Methoden zum Tätowieren von Xenopus laevis mit einer rotierenden Tätowiermaschine

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir Methoden zum Tätowieren von adulten Xenopus laevis (Afrikanischer Krallenfrosch) mit einer rotierenden Tätowiermaschine. Das richtige Tätowieren führt zu dunklen, gut lesbaren Ziffern, die mehrere Monate halten und die Tiere für Forschungs- und Aufzeichnungszwecke leicht unterscheidbar machen.

Zusammenfassung

Tiermodelle erweitern den Anwendungsbereich der biomedizinischen Forschung, erweitern unser Verständnis der Entwicklungs-, Molekular- und Zellbiologie und ermöglichen es Forschern, menschliche Krankheiten zu modellieren. Die Aufzeichnung und Verfolgung einzelner Tiere ermöglicht es den Forschern, die Anzahl der für Studien erforderlichen Tiere zu reduzieren und die Praktiken zur Verbesserung des Tierwohls zu verfeinern. Es gibt mehrere gut dokumentierte Methoden zur Markierung und Verfolgung von Säugetieren, darunter Ohrstanzen und Ohrmarken. Die Methoden zur Markierung aquatischer Amphibienarten sind jedoch begrenzt, da die vorhandenen Ressourcen veraltet, ineffektiv oder unerschwinglich teuer sind. In diesem Manuskript skizzieren wir Methoden und Best Practices für die Markierung von Xenopus laevis mit einer rotierenden Tätowiermaschine. Die richtige Tätowierung führt zu qualitativ hochwertigen Tätowierungen, die Individuen für Forscher leicht unterscheidbar machen und ein minimales Risiko für die Gesundheit der Tiere darstellen. Wir beleuchten auch die Ursachen für minderwertige Tätowierungen, die dazu führen können, dass Tätowierungen schnell verblassen und Tieren unnötigen Schaden zufügen. Dieser Ansatz ermöglicht es Forschern und Tierärzten, Amphibien zu markieren, wodurch sie biologische Replikate und transgene Linien verfolgen und genaue Aufzeichnungen über die Tiergesundheit führen können.

Einleitung

Tiermodelle sind nützliche Werkzeuge, um Fragen der menschlichen Gesundheit zu untersuchen. In der Praxis erfordert die biomedizinische Forschung mit Tiermodellen eine sorgfältige Organisation und Pflege einer gesunden Tierkolonie. Best Practices für einen ethischen Umgang und eine ethische Tierhaltung zielen darauf ab, die Anzahl der für Versuche benötigten Tiere zu reduzieren und die Praktiken zu verfeinern, um den Tierschutz zu gewährleisten¹. Die Gattung der Krallenfrösche, zu denen auch Xenopus laevis (X. laevis; Afrikanischer Krallenfrosch) und Xenopus tropicalis (X. tropicalis; Westlicher Krallenfrosch) werden seit den 1930er Jahren in der biomedizinischen Forschung eingesetzt, als X. laevis von südafrikanischen Ärzten zur Durchführung der ersten Schwangerschaftstests verwendet wurden². Während moderne Schwangerschaftstests keine Frösche mehr erfordern, besteht die Rolle der Xenopus-Forschung fort. Zu den Vorteilen der Verwendung von Xenopus für die biomedizinische Forschung gehören die gut annotierten Genome³, der ganzjährig induzierbare Eisprung großer Gelege⁴ und extern gelegte Eier, die für eine In-vitro-Fertilisation geeignet sind. Diese Eigenschaften machen sie zu einer nützlichen Bereicherung für die Embryologie und Entwicklung von Wirbeltieren ^5,6,7, die Grundlagen der Molekular- und Zellbiologie ^7,8,9,10 und für die Modellierung menschlicher Krankheiten 7,11,12,13.

Zuverlässige Methoden zur Verfolgung einzelner Xenopus-Tiere sind unerlässlich, um biologische Replikate zu erfassen und die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit in der Forschung zu verbessern. Da Xenopus häufig in Gruppen untergebracht sind, ermöglicht die Tiermarkierung den Forschern, einzelne Tiere leicht zu verfolgen⁴. Die Führung einer genauen Aufzeichnung der Tiere kann Zeit und Ressourcen sparen und die Fähigkeit zur Nachverfolgung der Gesundheit der Tiere verbessern. Zum Beispiel kann die individuelle Identifizierung von Tieren die Organisationsabläufe für die Generierung transgener Xenopus-Linien verbessern, da dies mehrere Generationen von Fröschen mit spezifischen Genotypen erfordert, die durch Sequenzierung¹⁴ verifiziert werden, was eine Organisation und individuelle Identifizierung der Tiere erfordert. Dies gilt insbesondere dann, wenn diesen Mutationen leicht erkennbare adulte Phänotypen fehlen. In ähnlicher Weise profitiert die Verwendung von Xenopus-Eizellen und -Embryonen zur Untersuchung grundlegender Zell- und Entwicklungsbiologie von der Verfolgung einzelner Tiere. Nach dem Auslösen des Eisprungs müssen sich die Tiere mindestens 3 Monate lang ausruhen, um gesundheitliche Komplikationen wie das Hyperovulationssyndrom^{zu vermeiden 15}. Individuelle Identifizierungsmethoden stellen sicher, dass die Tiere nicht zu häufig zum Eisprung veranlasst werden.

