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Methodenartikel

Robuste mitochondriale Isolierung aus Herzgewebe von Nagetieren

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DOI:

10.3791/67093

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23. August 2024

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1Department of Physiology, Michigan State University, 2Department of Kinesiology, Michigan State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Bioenergetische und metabolomische Studien an Mitochondrien haben ihre facettenreiche Rolle bei vielen Krankheiten gezeigt, aber die Isolierungsmethoden für diese Organellen variieren. Die hier beschriebene Methode ist in der Lage, hochwertige Mitochondrien aus mehreren Gewebequellen zu reinigen. Die Qualität wird durch Atemkontrollverhältnisse und andere Metriken bestimmt, die mit hochauflösender Respirometrie bewertet werden.

Zusammenfassung

Die mitochondriale Isolierung wird seit Jahrzehnten praktiziert, nach Verfahren, die von Pionieren auf dem Gebiet der Molekularbiologie und Biochemie entwickelt wurden, um metabolische Beeinträchtigungen und Krankheiten zu untersuchen. Eine gleichbleibende mitochondriale Qualität ist notwendig, um die mitochondriale Physiologie und Bioenergetik richtig zu untersuchen; Für Forschende stehen jedoch viele verschiedene veröffentlichte Isolationsmethoden zur Verfügung. Obwohl unterschiedliche experimentelle Strategien unterschiedliche Isolationsmethoden erfordern, sind die Grundprinzipien und Verfahren ähnlich. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, die in der Lage ist, gut gekoppelte Mitochondrien aus einer Vielzahl von Gewebequellen, einschließlich Kleintieren und Zellen, zu extrahieren. Zu den skizzierten Schritten gehören die Organdissektion, die mitochondriale Reinigung, die Proteinquantifizierung und verschiedene Qualitätskontrollen. Die primäre Qualitätskontrollmetrik zur Identifizierung hochwertiger Mitochondrien ist das Respiratory Control Ratio (RCR). Die RCR ist das Verhältnis der Atemfrequenz während der oxidativen Phosphorylierung zur Rate in Abwesenheit von ADP. Alternative Metriken werden diskutiert. Während mit diesem Protokoll hohe RCR-Werte im Verhältnis zu ihrer Gewebequelle erzielt werden, können mehrere Schritte optimiert werden, um den individuellen Bedürfnissen der Forscher gerecht zu werden. Dieses Verfahren ist robust und hat durchweg zu isolierten Mitochondrien mit überdurchschnittlichen RCR-Werten in Tiermodellen und Gewebequellen geführt.

