassen Sie die RBCs absetzen. Entfernen Sie mit einer serologischen Pipette vorsichtig das Medium aus jeder Vertiefung und beobachten Sie eine Farbänderung zu Gelb in Vertiefungen, die Parasiten enthalten, im Kontrast zur rosa Farbe der Medien in parasitenfreien Vertiefungen. Diese Farbveränderung tritt auf, weil die Parasiten das Medium ansäuern.
6. Nachdem Sie die Farbveränderung beobachtet haben, entnehmen Sie eine kleine Menge Kultur aus der Vertiefung, die eine Farbänderung aufweist, und bereiten Sie einen Abstrich auf einem Objektträger vor, den Sie mit einer Zahl beschriften, die der Position der Vertiefung entspricht. Färben Sie den Objektträger mit Giemsa-Beize und betrachten Sie ihn wie oben beschrieben unter dem Mikroskop.
7. Der Inhalt der Vertiefung wird in einen T25-Kolben überführt, in dem Parasiten unter dem Mikroskop beobachtet wurden. Lassen Sie die Parasiten 4-5 Tage lang im T25-Kolben wachsen und füllen Sie das Medium jeden zweiten Tag auf.
8. Sobald die Parasitämie 2-3% erreicht, extrahieren Sie 500 μl Parasitenkultur. Anschließend wird die Erythrozyten saponinlysiert und das genetische Material der Parasiten nach der in Abschnitt 11 beschriebenen Methode extrahiert.
9. Um die Erzeugung klonaler transgener Parasiten zu bestätigen, richten Sie eine PCR-Reaktion ein, wie oben in Schritt 1.1.1 beschrieben, und senden Sie das PCR-Produkt zur DNA-Sequenzierung, um die Einführung der gewünschten SNPs in den Ziellocus zu bestätigen.