Die Kennzeichnung und Verfolgung von Tieren ermöglicht es dem Laborpersonal auch, die gesundheitlichen Bedenken der Tiere zu verfolgen. Die Erkrankung von Tieren desselben Genotyps kann auf übermäßige Inzucht oder unvorhergesehene gesundheitliche Bedenken im Zusammenhang mit dem Transgen hinweisen. In ähnlicher Weise können Tiere, die nach dem kürzlichen Eisprung krank werden, auf Probleme mit Reagenzien, Materialien oder Techniken hinweisen. Die Verfolgung von Tieren und ihrer Gesundheit ermöglicht es Labormitarbeitern und Tierärzten, nachzugehen, wenn Bedenken wieder auftauchen, und vorbeugende Maßnahmen zu ergreifen, um zukünftige Krankheiten zu verhindern. Bei Säugetieren gibt es zahlreiche Bestimmungsmethoden. Zu den dauerhaften Methoden für Mäuse gehören das Stanzen von Ohren, Ohrmarken, Tätowieren und subkutane Mikrochips¹⁶. Diese können Tiere innerhalb einer Kolonie oder eines Käfigs eindeutig und zuverlässig unterscheiden und können vom Laborpersonal einfach verabreicht werden. Methoden wie das Ohrlochen sind minimalinvasiv, erfordern nur ein Spezialgerät und funktionieren für Tiere jeden Alters. Während diese Systeme für Mäuse unkompliziert und nützlich sind, stellt ihr Einsatz bei Fröschen eine Reihe einzigartiger Herausforderungen dar. Fröschen und anderen Amphibien fehlt eine Ohrmuschel (äußere Ohrstruktur). Einige Forscher haben Tags am Kiefer, an der Zehe oder an den Hintergliedmaßen des Tieres angebracht^17,18. Dieser Ansatz führte zu verschiedenen Problemen: Kiefermarken verursachten Irritationen, und aufgeregte Frösche versuchten, mit ihren Vordergliedmaßen Marken abzureißen¹⁷. Zehenmarken durchbohrten das Gurtband zwischen den Zehen, beeinträchtigten die Bewegung und bergen die Gefahr, verloren zu gehen. Daher benötigen Amphibien ihre eigenen Methoden zur Bestimmung. In der Vergangenheit wurde das Zehenkürzen auch zur Markierung von Amphibien verwendet^17,19. Die Zehe wird mit einer scharfen Schere geschoren, und das Tier kann an der Länge der Zehen an den Vorder- und Hinterpfoten oder an dem Winkel, in dem die Zehe nachgewachsen ist (bei Salamandern), identifiziert werden. Diese Methode wirft jedoch die ethische Befürchtung auf, dass das Scheren der Zehen die Bewegung des Tieres beeinträchtigen kann¹⁷. Darüber hinaus kann dies zu Blutungen führen und ein Infektionsrisiko mit sich bringen. Ein weiteres etabliertes Markierungssystem sind die Hautautotransplantate, bei denen die Haut von einem Teil des Strahls entnommen und chirurgisch mit einem anderen Teil verbunden wird. Zum Beispiel wird ein Verfahren beschrieben, um den Rücken oder die Schulter eines Frosches mit Hilfe eines hellen Hauttransplantats aus seiner Brust^{zu markieren 20}. Hauttransplantationen sind auch mit Einschränkungen und Risiken verbunden: Das Verfahren ist invasiv und birgt das Risiko einer Aeromonas hydrophila-Infektion oder des roten Beins, einer potenziell tödlichen Erkrankung; Die vollständige Heilung des Autotransplantats dauert bis zu 6 Wochen; Und mit den beschriebenen Methoden können nur 6 Frösche zusammen untergebracht werden, da die Plätze für ein Autotransplantat^{begrenzt sind 20}.

