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Etablierung eines Mausmodells für dünnes Endometrium

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DOI:

10.3791/67084

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1. November 2024

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1Shenzhen Key Laboratory of Reproductive Immunology for Peri-implantation, Shenzhen Zhongshan Institute for Reproductive Medicine and Genetics, Shenzhen Zhongshan Obstetrics and Gynecology Hospital (formerly Shenzhen Zhongshan Urology Hospital), 2Guangdong Engineering Technology Research Center of Reproductive Immunology for Peri-Implantation, 3School of Biomedical Engineering, Shenzhen Campus of Sun Yat-sen University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Herstellung eines zuverlässigen und reproduzierbaren dünnen Endometriums mit einer sehr niedrigen Mortalitätsrate und minimalen intrauterinen Adhäsionen durch Injektion von 95% Ethanol in die Gebärmutter der Maus innerhalb von 1-3 Minuten.

Zusammenfassung

Dünnes Endometrium (TE) ist weithin als eine der Hauptursachen für Unfruchtbarkeit anerkannt. Die Pathogenese der TE ist jedoch nach wie vor unklar, und es werden weiterhin dringend zufriedenstellende Behandlungsoptionen benötigt. Es wurden mehrere Tiermodelle von TE entwickelt, aber das Mausmodell mit abdominaler Operation und Injektion von 95 % Ethanol stellt aufgrund der hohen Sterblichkeitsrate und des Risikos von intrauterinen Adhäsionen bei nicht korrekter Durchführung eine gewaltige Herausforderung dar. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll, das durch Injektion von 95% Ethanol in die Gebärmutter der Maus mit unterschiedlichen Infusionszeiten eine zuverlässige und reproduzierbare TE mit einer sehr niedrigen Mortalitätsrate und minimalen intrauterinen Adhäsionen erzeugt. Die Ergebnisse zeigten, dass alle Mäuse erfolgreich TE mit Infusionszeiten von 1-3 Minuten entwickelten, die durch eine typische Verringerung der Endometriumdicke und der Anzahl der Drüsen sowie eine übermäßige Endometriumfibrose gekennzeichnet waren. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieses Mausmodell für die Untersuchung dünner Gebärmutterschleimhaut geeignet ist und als Plattform für die Entwicklung zukünftiger TE-Behandlungen dienen kann.

Einleitung

Dünnes Endometrium (TE) ist eine schwerwiegende Erkrankung in der Geburtshilfe und Gynäkologie, die häufig Frauen im gebärfähigen Alter betrifft. Eine TE wird diagnostiziert, wenn die Dicke des Endometriums bei einer Ultraschalluntersuchung weniger als 7 mm misst, begleitet von einer normalen Gebärmutterhöhle, und in engem Zusammenhang mit einem Schwangerschaftsversagensteht 1,2. Es wird geschätzt, dass etwa 1,5 % bis 9,1 % der Frauen, die sich einer In-vitro-Fertilisationsbehandlung (IVF) unterziehen, an TE leiden, was sie zu einer wachsenden Herausforderung in der Reproduktionsmedizin macht 3,4,5. Zu den häufigsten Ursachen für TE gehören eine unsachgemäße Endometriumreparatur nach chirurgischer Trennung von intrauterinen Adhäsionen (IUA) und Kürettage, die häufig mit einer gestörten Blutgefäßverteilung und spärlichen Drüsen einhergehen 6,7,8. Bisher sind die zellulären und molekularen Mechanismen, die der TE zugrunde liegen, unklar. Die Wiederherstellung des Endometriums bei TE-Patientinnen ist zeitaufwändig, obwohl eine Östrogenbehandlung und eine niedrig dosierte Aspirintherapie als mögliche Interventionen untersucht wurden9. Daher ist eine eingehende Untersuchung der Pathogenese der TE der direkteste Ansatz, um die Herausforderungen dieser Erkrankung anzugehen. Studien zur Pathogenese der TE stützen sich jedoch auf Tiermodelle, so dass die Auswahl eines geeigneten Modells entscheidend ist.

Die meisten histopathologischen Studien des dünnen Endometriums (TE) haben gezeigt, dass eine gestörte Proliferation von Epithelzellen und Makrophagen, eine verminderte Expression der Steroidhormonrezeptoren der Eierstöcke, eine übermäßige Ablagerung der extrazellulären Matrix und eine zelluläre Seneszenz die wichtigsten pathologischen Merkmale von TEsind 6,9,10. Derzeit wurden verschiedene Rattenmodelle entwickelt, um TE nachzuahmen, einschließlich Modelle, die durch Kratzen 11,12,13, Ischämie14, thermische Schädigung 15 und chemische Schädigung16,17,18,19 induziert werden. Ein Rattenmodell wird durch Kratzen des Endometriums mit einer Nadel oder einem Katheter induziert, was häufig zu intrauterinen Adhäsionen (IUA) anstelle von TE 11,12,20,21,22 führt. Es wurde auch über ein Ischämie-induziertes TE-Modell bei Ratten berichtet, bei dem eine endometriale Ischämie durch eine bilaterale Ligatur der Arteria uterine erreicht wird, was zu einer reduzierten Endometriumdicke führt. Diese Methode ist jedoch zeitaufwändig, dauert drei Monate und wird in der Forschung nicht häufig eingesetzt14. Bei dem Modell der thermischen Verletzungsinduziertheit wird ein künstlicher Besamungsschlauch verwendet, um 85 °C vorgewärmtes Wasser durch den Zusammenfluss der beiden Seiten in eine Seite des Gebärmutterhorns zu infundieren, was es komplexer macht als andere Verfahren15. Das chemisch induzierte Modell beinhaltet die Injektion von 95% Ethanol in das freiliegende Gebärmutterhorn, um das gesamte Endometrium zu schädigen. Dieses Modell bietet die Vorteile niedriger Kosten und einer kurzen experimentellen Zeit für die Untersuchung der pathologischen Mechanismen und Behandlungen bei TE, wird jedoch hauptsächlich bei Ratten und nicht bei Mäusen eingesetzt 16,17,23. Obwohl es verschiedene Tiermodelle gibt, insbesondere Rattenmodelle, hat jedes seine Grenzen. Sie können nur bestimmte Aspekte der TE simulieren, und nur wenige Mausmodelle replizieren die Krankheitsmerkmale der TE genau und sind gleichzeitig bequem und vielseitig für die Forschung.