13. Transkriptanalyse mittels Real-Time PCR

1. Percoll/Sorbitol-Reinigung und Synchronisation der Parasiten
   1. Bereiten Sie einen Percoll/Sorbitol-Gradienten^39,40 her, indem Sie nacheinander 3 ml à 70%ige gefolgt von 40%igen Percoll/Sorbitol-Lösungen in ein konisches 15-ml-Röhrchen schichten.
   2. Schichten Sie vorsichtig 1-2 ml Parasitenkultur, die überwiegend den Parasiten WT und CDPK1 T145M im Schizontenstadium enthält, auf den Gradienten.
   3. Zentrifugieren Sie den Gradienten bei 2.300 x g für 15 min bei RT mit der auf 4 eingestellten Debeschleunigung in der Zentrifuge in einem schwingenden Schaufelrotor.
   4. Den mittleren Ring mit den Trophozoiten- und Schizontenstadien des Parasiten von der Grenzfläche des Gradienten wird in einem frischen konischen 50-ml-Röhrchen gesammelt.
   5. Waschen Sie die Parasiten, indem Sie ein gleiches Volumen von 9:1 (cRPMI:10xPBS) hinzufügen, und zentrifugieren Sie dann 3 Minuten lang bei 994 x g , um die Parasiten zu pelletieren.
   6. Waschen Sie das Pellet erneut mit einer Lösung von 19:1 (cRPMI:10xPBS) und zentrifugieren Sie es dann bei 994 x g für 3 min.
   7. Jedes Parasitenpellet wird in separate Kolben gegeben, die cRPMI mit 2 % Hämatokrit enthalten (vorinkubiert bei 37 °C). Die Kolben werden 4 Stunden lang unter den in Schritt 9.1 beschriebenen Bedingungen inkubiert, um die Invasion von Merozoiten aus den angereicherten Schizonten in frische Erythrozyten zu ermöglichen.
   8. Behandeln Sie die Parasiten nach 4 h mit Sorbitol, wie oben in den Schritten 9.2-9.4 beschrieben, um hochsynchronisierte Parasiten im Ringstadium von 0 - 4 h zu erhalten.
   9. Inkubieren Sie die synchronisierten Parasiten für 44 Stunden nach der Sorbitbehandlung, um das 44 - 48 Stunden lange Schizontenstadium des Parasiten zu erhalten.
2. RNA-Isolierung aus Schizonten sowohl von WT- als auch von CDPK1 T145M-Parasiten
   1. Ernten Sie die WT- und CDPK1 T145M-Parasiten 44-48 Stunden nach der Invasion. Waschen Sie die Parasitenpellets mit 1x PBS bei 994 x g für 5 min bei 4 °C.
   2. Resuspendieren Sie die Parasitenpellets in 1 ml 1x PBS und behandeln Sie sie mit Saponin, um die umgebenden Erythrozyten zu lysieren, wie in Schritt 11.2.1 beschrieben.
   3. Das Parasitenpellet in 1 ml RNA-Extraktionsreagenz resuspendieren und bis zur weiteren Verarbeitung bei -80 °C lagern.
   4. Tauen Sie das gefrorene Pellet bei 15-30 °C auf, um eine vollständige Dissoziation der Nukleoproteinkomplexe zu erreichen.
   5. Fügen Sie 200 μl Chloroform pro mL RNA-Extraktionsreagenz hinzu und schütteln Sie die Röhrchen 15 s lang kräftig von Hand. Inkubieren Sie 2-3 Minuten bei RT.
   6. Zentrifugieren Sie das Gemisch bei 16.200 x g für 15 min bei 4 °C. Die RNA verbleibt ausschließlich in der farblosen oberen wässrigen Schicht. Isolieren Sie RNA mit einem Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
3. cDNA-Synthese aus der RNA des Parasiten WT und CDPK1 T145M
   1. Behandeln Sie die RNA-haltigen Proben mit einem DNA-Entfernungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers, um kontaminierende DNA zu entfernen.
   2. Synthetisieren Sie cDNA aus den isolierten RNA-Proben mit einem cDNA-Synthesekit gemäß dem Protokoll des Herstellers. Wir verwenden zufällige Hexamer-Primer für den reversen Transkriptionsprozess anstelle von Oligo-dT-Primern.
   3. Stellen Sie sicher, dass NO-RT-Kontrollen (Reaktionen, die ohne Zugabe des Reverse-Transkriptase-Enzyms durchgeführt werden) für jede RNA-Probe, die für die cDNA-Präparation verwendet wird, ausgeschlossen werden, um die Übertragung von genomischer DNA-Kontamination aus gereinigter RNA während der cDNA-Präparation auszuschließen.
   4. Testen Sie die cDNA, indem Sie ein beliebiges Gensegment amplifizieren, das eine intervenierende intronische Sequenz enthält, wie z. B. das cdpk1-Gen in voller Länge, um eine Kontamination der genomischen DNA auszuschließen. Verwenden Sie die PCR-Bedingung wie in Schritt 1.1.1 beschrieben.
4. Transkriptexpressionsanalyse von WT- und CDPK1 T145M-Parasiten
   1. Verwenden Sie die cDNA, die aus den Parasiten WT und CDPK1 T145M hergestellt wurde, um eine Transkriptexpressionsanalyse von 11 verschiedenen Genen durch Echtzeit-PCR durchzuführen. Zu den 11 Zielgenen gehören 7 Mitglieder der CDPK-Familie und 4 Kinasen, die an der Invasion von Erythrozyten beteiligt sind (siehe Tabelle 2 für Gene und entsprechende Primer, die für die real-time PCR verwendet werden).
   2. Entwerfen Sie Primer mit Primer-Synthese-Software. Amplifizieren Sie etwa 120 bp jedes ausgewählten Gens mit genspezifischen Primern mit ähnlichen Schmelztemperaturen.
   3. Amplifizieren Sie die Zielgene mit einem Pre-Mix und lassen Sie die Platte auf einem Real-Time-PCR-System unter Verwendung der folgenden Zyklusparameter laufen: anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 3 Minuten, gefolgt von 40 Zyklen der Denaturierung bei 95 °C für 10 s, Annealing bei 52 °C für 20 s und Verlängerung bei 62 °C für 30 s.
   4. Normalisieren Sie das Expressionsniveau jedes Gens mit zwei Housekeeping-Genen, Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) und Threonin tRNA-Ligase (ThrRS)³². Berechnen Sie die relative Expression jeder Zielkinase im CDPK1 T145M-Parasiten im Vergleich zur WT-Kontrolle.
   5. Führen Sie die statistische Analyse mit dem R-Paket für die statistische Analyse durch. Alternativ können Sie eine andere Analysesoftware verwenden.
      HINWEIS: Globale Transkriptomik-Methoden wie RNA-Seq oder Microarray sind im Vergleich zu WT überlegene Ansätze, um einen breiteren Überblick über die Transkriptom-Neuverdrahtung bei mutierten Parasiten zu erhalten.