Zu den weniger invasiven Markierungsansätzen gehören Glasperlen und Transponderchips^17,19. Bei der Glasperlenmethode werden Glasperlen auf eine kleine Naht aufgefädelt und in die Haut des Frosches eingenäht. Dies bietet eine größere Variabilität als Hautautotransplantate mit mindestens 60 unverwechselbaren Farbkombinationen. Es besteht jedoch die Gefahr, dass sich die Naht lösen und die Kügelchen verloren gehen. Alternativ kann ein Mikrochip-Transponder unter die Haut im dorsalen Lymphsack des Frosches implantiert werden. Dies gilt als die dauerhafteste Markierungsmethode und ermöglicht es, eine potenziell unendliche Anzahl von Tieren individuell zu identifizieren und zu katalogisieren. Dies ist jedoch auch die teuerste Methode, da einzelne Mikrochips teuer sind und die Markierung einer großen Kolonie kostspielig wäre. Mikrochips benötigen auch einen speziellen Scanner, um¹⁹ zu lesen. Ein gängiger Ansatz zur Identifizierung von Xenopus bezieht sich auf die natürliche Färbung und Musterung der Tiere. Dies funktioniert besonders gut bei Fröschen wie X. laevis, die ausgeprägte Muster aufweisen, die bis ins Erwachsenenalter bestehen bleiben. Diese Muster können sich jedoch im Laufe der Zeit bei Belastung ändern, und die Färbung kann anders aussehen, wenn Frösche zwischen transparenten und getönten Behältern bewegt werden¹⁵. Darüber hinaus ist diese Identifizierungsmethode weniger nützlich für X. tropicalis, die im Vergleich zu X. laevis weniger ausgeprägte Markierungsmuster aufweist, oder für Albino-Tiere, die keine Farbmarkierungen aufweisen²¹. Selbst bei Spezies mit unterschiedlichen Markierungen kann das Laborpersonal die Platzierung und Größe der Markierungen unterschiedlich interpretieren, was zu Fehlern bei der Identifizierung führen kann. Aus diesem Grund ist das Fotografieren von Tieren in Verbindung mit einer zusätzlichen Identifizierungsmethode am zuverlässigsten. Daher versuchen wir, Xenopus-Tiere mit einer Technik zu markieren und zu identifizieren, die leicht erkennbar, dauerhaft und minimalinvasiv ist.

Es gibt nur wenige veröffentlichte Quellen, die Methoden zum Tätowieren von Amphibien beschreiben. Das Tätowieren wurde zusammen mit anderen Branding-Techniken beschrieben, darunter Hitzemarken, Silbernitratmarken und Gefriermarken¹⁷. In der gleichen Ressource wurde das Tätowieren durch Zeichnen von Ziffern mit einer 27G-Injektionsnadel durchgeführt, und es wurde festgestellt, dass der Prozess keine Infektion verursachte, im Gegensatz zu den anderen Branding-Techniken, bei denen ein Draht verwendet wurde, der zu einer Ziffer oder einer anderen Markierung geformt wurde. In einer anderen Quelle wurde eine elektrische Tätowiermaschine (beschrieben als vibrierende Nadel) verwendet, um Frösche zu markieren, aber es wurden nur wenige Details über die Technik geliefert^17,19. Die Autoren warnen davor, dass dieses Verfahren durch die Störung der schützenden Schleimschicht des Frosches das Risiko für ein rotes Bein erhöht. Es gibt zwar keine Markierungs- oder Identifizierungsmethode, die sowohl völlig nicht-invasiv (z. B. Fotos) als auch dauerhaft (z. B. Mikrochips) ist, aber das Tätowieren stellt einen wirksamen Kompromiss dar. Das Tätowieren ist im Vergleich zu anderen Techniken, wie z. B. Hautautotransplantaten, relativ einfach. Zu den weiteren Vorteilen gehören eine kleinere Lernkurve und eine relativ günstige Ausstattung. Das Tätowieren von Amphibien im Wasser bringt gewisse Herausforderungen mit sich, die Forscher einschüchtern und die erfolgreiche Tiermarkierung beeinträchtigen können. Diese Arbeit zielt darauf ab, Forschern gut dokumentierte Methoden zum Tätowieren von erwachsenen Xenopus mit einer rotierenden Tätowiermaschine an die Hand zu geben.

Protokoll

Alle beschriebenen Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Dartmouth College genehmigt.

1. Einrichtung der Ausrüstung

HINWEIS: Ein Workflow für das Verfahren und ein Beispiel für die Einrichtung einer Prüfbank sind enthalten (Abbildung 1).