In diesem Zusammenhang haben wir ein neuartiges Mausmodell für dünnes Endometrium (TE) entwickelt, indem wir 95% Ethanol in die Gebärmutterhöhle infundiert haben, wobei ein Zeitgradientenansatz mit einer modifizierten Methodeverwendet wurde 24 (Abbildung 1). Die Ergebnisse zeigten, dass alle Mäuse erfolgreich TE entwickelten, wenn die Infusionszeit zwischen 1 und 3 Minuten lag und typische Merkmale wie reduzierte Endometriumdicke, Drüsenverkleinerung und erhöhte Endometriumfibrose aufwiesen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass unser Mausmodell ein geeignetes Werkzeug für die Untersuchung von TE ist und als Plattform für die Entwicklung zukünftiger TE-Behandlungen dienen kann.

Protokoll

Diese Studie wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee des Shenzhen Zhongshan Obstetrics & Gynecology Hospital (ehemals Shenzhen Zhongshan Urology Hospital) genehmigt, wo alle Tierversuche durchgeführt wurden. In dieser Studie wurden weibliche C57BL/6-Mäuse (Alter 6-8 Wochen, Gewicht 18-20 g) verwendet. Alle Tiere wurden in einer spezifischen pathogenfreien (SPF) Umgebung im selben Raum untergebracht und vor den Experimenten eine Woche lang in einem Raum ohne spezifische Erreger bei (22 ± 1) °C unter einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus akklimatisiert. Sie erhielten freien Zugang zu Nahrung und Wasser. Die Einzelheiten zu den in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Identifizierung der Brunst

HINWEIS: Die Brunstphase bei Mäusen ist vergleichbar mit der späten Lutealphase beim Menschen, mit einer relativ dicken Gebärmutterschleimhaut zu diesem Zeitpunkt. Die Auswahl von Mäusen in der Brunst für die Modellinduktion stellt sicher, dass sie sich in einem relativ konsistenten physiologischen Zustand befinden. Darüber hinaus sind die Ergebnisse der Ausdünnung des Endometriums ausgeprägter, wenn die Dicke des Endometriums relativ dick ist. Einzelheiten zu diesem Verfahren finden Sie in den zuvor veröffentlichten Berichten 25,26.

  1. Bereiten Sie 20 μl Kochsalzlösung mit einer Pipette vor. Fassen Sie beide Seiten der Ohre der Maus und fixieren Sie den Schwanz der Maus, indem Sie die Spitze der Pipette vorsichtig bis zu einer Tiefe von ca. 2 mm in die Vaginalöffnung einführen. Gießen Sie 20 μl Kochsalzlösung in die Vagina und spülen Sie sie sanft für 5 Zyklen aus.
  2. Nehmen Sie die Kochsalzlösung heraus und geben Sie sie gleichmäßig auf einen sauberen Objektträger. Lassen Sie es verdampfen und natürlich bei Raumtemperatur trocknen.
  3. Tragen Sie 30 μl Ethanol auf jeden Objektträger auf, um die Zellen zu fixieren. Lassen Sie das Ethanol 5 Minuten verdampfen, bis der Objektträger trocken ist.
  4. Tragen Sie 50 μl kristallviolette Färbelösung auf jeden Objektträger auf und färben Sie die Zellen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.
  5. Spülen Sie jeden Objektträger mit entionisiertem Wasser ab, um überschüssige Farbe zu entfernen und unspezifische Flecken zu reduzieren.
  6. Beobachten Sie die Zellmorphologie und bestimmen Sie den Anteil der Zelltypen unter dem Mikroskop.
  7. Beobachten Sie die Brunstzyklen von Mäusen zweimal hintereinander, um die Stabilität zu gewährleisten. Wählen Sie Mäuse in der dritten Brunst für das Experiment aus.
    HINWEIS: Der Östruszyklus bei Mäusen dauert in der Regel 4-5 Tage und ist in vier Stadien unterteilt: Proöstrus, Brunst, Metestrus und Diöstrus. Die Proöstrus dauert etwa 24 Stunden und ist durch runde bis ovale kernhaltige Epithelzellen gekennzeichnet (Abbildung 2A). Die Brunst dauert zwischen 12 h und 48 h und ist gekennzeichnet durch überwiegend kernhaltige keratinisierte Epithelzellen (Abbildung 2B). Metestrus dauert bis zu 24 Stunden und ist durch eine Mischung aus kernhaltigen keratinisierten Epithelzellen und Neutrophilen gekennzeichnet (Abbildung 3C). Die Brunst dauert zwischen 48 h und 72 h und ist gekennzeichnet durch eine Kombination aus neutrophilen, kernhaltigen Epithelzellen und einigen wenigen kernhaltigen keratinisierten Zellen (Abbildung 2D).

2. Gruppengestaltung

HINWEIS: Um die Auswirkungen verschiedener Dauern einer 95%igen Ethanolinfusion auf die Stabilität des TE-Modells zu bewerten, wurden sechs Behandlungsgruppen gebildet. Eine Gruppe unterzog sich einer Scheinoperation ohne Ethanolverabreichung, um als Kontrolle für die prozeduralen Effekte zu dienen. Mäuse mit Ethanol-induzierter TE wurden basierend auf der Infusionszeit (n = 5 pro Gruppe) nach dem Zufallsprinzip wie folgt in fünf Behandlungsgruppen eingeteilt:

  1. 1-Minuten-Gruppe: Injizieren Sie 1 Minute lang Ethanol in die Gebärmutterhöhle.
  2. 2-Minuten-Gruppe: Injizieren Sie Ethanol für 2 Minuten in die Gebärmutterhöhle.
  3. 3-Minuten-Gruppe: Injizieren Sie Ethanol 3 Minuten lang in die Gebärmutterhöhle.
  4. 4-Minuten-Gruppe: Injizieren Sie Ethanol für 4 Minuten in die Gebärmutterhöhle.
  5. 5-Minuten-Gruppe: Injizieren Sie 5 Minuten lang Ethanol in die Gebärmutterhöhle.