Results

Rekombinantes WT CDPK1 wird als Fusionsprotein mit einem N-terminalen Glutathion-S-Transferase (GST)-Tag exprimiert und mittels GST-Affinitätschromatographie aufgereinigt. Das gereinigte CDPK1-Protein wurde durch Western Blot unter Verwendung von Anti-CDPK1- und Anti-GST-Antikörpern nachgewiesen (Abbildung 1). Der Threonin-Gatekeeper-Rest (T145) in WT CDPK1 wurde durch Met und Ser ersetzt, wobei eine ortsgerichtete Mutagenese verwendet wurde, um CDPK1T145M bzw. CDPK1T145S mutierte rekombinante Proteine zu erzeugen (Abbildung 2). In vitro wurde ein Kinase-Assay durchgeführt, um die Kinaseaktivität aller rekombinanten CDPK1-Proteine zu bewerten. Die Kinaseaktivität wurde unter Verwendung eines halbsynthetischen Epitop-Tagging-Ansatzes³⁴ getestet, indem die Thiophosphatestergruppe mit einem spezifischen Antikörper in einem Western-Blot-Format nachgewiesen wurde (Abbildung 3). Der Einfluss der Gatekeeper-Substitution auf die Autophosphorylierungsaktivität von CDPK1 und die Transphosphorylierung von MBP, das als exogenes Substrat von CDPK1 verwendet wird, wurde durch Quantifizierung der Intensität der jeweiligen Autophosphorylierungs- und Transphosphorylierungsbanden bewertet. Die Mutante CDPK1 mit Methionin-Gatekeeper behielt ~ 53% Transphosphorylierungsaktivität bei, während das Vorhandensein eines Serins an der Gatekeeper-Position zu einer vollständigen Aufhebung der Substrattransphosphorylierung führte (Abbildung 3). SNPs, die zu einer Gatekeeper-Substitution von Thr zu Met (T145M) führen, wurden im endogenen cdpk1-Locus durch CRISPR-Cas9 unter Verwendung eines Zwei-Plasmid-Systems modifiziert (Abbildung 4 und Abbildung 5). Mutierte Parasiten mit T145S-Substitution konnten nicht erzeugt werden, möglicherweise aufgrund der tödlichen Wirkung des Ser-Gatekeepers auf die CDPK1-Aktivität. Die CDPK1T145M mutierten Parasiten wurden unter Verwendung der limitierenden Verdünnungsmethode subkloniert, und die Gatekeeper-Substitution wurde durch Sanger-Sequenzierung bestätigt, um die Erzeugung des CDPK1T145M mutierten Parasiten zu verifizieren. Die Transkriptspiegel von 11 verschiedenen Kinasen, darunter 7 Mitglieder der CDPK-Familie und 4 weitere Kinasen, die an der späten schizogonischen Entwicklung des Parasiten beteiligt sind, wurden mittels real-time PCR getestet (Abbildung 6). Die Expressionsniveaus von 11 verschiedenen Kinasen wurden zwischen den CDPK1T145M mutierten und Wildtyp-Parasiten (WT) verglichen, normiert auf die Housekeeping-Gene. Die Transkriptexpression von Mitgliedern der CDPK-Familie war in der CDPK1T145M Mutante im Vergleich zum WT-Parasiten verändert (Abbildung 6). Transkripte, die eine höhere Expression in der CDPK1T145M Mutante zeigen, könnten die Funktion von CDPK1 im CDPK1T145M mutierten Parasiten kompensieren.