1. Verbinde die Tattoopistole und das Fußpedal mit dem Stromnetz. Positionieren Sie das Fußpedal unter der Arbeitsfläche.
2. Zusammenbau der Tattoo-Pistole
   1. Lösen Sie mit einem Inbusschlüssel oder einem Inbusschraubendreher die Schrauben im Griff (Abbildung 2A, rot eingekreist).
   2. Führen Sie die Kunststoffspitze ganz in den Griff ein. Ziehen Sie die Schraube fest, um sie an Ort und Stelle zu halten.
   3. Führen Sie das Metallrohr in die Rückseite des Griffs ein (Abbildung 2A). Dies wird angepasst, also führen Sie es auf die Hälfte seiner Länge ein. Ziehen Sie die Schraube fest, um sie festzuhalten.
   4. Führen Sie eine Tätowiernadel durch die Rückseite des Griffs, so dass sie bequem in der Kunststoffspitze an der Vorderseite des Griffs sitzt (Abbildung 2B).
   5. Schieben Sie die Rückseite der Nadel und des Metallrohrs durch die Rohrschelle. Stellen Sie das Metallrohr so ein, dass die Nadel bequem in die Kunststoffspitze passt (Abbildung 2B). Ziehen Sie die Rohrschelle von Hand fest, bis sich das Rohr nicht mehr bewegen kann (Abbildung 2C).
   6. Entfernen Sie den schwarzen O-Ring und haken Sie die Nadel in den Rotorarm ein. Setzen Sie den O-Ring wieder ein, um die Nadel zu fixieren (Abbildung 2C).
3. Stellen Sie die Spannung am Netzteil so ein, dass genügend Strom vorhanden ist, um die Haut zu durchbohren, aber nicht so stark, dass es schwierig ist, sie zu kontrollieren. Sobald das Netzteil eingesteckt und angeschlossen ist, drücken Sie das Fußpedal, um sicherzustellen, dass die Maschine funktioniert. Achten Sie darauf, die Nadel nicht auf sich selbst oder andere Mitarbeiter zu richten.
   HINWEIS: Die in diesem Protokoll verwendete Tätowiermaschine funktioniert am besten zwischen 6,0 und 9,0 V, dies kann jedoch zwischen Tätowiermaschinen und Spannungsversorgungen variieren und sollte empirisch bestimmt werden.
4. Füllen Sie die Kappe eines 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchens oder eines bereitgestellten Kunststoff-Tintenfasses mit schwarzer Tätowierfarbe zu etwa drei Vierteln.

2. Anästhesie

1. Bereiten Sie die Anästhesie in einem Tank vor, der groß genug ist, um ein erwachsenes Weibchen X. laevis Frosch zu tauchen.
   1. Mit froschfestem (chlorfreiem) Wasser Tricain bis zur Endkonzentration von 1,5 g/l und Natriumbicarbonat bis zur Endkonzentration von 3,5 g/l hinzufügen. Der pH-Wert dieser Lösung beträgt 7,15.
      ACHTUNG: Tricain ist ein Reizstoff.
2. Tauchen Sie einen Frosch in den Anästhesietank. Stellen Sie sicher, dass der Strahl bis zur Betäubung (7-8 Minuten) in die Tricainlösung eingetaucht bleibt.
   1. Um zu überprüfen, ob der Frosch vollständig betäubt ist, heben Sie ihn auf, halten Sie ihn auf den Kopf und drücken Sie ihn fest auf einen Fuß. Wenn der Frosch nicht zusammenzuckt oder reagiert, kann er sich tätowieren lassen.
   2. Wenn Frösche durchweg länger als 10 Minuten brauchen, um betäubt zu werden, bereiten Sie frische Tricainlösung vor, die mit Natriumbicarbonat gepuffert ist.
      HINWEIS: Frösche sollten nicht länger als 30 Minuten in Tricainlösung¹⁵ verbringen.

3. Tätowieren

HINWEIS: Bevor Sie ein lebendes Tier tätowieren, kann es nützlich sein, an einem Stück Obst mit fester Schale (z. B. einer Zitrone oder Banane) zu üben.

1. Bereite vor dem Tätowieren einen Auffangtank für die Frösche vor. Füllen Sie einen Tank mit 10-15 l frischem froschsicherem Wasser und fügen Sie eine Styroporinsel hinzu. Dies bietet dem Frosch eine Oberfläche, auf der er aufwachen kann, ohne zu ertrinken.
   HINWEIS: Eine Styroporinsel kann mit dem Deckel eines Styropor-Kalttransportbehälters hergestellt werden, der in einem Beutel mit Reißverschluss platziert ist.
2. Legen Sie den betäubten Frosch auf den Rücken auf ein trockenes Papiertuch oder Bankpapier (Abbildung 3A). Verwenden Sie ungebleichte (braune) Papiertücher für alle Arbeiten, bei denen Frösche zu tun haben.
3. Wischen Sie mit einem trockenen, fusselfreien Tuch das Wasser und den Schleim von der Brust des Frosches ab.
4. Finde das Brustbein mit den Fingern in der Mitte der Brust des Frosches und halte die Haut mit der nicht dominanten Hand straff.
5. Markieren des Frosches
   1. Halten Sie die zusammengebaute Tätowierpistole senkrecht relativ zur Arbeitsfläche und tauchen Sie die Nadel in die Tinte (Abbildung 3B).
   2. Halten Sie die zusammengebaute Tätowierpistole senkrecht und drücken Sie die Nadelspitze auf die Haut des Frosches, bevor Sie das Fußpedal drücken. Zeichnen Sie Linien auf die Haut des Frosches und üben Sie dabei gleichmäßigen Druck aus.
      HINWEIS: Leichte Blutungen oder Rötungen sind normal, ebenso wie leichte Hautschuppungen.
   3. Wenn sich die Nadel an der Haut des Frosches verfängt, entfernen Sie überschüssige Tinte oder Haut mit einem Tuch von der Nadel. Überschüssige Tinte ist beim Tätowieren normal.
   4. Wenn die Brust des Frosches mit zu viel Tinte bedeckt ist, um den markierten Bereich deutlich zu sehen (Abbildung 3C), entfernen Sie überschüssige Tinte mit froschsicherem Wasser und einem Tuch (Abbildung 3C'). Dann die Feuchtigkeit mit einem trockenen Tuch ableiten und mit dem Einfärben fortfahren.
      HINWEIS: Vor dem Tätowieren kann eine Quetschflasche mit froschsicherem Wasser vorbereitet werden.
   5. Fahren Sie mit der Tinte im selben Bereich fort, bis nach dem Abwischen der überschüssigen Tinte dunkle, lesbare Zahlen übrig bleiben (Abbildung 3D). Anstatt die gesamte Markierung oder Zahl in einem Strich zu zeichnen, machen Sie immer wieder kleinere Striche, insbesondere bei Kurven.