3. Induktion des TE-Modells bei Mäusen

  1. Betäuben Sie die Mäuse mit einem Anästhesiegerät mit 5 % Isofluran und 100 % Sauerstoff für 3 Minuten (nach einem institutionell anerkannten Protokoll). Halten Sie die Anästhesie bei 1%-3% Isofluran mit einem Nasenkonus. Tragen Sie tierärztliche Salbe auf die Augen der Mäuse auf, um Trockenheit während der Narkose zu verhindern. Überwachen Sie die Atemfrequenz während des gesamten Eingriffs mit einem Zehenklemmen.
  2. Befestigen Sie die Gliedmaßen der Mäuse mit medizinischem Klebeband und halten Sie sie in Rückenlage auf dem Operationstisch, der mit einer elektronischen Decke vorgeheizt ist. Ziehen Sie vorsichtig leicht an der Zunge der Maus, um eine Obstruktion der Atemwege zu vermeiden.
    HINWEIS: Das Warmhalten von Mäusen während der Operation trägt zur Aufrechterhaltung der Immunfunktion und der Durchblutung bei und beugt der Gerinnung vor. Darüber hinaus sorgt das Herausziehen der Zunge der Mäuse für klare Atemwege, um ein Ersticken während der Narkose zu vermeiden.
  3. Tragen Sie Tierhaarentfernungscreme 3 Minuten lang auf den unteren Bauch der Mäuse auf. Entfernen Sie die Haare mit sauberen Tüchern. Desinfizieren Sie den Bereich mit 75% Ethanol und Jodophor.
  4. Machen Sie einen 1 cm langen Schnitt im Bauchraum, 1 cm von der Harnröhrenöffnung entfernt. Verwenden Sie eine sterile Schere und Pinzette, um den Schnitt bis in die Bauchhöhle zu verlängern.
  5. Schieben Sie die Eingeweide vorsichtig mit einer sterilen Pinzette zur Seite, um die Gebärmutter zu lokalisieren und das rechte Gebärmutterhorn freizulegen. Bringen Sie hämostatische Klemmen am proximalen Ende in der Nähe des Gebärmutterhalses und am distalen Ende in der Nähe des Eierstocks an.
    HINWEIS: Das Einklemmen beider Enden des Gebärmutterhorns stellt sicher, dass während der Ethanol-Injektion kein Leck auftritt, und verhindert so eine Schädigung des Gebärmutterhalses, der Vagina und des Eierstocks.
  6. Mit einer 25-g-Spritze etwa 50 μl 95%iges Ethanol27 in die Gebärmutterhöhle inträufeln, wobei die Nadel parallel zur Richtung des Gebärmutterhorns verläuft. Führen Sie die Nadel in einem Winkel von 30 Grad in die Gebärmutterhöhle ein. Halten Sie die Spritze je nach Bedarf 1 min, 2 min, 3 min, 4 min oder 5 min lang. Entnehmen Sie das Ethanol und spülen Sie die Gebärmutterhöhle 5 Mal mit steriler Kochsalzlösung, um das restliche Ethanol zu entfernen. In ähnlicher Weise inträufeln Sie ein gleiches Volumen steriler Kochsalzlösung in das linke Gebärmutterhorn als Kontrolle, indem Sie die gleichen Verfahren befolgen.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Spritzennadel parallel zur Richtung des Gebärmutterhorns verläuft. Vermeiden Sie es, die Nadel in einem zu steilen Winkel einzuführen, um zu verhindern, dass sie das gesamte Gebärmutterhorn durchquert. Entziehen Sie das Ethanol so vollständig wie möglich, um anhaltende Schäden und experimentelle Instabilität zu vermeiden.
  7. Entfernen Sie die Klammern und bringen Sie die Gebärmutter und die Eingeweide wieder in ihre ursprüngliche Position.
  8. Vernähen Sie das Peritoneum mit 5-0 resorbierbaren Polyglykolid-Operationsnähten, gefolgt von der Naht der Epidermis mit 5-0 nicht resorbierbaren Polyglykolid-Stichenähten.
  9. Desinfizieren Sie den Schnitt mit 75%igem Ethanol und Jodophor und bringen Sie die Tiere dann in ihren Käfig zurück. Beobachten Sie nach der Operation genau, ob die Herzfrequenz der Maus allmählich und stetig ansteigt, bis sich die Maus vollständig erholt und sich normal bewegen kann (Abbildung 3A-H).
    HINWEIS: Ein orales Analgetikum (3,2 mg/ml Paracetamol im Trinkwasser) wurde am Tag vor der Operation verabreicht und während des restlichen Studienverlaufs fortgesetzt.
  10. Beobachten Sie die Mäuse jeden Tag um 9:00 und 15:00 Uhr und desinfizieren Sie den Schnitt mit Jodophor, um sicherzustellen, dass sie in gutem Zustand sind.

4. Probenentnahme

  1. Euthanasieren Sie die Mäuse durch Luxation der Halswirbelsäule unter tiefer Narkose 7 Tage nach einer 95%igen Ethanolbehandlung (nach einem institutionell anerkannten Protokoll).
  2. Schneiden Sie die Nähte, um die Gebärmutter mit einer chirurgischen Schere freizulegen.
  3. Ziehen Sie vorsichtig und langsam die gesamte Gebärmutter mit einer chirurgischen Zange heraus. Löse die Gebärmutter von den umgebenden Eingeweiden.
  4. Entfernen Sie sofort beide Gebärmutterhörner und teilen Sie jedes Horn in 3-4 kleine Segmente.
  5. Geben Sie mit einer Pipette 1 ml 4 % Paraformaldehyd in ein 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Bewahren Sie das Gebärmuttergewebe in 4% Paraformaldehyd für 24 h zur Fixierung auf.