Einleitung

Mitochondrien sind subzelluläre Organellen, die zytoplasmatische energetische Bedingungen schaffen, die für bestimmte Zellfunktionen optimiert sind. Während Studien auf Zell-, Gewebe- und Organismusebene Einblicke in die mitochondriale Funktion geben können, bietet die Isolierung der Organellen ein Maß an experimenteller Kontrolle, das sonst nicht möglich wäre. Mitochondriale Isolierungen werden seit den 1940er Jahren durchgeführt, was mechanistische Untersuchungen des Stoffwechsels und der Atmung in einer Vielzahl von Zellen und Geweben ermöglicht 1,2. Die historische Bedeutung der Mitochondrien ist ebenfalls gut dokumentiert3. Als Hauptproduzenten von ATP spielen die Mitochondrien viele Schlüsselrollen, die für eine optimale Zell- und Organfunktion von entscheidender Bedeutungsind 4. Innerhalb der mitochondrialen Matrix werden Substrate durch den TCA-Zyklus oxidiert, wodurch reduzierende Äquivalente und mobile Elektronenträger wie NADH und UQH2 5,6 entstehen. Cytochrom C ist der dritte mobile Hauptelektronenträger im mitochondrialen biochemischen Reaktionsnetzwerk7. Diese Moleküle werden dann durch die Transmembrankomplexe des Elektronentransportsystems (ETS) oxidiert, die in die innere Mitochondrienmembraneingebettet sind 8. Redoxreaktionen des ETS sind gekoppelt mit der Protonentranslokation von der Matrix in den Intermembranraum. Diese Prozesse etablieren einen elektrochemischen Protonengradienten, der verwendet wird, um ADP mit Pi durch F1F0 ATP-Synthase zu phosphorylieren und ATP 9,10 zu produzieren. Die einzelnen Prozesse, die an jedem Komplex ablaufen, können mit hochauflösender Respirometrie unter Verwendung von Clark-Elektroden oder Mikrotiterplatten-Sauerstoffverbrauchsassays untersucht werden11,12. Darüber hinaus können Krankheitsmodelle und Behandlungen mit isolierten Mitochondrien den Einfluss oder die Bedeutung der Mitochondrienfunktion beim Fortschreiten bestimmter Pathologien bestimmen. Dies hat sich im Bereich der Kardiologie als fruchtbar erwiesen, wo Veränderungen in der Kraftstoff- und Substratzufuhr verwendet wurden, um aufzuklären, wie mitochondriale Dysfunktion die Herzinsuffizienz beeinflusst 13,14,15,16. Es ist auch bekannt, dass Mitochondrien die Entwicklung anderer Krankheitszustände wie Diabetes, Krebs, Fettleibigkeit, neurologische Störungen und Myopathien beeinflussen17,18. Daher ermöglicht die Verwendung von isolierten oder gereinigten Mitochondrien mechanistische Untersuchungen des oxidativen Stoffwechsels und der ATP-Produktion im Ausgangsgewebe.

Es gibt keinen Mangel an mitochondrialen Isolationsprotokollen, da sie für die bioenergetische Forschung wichtig sind. Darüber hinaus finden sich hochspezifische Methoden, die auf Subpopulationen von Mitochondrien in Geweben und Zellen zugeschnitten sind19,20. Die grundlegenden Verfahrensschritte sind bei den Isolierungsmethoden ähnlich, aber es können Variationen an der Pufferzusammensetzung, den Homogenisierungsschritten und den Zentrifugationsdrehungen vorgenommen werden, um die Menge und Qualität der Mitochondrien zu verbessern. Änderungen dieser Aspekte beruhen auf dem metabolischen Bedarf des Gewebes, der allgemeinen Organfunktion, der mitochondrialen Dichte und anderen Faktoren. In Geweben wie der Leber und der Skelettmuskulatur werden tragbare Homogenisatoren verwendet, um die mitochondriale Integrität zu erhalten und die Schädigung der mitochondrialen Membranen zu begrenzen21. Bei der Isolierung aus der Niere wird jedoch in einigen Protokollen die Verwendung einer manuell angetriebenen Homogenisierung oder kommerzieller Kits empfohlen, um bessere Ergebnisse zu erzielen22. Obwohl beide Methoden funktionelle Mitochondrien liefern, kann die Qualität der Organellen durch die zusätzliche Zeit, die für die Durchführung der Isolierungen mit diesen Protokollen benötigt wird, beeinträchtigt werden. Die Zentrifugation ist auch für die Extraktion von mitochondrialem Protein von entscheidender Bedeutung, da sie zelluläre Bestandteile wie Zellkerne und andere Organellen von den Mitochondrien trennt23. Während des Isolierungsprozesses wird diskutiert, ob eine differentielle oder eine dichtebasierte Zentrifugation durchgeführt werden sollte, um reinere Isolatezu erhalten 24. Während die Dichtezentrifugation Mitochondrien von Organellen mit ähnlichem spezifischem Gewicht, wie z. B. Peroxisomen, trennen kann, ist es nicht gut etabliert, ob Mitochondrien aus diesen Methoden die In-situ-Organellenfunktion besser repräsentieren als Mitochondrien, die durch differentielle Zentrifugation isoliert wurden. Im Bereich der mitochondrialen Physiologie wird die dichtebasierte Zentrifugation bevorzugt und kann leicht verändert werden, um die Reinheit des Isolats zu erhöhen. Ob Änderungen der g-Kräfte, der Zentrifugationsdauer und der Anzahl der Zentrifugationsumdrehungen berücksichtigt werden, sollte aufgrund ihres Einflusses auf die mitochondriale Reinigung vor dem Versuch berücksichtigt werden. Darüber hinaus unterscheidet sich die mitochondriale Resuspension, der wohl wichtigste Schritt während der Isolierung, stark zwischen den Studien, wobei Schaben, wirbelbasiertes Mischen oder Homogenisieren verwendet werden 23,25,26. Eine mechanische Resuspension dieser Art kann zu abrasiv sein und die Membranintegrität der Mitochondrien beeinträchtigen. Aus diesem Grund sollte eine schonende Wäsche durchgeführt werden, um dies zu korrigieren. Trotz der Fülle an Modulationen und vorgeschlagenen Methoden gibt es weniger umfassende Protokolle mit hoher Reproduzierbarkeit und Anpassungsfähigkeit für Nagetiermodelle.

