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Methodenartikel

Modellierung des posthämorrhagischen Hydrozephalus der Frühgeburt bei Ratten

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DOI:

10.3791/67082

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28. März 2025

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1Division of Pediatric Neurosurgery, Department of Neurosurgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Neurology, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Division of Neonatal-Perinatal Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Neurosciences Intensive Care Nursery, Johns Hopkins Children's Center, 5Kennedy Krieger Institute

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Der posthämorrhagische Hydrozephalus der Frühgeburt (PHHP) kann bei neugeborenen Ratten durch Kombination von Chorioamnionitis und intraventrikulärer Blutung modelliert werden. Die Kombination dieser pränatalen und postnatalen Ereignisse rekapituliert genau die klinischen Merkmale von PHHP, einschließlich Makrozephalie, Ventrikulomegalie und erhöhtem Hirndruck, über die gesamte Lebensspanne.

Zusammenfassung

Der posthämorrhagische Hydrozephalus der Frühgeburt (PHHP) ist eine schwerwiegende Folge einer schweren intraventrikulären Blutung (IVH) bei sehr frühgeborenen Säuglingen unter 32 Wochen Gestationsalter (GA). PHHP ist definiert als die Ansammlung von Liquor cerebrospinalis (CSF), die mit klinischen Symptomen eines erhöhten intrakraniellen Drucks (ICP) einhergeht. Säuglinge mit PHHP leiden lebenslang an einer Shunt-Abhängigkeit, wobei die Hälfte im ersten Lebensjahr wiederholt operiert werden muss und viele im Laufe des Lebens mehrere zusätzliche Operationen benötigen. Die pränatale Chorioamnionitis prädisponiert Frühgeborene für eine schwere IVH und die Notwendigkeit einer chirurgischen Behandlung von PHHP-Trends mit neonataler Sepsis. Diese klinischen Merkmale deuten darauf hin, dass die systemische Entzündung ein integraler Bestandteil der PHHP-Pathophysiologie ist.

Hier definieren wir ein Tiermodell, das alle klinischen Aspekte und wesentlichen Merkmale von PHHP bei Ratten rekapituliert. Das Ziel dieses Protokolls ist es, zu veranschaulichen, wie in utero Chorioamnionitis und postnatale IVH mit lysierten roten Blutkörperchen kombiniert werden können, um PHHP zu erhalten. Dieser präklinische Ansatz führt zu einer fortschreitenden Makrozephalie und gewölbten Schädeln, einem erhöhten Hirndruck und einer Ventrikulomegalie, die mittels Magnetresonanztomographie (MRT) oder Mikroskopie nachgewiesen werden können. Zusätzlich zu einer anhaltenden Störung der Liquordynamik haben Ratten auch kognitive Verzögerungen und funktionelle Behinderungen bis ins Erwachsenenalter. Dementsprechend ermöglicht diese präklinische Plattform einzigartige und beispiellose translationale Studien von PHHP, die molekulare, zelluläre, biochemische, histologische, bildgebende und funktionelle Ergebnismessungen einbeziehen können. Es kann auch für eine rigorose parallele Analyse des Plexus choroideus, der ependymalen beweglichen Zilien und des glymphatischen Systems verwendet werden. Schließlich kann es auch ein unschätzbares präklinisches Werkzeug für die Untersuchung neuartiger chirurgischer Interventionsstrategien und nicht-chirurgischer Therapieansätze zur Behandlung des Hydrozephalus sein.

Einleitung

Der posthämorrhagische Hydrozephalus der Frühgeburt (PHHP) ist nach wie vor ein erhebliches Problem für die öffentliche Gesundheit. Definiert durch eine symptomatische Akkumulation von Liquor cerebrospinalis (CSF), die mit einem erhöhten intrakraniellen Druck (ICP) als Folge einer intraventrikulären Blutung (IVH) einhergeht, ist die PHHP eine schwere Manifestation der Frühgeborenenzephalopathie und trägt wesentlich zur globalen Belastung durch Frühgeburt und erworbenen Hydrozephalusbei 1,2. Weltweit werden jedes Jahr etwa 400.000 Säuglinge mit Hydrozephalus geboren oder erkranken an einem lebenslangen Hydrozephalus3, und viele sterben aufgrund mangelnder Behandlung3. PHHP tritt in Industrieländern häufig bei sehr frühgeborenen Säuglingen (<32. Schwangerschaftswoche) mit schwerer IVH auf und betrifft häufig die kränksten Säuglinge, die bereits an anderen lebensbedrohlichen Komorbiditäten leiden 4,5.