Abbildung 1: Charakterisierung des rekombinanten Wildtyps (WT) PfCDPK1 in voller Länge. Das WT CDPK1-Protein in voller Länge, das mit dem N-terminalen Glutathion-S-Transferase (GST)-Tag fusioniert ist, wurde mittels Affinitätschromatographie aufgereinigt und auf 10% SDS-PAGE abgetrennt. CDPK1 migrierte auf die vorhergesagte Molekülmasse von ~ 87 kDa, wie im Coomassie Brilliant Blue R-250 gefärbten Polyacrylamidgel gezeigt. Rekombinantes Protein, das auf der SDS-PAGE abgetrennt wurde, wurde auf eine PVDF-Membran übertragen und für die Western-Blot-Analyse mit Anti-CDPK1- und Anti-GST-Antikörpern verarbeitet. Mit beiden Antikörpern wurde eine Bande nachgewiesen, die der rekombinanten CDPK1 in voller Länge auf SDS-PAGE entspricht, was die Identität des Proteins bestätigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Charakterisierung von aufgereinigten rekombinanten CDPK1-Gatekeeper-mutierten Proteinen. (A) Ausrichtung der primären Aminosäuresequenz von TgCDPK1 und PfCDPK1 (Plasmodb-Zugangs-Nr. PF3D7_0217500). Threonin an Position 145 von PfCDPK1 entspricht Glycin 128, der Gatekeeper-Position in TgCDPK1 (rot hervorgehoben). (B) Karikaturistische Darstellung des Thr-Gatekeeper-Rests (rot hervorgehoben), kodiert durch das Triplett-Codon ACC (schwarzer Kreis) in WT CDPK1. Substitution des Gatekeeper-Rests durch ortsgerichtete Mutagenese zur Erzeugung rekombinanter mutierter CDPK1-Proteine mit Met (gelb hervorgehoben) in CDPKT145M und Ser (blau hervorgehoben) in CDPKT145S. (C) SDS-PAGE-Profil von rekombinanten WT- und mutierten Proteinen von CDPK1. Die rekombinanten WT- und Gatekeeper-mutierten Proteine wurden mittels GST-Affinitätschromatographie aufgereinigt und auf SDS-PAGE getrennt. Alle rekombinanten Proteine entsprechen dem erwarteten Molekulargewicht von ~87 kDa. M- Molekulargewichtsleiter. (D) Charakterisierung von rekombinantem CDPK1 WT und mutierten Proteinen durch Western Blotting. Die rekombinanten WT- und Gatekeeper-mutierten Proteine von CDPK1 wurden auf SDS-PAGE getrennt und für das Western Blot auf die PVDF-Membran übertragen. Banden, die den rekombinanten WT- und mutierten CDPK1-Proteinen in voller Länge auf SDS-PAGE entsprechen, wurden mit anti-CDPK1- und anti-GST-Antikörpern nachgewiesen, was die Identität aller rekombinanten Proteine bestätigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Die Gatekeeper-Substitution in CDPK1 führt zu einer Abnahme der Kinaseaktivität mutierter Enzyme. (A) Karikaturistische Darstellung des halbsynthetischen Epitop-Tagging-Ansatzes zum Nachweis der Kinaseaktivität des CDPK1-Proteins. Hier wird nur die Transphosphorylierungsaktivität dargestellt. Das CDPK1-Protein thiophosphoryliert ein exogenes Substrat (S, festes grünes Quadrat) in Gegenwart von ATPγS (festes gelbes Dreieck), einer Quelle der übertragbaren terminalen Thiophosphatgruppe). Der thiophosphorylierte Rückstand wird durch Behandlung mit p-Nitrobenzylmesylat (PNBM) alkyliert, wobei ein Thiophosphatester gebildet wird, der dann mit einem Antikörper nachgewiesen wird, der spezifisch alkyliertes Thiophosphataddukt erkennt. (B) Ein In-vitro-Kinase-Aktivitätsassay unter Verwendung eines halbsynthetischen Epitop-Tagging-Ansatzes wurde verwendet, um die Wirkung der Gatekeeper-Substitution auf das Autophosphorylierungs- und Transphosphorylierungspotenzial von rekombinanten CDPK1-mutierten Proteinen zu testen. Alle rekombinanten Proteine weisen eine calciumabhängige Kinaseaktivität auf. Die Autophosphorylierung von CDPK1 und die Transphosphorylierung des Myelin-Basisproteins (MBP), eines exogenen Substrats, war nur in Gegenwart von Calciumchlorid (Ca2⁺) nachweisbar, während in Gegenwart von EGTA, einem spezifischen Chelator von Ca2⁺ -Ionen, keine Phosphorylierung nachgewiesen wurde. Die Gatekeeper-Mutanten zeigen eine verminderte Autophosphorylierungsaktivität, während die Transphosphorylierung von MBP in CDPK1T145S vollständig aufgehoben wurde. CDPK1T145M behält das Transphosphorylierungspotenzial (~ 53 %) bei, wie bereits berichtet³². Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Konstruktion von Plasmiden zur Einführung von SNPs an der Gatekeeper-Position im cdpk1-Locus mit Hilfe von CRISPR-Cas9. Eine Leitsequenz von 20 Nukleotiden, die 432 bis 451 bp entsprechen, wurde in der BtgZI-Restriktionsstelle im pL6eGFP-Plasmid kloniert, um pL6CK1G zu erzeugen. Ein Homologiearm (421 bp), der die gewünschten SNPs (T145M oder T145S, entsprechendes Codon in grün dargestellt) zusammen mit Schildmutationen (rot dargestellt) enthielt, wurde in pL6CK1G innerhalb der AflII- und SpeI-Restriktionsenzymstellen kloniert, um pL6CK1G^T145M bzw. pL6CK1G^T145M zu erzeugen. Schildmutationen verhindern das erneute Schneiden des modifizierten Locus nach der gewünschten Bearbeitung. Die Cas9-Endonuklease, die in einem zweiten