4. Wiederherstellung

1. Befeuchten Sie ein Papiertuch mit froschsicherem Wasser und legen Sie es flach auf die Styroporinsel (Abbildung 4A).
2. Rückführung von Fröschen in stehende Becken
   1. Legen Sie den Frosch mit dem Bauch nach unten auf das Handtuch mit dem Gesicht zum Wasser (Abbildung 4B). Falten Sie die Hälfte des Papiertuchs über die hintere Hälfte des Frosches und befeuchten Sie mit den hohlen Händen die Oberseite des Frosches. Sobald ein Frosch aus der Narkose kommt (ca. 1 h nach dem Tätowieren), geht er selbstständig ins Wasser und schwimmt normal.
   2. Bringen Sie die Frösche nach 24 Stunden in die Langzeithaltung zurück, sobald die Tätowierung vollständig verheilt ist.

5. Reinigung und Wartung der Geräte

1. Wiederverwendung und Autoklavieren von Tätowiernadeln
   1. Spülen Sie die Nadeln mit 100 % Isopropanol und entionisiertem Wasser aus, um die Tinte zu lösen und die verbleibende Tinte, die sich nicht aufgelöst hat, abzuschrubben.
   2. Legen Sie die Nadeln nach dem Schrubben in ein Autoklaviergehäuse aus Metall oder wickeln Sie sie mit Aluminiumfolie ein und autoklavieren Sie sie 30 Minuten lang im Trockengang.
2. Wenn sich Tinte auf Teilen der Tätowiermaschine oder anderer Geräte befindet, wische sie mit 100% Ethanol und einem Papiertuch ab.
3. Die Anästhesielösung hat eine endgültige Tricainkonzentration von ca. 0,5%. Entsorgen Sie diese gemäß den Richtlinien der institutionellen Entsorgung gefährlicher Abfälle.
4. Lagerung und Wartung der Ausrüstung
   1. Wenn möglich, lagere die Tätowiermaschine in einem trockenen Raum. Übermäßige Feuchtigkeit beschädigt die elektrischen Komponenten und verringert die Langlebigkeit der Maschine.
   2. Um die Tätowiermaschine in gutem Zustand zu halten, überprüfen Sie das Lager am Rotor (Abbildung 2C), um sicherzustellen, dass es sich nicht durch Vibrationen²² gelöst hat. Dieser kann mit einem Inbusschlüssel oder Inbusschraubendreher festgezogen werden.
   3. Schmieren Sie etwa einmal im Monat das Lager am Rotorarm mit einem dickflüssigen Schmierfett²².
   4. Bei einigen Tätowiermaschinen kann der Rotorarm stecken bleiben und vibriert nicht. Um dies zu korrigieren, drehen Sie den Rotorarm oder drücken Sie die Feder so zusammen, dass sich die Nadel in der abgesenkten Position befindet (Abbildung 2C).

Ergebnisse

Hochwertige Tätowierungen haben dunkle, lesbare Striche auf der Brust des Frosches und können aus mehreren Metern Entfernung deutlich unterschieden werden (Abbildung 5A). Im Allgemeinen sind größere Zahlen und Markierungen besser für die Lesbarkeit, aber längere Namen und Nummern können kleiner gemacht werden, damit sie bequem auf die Brust des Frosches passen. Die Langlebigkeit von Tätowierungen ist schwieriger zu beurteilen, aber hochwertige Frosch-Tattoos sollten mindestens 3-6 Monate lang dunkel und lesbar bleiben (Abbildung 5D-D'). Sobald ein Tattoo verblasst ist, kann es mit der gleichen Technik ausgebessert werden.

Eine schlechte Technik schadet den Tieren nicht, kann aber zu Tätowierungen führen, die schnell verblassen (Abbildung 5B), was zu häufigeren Nachbesserungen führt. Übereifriges Tätowieren kann zu Blutungen und Rötungen führen, und einen Frosch in eine falsche stabile Seitenlage zu bringen, kann zum unbeabsichtigten Ertrinken führen.