Die einzige verfügbare Behandlung für Hydrozephalus ist die Operation6. Chirurgische Eingriffe führen zu einer besseren Langlebigkeit, wenn Säuglinge zum Zeitpunkt des ersten dauerhaften Eingriffs älter als 6 Monate sind, sei es für einen ventrikuloperitonealen (VP) Shunt zur Umleitung von Liquor cerebrospinalis (CSF), eine endoskopische dritte Ventrikulostomie (ETV) oder eine ETV mit Koagulation des Plexus choroideus (ETV-CPC)7. Die häufigste Option, VP-Shunts, versagt oft innerhalb eines Jahres und prädisponiert Kinder für ein Leben voller Komplikationen, wiederholter Operationen und Krankenhausaufenthalte mit enormen Kosten für das Kind, die Familie und die Gesellschaft. 8 Insbesondere die Angst, dass ein Shunt jederzeit versagen könnte, ist für die Familien belastend9. Die Versorgung von Kindern mit symptomatischem Hydrozephalus, einschließlich häufiger Operationen, ist eine der Hauptursachen für die Ausgaben für die pädiatrische Gesundheitsversorgung 10,11,12,13,14. Die geschätzten jährlichen Kosten für Shunt-bezogene Ausgaben bei Kindern beliefen sich 2003 auf 2 Milliarden US-Dollar15. Während Kinder mit Shunts nur 0,6 % der Krankenhauseinweisungen ausmachen, verursachen sie 3,1 % der pädiatrischen Krankenhauskosten15. Daher ist die Entdeckung sicherer, nicht-chirurgischer Therapien für die Behandlung von PHHP von größter Bedeutung.

Bei Säuglingen entwickelt sich PHHP nach IVH über einen klinischen Verlauf, der Wochen bis Monate nach der ersten Identifizierung der Hirnblutung andauert. Eine vom Hydrocephalus Clinical Research Network (HCRN) durchgeführte Studie bestätigte, dass VP-Shunts nach wie vor die beste chirurgische Option für Neugeborene mit PHHP16 sind. Selbst für Kinder mit PHHP in Ländern mit hohem Einkommen und Zugang zu qualifizierter pädiatrischer neurochirurgischer Versorgung sind die Ergebnisse alles andere als optimal: >50 % der Shunts, die bei Säuglingen mit PHHP platziert werden, müssen innerhalb der ersten 2 Jahre operativ überarbeitet werden8. Trotz der eindeutigen Notwendigkeit, sicherere und wirksamere Behandlungen für PHHP zu finden, stieß die Forschung auf Hindernisse. Der Fortschritt wurde zum Teil dadurch behindert, dass die präklinische Literatur zu PHHP die durch einen Hydrozephalus ex vacuo verursachte Ventrikulomegalie oft nicht angemessen unterscheidet 17,18 von einem symptomatischen Hydrozephalus mit Makrozephalie19,20. In der Tat sollten Entwicklungsmodelle des Hydrozephalus eine progressive Makrozephalie und/oder Messungen eines erhöhten ICP1 umfassen.

Die Zusammenführung klinischer und präklinischer Erkenntnisse hat das Studiendesign verbessert und unser Verständnis von PHHP2 vorangetrieben. Studien, die in verschiedenen Zentren auf der ganzen Welt durchgeführt wurden, haben gezeigt, dass IVH am häufigsten bei sehr frühgeborenen Neugeborenen als Folge einer Chorioamnionitisauftritt 21,22,23,24,25,26,27,28. Neben einer Plazentainfektion und -entzündung ist die neonatale Sepsis ein weiterer wichtiger Risikofaktor und kann eine zentrale Rolle bei der Progression von der IVH über die Ventrikulomegalie zur symptomatischen PHHP und den anschließenden chirurgischen Eingriff spielen29. Präklinische und klinische Daten belegen, dass eine durch Blut übertragene Entzündung einen Hydrozephalusverursachen kann 20, und eine systemische Entzündung erhöht die Sekretion von Liquor durch den Plexus choroideus30. Darüber hinaus benötigen Erwachsene mit Subarachnoidalblutungen und IVH, die auch an einer Sepsis leiden, viel häufiger einen Shunt31. Neuere Literatur hat bestätigt, dass eine Entzündung den Antrieb der beweglichen Zilien der Ependymale reduziert 19,20,32 und die Liquorresorption durch das glymphatische System 33,34,35,36. Insgesamt ist die systemische Entzündung ein wichtiger pathophysiologischer und klinischer Treiber bei PHHP1.

Unter Berücksichtigung dieser Erkenntnisse haben wir ein altersgerechtes präklinisches Modell der PHHP erstellt. Dieses Modell kombiniert die IVH in der unmittelbaren und frühen postnatalen Phase mit der Chorioamnionitis, der Hauptursache für Frühgeburten19. Dieser experimentelle Ansatz beginnt in utero mit der Plazentainsuffizienz, der Plazentaentzündung und der intraamniotischen Entzündung, die die Chorioamnionitis definiert 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,
23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,
43,44,45. Konkret rekapitulieren wir ein fetales Entzündungsreaktionssyndrom, eine Plazenta-Neutrophilie und eine proinflammatorische ZNS-Mikroumgebung in der Frühphase mittels abdominaler Laparotomie bei trächtigen Rattendamen am embryonalen Tag 18 (E18)37,38,39,40,41,42,43,44,45. Die intrauterine Schädigung wird durch einen vorübergehenden bilateralen Verschluss der Arteria uterine induziert, der zu einer vorübergehenden systemischen Hypoxie-Ischämie (TSHI) führt, gefolgt von einer intraamniotischen Injektion von Lipopolysaccharid (LPS)37,38,39,40,41,42,43,44,45. Um die Liquordynamik zu stören und die Entwicklung eines Hydrozephalus bei den lebend geborenen Welpen zu katalysieren, wird die IVH am postnatalen Tag 1 induziert. Dies wird durch eine bilaterale intrazerebroventrikuläre Injektion (ICV) von Wurfgeschwister-lysierten roten Blutkörperchen (RBCs) in die lateralen Ventrikel erreicht 19,37,44. Die Jungtiere werden dann untersucht, während sich der Hydrozephalus entwickelt und während ihrer gesamten Lebensspanne.