Plasmid, pUF1, kodiert ist, wird mit Hilfe von Guide-RNA, die vom pL6CK1G^{T145M/S-Plasmid} exprimiert wird, an die Zielstelle innerhalb des cdpk1-Locus gerichtet. Cas9 führt zu einem Doppelstrangbruch an der Zielstelle in Richtung der 5'-Seite der PAM-Sequenz. Das DSB wird mit Hilfe eines Homologiearms im pL6CK1G^T145M/S Plasmid repariert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Schematische Darstellung von P. falciparum-Transfektion mit CRISPR-Plasmiden zur Einführung der Gatekeeper-Mutation (T145M) im cdpk1-Locus . i) Asynchrones P. Die Falciparum-Kultur wird mit Sorbit behandelt, um synchronisierte Parasiten im Ringstadium zu erhalten. ii) Synchronisierte Ringstadien-Parasiten werden in einer Elektroporationsküvette zusammen mit pL6CK1G^T145M/S und pUF1-Plasmiden, die in Pufferlösung resuspendiert werden, entnommen. iii) Die Parasiten werden mit 310 Volt, 950 μF und unendlichem Widerstand elektroporiert. iv) Nach der Transfektion werden die Parasiten in einen T25-Kolben mit frischem vollständigem RPMI-Medium (cRPMI) überführt und 48 Stunden lang kultiviert. Nach 48 h werden die transfizierten Parasiten auf cRPMI umgestellt, ergänzt mit den Medikamenten WR99210 und DSM267, und im T75-Kolben expandiert. v) Am 14. Tag werden die Objektträger vorbereitet und mit Giemsa-Beize gefärbt. vi) Anschließend wird der Blutausstrich unter einem Lichtmikroskop sichtbar gemacht, um das Vorhandensein von parasitierten Erythrozyten zu beurteilen. vii) Bei der Visualisierung werden die Parasiten in Gegenwart von Medikamenten wachsen gelassen. Anschließend werden die Parasiten verarbeitet, um das Template für die PCR und DNA-Sequenzierung zur Verifizierung der gewünschten Modifikation des cdpk1-Ziellocus zu erhalten. viii) Nach der Verifizierung werden klonale transgene Parasiten erhalten, indem die begrenzende Verdünnung in einer 96-Well-Platte eingerichtet wird. ix) Klonale transgene Parasiten aus positiven Vertiefungen werden in T25-Kolben überführt und wachsen gelassen. x) Klonale transgene Parasiten werden durch PCR und das Vorhandensein der gewünschten SNPs an der Gatekeeper-Position durch DNA-Sequenzierung und Analyse des Chromatogramms weiter validiert. Die Zahl ist von³² modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Schematische Darstellung der Schritte, die für die Transkriptanalyse von Zielgenen mittels Echtzeit-PCR (RT-PCR) verwendet werden. Die Falciparum-Kultur mit überwiegend reifen Parasiten im Schizontenstadium wird durch Sorbitbehandlung im selben Zyklus gewonnen. ii) Die Parasiten werden schonend auf einem Gradienten von 70/40 Percoll/Sorbit in einem konischen 15-ml-Röhrchen geschichtet, um die Parasiten im reifen Schizontenstadium anzureichern. iii) Der schwarz gefärbte Ring an der Interphase von 40 % und 70 % persönlichem/Sorbit wird auf ein frisches 50-ml-Röhrchen übertragen, verarbeitet und in cRPMI resuspendiert. Die mit Schizonten angereicherten Parasiten werden mit frischen Erythrozyten inkubiert, die bei 37 °C für die Invasion vorinkubiert werden. iv) Die Parasiten werden 4 h lang kultiviert und dann mit 5 % Sorbit behandelt, um hochsynchronisierte Parasiten im Ringstadium von 0-4 h zu erhalten. v) Die Parasiten werden für weitere 44 Stunden nach der Sorbitbehandlung weiter kultiviert, um hochsynchronisierte Parasiten im Schizontenstadium von 44 bis 48 Stunden zu erhalten. vi) Die synchronisierten Parasiten werden mit Saponin behandelt, um sie aus den Erythrozyten freizusetzen, und in RNA-Extraktionsreagenz gelagert. Die Gesamt-RNA wird aus der RNA-Extraktion von resuspendierten Parasiten isoliert. vii) cDNA wird aus der isolierten RNA hergestellt. viii) Es wird ein real-time PCR-Experiment mit dem cDNA-Template aufgebaut, um die Zielgene mit genspezifischen Primern zu amplifizieren. Die Platte wird auf einem real-time PCR-System ausgeführt. ix) Die Transkriptexpressionsdaten werden mit einer Analysesoftware analysiert. Das Diagramm zeigt die differentiellen Transkriptexpressionsniveaus von 11 Kinasen in CDPK1 T145M-Parasiten im Vergleich zum Wildtyp (WT). Diese Zahl ist modifiziert von³². Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Name des Gens	Sequenz der Grundierung
Pk1fpgex	ATGCGCGGATCCATGGGGTGTTCACAAAGTTCAAACG
Pk1rpgex	ATGCGCGCGCGGCCGCTTATGAAGATTTATCAAATTTTGTGCATC
CK1T145S	GTTTGATGTTTTTGAAGATAAGAAATATTTTTATTTAGTAAGCGAATTTTATGAAGGTGGGGAA
Ck1T145S_antisense	TTCCCCACCTTCATAAAATTCGCTTACTAAATAAAAATATTTCTTATCTTCAAAAACATCAAAC
CK1T145M	GTTTGATGTTTTTGAAGATAAGAAATATTTTTATTTAGTAATGGAATTTTATGAAGGTGGGGAA
Ck1T145M_antisense	TTCCCCACCTTCATAAAATTCCATTACTAAATAAAAATATTTCTTATCTTCAAAAACATCAAAC
ck1GUIDEFWD	TAAGTATATAATATTAACCGAATTTTATGAAGGTGGTTTTAGAGCTAGAA
Ck1GUIDEREV	TTCTAGCTCTAAAACCTTCATAAAATTCGGTTAATATTATATACTTA
ck1f1	ATTTTCTTTTCTGAACGTGTAACATG
ck1r3wt	TGCATCTCTTAATCTCTCCTCACTG