Die Qualität der Tätowierungen und die Wirksamkeit der Technik können in den Monaten nach der Tätowierung beurteilt werden (Abbildung 5E). Solange sich nach der Erholungsphase Tinte auf dem Frosch befindet, gilt eine Tätowierung als erfolgreich.

Abbildung 1: Protokoll-Workflow und Bench-Setup. (A) Workflow und Timing. (1) Frösche verbringen 7-8 Minuten damit, in einer Lösung aus 1,5 g/l Tricain und 3,5 g/l Natriumbicarbonat, pH 7,15, gelöst in froschsicherem Wasser, betäubt zu werden. Während ein Frosch tätowiert wird, kann ein zweiter Frosch an Deck im Anästhesiebecken platziert werden. Es kann jeweils nur ein Frosch in Tricainlösung sein. (2) Frösche verbringen etwa 10 Minuten außerhalb des Wassers, um tätowiert zu werden. Die Zeit hängt von der Größe der Tätowierung und der Erfahrung des Laborpersonals ab. (3) Bewusstlose Frösche werden für 30-45 min auf Styropor gelegt, um ein Ertrinken zu verhindern, und mit einem nassen Papiertuch abgedeckt, damit sie nicht austrocknen. (4) Nach dem Tätowieren erholen sich Frösche 24 Stunden lang in frischem, froschsicherem stehendem Wasser. Sobald sie sich erholt haben, können die Frösche in ihre Kolonie zurückgebracht werden. (B) Aufbau einer Werkbank für einen Beispielarbeitsbereich. Der Tätowierarbeitsplatz, ein ungebleichtes Papiertuch, befindet sich in der Mitte der Bank. Die Tattoo-Maschine und die Spannungsversorgung befinden sich links neben dem Papiertuch. Diese werden auf der dominanten Seite des Personals platziert (das Personal ist Linkshänder). Ein Tintenfass und Tätowierfarbe werden in der Nähe der Spannungsversorgung und außerhalb des Tätowierarbeitsbereichs platziert. Das Fußpedal befindet sich auf der gleichen Seite wie die Spannungsversorgung. Durch Drücken dieses Fußpedals wird die Drehbewegung gesteuert. Fusselfreie Tücher und eine Quetschflasche mit froschsicherem Wasser befinden sich rechts neben dem Papiertuch. Diese werden verwendet, um überschüssige Tinte von der Haut des Frosches während des Tätowierens zu entfernen. Ein Inbusschlüssel wird verwendet, um Schrauben in der Tätowiermaschine festzuziehen und zu lösen. Diese dient zum Auf- und Abbau der Tätowiermaschine. Der Anästhesietank und zusätzliche Papiertücher werden während des Tätowierens ebenfalls auf der Bank aufbewahrt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Montage der Tätowiermaschine. (A) Bild der zerlegten Tätowiernadel, des Griffs und der zugehörigen Komponenten. Die Schrauben am Metallgriff sind rot eingekreist. (B) Bild der Tätowiernadel, die ordnungsgemäß in den Griff eingebaut ist. (C) Bild der Tätowiernadel und des Griffs, die in die Tätowierpistole eingebaut sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Positionierungs- und Referenzbilder für das Tätowieren von Fröschen. (A) Bild eines Frosches, der mit dem Gesicht nach oben auf einem Papiertuch liegt. Der Pfeil zeigt auf das Brustbein des Frosches. (B) Bild des Laborpersonals, das den Frosch einfärbt. (C) Bilder von Zahlen während der Freihandeingabe, vor (C) und nach dem Abwaschen von (C') überschüssiger Tinte. (D) Bild der Frosch-Tätowierung unmittelbar nach dem Einfärben, vor der Wiederherstellung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Erholung nach der Tätowierung. (A) Styroporinsel. Der Deckel der Styropor-Eisbox befindet sich in einer Tasche mit Reißverschluss. (B) Frösche in der Ruheposition nach dem Tätowieren. Styroporinseln können in der Regel 1 oder 2 Frösche beherbergen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Beispiele für repräsentative Ergebnisse. (A) Eine frische Tätowierung 24 Stunden nach der Tätowierung. (B) Techniken von schlechter Qualität. In (B) war die Tätowiermaschine nicht richtig zusammengebaut, aber immer noch in der Lage, sich zu drehen. Dieses Foto wurde 4 Monate nach dem Tätowieren aufgenommen. In (B') war die Tätowiermaschine nicht ordnungsgemäß zusammengebaut und nicht in der Lage, sich zu drehen. Dieses Foto wurde 6 Monate nach dem Tätowieren aufgenommen. (C) Unsachgemäß montierte Tätowiermaschine. Das Metallrohr und die Kunststoffspitze sind nicht vorhanden, und der Metallgriff ist nicht richtig am Rest der Tätowiermaschine befestigt. Das Gummiband beeinträchtigt die Drehbewegung (D) Vor (D) und nach (D') eines Frosches, der mit guter Technik und richtiger Ausrüstung tätowiert wurde. (D) wurde unmittelbar nach dem Tätowieren eingenommen und (D') wurde 4 Monate nach dem Tätowieren eingenommen. (E) Quantitative Daten zu den Ergebnissen des Froschtätowierens. Von den tätowierten Fröschen hatten 100 % sofort nach dem Tätowieren sichtbare Tätowierungen, 100 % 24 Stunden nach dem Tätowieren und 91 % 4 Monate nach dem Tätowieren. n = 58 Frösche. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Das Tätowieren von Menschen ist eine Kunstform, die Tausende von Jahren zurückreicht, und solange Menschen sich selbst tätowiert haben, haben sie auch Tiere tätowiert oder gebrandmarkt²³. Die Ausrüstung und die Techniken zur Markierung von Tieren, insbesondere von Säugetieren, sind gut etabliert, gut dokumentiert und allgemein zugänglich. Während die Kennzeichnung von Tieren ursprünglich zur Unterscheidung von Nutztieren und zur Abschreckung von Diebstahl diente²³, ist ihre Rolle in der biomedizinischen Forschung ebenso wichtig geworden.