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Protokoll

Das Animal Care and Use Committee (ACUC) der Johns Hopkins University hat alle hier beschriebenen Versuchsverfahren genehmigt. Dieses Protokoll verwendet trächtige Sprague-Dawley-Rattenmütter und Jungtiere beiderlei Geschlechts.

1. Induktion einer Chorioamnionitis auf E18

HINWEIS: Der Teil dieses Protokolls über die Beleidigung in utero wurde zuvor ausführlich veröffentlicht, ist oben zusammengefasst und ist Gegenstand eines separaten JOVE-Protokolls und Videos 19,37,38,39,40,41,42,43,44,46. Kurz gesagt, schwangere weibliche Sprague-Dawley-Ratten werden am embryonalen Tag 18 (E18) einer abdominalen Laparotomie unterzogen, um eine Chorioamnionitis auszulösen, die die Verabreichung von TSHI und intraamniotischem LPS umfasst.

  1. Anästhesie
    1. Induzieren Sie die Anästhesie bei der E18-trächtigen Rattenmutter mit 2-4% Isofluran.
    2. Nehmen Sie die trächtige Mutterdame aus der Induktionskammer und legen Sie die Ratte in Rückenlage auf eine drapierte chirurgische Zirkulationswasserdecke, die auf 37 °C eingestellt ist.
    3. Tragen Sie eine Augensalbe auf, um ein Austrocknen der Hornhaut zu verhindern. Drücken Sie vorsichtig eine Pfote, um zu bestätigen, dass es keinen Zehenklemmreflex gibt. Überwachen Sie die Anästhesietiefe alle 15-20 Minuten und erhöhen Sie den Isofluran im Falle einer positiven Zehenklemmreaktion.
    4. Verabreichen Sie Buprenorphin mit verlängerter Freisetzung (0,1 mg/kg SC) in den Nacken.
  2. Chirurgische Vorbereitung und Peeling
    1. Rasieren Sie den Bauch mit der sterilen Standardtechnik.
    2. Schrubben Sie den Bauch 3x abwechselnd mit Betadin und 70% Ethanol.
    3. Drapieren Sie das Tier mit sterilen OP-Abdeckungen.
  3. Abdominale Laparotomie
    1. Machen Sie mit einem Skalpell einen 3 cm langen Schnitt in der Mittellinie auf der vorbereiteten Bauchhaut.
    2. Verwenden Sie eine Pinzette und eine chirurgische Schere, um die fasziale Schicht des Bauches hochzuhalten, und machen Sie einen Schnitt in die avaskuläre Linea alba der Muskelschicht, um Zugang zur Bauchhöhle zu erhalten.
    3. Externalisieren Sie die Gebärmutter.
    4. Isolieren Sie die Gebärmutterarterien und klemmen Sie sie mit Aneurysmaclips für 60 Minuten fest. Halten Sie die Temperatur aufrecht und halten Sie den intraabdominalen Inhalt mit steriler Kochsalzlösung feucht.
    5. Entfernen Sie die Clips und injizieren Sie 100 μl LPS (4 μg/Sack LPS-Lösung) in jede Fruchtblase jedes Fötus. Stören Sie weder den Fötus noch die Plazenta.
    6. Spülen Sie die Gebärmutterhörner und das Feld großzügig 3x mit steriler Kochsalzlösung.
  4. Verschluss der Laparotomie
    1. Ersetzen Sie die Gebärmutterhörner in der Bauchhöhle.
    2. Die Ränder der muskulofaszialen Schicht wieder annähern und mit einer laufenden 3-0-Naht verschließen.
    3. Nähern Sie sich der Hautschicht wieder an und schließen Sie die Haut mit einer laufenden 3-0-Naht.
    4. Verwenden Sie eine 26-g-Nadel, um 0,125 % Bupivacain subkutan um die Wundränder zu injizieren.
    5. Bei Scheinkontrollen führen Sie die Laparotomie für die Dauer der Anästhesie genauso lange durch wie die Kontrolle. Verklemmen Sie die Arterien nicht und verabreichen Sie keine intraamniotischen Injektionen. Am Ende des Eingriffs schließen Sie die Laparotomie in zwei Schichten (Bauchmuskelfaszie und Haut) mit einer 3-0-Naht. In allen Fällen werden die Jungtiere termingerecht geboren (E21/22) und von der Hündin betreut.