Die hierin beschriebenen Verfahren skizzieren ein detailliertes, robustes und hochgradig reproduzierbares Protokoll, das gereinigte, gut gekoppelte Mitochondrien aus kleintierischem Herzgewebe liefert. Wie gezeigt, kann diese Methode leicht an die spezifischen Anforderungen jedes Experiments und/oder jeder Laborumgebung angepasst werden, um Mitochondrien aus Nieren, Leber und kultivierten Zellen zu isolieren. Weitere Modifikationen können vorgenommen werden, um Mitochondrien aus Geweben und anderen Tieren zu isolieren, die hier nicht aufgeführt sind. Pufferrezepte, die für alle Isolationen verwendet werden, werden bereitgestellt und können bei Bedarf geändert werden. Ähnlich wie bei anderen veröffentlichten Protokollen werden die motorisierte Homogenisierung und die differentielle Zentrifugation implementiert; Je nach Isolationsquelle werden jedoch sowohl die Scherzeit als auch die Kraft, mit der die Proben zentrifugiert werden, angepasst, um gleichbleibend hochwertige mitochondriale Isolate zu liefern. Bemerkenswert ist, dass sich dieses Protokoll von anderen durch sanftes Waschen durch Pipettieren unterscheidet, um pelletierte Mitochondrien zu resuspendieren, was dazu beiträgt, die Integrität der Mitochondrienmembran zu erhalten und die Gesamtfunktionalität der Organellen zu erhalten. Die Quantifizierung des mitochondrialen Proteins erfolgt entweder durch Bestimmung des Gesamtproteins oder durch Messung der Citratsynthase-Aktivität. Der Nutzen und die breite Anwendbarkeit dieser Isolationsmethode werden durch die Werte der Atemkontrollverhältnisse (RCR) unterstützt, die über verschiedene Organismen und Gewebequellen hinweg erreicht wurden.

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Protokoll

Die Verwendung und Behandlung aller Wirbeltiere erfolgte in Übereinstimmung mit genehmigten Protokollen, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der Michigan State University überprüft und akzeptiert wurden. Dieses Protokoll wurde sowohl mit männlichen als auch mit weiblichen Hartley-Albino-Meerschweinchen und Sprague Dawley (SD)-Ratten entwickelt. Für die Isolierung von Herzmitochondrien aus Meerschweinchen wurden Tiere im Alter zwischen 4 und 6 Wochen (300-450 g) getötet. Herzmitochondrien von SD-Ratten beiderlei Geschlechts wurden im Alter von 10-13 Wochen (250-400 g) gewonnen. Rezepte für Puffer sind in Tabelle 1 beschrieben und sollten im Voraus vorbereitet werden. Einzelheiten zu den in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung der Versuche