Ein Vorteil des Tätowierens von Amphibien besteht darin, dass Tätowierungen innerhalb von 24 Stunden abheilen und gute Tätowierungen mehrere Monate halten (Abbildung 5D'). Das Tätowieren bietet mehrere Vorteile für die Unterbringung und Haltung von Amphibien. Tätowierungen ermöglichen es Forschern und Veterinärpersonal, einzelne Tiere anhand von Zahlen zu unterscheiden, die selbst in Becken mit dunkleren Tönungen leicht zu erkennen und zu interpretieren sind¹⁹. Dieses Verfahren kann auch bei jedem erwachsenen Frosch durchgeführt werden, im Vergleich zu Hauttransplantationen, die für Frösche über 2 Jahre¹⁵ Jahre nicht empfohlen werden. Am wichtigsten ist, dass das Tätowieren die Identifizierung einer großen Anzahl von Tieren ermöglicht, wobei mindestens drei Ziffern bequem auf die Brust von X. laevis passen (Abbildung 5A).

Im Vergleich zum Anbringen von Perlen oder Tags hinterlässt das Tätowieren nichts, was abfallen könnte, und verursacht nur begrenzte Irritationen¹⁷. Darüber hinaus ist das Tätowieren vielseitiger als andere Branding-Techniken, bei denen ein Draht in die Marke eingearbeitet werden muss. Das Verfahren selbst ist viel weniger störend als Hautautotransplantate, da kein Gewebe entfernt wird. Wie Autotransplantate ist auch das Tätowieren teilweise invasiv und birgt ein geringes Verletzungs- oder Infektionsrisiko. Dies ist ein notwendiger Teil der Markierung eines Tieres, aber es ist wichtig für Forscher, sich vor übermäßigen Blutungen während des Tätowierens zu hüten und die Tiere auf eine A.-Hydrophilie-Infektion zu überwachen. Dies kann verhindert werden, indem vor, während und nach dem Tätowieren ein sauberer Arbeitsplatz aufrechterhalten wird und sichergestellt wird, dass die Tätowierungen vollständig verheilt sind, bevor die Tiere in ihre Kolonie zurückgebracht werden. Beim Schreiben und Entwickeln dieser Arbeit wurde keiner der Frösche dauerhaft verletzt oder starb an den Folgen des Tätowierens. Eine Einschränkung dieses Verfahrens besteht darin, dass es nur an erwachsenen Fröschen getestet wurde, die älter als 1 Jahr sind. Bisher wurden noch keine Frösche mit diesem Protokoll tätowiert. Darüber hinaus ist dieses Verfahren nicht für X. tropicalis optimiert, die eine dunkle Färbung auf der Brust aufweisen und Tätowierungen weniger erkennbar machen²¹. In Zukunft kann dieses Tätowierungsprotokoll aktualisiert werden, um Überlegungen zu X. tropicalis aufzunehmen.

Da der Lebensraum von Xenopus aquatisch⁴ ist, ist es normal, dass diese Tattoos mit der Zeit verblassen. Die Notwendigkeit, Tätowierungen häufig zu ersetzen, wird bei menschlichen Lippentätowierungen im Mund dokumentiert, die aufgrund des ständigen Kontakts mit Speichel und Getränken schneller verblassen als epidermale Tätowierungen²⁴. Die Langlebigkeit eines Tattoos hängt jedoch maßgeblich von der Tätowiertechnik ab. Eine schlechte Technik kann von einer unsachgemäß zusammengebauten Tätowiermaschine (Abbildung 4C) oder suboptimalen Spannungsversorgungseinstellungen herrühren. Eine zu niedrige Spannung verhindert, dass die Nadel in die Haut eindringt, was zu schwachen Flecken oder Linien führt. Wenn Sie die Spannung zu hoch einstellen, wird das Tier unnötig geschädigt. Eine weitere häufige Ursache für schlechtes Tätowieren ist die falsche Positionierung der Nadel oder der Druck, wenn das Personal die Tätowierpistole hält. Das Tätowieren mit zu wenig Druck hat den gleichen Effekt wie eine zu niedrige Spannung und führt zu einer schwachen Tätowierung, die schnell verblasst (Abbildung 5B'). Beim Tätowieren kann es sich so anfühlen, als würde die Nadel über die Haut des Frosches gleiten, anstatt sie zu durchstechen. Das Tätowieren mit zu viel Druck führt zu spürbaren oder unkontrollierbaren Blutungen. Die beste Tätowierung erfolgt geduldig und methodisch, indem man kurze Abschnitte einfärbt und die Linien mit starkem, gleichmäßigem Druck nachzeichnet.