2. Aufbereitung von lysierten roten Blutkörperchen auf P1

  1. Entnahme von Blut
    1. Entnehmen Sie ein männliches und ein weibliches Sprague-Dawley-Rattenjunges am postnatalen Tag 1 (P1) aus einem Wurf, der am E18 eine Chorioamnionitis hatte. Enthaupten Sie jeden Spenderwelpen schnell mit einer speziellen chirurgischen Schere.
      HINWEIS: Wir verwenden 1 männlichen und 1 weiblichen Welpen für die Blutentnahme, um eine mögliche geschlechtsspezifische Verzerrung auszuschließen, indem wir jeden in den Spenderkohorten repräsentieren. Zusätzlich verwenden wir ein geschlechtsspezifisches Paar, um ein ausreichendes Volumen und eine ausreichende Ausbeute an lysierten Erythrozyten zu gewährleisten, um ihre Wurfgeschwister zu injizieren. In der Regel liefert jeder Spenderwelpe genügend lysierte Erythrozyten, um eine ICV-Injektion bei maximal 4-5 Wurfgeschwistern durchzuführen.
    2. Sammeln Sie das Blut sofort in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 0,2 ml steriler Kochsalzlösung und achten Sie darauf, nach der Enthauptung nur frei fließendes Blut zu sammeln und nicht zu kratzen oder zu quetschen, um mehr Blut zu produzieren, da dies zu einer vorzeitigen Hämolyse führt. Gut vortexen.
      HINWEIS: Die genaue Blutmenge variiert je nach Spendertier und Gewicht, sollte jedoch unter Einhaltung der oben genannten Vorsichtsmaßnahmen maximal sein.
    3. Zerkleinern/zerkleinern Sie Blutgerinnsel mit einer kleinen chirurgischen Schere.
    4. Die Blutsuspension wird bei 500 × g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert, der Überstand entfernt und das Pellet in 0,2 ml steriler Kochsalzlösung resuspendiert. Gut vortexen.
    5. Zerkleinern/zerkleinern Sie die verbleibenden Blutgerinnsel nach dem Wirbel mit einer kleinen chirurgischen Schere.
    6. Wiederholen Sie die Schritte 2.1.4-2.1.5 noch zweimal für insgesamt 3x und reinigen Sie die chirurgische Schere zwischen jeder Lyserunde mit 70 % Ethanolspray.
  2. Lyse der roten Blutkörperchen
    1. Nach der abschließenden Zentrifugation fügen Sie dem Pellet 0,25 ml sterile Kochsalzlösung hinzu; Wirbel gut.
    2. Legen Sie die Suspension für 5 Minuten auf Trockeneis.
    3. Nehmen Sie die Suspension aus dem Trockeneis, legen Sie sie 5 Minuten lang in einen auf 37,5 °C eingestellten Inkubator, bis sie vollständig aufgetaut ist, und wirbeln Sie sie gut ein.
    4. Wiederholen Sie die Gefrier- und Auftauzyklen insgesamt 3x (drei Einfrieren und drei Auftauen).
    5. Am Ende des letzten Tauwetters wirbeln Sie und drehen sich schnell. Die Erythrozyten sind nun lysiert und einsatzbereit.
      HINWEIS: Die Mischung sollte eine undurchsichtige , tomatensaftähnliche Farbe haben und sich leicht in Spritzen ziehen lassen.

3. Intrazerebroventrikuläre Injektionen von lysierten roten Blutkörperchen auf P1

  1. Anästhesie mittels Hypothermie
    1. Lege eine kleine Plattform zum Abkühlen auf nasses Eis.
    2. Legen Sie ein trockenes Labortuch darauf, um die Haut des Welpen zu schützen.
      HINWEIS: Diese flache kalte Oberfläche wird zum Betäuben und Injizieren der Welpen verwendet.
    3. Übertragen Sie den Welpen (im Alter von P1) vom Wärmekissen auf das Aufgabentuch auf der kalten Plattform, um eine Anästhesie durch Unterkühlung einzuleiten.
    4. Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie eine Pfote zusammendrücken und das Fehlen des Zehenkneifreflexes bestätigen.
    5. Stellen Sie eine externe OP-Lampe auf die hellsten Einstellungen ein.
    6. Mit einem Assistenten, der mit Zeige- und Mittelfinger die Mittellinie des Tierkopfes sanft hält, durchleuchten Sie den Schädel, um die seitlichen Ventrikel durch den Schädel sichtbar zu machen. Identifizieren Sie Bregma, indem Sie den Sinus sagittalis superior (Mittellinie) durch die Haut und das Abtasten der Koronalnaht mit feiner Pinzette als sich schneidende Orientierungspunkte visualisieren.
  2. ICV-Injektion
    1. Wischen Sie den Kopf des betäubten Welpen mit einem Wattestäbchen ab, das mit 70% Ethanol getränkt ist.
    2. Identifizieren und markieren Sie die Injektionsstelle als 1 mm lateral von der sagittalen Naht, auf halbem Weg zwischen Lambda und Bregma.
    3. Nach der Visualisierung verwenden Sie eine 0,3 ml, 8 mm lange 31-g-Insulinspritze mit einer ultrafeinen perkutanen Nadel, um 20 μl lysierte Erythrozyten in den rechten lateralen Ventrikel zu injizieren. Führen Sie die Nadel in der Freihandtechnik bis zu einer Tiefe von etwa der halben Nadellänge gerade nach unten ein und injizieren und entfernen Sie die Nadel langsam (Injektions- und Entnahmevorgang über ca. 10-15 s).
    4. Lassen Sie die Nadel nach der Injektion einige Sekunden lang an Ort und Stelle, um ein Austreten der injizierten lysierten Erythrozyten zu verhindern.
    5. Wiederholen Sie den Vorgang mit dem linken Seitenventrikel und injizieren Sie 20 μl lysierte Erythrozyten.
    6. Legen Sie den Welpen auf ein auf 37,5 °C eingestelltes Wärmekissen, um sich von der Narkose zu erholen.
    7. Notieren Sie das Geschlecht des Welpen und weisen Sie ihm eine eindeutige Tierkennung zu.
    8. Bringen Sie den Welpen erst dann wieder in den Käfig zurück, wenn er sich vollständig auf dem Wärmekissen erholt und das Bewusstsein wiedererlangt hat, damit das Tier sicher auf dem Brustbein liegen kann.
    9. Überwachen Sie alle Rattenbabys täglich auf Gesundheit und Wohlbefinden.