5. Dehydrierung des Gewebes

HINWEIS: Die Dehydrierung des Gewebes wird mit einem automatischen Gewebeprozessor erreicht (siehe Materialtabelle).

  1. Geben Sie die formalinfixierten Proben in Gewebekassetten.
  2. Übertragen Sie die Gewebekassetten durch eine Reihe von ansteigenden Ethanolkonzentrationen, um das Gewebe wie folgt zu dehydrieren: 70 % Ethanol für 1 h, 85 % Ethanol für 1 h, 95 % Ethanol zweimal (je 1 h) und 100 % Ethanol zweimal (je 1 h).
  3. Ersetzen Sie das Ethanol durch 100% Xylol (135 min für das erste Eintauchen, 20 min für jedes weitere zweimalige Eintauchen), um sicherzustellen, dass das Paraffin in das Gewebe eindringt.
  4. Tauchen Sie die Gewebekassetten in einem Inkubator bei 60-65 °C (3 Mal, je 140 min) in Paraffin und halten Sie die Kassetten bis zum Einbetten warm.

6. Einbettung von Paraffin

HINWEIS: Führen Sie diese Schritte mit einem modularen Gewebeeinbettungszentrum durch (siehe Materialtabelle).

  1. Füllen Sie eine Wachsform mit geschmolzenem Paraffinwachs, das auf 55 °C erhitzt wird.
  2. Verwenden Sie eine beheizte Pinzette, um die infiltrierten Segmente schnell von der Einbettkassette in die Wachsform zu übertragen, wobei Sie sicherstellen, dass der Querschnitt jedes Segments parallel zum Boden der Form aufliegt.
  3. Sobald die Segmente richtig positioniert sind, legen Sie den Boden der Einbettkassette auf die Histologieform.
  4. Stellen Sie die Form direkt für mindestens 20 Minuten auf eine Kühlplatte, die auf 4 °C eingestellt ist, damit sich das Paraffin verfestigen kann.
  5. Nachdem das Wachs erstarrt ist, entferne die Probe aus der Form und verwende einen Paraffintrimmer, um überschüssiges Wachs um sie herum abzuschneiden.

7. Paraffin-Trennen

  1. Bereiten Sie ein Wasserbad bei 42 °C vor. Legen Sie die Paraffinblöcke vor dem Schneiden auf eine kalte Platte, damit sie abkühlen und leichter zu schneiden sind.
  2. Klemmen Sie die in Paraffin eingebettete Probe mit der Gewebeoberfläche nach oben auf ein rotierendes Mikrotom.
  3. Jeweils 20 μm schneiden, um überschüssiges Paraffin zu entfernen, das das Gewebe bedeckt, bis die gewünschte Gewebeebene erreicht ist.
  4. Schneiden Sie jeweils 4 μm Abschnitte.
  5. Das Paraffinband für 2 min in das 42 °C warme Wasserbad geben.
  6. Nehmen Sie die Schnitte von der Wasseroberfläche auf und legen Sie sie nach dem Aufklappen auf einen Objektträger.
  7. Trocknen Sie die Objektträger in einem 60 °C heißen Inkubator für 30 min.

8. Hämatoxylin- und Eosin-Färbung

HINWEIS: Die Hämatoxylin- und Eosin-Färbung wird mit einer automatischen Objektträger-Färbemaschine durchgeführt (siehe Materialtabelle).

  1. Bereiten Sie alle Reagenzien im Voraus vor, bevor Sie mit dem Färbevorgang beginnen.
  2. Weichen Sie die Objektträger 10 Minuten, 5 Minuten bzw. 3 Minuten lang in 100 % Xylol ein.
  3. Rehydrieren Sie die Objektträger in einer abnehmenden Ethanolserie in deionisiertem Wasser wie folgt: 100 % Ethanol, 95 % Ethanol (zweimal) und 80 % Ethanol für jeweils 2 Minuten.
  4. Spülen Sie die Objektträger in entionisiertem Wasser ab.
  5. Färben Sie die Objektträger 10 Minuten lang in Hämatoxylinlösung. Spülen Sie die Objektträger 1 Minute lang in entionisiertem Wasser ab oder bis das Wasser nicht mehr violett ist.
  6. Tauchen Sie die Objektträger zweimal für jeweils 3-5 s in 0,5%ige saure Ethanol-Differenzierungslösung. Spülen Sie die Objektträger 1 Minute lang in entionisiertem Wasser ab.
  7. Legen Sie die Objektträger 1 Minute lang in einen Bläuepuffer (1%ige Ammoniaklösung). Spülen Sie die Objektträger 1 Minute lang in entionisiertem Wasser ab.
  8. Dehydrieren Sie die Objektträger mit 80% Ethanol und tauchen Sie sie dann 10 s lang in eine Eosin-Y-Arbeitslösung.
  9. Übertragen Sie die Objektträger auf 95%iges Ethanol und spülen Sie sie zweimal für jeweils 10 s. Übertragen Sie dann die Objektträger auf absolutes Ethanol und dehydrieren Sie sie zweimal für jeweils 10 s.
  10. Tauchen Sie die Objektträger zweimal für jeweils 2 Minuten in 100% Xylol, um das Gewebe zu reinigen.
  11. Legen Sie ein Deckglas über das Taschentuch und versiegeln Sie es mit Naturharz.