Insgesamt überwiegen die Vorteile der Tiermarkierung durch Tätowieren bei Amphibien die Nachteile. Die individuelle Verfolgung von Xenopus in der biomedizinischen Forschung ermöglicht eine wissenschaftliche Genauigkeit bei der Verfolgung biologischer Replikate, ermöglicht es Forschern und Veterinärpersonal, das Wohlbefinden einzelner Tiere zu beurteilen, und gewährleistet eine angemessene Häufigkeit des Eisprungs, um die langfristige Gesundheit des Tieres zu erhalten. In Bezug auf die 3R der Tierforschung - Verfeinerung, Reduktion und Entfernung - ist dieses Protokoll am relevantesten für die Verfeinerung und Reduktion¹. Die Markierung von Fröschen erleichtert es Forschern und Tierärzten, gesundheitliche Bedenken zu verfolgen, und stellt sicher, dass die Frösche zwischen den Versuchen ausreichend Ruhezeit haben. Dies verfeinert den Forschungsprozess, indem es eine höhere Qualität der von Tieren gesammelten Daten und Proben gewährleistet und die Tierhaltungs- und Pflegepraktiken verfeinert. Es trägt auch dazu bei, die Reproduzierbarkeit in Experimenten zu verbessern. Darüber hinaus ermöglicht die Kennzeichnung von Tieren deren Wiederverwendung, wodurch sich die Gesamtzahl der benötigten Tiere reduziert. Frösche, die besonders hochwertige Eier legen oder für andere Versuche am nützlichsten sind, können markiert und als besser geeignet für die Forschung identifiziert werden. Sind Frösche für Experimente immer wieder nicht brauchbar, können sie identifiziert und aus der Kolonie entfernt werden, was Ressourcen und Platz spart. Der Zweck dieses Artikels ist es, Best Practices bei der Amphibientätowierung zu dokumentieren und Xenopus-Laboren ein detailliertes, leicht zugängliches Tätowierungsprotokoll zur Verfügung zu stellen. Diese Praxis ist im Xenopus-Bereich noch nicht üblich, was zum Teil daran liegt, dass die vorhandenen veröffentlichten Ressourcen begrenzt sind. Diese Ressource wird es Forschern ermöglichen, Tiere sicher und effektiv zu markieren, die Aufzeichnungen für große Kolonien zu verbessern und den Einsatz von Amphibien in der biomedizinischen Forschung zu verfeinern.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
3 Nadel Rundliner	Worldwide Tattoo Supply	1203RLB	Verpackt steril
5 Nadel Rund Einweg ULTRA	Worldwide Tattoo Supply	HTIPRS5-U	Verpackt steril
5 Nadel Rundliner	Worldwide Tattoo Supply	1205RLB	Verpackt steril
7 Nadel Rundliner	Worldwide Tattoo Supply	1207RLB	Verpackt steril
Clip Cord	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Fußpedal	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Tintenfässer	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Kimwipes, zarte Arbeitstücher	Fisher Scientific	06-666A
RCA Connection	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Scream Ink Pitch Black, 1oz	Worldwide Tattoo Supply	SI101
Natriumbicarbonat (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761
Edelstahl Griffe	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Stealth 2.0 Rotary Tattoo Machine	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Stealth 2.0 Rotary Tattoo Machine Box Set	Worldwide Tattoo Supply	STEALTH2-SET
Styroporinsel	N/A	N/A	Dies ist der Deckel eines Styropor-Kühlbehälters
Tricain (Ethyl-3-aminobenzonat-Methansulfat)	Sigma-Aldrich	E10521	ACHTUNG: REIZEND
Ungebleichte Papierhandtücher	Grainger	2U229	Papierhandtücher MÜSSEN ungebleicht sein, Bleiche ist giftig für Amphibien
Spannungsversorgung	Weltweit Tattoo Versorgung	N/A
Waschflasche (mit froschsicherem Wasser)	Fisher Scientific	FB0340923T	froschsicheres Wasser ist entchlort, pH 7,0-8,5, Leitfähigkeit 1200-1800 uS
X. laevis erwachsenes weibliches	Xenopus1	N/A
Plastiktüte mit Reißverschluss	N/A	N/A Diese	Tasche sollte groß genug sein, um die Styroporinsel aufzunehmen