4. Bestätigung einer erfolgreichen bilateralen intraventrikulären Blutung auf P2

  1. Ultraschall des Kopfes
    1. Um sich auf den Kopfultraschall vorzubereiten, nehmen Sie die P2-Welpen aus ihrem Heimkäfig.
    2. Legen Sie das Ultraschallgel auf die Ultraschallsonde und positionieren Sie die Sonde über dem Schädel.
    3. Bewegen Sie die Sonde mit extrem leichtem Druck, um die Ventrikel sichtbar zu machen. Bestätigen Sie die bilaterale Hyperechogenität in den lateralen Ventrikeln, die die IVH darstellen.

5. Bestätigung des erfolgreichen posthemorrhagischen Hydrozephalus

  1. Messung der intraauralen Distanz (IAD), einem Surrogat für den Kopfumfang, zur Bestätigung der Makrozephalie
    1. Besorgen Sie sich zur Vorbereitung der Messung ein kleines Maßband, das für die Messung des Kopfumfangs geeignet ist, idealerweise mit übersichtlich visualisierten Millimeterbezeichnungen.
    2. Lassen Sie einen maskierten Beobachter den Welpen aus seinem Käfig nehmen.
    3. Während Sie den Welpen vorsichtig halten, messen Sie den Abstand von Ohr zu Ohr (intraaurale Distanz, IAD) und notieren Sie den Wert in Millimetern.
    4. Wiederholen Sie den IAD-Vorgang täglich von P1 bis P15, und stellen Sie die Werte grafisch dar. Verfolgen Sie die IAD seriell und messen Sie erneut bei P21, wenn die Welpen in neue Käfige umgesiedelt werden, die physisch vom Muttertier getrennt sind (was der Standardzeitpunkt für die Entwöhnung der Welpen ist). Wiederholen Sie die IAD anschließend alle 5 Tage, beginnend bei P25 bis P60.
  2. Messung des Öffnungsdrucks zur Bestätigung eines erhöhten Hirndrucks
    1. Lassen Sie einen maskierten Beobachter den Welpen aus seinem Käfig nehmen.
    2. Anästhesie mit 75-100 mg/kg intraperitonealem (IP) Ketamin und 5-10 mg/kg IP Xylazin zur Vorbereitung auf die Euthanasie.
    3. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie eine Pfote zusammendrücken und bestätigen, dass das Fehlen des Zehenklemm-/Pedalreflexes vorhanden ist.
    4. Führen Sie eine kleine Nadel (31 G), die mit einem Manometer verbunden ist, in den Liquorraum des zervikomdullären Übergangs ein.
    5. Notieren Sie den Öffnungsdruck auf dem Manometer.
    6. Entfernen Sie die Nadel und enthaupten Sie die Ratte mit einer scharfen Schere und fahren Sie mit der Gewebeentnahme fort.
  3. Ex-vivo-Magnetresonanztomographie (MRT) zur Beurteilung der Ventrikulomegalie
    1. Anästhesie mit 75-100 mg/kg intraperitonealem (IP) Ketamin und 5-10 mg/kg IP Xylazin zur Vorbereitung auf die Euthanasie.
    2. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie eine Pfote zusammendrücken und bestätigen, dass das Fehlen des Zehenklemm-/Pedalreflexes vorhanden ist.
    3. Perfundieren Sie die Ratten mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), gefolgt von 4 % Paraformaldehyd (PFA), bis sie gut fixiert sind.
    4. Entfernen Sie das Gehirn und fixieren Sie das Gehirn mit 4 % PFA
    5. Betten Sie das Gehirn in 2% Agarose in ein konisches 50-ml-Röhrchen ein. Lassen Sie es bei Zimmertemperatur stehen.
    6. Übertragen Sie das Gehirn auf den MRT-Scanner für die ex vivo MRT.
    7. Führen Sie die 11,7-T-MRT wie folgt durch: T2 Turbo RARE; TE/TR = 30,0/3000 ms; Durchschnitt = 2; Echoabstand = 10.000 ms; SELTENHEITSFAKTOR = 8; Anzahl der Scheiben = 30; Dicke der Scheibe = 1 mm; Bildgröße = 128 x 128; Sichtfeld = 28 mm x 28 mm; Schnittauflösung = 0,219 x 0,219 mm2; FA = 90,0°.
      HINWEIS: Die MRT-Bildgebung liefert zwar einen Nachweis für eine erfolgreiche PHHP-Modellierung, ist jedoch nicht erforderlich, alle Gehirne in einer bestimmten Kohorte zu scannen, um die PHHP zu verifizieren. Die IAM- und ICP-Messung ist ausreichend, um die oben beschriebene Überprüfung durchzuführen. Letztendlich hängt die Fähigkeit eines Prüfarztes, eine In-vivo - oder Ex-vivo-MRT durchzuführen, von einer Vielzahl von Faktoren ab, wie z. B. dem Zugang zum MRT-Scanner, den finanziellen Mitteln und den technischen Fähigkeiten. Dieser Schritt ist besonders nützlich für die Validierung bei der Neueinbindung des PHHP-Modells. Es ist wichtig zu beachten, dass in Ermangelung dokumentierter Anzeichen eines erhöhten intrakraniellen Drucks, wie z. B. erhöhter Öffnungsdruck, isolierte Befunde einer Ventrikulomegalie in der MRT-Bildgebung keinen Hydrozephalus darstellen.