9. Masson-Färbung

  1. Entparaffinisieren Sie das Gewebe, indem Sie die Objektträger 10 min, 5 min bzw. 3 min in 100% Xylol einweichen.
  2. Nach dem Entparaffinieren die Objektträger in einer abnehmenden Ethanolreihe in entionisiertem Wasser einweichen: 100 % Ethanol, 95 % Ethanol (zweimal) und 80 % Ethanol für jeweils 2 Minuten.
  3. Spülen Sie die Objektträger in entionisiertem Wasser ab.
  4. Färben Sie die Objektträger 5 Minuten lang in Weigerts Eisen-Hämatoxylin-Lösung, waschen Sie die Objektträger dann 30 s lang in entionisiertem Wasser.
  5. Differenzieren Sie die Farben der gefärbten Gewebestrukturen, indem Sie die Objektträger 15 s lang in 1%igem Salzsäurealkohol inkubieren.
  6. Spülen Sie die Objektträger 30 s lang in entionisiertem Wasser.
  7. Inkubieren Sie das Gewebe 3-5 Minuten lang in einer Bläuelösung.
  8. Spülen Sie die Objektträger 30 s lang in entionisiertem Wasser.
  9. Legen Sie die Objektträger für 5-10 min in Ponceau-Säure-Fuchsin-Lösung.
    HINWEIS: Mischen Sie entionisiertes Wasser und schwache saure Lösung im Verhältnis 2:1, um die schwach saure Arbeitslösung herzustellen.
  10. Spülen Sie die Objektträger 30 s lang mit der schwach sauren Arbeitslösung.
  11. Differenzieren Sie das Gewebe 1-2 Minuten lang in der Phosphomolybdsäurelösung und spülen Sie die Schnitte dann 30 s lang mit einer schwach sauren Arbeitslösung ab.
  12. Färben Sie die Gewebeschnitte 1-2 min lang mit Anilinblau-Lösung.
  13. Dehydrieren Sie die Gewebeschnitte schnell in 95% Ethanol für 2-3 s, gefolgt von 100% Ethanol zweimal für jeweils 5-10 s. Reinigen Sie die Objektträger zweimal für jeweils 1-2 Minuten mit Xylol.
  14. Legen Sie ein Deckglas über das Taschentuch und versiegeln Sie es mit Naturharz.
  15. Überschüssiges Harz abtropfen lassen und die Objektträger trocknen lassen.

10. Bildgebung und Analyse

  1. Erfassen Sie Bilder der Schnitte mit einem Dia-Scanner-System.
    HINWEIS: Verwenden Sie ein 4x- oder 10x-Objektiv, um einen Überblick über die Abschnitte zu erhalten. Für detailliertere Bilder verwenden Sie 20- bis 100-fache Objektive.
  2. Führen Sie eine quantitative Analyse der Endometriumdicke, der Anzahl der Drüsen und des Ausmaßes der Gewebefibrose mit der Bildanalyseplattform HALO durch.
    HINWEIS: Die durchschnittliche Dicke wird durch Messung des vertikalen Abstands von der Gebärmutterhöhle zum Myometrium in 5 zufällig ausgewählten Sichtfeldern ermittelt.

11. Statistische Analysen

  1. Führen Sie statistische Analysen mit SPSS Version 23.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) durch.
  2. Bewerten Sie die statistische Signifikanz experimenteller Unterschiede zwischen der Kontroll- und der Modellgruppe, indem Sie zunächst einen Normalverteilungstest durchführen.
  3. Präsentieren Sie Daten, die normalverteilt sind, als Mittelwert ± SEM.
  4. Analysieren Sie Daten aus verschiedenen Behandlungsgruppen mit unidirektionaler ANOVA. Passen Sie die Anzahl der getesteten Allele in jedem Locus mit der Bonferroni-Methode an. Betrachten Sie einen p-Wert <0,05 als statistisch signifikant.

Ergebnisse

Die Hauptmerkmale des dünnen Endometriums (TE) sind eine verringerte Endometriumdicke und Drüsendichte sowie eine erhöhte Endometriumfibrose. Mit dieser Methode konnten diese Eigenschaften in den Modellmäusen erfolgreich repliziert werden. Die Datenanalyse zeigte eine signifikante Abnahme der Endometriumdicke in der 1-Minuten-Gruppe (222,3 μm ± 13,96 μm vs. 359,2 μm ± 12,41 μm, P < 0,05), der 2-Minuten-Gruppe (168,7 μm ± 17,57 μm vs. 359,2 μm ± 12,41 μm, P < 0,05) und der 3-Minuten-Gruppe (131,8 μm ± 3 μm vs. 359,2 μm ± 12,41 μm, P < 0,05) im Vergleich zur Kontrollgruppe. Es wurde jedoch kein signifikanter Unterschied in der Endometriumdicke zwischen der 2-Minuten- und der 3-Minuten-Gruppe beobachtet (168,7 μm ± 17,57 μm vs. 131,8 μm ± 3 μm, P > 0,05) (Abbildung 3A,B).

Die Anzahl der Endometriumdrüsen war in der 1-Minuten-Gruppe (4,4 ± 2,38 vs. 24,4 ± 1,6, P < 0,05), der 2-Minuten-Gruppe (0,8 ± 0,49 vs. 24,4 ± 1,6, P < 0,05) und der 3-Minuten-Gruppe (4,4 ± 3,20 vs. 24,4 ± 1,6, P < 0,05) signifikant reduziert (Abbildung 3A, C). Es wurde jedoch kein signifikanter Unterschied in der Anzahl der Endometriumdrüsen zwischen den 1-Minuten-, 2-Minuten- und 3-Minuten-Gruppen beobachtet.

Da die TE nach einer 7-tägigen Behandlung mit 95 % Ethanol auftrat, wurde die Hypothese aufgestellt, dass die Endometriumdicke mit der Infusionsdauer zusammenhängen könnte. Um dies zu untersuchen, wurden zwei weitere Gruppen für 4 min bzw. 5 min mit 95% Ethanol behandelt. Interessanterweise zeigten die Ergebnisse eine starke Uterusadhäsion, wenn sich die Infusionszeit verlängerte. (Abbildung 4), wobei die Gebärmutterhöhle fast unsichtbar wird. Darüber hinaus wurden bei der verlängerten Infusionszeit keine Endometriumdrüsen in der Gebärmutter der Maus beobachtet (Abbildung 4).

Darüber hinaus stieg das Ausmaß der Endometriumfibrose mit der Dauer der 95%igen Ethanolinfusion an, was durch die Masson-Färbung bestätigt wurde, was auf eine übermäßige Fibrose im geschädigten Endometrium hinweist (Abbildung 5A,B).