Tabelle 1: Liste der in der Studie verwendeten Primer.

Name des Gens	Vorwärts-Grundierung		Umgekehrte Grundierung
CDPK1 (PF3D7_0217500)	GGAAGAATTAGCAAATTTATTTGGTTTGACATC		ATGTTAACGAATTCATCAAAGTCAATCATGT
CDPK2 (PF3D7_0610600)	GGAACAGGAGAATTTACAACGAC		TGTATACATAATAACACCACTAGACCAG
CDPK3 (PF3D7_0310100)	CACGAAATATTGAGCATGGTAAAGAAGG		CAGCGTCCATTGTAAG ACATCTTTTTATTAAATC
CDPK4 (PF3D7_0717500)	ATACTTCTCTCAGGGTGCCC		CTTATCACTAATTTTTTTTT GAATTGTGGTAAATCG
CDPK5 (PF3D7_1337800)	GGAGGTCGAAGATATGGATACGAATAG		TATCGGCTAACGTACTCTTTGTCG
CDPK6 (PF3D7_1122800)	CCTCCCGTAGATAATAATATATCTATCG		ATCTGCTTCAATAAATCCCAATACATTTGC
CDPK7 (PF3D7_1123100)	AGTCCTAAAAAAGATATA TAAAGAACTAGGTAGTAG		TTTAAAAATAATCTTTCTCCCCACAACCC
PKA (PF3D7_0934800)	AATCATCCATTTTGTGTAAATTTACATGG		CTTTTGTTTTTCTTCTTAAA AATGTAAAAAATTCTCC
PKG (PF3D7_1436600)	AAAGGGAATGAAAGAAATAAAAAGAAGGC		CATATCAATATCTTCTGAAAGCTTTTCCC
PKB (PF3D7_1246900)	CACAATAGAAGAAATGATGTTCTTTTTTACG		GAGAGCGCAATTAGCCATATTG
PI3K (PF3D7_0515300)	CCCCTTCAATTTGTTTGTGAAACAG		ATCACATTTGTTATACTT ATTATCATCACATTTGTT
GAPDH (PF3D7_1462800)	GGAAGGAAAGATATCGAAGTAG		GGGTTACCTCACATGG
ThrRS (PF3D7_1126000)	CTTGGGAACTGCAGAGTAGAATTT		TAAAAATCCTCCGAACAATTTTTCTAAACTAC

Tabelle 2: Liste der Zielgene (PlasmoDB-Identifikationsnummer) zusammen mit der Sequenz der Primer, die für die Echtzeit-PCR-Analyse verwendet wurden.

Discussion

Die Generierung eines mutierten transgenen Parasiten, der ein hypomorphes Allel von cdpk1 enthält, basiert auf den in vitro Kinase-Aktivitätsdaten mit rekombinanten Enzymen. Es ist besser, so viele mutierte rekombinante Proteine mit unterschiedlichen Gatekeeper-Resten wie möglich zu erzeugen. Da das Genom von P. falciparum sehr AT-reich ist, ist die Expression rekombinanter Proteine in E möglich. Coli kann eine Codon-Optimierung erfordern. Dies wird zu einer umfassenden Bewertung der Gatekeeper-Substitution auf die Kinaseaktivität des mutierten Enzyms beitragen. Die Gatekeeper-Substitution, die zu einer Verringerung des Transphosphorylierungspotentials führt, wird zur Erzeugung eines allelischen Austausch-transgenen Parasiten ausgewählt. Parallel dazu sollte eine Gatekeeper-Substitution, die die Transphosphorylierungsaktivität der Kinase vollständig aufhebt, als Negativkontrolle genommen werden. Eine weitere wichtige Überlegung bei der Erzeugung des Allelaustauschparasiten ist die Einführung einer synonymen Mutation zusammen mit der Testmutation und der Negativkontrolle. Die Generierung des Parasiten, der eine synonyme Mutation im cdpk1-Locus enthält, dient als wichtige interne Kontrolle, um technische Fehler bei der Einführung der Testmutation auszuschließen. Darüber hinaus kann der transgene Parasit mit der synonymen Mutation anstelle des WT-Parasiten als Kontrolle für alle Vergleichsstudien verwendet werden.