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Ergebnisse

Nach diesem Modell entwickelt sich der Hydrozephalus in den Tagen und Wochen nach der Injektion von lysierten roten Blutkörperchen. Eine Darstellung eines typischen Versuchsaufbaus und des Verlaufs des Hydrozephalus ist in Abbildung 1 dargestellt. Wir bewerteten 5-6 Scheintiere und 6-8 PHHP-Tiere pro Gruppe. Als Jugendliche zeigten Ratten mit PHHP eine Makrozephalie (Abbildung 2), einen erhöhten intrakraniellen Druck (

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Diskussion

Dieses Protokoll für die Induktion von PHHP ermöglicht rigorose, quantifizierbare und klinisch übertragbare Ergebnismessungen der Gehirnstruktur und -funktion, die mit phänotypischen Kennzeichen des Hydrozephalus, einschließlich chronischer ICP-Erhöhung, Ventrikulomegalie und Makrozephalie, von der Geburt bis zum Erwachsenenalter einhergehen4. Biochemische, histologische und funktionelle Assays können verwendet werden, um die Gesundheit des Plexus choroideus, des ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren danken für die Finanzierung durch die National Institutes of Health (R01HL139492), das Congressionally Directed Medical Research Program (W81XWH1810166, W81XWH1810167, W81XWH2210461 und W81XWH2210462), die Hydrocephalus Association und das Rudi Schulte Research Institute.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
70% Ethanol Pharmco 111000200Verdünnt auf 70 % & nbsp;
Betadine-OperationspeelingKardinalgesundheitNDC-67618-151-17
Stumpfe ZangeRobozRS-8100
Bravmini Plus Kabelloser Wiederaufladbarer Trimmer Wahl 41590-0438
Chirurgische Klingen aus Kohlenstahl  Bard-Parker371151-11
Zentrifuge&NBSP;Eppendorf5424R
Baumwoll-Gaze-SchwammFisherbrand22-362-178Klein, 15 cm steril
BaumwollspitzenapplikatorenFisherbrand23-400-11430 G 1
AugenschmiermittelLacri Gleitmittel auffrischen75929
Ferninfrarot-WärmeplattformKent ScientificRT-0501 
Inkubator -  Genie Temp-Shaker 100 Wissenschaftliche IndustrienSI-G100
InsulinspritzenBD3284380,3 cm³ 3 mm 31 G, ultrafein 
IsofluraneCovetrus 11695067772 
Ketaminhydrochlorid-InjektionDechra 17033-101-10
KimwipesKimtech-WissenschaftBXTNI141300
LPS 011B4SigmaL2630
MikrozentrifugenröhrenThermo Fisher Scientific34532,0 mL
NadelBD3051221 mL
NadelBD30512825 G 5/8
NadelhalterKent Scientific Corp.INS1410912,5 CM KURS
OR-HandtücherKardinalgesundheit287000-008
Maßband aus PapierKardinalgesundheitSKU  
Kochsalzlösung, 0,9 %SigmaS8776
SchereRobozRS-6808
SomnoSuiteKent ScientificSS6823B 
Sterile AlkoholvorbereitungspadsFisherbrand06-669-62Steril
Chirurgische HandschuheBiogel40870
Chirurgische SchereRobozRS-5880
Chirurgische SchereEST14002-16
SpritzeBD309628
T/Pumpe (Wärmetherapiepumpe)Stryker Medical TP700
GefäßclipsKent Scientific Corp.INS1412030 g Druck
Xylazin-Injektion Vet One&NBSP;NDC 13985-704-10