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Abbildung 1: Flussdiagramm der Etablierung des TE-Mausmodells. Das gesamte Prozedere umfasst folgende Schritte: Zunächst durften sich die Mäuse vor dem Experiment 1 Woche lang akklimatisieren. Als nächstes wurden zwei Östruszyklen überwacht. Mäuse in der dritten Brunst wurden dann für die Modelletablierung ausgewählt, indem 95%iges Ethanol in die Gebärmutterhöhle injiziert wurde. Sieben Tage nach der Ethanol-Injektion wurden die Mäuse getötet und die Gebärmutterhörner für weitere HE-Färbungen und Masson-Färbeanalysen entnommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Identifizierung der Brunst bei Mäusen. (A) Die Brunst ist durch das Überwiegen kernhaltiger Epithelzellen gekennzeichnet (Pfeil). (B) Die Brunst ist gekennzeichnet durch das Überwiegen von kernhaltigen keratinisierten Epithelzellen (Sternchen). (C) Metestrus ist gekennzeichnet durch eine Kombination aus anukleierten keratinisierten Epithelzellen und Neutrophilen (Dreieck). (D) Diestrus ist gekennzeichnet durch eine Kombination von Neutrophilen, kernhaltigen Epithelzellen und einer geringen Anzahl von kernhaltigen keratinisierten Zellen. Objektivvergrößerung um das 20-fache. Maßstabsleisten = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Verfahren zur TE-Induktion durch 95%ige Ethanolinfusion. (A) Mäuse werden mit einem Anästhesiegerät anästhesiert. (B) Bauchhaare werden entfernt. (C) Ein 1 cm langer Schnitt wird 1 cm von der Harnröhrenöffnung entfernt vorgenommen. (D) Die Gebärmutter befindet sich und eine Seite des Gebärmutterhorns liegt frei. (E) Hämostatische Klemmen werden auf beiden Seiten des Gebärmutterhorns angebracht. (F) 95%iges Ethanol wird in das Gebärmutterhorn geträufelt und dann mit steriler Kochsalzlösung gespült. (G) Die Klammern werden entfernt und die Gebärmutter wird wieder eingesetzt. (H) Der Schnitt wird vernäht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Beobachtung der Endometriummorphologie bei Mäusen mittels HE-Färbung unter Mikroskopie. (A) Die Morphologie des Endometriums auf der Verletzten- und Kontrollseite wurde untersucht. Die rechte Gebärmutter wurde mit 95%igem Ethanol injiziert, während die linke Gebärmutter als Kontrolle mit steriler Kochsalzlösung injiziert wurde. Maßstabsbalken = 200 μm. (B) Vergleich der Endometriumdicke zwischen den Gruppen Con, 1 min, 2 min und 3 min. (C) Vergleich der Anzahl der Drüsen im Endometrium in den Gruppen Con, 1 min, 2 min, 3 min, 4 min und 5 min. Contra, Kontrolle; **P < 0,01, ****P < 0,0001 mit einfacher ANOVA. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Endometriumfibrose im Endometrium der Maus. (A) Die Masson-Trichrom-Färbung wurde zur Beurteilung der Endometriumfibrose verwendet, bei der die blaue Farbe die Verteilung der Kollagenfasern in den angegebenen Behandlungsgruppen anzeigt. Maßstabsbalken = 200 μm. (B) Ein zusammenfassendes Balkendiagramm zeigt den Grad der Kollagenfibrose in verschiedenen Gruppen. **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001 mit einfacher ANOVA. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Die TE ist gekennzeichnet durch unzureichende Zellproliferation und dysfunktionale Zellen, die eng mit Unfruchtbarkeit, wiederkehrenden Fehlgeburten und Plazentaanomalien verbunden sind 2,3. Leider gibt es derzeit keine wirksame Therapie für TE. Tiermodelle spielen eine entscheidende Rolle bei der Erforschung dieser Erkrankung. Zwischen 2014 und 2024 wurden Ratten in 16,4 % von 208.000 Studien (34.200 Studien) und Mäuse in 22,7 % (47.300 Studien) als Modellorganismen verwendet. Der zunehmende Einsatz von Mäusen in Experimenten kann auf ihre Vorteile gegenüber anderen Modellen zurückgeführt werden, insbesondere auf ihr Potenzial in Regenerationsstudien 28,29,30. Angesichts der Bedeutung der Modellkonsistenz besteht ein wachsender Bedarf an kompatibleren Instrumenten für die Durchführung von Studien mit Mäusen als Modelle31.

Zu den gängigen Methoden zur Induktion von TE-Modellen, wie in früheren Studien berichtet, gehören Kratzen11,12, Ischämie14, thermisch induzierte Schädigung 15 und chemisch induzierte Schädigung16,17,23. Um die Verwendung von Tiermodellen in TE-Studien zu erleichtern und die Grundlage für wirksame Behandlungen zu legen, etablierten Gao et al.24 zunächst ein TE-Modell bei SD-Ratten, indem sie 5 Minuten lang absolutes Ethanol injizierten, um das Endometrium zu verletzen. Obwohl diese Methode das Wachstum des Endometriums einschränkt, führt sie oft zu starken Verwachsungen in der Bauchhöhle, mit einer Überlebensrate von nur 70%.

Früher wurde 95%iges Ethanol aufgrund seiner einfachen Anwendung überwiegend bei Ratten verwendet, aber diese Methode erzeugte nur wenige Mausmodelle für TE-Studien. Nach klinischen Beobachtungen, einer umfassenden Literaturrecherche, Vorversuchen, wiederholten Diskussionen und Analysen wurde eine verbesserte Methode mit einer kürzeren Infusionszeit der Gebärmutter entwickelt. Geschickte Techniken ermöglichen es, 95%iges Ethanol in die Gebärmutterhöhle zu injizieren, um ein TE-Modell mit unterschiedlichen Infusionszeiten zu erstellen.

Das in dieser Studie vorgestellte Mausmodell baut auf den Prinzipien von Gaos Modell24 auf. Es wurden jedoch mehrere Modifikationen vorgenommen, darunter die Verkürzung der Ethanol-Infusionszeit und die Erhöhung der Häufigkeit der Kochsalzspülung. In diesem Modell wurde die Gebärmutter der Maus durch Abdomendissektion freigelegt, und 95% Ethanol wurde für verschiedene Zeiträume in eine Seite der Gebärmutterhörner injiziert: 1 min, 2 min, 3 min, 4 min und 5 min. Dank der präzisen Kontrolle über die Ethanol-Infusionszeit und des standardisierten Verfahrens konnten in Mausexperimenten stabile Daten erzielt werden, die Abweichungen aufgrund individueller Unterschiede zwischen den Mäusen minimierten.