Wir haben ein Zwei-Plasmid-System zur Erzeugung des Gatekeeper-Mutanten-Parasiten^32,35 eingesetzt. Die Effizienz der Einführung des SNP in den Ziellocus kann jedoch durch die Verwendung eines Einzelplasmidsystems anstelle eines Zweiplasmidsystems⁴¹ erhöht werden. Im Einzelplasmidsystem werden alle kritischen Elemente, die für die CRISPR-Cas9-vermittelte Geneditierung erforderlich sind, in einem einzigen Plasmid statt in zwei eingebaut. Das einzelne Plasmid kodiert für die Cas9-Endonuklease, transkribiert sgRNA, die aus tracrRNA und der Guide-RNA besteht, und enthält einen Homologiearm für die Reparatur des Doppelstrangbruchs, der durch die Cas9-Endonuklease an der Zielstelle eingeführt wurde. In einem Zwei-Plasmid-System werden die Parasiten mit beiden Plasmiden co-transfiziert. Da die Anzahl der Parasiten, die beide Plasmide gleichzeitig in einem Zwei-Plasmid-System erhalten, im Vergleich zu einem Einzelplasmid-System gering ist, ist die Effizienz der CRISPR-vermittelten Gen-Editierung in einem Zwei-Plasmid-System geringer als in einem Einzelplasmid-System. Alternativ kann auch eine Suizid-Rettungsstrategie⁴² angewendet werden, wobei der Homologiearm als lineares Fragment oder in einem Plasmid ohne einen Wirkstoffauswahlmarker (Rettungsplasmid) bereitgestellt ist. Die Cas9-Endonuklease und die sgRNA-kodierende Leit-RNA werden in einem Plasmid bereitgestellt, das eine Wirkstoffauswahlkassette (Suizidplasmid) enthält. Da ein lineares Fragment oder ein Plasmid ohne Wirkstoffauswahlkassette mit größerer Wahrscheinlichkeit während der Parasitenreplikation verloren geht, muss der durch die Cas9-Endonuklease im Ziellocus eingeführte Doppelstrangbruch mit Hilfe des Homologiearms, der für eine begrenzte Dauer verfügbar sein kann, leicht repariert werden. Diese Strategie hat einige Vorteile gegenüber einem Zwei-Plasmid-System, da sie effizienter ist und es nicht notwendig ist, den Homologiearm in einem anderen Plasmid zu subklonieren. Andere Varianten der CRISPR-Cas9-Geneditierung können ebenfalls für die Einführung von SNP im Ziellocus⁴³ in Betracht gezogen werden.

Wir haben die Leitregion für die Einführung der T145M-Substitution im cdpk1-Locus manuell ausgewählt. Eine geeignete Leitsequenz für das Einbringen des Doppelstrangbruchs im Zielort kann mit verschiedenen frei verfügbaren Online-Softwares wie Chopchop⁴⁴, CRISPOR⁴⁵, CCTop⁴⁶, Cas-OFFinder⁴⁷ ausgewählt werden. Diese Software liefert nicht nur die Effizienz jeder Guide-Sequenz, sondern auch die Off-Target- und Spezifitäts-Scores, die die Erfolgsrate eines CRISPR-Cas9-vermittelten Gen-Editing-Experiments erhöhen.

Für die Transfektion von Malaria-Parasiten stehen verschiedene Methoden zur Verfügung. Wir verwenden Parasiten im Ringstadium für Transfektionsexperimente^48,49, aber auch für Parasitentransfektionsstudien wurde die Vorbeladung von Erythrozyten mit Plasmiden erfolgreich eingesetzt⁵⁰. Bei dieser Methode werden Erythrozyten unter einem bestimmten Parametersatz durch Elektroporation mit Plasmiden transfiziert und anschließend für die Infektion mit gereinigten Parasiten im Spätstadium verwendet. Die Parasiten dringen in Erythrozyten ein, die mit Plasmiden vorgeladen sind. Während ihres Wachstums innerhalb der mit Plasmiden vorgeladenen Erythrozyten nimmt der Parasit Plasmid-DNA durch einen unbekannten Mechanismus^{auf 50}. Es gibt eine andere Methode, die für die Transfektion von Parasiten eingesetzt werden kann, die sehr reife, gereinigte Parasiten im Schizontenstadium für die direkte Transfektion mit den Plasmiden erfordert. Das für die Transfektion der gereinigten Schizonten verwendete Instrument ist der 4D-Nukleofektor⁵¹. Die Wahl einer Transfektionsmethode variiert je nach den verfügbaren Ressourcen und der Erfolgsquote. Es ist eine gute Idee, zu prüfen, welche der drei Methoden für eine Gruppe geeignet ist, und diese für nachfolgende Transfektionsexperimente zu verwenden. Zwei Methoden können nacheinander angewendet werden, um die Transfektionseffizienz weiter zu erhöhen. Zum Beispiel kann der erste Transfektionsschritt Ringstadien mit Parasiten verwenden, gefolgt von der Zugabe von frischen Erythrozyten, die mit den Plasmiden vorgeladen sind.