Referenzen

  1. Sevensky, R., Newville, J. C., Tang, H. L., Robinson, S., Jantzie, L. L. Cumulative damage: Cell death in posthemorrhagic hydrocephalus of prematurity. Cells. 10 (8), 1911(2021).
  2. Robinson, S., Jantzie, L. L. Pathogenesis of posthemorrhagic hydrocephalus of prematurity: New horizons. Semin Perinatol. 46 (5), 151596(2022).
  3. Dewan, M. C., et al. Global hydrocephalus epidemiology and incidence: systematic review and meta-analysis. J Neurosurg. 130 (4), 1065-1079 (2018).
  4. Robinson, S. Neonatal posthemorrhagic hydrocephalus from prematurity: pathophysiology and current treatment concepts. J Neurosurg Pediatr. 9 (3), 242-258 (2012).
  5. Gigi, M., Roth, J., Eshel, R., Constantini, S., Bassan, H. Health-related quality of life after post-haemorrhagic hydrocephalus in children born preterm. Dev Med Child Neurol. 61 (3), 343-349 (2019).
  6. Muir, R. T., Wang, S., Warf, B. C. Global surgery for pediatric hydrocephalus in the developing world: a review of the history, challenges, and future directions. Neurosurg Focus. 41 (5), E11(2016).
  7. Kulkarni, A. V., et al. Endoscopic third ventriculostomy and choroid plexus cauterization in infant hydrocephalus: a prospective study by the Hydrocephalus Clinical Research Network. J Neurosurg Pediatr. 21 (3), 214-223 (2018).
  8. Riva-Cambrin, J., et al. Risk factors for shunt malfunction in pediatric hydrocephalus: a multicenter prospective cohort study. J Neurosurg Pediatr. 17 (4), 382-390 (2016).
  9. Agajany, N., et al. The impact of neonatal posthemorrhagic hydrocephalus of prematurity on family function at preschool age. Early Hum Dev. 137, 104827(2019).
  10. Berry, J. G., et al. Characteristics of hospitalizations for patients who use a structured clinical care program for children with medical complexity. J Pediatr. 159 (2), 284-290 (2011).
  11. Berry, J. G., et al. Hospital utilization and characteristics of patients experiencing recurrent readmissions within children's hospitals. JAMA. 305 (7), 682-690 (2011).
  12. Berry, J. G., et al. Trends in resource utilization by children with neurological impairment in the United States inpatient health care system: a repeat cross-sectional study. PLoS Med. 9 (1), e1001158(2012).
  13. Drake, J. M., et al. Randomized trial of cerebrospinal fluid shunt valve design in pediatric hydrocephalus. Neurosurgery. 43 (2), discussion 303-295 294-303 (1998).
  14. Simon, T. D., et al. Cerebrospinal fluid shunt infection: Emerging paradigms in pathogenesis that affect `prevention and treatment. J Pediatr. 206, 13-19 (2019).
  15. Simon, T. D., et al. Hospital care for children with hydrocephalus in the United States: utilization, charges, comorbidities, and deaths. J Neurosurg Pediatr. 1 (2), 131-137 (2008).
  16. Riva-Cambrin, J., et al. Predictors of success for combined endoscopic third ventriculostomy and choroid plexus cauterization in a North American setting: a Hydrocephalus Clinical Research Network study. J Neurosurg Pediatr. 24 (2), 128-138 (2019).
  17. Emmert, A. S., et al. Characterization of a novel rat model of X-linked hydrocephalus by CRISPR-mediated mutation in L1cam. J Neurosurg. 132 (3), 945-958 (2019).
  18. Strahle, J. M., et al. Role of hemoglobin and iron in hydrocephalus after neonatal intraventricular hemorrhage. Neurosurgery. 75 (6), discussion 706 696-705 (2014).
  19. Robinson, S., et al. Extended combined neonatal treatment with erythropoietin plus melatonin prevents posthemorrhagic hydrocephalus of prematurity in rats. Front Cell Neurosci. 12, 322(2018).
  20. Yung, Y. C., et al. Lysophosphatidic acid signaling may initiate fetal hydrocephalus. Sci Transl Med. 3 (99), 99ra87(2011).
  21. Moscuzza, F., et al. Correlation between placental histopathology and fetal/neonatal outcome: chorioamnionitis and funisitis are associated to intraventricular haemorrage and retinopathy of prematurity in preterm newborns. Gynecol Endocrinol. 27 (5), 319-323 (2011).
  22. Salas, A. A., et al. Histological characteristics of the fetal inflammatory response associated with neurodevelopmental impairment and death in extremely preterm infants. J Pediatr. 163 (3), e651-652 652-657 (2013).
  23. Arayici, S., et al. The effect of histological chorioamnionitis on the short-term outcome of preterm infants ≤32 weeks: a single-center study. J Matern Fetal Neonatal Med. 27 (11), 1129-1133 (2014).
  24. Shankaran, S., et al. Maternal race, demography, and health care disparities impact risk for intraventricular hemorrhage in preterm neonates. J Pediatr. 164 (5), 1005-1011.e3 (2014).
  25. Lu, H., Wang, Q., Lu, J., Zhang, Q., Kumar, P. Risk factors for intraventricular hemorrhage in preterm infants born at 34 weeks of gestation or less following preterm premature rupture of membranes. J Stroke Cerebrovasc Dis. 25 (4), 807-812 (2016).
  26. Stark, M. J., Hodyl, N. A., Belegar, V. K., Andersen, C. C. Intrauterine inflammation, cerebral oxygen consumption and susceptibility to early brain injury in very preterm newborns. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed. 101 (2), F137-F142 (2016).
  27. Lee, J., et al. A new anti-microbial combination prolongs the latency period, reduces acute histologic chorioamnionitis as well as funisitis, and improves neonatal outcomes in preterm PROM. J Matern Fetal Neonatal Med. 29 (5), 707-720 (2016).