Histologische Ergebnisse zeigen deutliche Veränderungen der Endometriumdicke, der Anzahl der Endometriumdrüsen und der Endometriumfibrose in unterschiedlichem Ausmaß bei den TE-Mäusen, was die Zuverlässigkeit des in dieser Studie etablierten Modells bestätigt 3,6,9. Insbesondere wenn die Ethanol-Infusionszeit 4 min oder 5 min überschritt, wurden schwere intrauterine Adhäsionen (IUA) beobachtet. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das TE-Mausmodell mit einer 1-3-minütigen 95%igen Ethanolinfusion effektiv etabliert werden kann, während Infusionszeiten von mehr als 3 Minuten schwere IUA induzieren können.

Bisher wurden mehrere Tiermodelle entwickelt, um TE zu untersuchen, darunter Kratzen, Ischämie, thermisch induzierte und chemisch induzierte Modelle. Das Scratching-induzierte Modell ist zwar einfacher durchzuführen, führt aber oft eher zu intrauterinen Adhäsionen (IUA) als zu TE. Das Ischämie-induzierte TE-Modell erfordert eine viel längere Dauer als das chemisch induzierte Modell, und die thermisch induzierte Methode ist im Vergleich zur chemischen Induktion komplexer und schwieriger durchzuführen. Obwohl das chemisch induzierte Modell zeiteffizient und stabil ist, weist es potenzielle Einschränkungen auf, wie z. B. ein Trauma für die Tiere und das Risiko einer Infektion oder des Todes aufgrund unsachgemäßer Technik. Diese Probleme können durch sorgfältige Schulung und Erfahrung gemildert werden.

Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass das TE-Mausmodell effektiv etabliert werden kann, indem 95% Ethanol für 1-3 Minuten in die Gebärmutterhöhle injiziert wird. Dieser Ansatz bietet eine vielversprechende Methode, um die pathologischen Mechanismen und Reparaturprozesse der TE zu untersuchen und wirksame Behandlungen für Patienten mit dieser Erkrankung zu entwickeln.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken den anonymen Gutachtern für ihre wichtigen und hilfreichen Kommentare. Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Shenzhen Science and Technology Project (Nr. JCYJ20220818103207016) und der Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (Nr. 2024A1515010478).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AnästhesiegerätRWD Life ScienceR530Mobiles Inhalations-Anästhesiegerät für Kleintiere
0,9% KochsalzlösungHubei Kelun Pharmaceutical C230817A210 mL, medizinische Injektion
75 % EthanolLIRCON6303060031500 mL, Desinfektionsmittel Reagenz
95 % EthanolGuangzhou Chemical Reagent Factory64-17-5500 mL, chemisches Reagenz Resorbierbare
NähteJinhuan MedicalCR537Dicke: 5-0; Länge: 90 cm
Wässriges AmmoniakMilliporeSigma1336-21-61000 mL, chemisches Reagenz
Automatischer GewebeprozessorLeicaTP1020100 Einbettboxen können gleichzeitig verarbeitet werden
C57BL/6 Mäuse Zentrum für Versuchstiere der Southern Medical University 
Eosin-YBASO BA40241000 mL, verwendet für die Färbung von Paraffinschnitten, Schnellschnitten, etc
HämatoxylinBASOBA40411000 mL, verwendet für die Färbung von Paraffinschnitten, Schnellschnitten, etc
HALO Image Analysis PlatformIndicaLabs Das Gerät zeichnet sich durch Benutzerfreundlichkeit und Skalierbarkeit, leistungsstarke Analysefunktionen und die schnellste Verarbeitung aus speed
Hämostatische KlemmenHUAYON18-50211,8 cm Gesamtlänge mit 0,7 cm Backe
Hämostatische PinzetteHUAYON18-502010 cm Gesamtlänge
HistoCore RotationsmikrotomLeica149BIO000C1Scheibendickenbereiche von 1 bis 60 μ m
IndorphorADF1005500 mL, Desinfektionsmittel Reagenz
IsofluranRWD Life ScienceR510-22-10100 mL, Wirkstoff 100% Isofluran
Massons Trichrom-FärbungSOLARBIOG13407 & mal 100 mL für 100
Tests ObjektträgerGene TechGT100511Länge: 75 cm; Breite: 25 cm
Modulares GewebeeinbettungszentrumLeicaEG1150 CDas Gerät enthält einen Kalttisch und ein beheiztes Paraffinverteilungsmodul, das Flexibilität für die Einbettungsarbeiten bietet
NaturharzSAKURA4770Harzbeschichtete Folie, geeignet für histologische Färbungen
Olympus SLIDEVIEW VS200PANOVUEVS200Das Gerät erfasst hochwertige virtuelle Objektträgerbilder und ermöglicht eine fortschrittliche quantitative Bildanalyse 
Paraformaldehyd-FixierlösungServicebioG1011500 mL, universelles Gewebefixiermittel (neutral)
Chirurgische ZangeHUAYON18-13002,2 mm gerade, 12,5 cm breit
Chirurgische SchereHUAYON18-011010 cm, chirurgische Schere aus Edelstahl Spritze
freundlich600170311 mL, sterile Einwegspritze mit Nadel
Gewebe KassettenCITOTEST80106-1100-16Weiß; Durchlaufschlitze; 0ne-Stück integrierter Deckel; Beschriftungsbereiche sind an drei Seiten angeordnet
Tissue-Tek Prisma PlusSAKURADRS-Prisma-P-JCSDie Verarbeitungskapazität beträgt 60 Objektträger auf einmal
XylolGuangdong Guanghua Sci-Tech1330-20-71000 mL, organisches Lösungsmittel
. .