Wir wählten nur wenige Gene für die Transkriptanalyse bei den CDPK1T145M Parasiten aus, verglichen mit der Kontrolle, die auf der bisherigen Literatur oder dem Vorhandensein von Mitgliedern der CDPK-Familie basierte. Um jedoch einen umfassenden Überblick über die globale transkriptionelle Neuverdrahtung in einem transgenen Parasiten zu erhalten, der ein hypomorphes Allel von CDPK1 enthält, können Ansätze wie RNA-Seq oder Microarray eingesetzt werden.

Die in dieser Studie verwendete Methode kann auf andere Kinasen des Malariaparasiten angewendet werden, um die Entwicklung von Kompensationsmechanismen unter Medikamentendruck zu verstehen. Die durch diese Technik gewonnenen Informationen können beim strategischen Einsatz von Kombinationspräparaten nützlich sein, um die Entwicklung und Ausbreitung von Arzneimittelresistenzen zu verhindern. Die Ausrichtung auf zwei oder mehrere Kinasen, die eine funktionelle Komplementierung zeigen, ist eine bessere Strategie als die Ausrichtung auf einzelne Kinasen zur Kontrolle und Eliminierung von Malaria.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Phosphatinhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	04906 845001
AflII	NEB	R0520S
Albumax II	Gibco	11021-037
Anti-GST-Antikörper	ThermoFisher Scientific	G7781
Anti-Maus HRP	Sigma-Aldrich	A4416
Anti-Kaninchen HRP	Sigma-Aldrich	A6154
BamHI	NEB	R3136S
BtgZ1	NEB	R0703S
Zentrifuge	ThermoFisher Scientific	Sorvall Legend Micro 17R
Zentrifuge ( Zum Pelletieren von Bakterienzellen)	ThermoFisher Scientific	Sorvall ST 8R
Zentrifuge ( Zum Pelletieren/Verarbeiten von Parasiten)	ThermoFisher Scientific	Sorvall ST 8R (TX-400 Rotor)
DpnI	NEB	RO1765
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
E. coli BLR(DE3) pLysS kompetente Zellen	Sigma-Aldrich	69956
E. coli DH5a Kompetente Zellen	Takara Bio	9057
Elektroporationsküvetten, 0,2 cm Abstand	BioRad	1652086
Elektroporator	BioRad	GenePulser Xcell
femtoLUCENTTM PLUS HRP Chemilumineszenz-Reagenz	G-Bioscience	7860-003
Gentamicin	ThermoFisher Scientific	15750078
Giemsa Stain	Himedia	S011-100ML
Glutathion Sepharose 4B	GE Healthcare	17075601
HEPES, freie Säure	Merck	391338
Hypoxanthin	Merck	4010CBC
In-Fusion-HD-Klonierungskit	Takara Bio	1711641A
iQ SYBR Green Supermix	BioRad	1708880EDU
MBP, dephosphoryliert	Merck	13-110
NotI	NEB	R3189S
Nukleobond Xtra Maxi EF	Takara Bio	740424
NucleoSpin Gel und PCR-Aufreinigung Mini-Kit	Takara Bio	740609
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
p-Nitrobenzylmesylat (PNBM)	Abcam	Ab138910
Primestar Max DNA-Polymerase	Takara Bio	R045A
Proteasehemmer Cocktail	Roche
Qiaprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
QuikChange II XL ortsgerichtetes Mutagenese-Kit	Agilent	200521
RNeasy Mini-Kit	Qiagen	74104
RPMI-1640	ThermoFisher Scientific	31800-105
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
Natriumbicarbonat	Sigma-Aldrich	S5761
SpeI-HF	NEB	R3133S
SuperScript III Erststrang-Synthesekit	ThermoFisher Scientific	18080-051
T4 DNA-Ligase	ThermoFisher Scientific	15224017
Thiophosphatester-Antikörper	Abcam	Ab92570