  28. Edwards, J. M., Edwards, L. E., Swamy, G. K., Grotegut, C. A. Magnesium sulfate for neuroprotection in the setting of chorioamnionitis. J Matern Fetal Neonatal Med. 31 (9), 1156-1160 (2018).
  29. Alan, N., et al. Reduced ventricular shunt rate in very preterm infants with severe intraventricular hemorrhage: an institutional experience. J Neurosurg Pediatr. 10 (5), 357-364 (2012).
  30. Karimy, J. K., et al. Inflammation-dependent cerebrospinal fluid hypersecretion by the choroid plexus epithelium in posthemorrhagic hydrocephalus. Nat Med. 23 (8), 997-1003 (2017).
  31. Wessell, A. P., et al. A sustained systemic inflammatory response syndrome is associated with shunt-dependent hydrocephalus after aneurysmal subarachnoid hemorrhage. J Neurosurg. 130 (6), 1984-1991 (2018).
  32. Abdi, K., et al. Uncovering inherent cellular plasticity of multiciliated ependyma leading to ventricular wall transformation and hydrocephalus. Nat Commun. 9 (1), 1655(2018).
  33. Goulding, D. S., et al. Neonatal hydrocephalus leads to white matter neuroinflammation and injury in the corpus callosum of Ccdc39 hydrocephalic mice. J Neurosurg Pediatr. 25 (5), 476-483 (2020).
  34. Hussain, R., et al. Potentiating glymphatic drainage minimizes post-traumatic cerebral oedema. Nature. 623 (7989), 992-1000 (2023).
  35. Cai, Y., et al. The relationship between inflammation, impaired glymphatic system, and neurodegenerative disorders: A vicious cycle. Neurobiol Dis. 192, 106426(2024).
  36. Mogensen, F. L., Delle, C., Nedergaard, M. The glymphatic system (en)during inflammation. Int J Mol Sci. 22 (14), 7491(2021).
  37. Jantzie, L. L., Winer, J. L., Maxwell, J. R., Chan, L. A., Robinson, S. Modeling encephalopathy of prematurity using prenatal hypoxia-ischemia with intra-amniotic lipopolysaccharide in rats. J Vis Exp. (105), e53196(2015).
  38. Kitase, Y., et al. Chorioamnionitis disrupts erythropoietin and melatonin homeostasis through the placental-fetal-brain axis during critical developmental periods. Front Physiol. 14, 1201699(2023).
  39. Maxwell, J. R., Denson, J. L., Joste, N. E., Robinson, S., Jantzie, L. L. Combined in utero hypoxia-ischemia and lipopolysaccharide administration in rats induces chorioamnionitis and a fetal inflammatory response syndrome. Placenta. 36 (12), 1378-1384 (2015).
  40. Ozen, M., et al. Chorioamnionitis precipitates perinatal alterations of heme-oxygenase-1 (HO-1) homeostasis in the developing rat brain. Int J Mol Sci. 22 (11), 5773(2021).
  41. Yellowhair, T. R., et al. CXCR2 blockade mitigates neural cell injury following preclinical chorioamnionitis. Front Physiol. 10, 324(2019).
  42. Yellowhair, T. R., et al. Chorioamnionitis in rats precipitates extended postnatal inflammatory lymphocyte hyperreactivity. Dev Neurosci. , 1-11 (2019).
  43. Yellowhair, T. R., et al. Preclinical chorioamnionitis dysregulates CXCL1/CXCR2 signaling throughout the placental-fetal-brain axis. Exp Neurol. 301 (Pt B), 110-119 (2018).
  44. Jantzie, L. L., et al. Complex pattern of interaction between in utero hypoxia-ischemia and intra-amniotic inflammation disrupts brain development and motor function. J Neuroinflammation. 11, 131(2014).
  45. Jantzie, L. L., et al. Repetitive neonatal erythropoietin and melatonin combinatorial treatment provides sustained repair of functional deficits in a rat model of cerebral palsy. Front Neurol. , 233(2018).
  46. Maxwell, J. R., et al. Prenatal alcohol exposure and chorioamnionitis results in microstructural brain injury in a preclinical investigation. Ann Pediatr Res. 4 (1), 1031(2020).
  47. Karimy, J. K., et al. Outcomes of the 2019 hydrocephalus association workshop, "Driving common pathways: extending insights from posthemorrhagic hydrocephalus". Fluids Barriers CNS. 20 (1), 4(2023).
  48. Jakopin, N. E., et al. Establishing ranked priorities for future hydrocephalus research. J Neurosurg. 139 (2), 492-501 (2022).
  49. Koschnitzky, J. E., et al. Opportunities in posthemorrhagic hydrocephalus research: outcomes of the Hydrocephalus Association Posthemorrhagic Hydrocephalus Workshop. Fluids Barriers CNS. 15 (1), 11(2018).
  50. Strahle, J., et al. Mechanisms of hydrocephalus after neonatal and adult intraventricular hemorrhage. Transl Stroke Res. 3 (Suppl 1), 25-38 (2012).
  51. Segado-Arenas, A., et al. Cognitive impairment and brain and peripheral alterations in a murine model of intraventricular hemorrhage in the preterm newborn. Mol Neurobiol. 55 (6), 4896-4910 (2018).
  52. Li, Q., et al. Targeting germinal matrix hemorrhage-induced overexpression of sodium-coupled bicarbonate exchanger reduces posthemorrhagic hydrocephalus formation in neonatal rats. J Am Heart Assoc. 7 (3), e007192(2018).
  53. Gaisie, G., Roberts, M. S., Bouldin, T. W., Scatliff, J. H. The echogenic ependymal wall in intraventricular hemorrhage: sonographic-pathologic correlation. Pediatr Radiol. 20 (5), 297-300 (1990).
  54. Mohammad, K., et al. Consensus approach for standardizing the screening and classification of preterm brain injury diagnosed with cranial ultrasound: A Canadian perspective. Front Pediatr. 618236, (2021).
  55. Gao, C., et al. Role of red blood cell lysis and iron in hydrocephalus after intraventricular hemorrhage. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (6), 1070-1075 (2014).

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