Referenzen

  1. Mahajan, N., Sharma, S. The endometrium in assisted reproductive technology: How thin is thin. J Hum Reprod Sci. 9 (1), 3-8 (2016).
  2. Liu, X., et al. Thin endometrium is associated with the risk of hypertensive disorders of pregnancy in fresh IVF/ICSI embryo transfer cycles: A retrospective cohort study of 9,266 singleton births. Reprod Biol Endocrinol. 19 (1), 55(2021).
  3. Liu, K. E., Hartman, M., Hartman, A. Management of thin endometrium in assisted reproduction: A clinical practice guideline from the Canadian Fertility and Andrology Society. Reprod Biomed Online. 39 (1), 49-62 (2019).
  4. Wang, Y., Tang, Z., Teng, X. New advances in the treatment of thin endometrium. Front Endocrinol (Lausanne). 15, 1269382(2024).
  5. Saad-Naguib, M. H., Kenfack, Y., Sherman, L. S., Chafitz, O. B., Morelli, S. S. Impaired receptivity of thin endometrium: Therapeutic potential of mesenchymal stem cells. Front Endocrinol (Lausanne). 14, 1268990(2023).
  6. Lv, H., et al. Deciphering the endometrial niche of human thin endometrium at single-cell resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (8), e2115912119(2022).
  7. Gharibeh, N., et al. Cell-based therapy in thin endometrium and Asherman syndrome. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 33(2022).
  8. Lei, L., et al. Angiogenic microspheres for the treatment of a thin endometrium. ACS Biomater Sci Eng. 7 (10), 4914-4920 (2021).
  9. Maekawa, R., et al. Thin endometrium transcriptome analysis reveals a potential mechanism of implantation failure. Reprod Med Biol. 16 (2), 206-227 (2017).
  10. Xu, L., Fan, Y., Wang, J., Shi, R. Dysfunctional intercellular communication and metabolic signaling pathways in thin endometrium. Front Physiol. 13, 1050690(2022).
  11. Hu, J., Song, K., Zhang, J., Zhang, Y., Tan, B. Z. Effects of menstrual blood-derived stem cells on endometrial injury repair. Mol Med Rep. 19 (2), 813-820 (2019).
  12. Kim, Y. Y., et al. Efficient production of murine uterine damage model. Tissue Eng Regen Med. 16 (2), 119-129 (2019).
  13. Chen, K., et al. A novel method to repair thin endometrium and restore fertility based on menstruation-derived stem cell. Reprod Sci. 31 (6), 1662-1673 (2024).
  14. Hu, J., Yuan, R. Decreased expression of C-kit and telomerase in a rat model of chronic endometrial ischemia. Med Sci Monit. 17 (4), Br103-Br109 (2011).
  15. Wang, G., Ren, C., Jiang, J. Effects of bone marrow mesenchymal stem cells on repair and receptivity of damaged endometrium in rats. J Obstet Gynaecol Res. 47 (9), 3223-3231 (2021).
  16. Lin, J., et al. Microenvironment-protected exosome-hydrogel for facilitating endometrial regeneration, fertility restoration, and live birth of offspring. Small. 17 (11), e2007235(2021).
  17. López-Martínez, S., et al. Bioengineered endometrial hydrogels with growth factors promote tissue regeneration and restore fertility in murine models. Acta Biomater. 135, 113-125 (2021).
  18. Haghighi, L., et al. Angiogenic lipid-based drug delivery system (phytosolve) for treatment of a thin endometrium in animal model. Tissue Cell. 90, 102481(2024).
  19. Saleem Raheem, S., Falah Hasan, H., Hashim Abid Ali, A., Mansour Jasim, A. Effectiveness of histopathological changes of induced thin layer endometrium by pentoxifylline and pentoxifylline-loaded poly lactic-co-glycolic acid on female rats. Arch Razi Inst. 78 (6), 1762-1770 (2023).
  20. Feng, Q., et al. Establishment of an animal model of intrauterine adhesions after surgical abortion and curettage in pregnant rats. Ann Transl Med. 8 (4), 56(2020).
  21. Bazoobandi, S., et al. Induction of Asherman's syndrome in rabbit. J Reprod Infertil. 17 (1), 10-16 (2016).
  22. Bai, X., et al. Therapeutic effect of human amniotic epithelial cells in rat models of intrauterine adhesions. Cell Transplant. 29, 963689720908495(2020).
  23. Liu, J., et al. The effects and mechanisms of GM-CSF on endometrial regeneration. Cytokine. 125, 154850(2020).
  24. Yan-Ping, L. Establishment and identification of rat thin endometrium model. Life Sci Res. , https://api.semanticscholar.org/CorpusID:88150888 (2011).
  25. Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. Vaginal cytology of the laboratory rat and mouse: Review and criteria for the staging of the estrous cycle using stained vaginal smears. Toxicol Pathol. 43 (6), 776-793 (2015).
  26. Quignon, C. Collection and analysis of vaginal smears to assess reproductive stage in mice. Curr Protoc. 3 (9), e887(2023).
  27. Yi, K. W., et al. marrow-derived cells or C-X-C motif chemokine 12 (CXCL12) treatment improve thin endometrium in a mouse model. Biol Reprod. 100 (1), 61-70 (2019).
  28. Nakada, Y., et al. Hypoxia induces heart regeneration in adult mice. Nature. 541 (7636), 222-227 (2017).
  29. Mylonas, K. J., et al. Cellular senescence inhibits renal regeneration after injury in mice, with senolytic treatment promoting repair. Sci Transl Med. 13 (594), eabb0203(2021).
  30. Mckellar, D. W., et al. Large-scale integration of single-cell transcriptomic data captures transitional progenitor states in mouse skeletal muscle regeneration. Commun Biol. 4 (1), 1280(2021).
  31. Elzat, E. Y., et al. Establishing a mouse contusion spinal cord injury model based on a minimally invasive technique. J Vis Exp. 187, e64538(2022).

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EndometriumfibroseInjektion in das UterushornEthanol InfusionEndometriumdickeUterusadh sionTierchirurgieParaffineinbettungUnfruchtbarkeitsmodell

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