  1. Bevor Sie mit der Isolierung beginnen, beschriften Sie zwei 50-ml-Zentrifugationsröhrchen mit "Spins 1 und 2" und "Spin 3".
  2. Legen Sie die Röhrchen, den frisch aufgetauten Isolationspuffer (IB), die scharfe Hackschere, die zusammengebaute Homogenisierungssonde und ein 5-ml-Becherglas oder einen Behälter gleicher Größe auf Eis.
  3. Legen Sie den frisch aufgetauten Respirationspuffer (RB) in einen Inkubator, um ihn für nachfolgende Atemuntersuchungen zu erwärmen.
  4. Eine gekühlte Zentrifuge auf 4 °C vorkühlen.
  5. Stellen Sie sicher, dass alle Geräte angeordnet sind und 20 μl 7-15 U/mg Protease aus Bacillus licheniformis in das Röhrchen mit der Bezeichnung "Spins 1 und 2" gegeben wurden.
  6. Richten Sie ein schwerkraftabhängiges Drucksystem für die Perfusion durch Kanülierung mit Kardioplegiepuffer (CB, Tabelle 1), Glaskanüle und Kunststoffschlauch mit angeschlossenem Absperrhahnventil ein.
  7. Ordnen Sie chirurgische Instrumente an und fügen Sie eine geeignete Schere und Pinzette für die Dissektion und Kanülierung des Herzens hinzu.
    HINWEIS: Das gesamte Wasser sollte von reiner Qualität sein (18,2 MΩ cm)

2. Dissektion des Gewebes

  1. Injizieren Sie Tieren steriles Heparinsulfat intraperitoneal in einer Dosis von 500 U/kg.
  2. Lassen Sie das Tier nach der Heparinverabreichung 15 Minuten in der Induktionskammer sitzen. Während dieser Zeit ist 2 l/min reinesO2-Gas zuzuführen, um die Tiere vollständig mit Sauerstoff zu versorgen, sie zu beruhigen und Stress zu minimieren, der nachteilige Auswirkungen auf das interessierende Gewebe haben kann.
  3. Beginnen Sie die Anästhesieeinleitung mit einem kontinuierlichen Fluss von Isofluran bei 0,5%. Nach 1 Min. auf 1% erhöhen. Erhöhen Sie die Geschwindigkeit jede Minute um 1 %, bis 5 % erreicht sind. Sobald Sie bei 5 % sind, warten Sie 1 Minute und überwachen Sie das Atemmuster des Tieres.
  4. Sobald sich die Atmung verlangsamt hat und mühsam wird (ungefähr bei der 6,5-Minuten-Marke), schalten Sie den Isofluran- und Sauerstofffluss aus.
  5. Nehmen Sie das Tier schnell aus der Induktionskammer und prüfen Sie, ob die Anästhesietiefe angemessen ist, indem Sie eine Pfote zusammendrücken und auf den Hornhautreflex prüfen. Wenn das Tier auf einen der beiden Reize reagiert, setzen Sie es zurück in die Induktionskammer, verabreichen Sie die Anästhesie und wiederholen Sie die Narkosetiefenkontrolle.
  6. Sobald die richtige Narkosetiefe erreicht ist, enthaupten Sie schnell mit einer Guillotine, um die Halswirbelsäule zu belasten und den liegenden Körper auf Eis zu legen.
  7. Machen Sie zwei parallele vertikale Schnitte von den Schlüsselbeinen, die entlang des lateralen Brustkorbs über die Länge des Brustkorbs verlaufen. Stellen Sie sicher, dass die Schnitte tief genug sind, um die Rippen am lateralen Thorax zu durchschneiden, aber vermeiden Sie es, intrathorakale Strukturen wie das Herz oder große Gefäße zu beschädigen.
    HINWEIS: Die Größe der vertikalen Schnitte hängt vom verwendeten Tier ab. Bei Verwendung von Meerschweinchen und Ratten bis zum Zwerchfell schneiden (ca. 6,35 cm bei Ratten und 11 cm bei Meerschweinchen). Wenn Sie Mäuse verwenden, führen Sie eine Standard-Thorakotomiedurch 27.
  8. Legen Sie das Herz mit einem Blutstiller frei, um den vorderen Thorax zu verlagern, und füllen Sie die freiliegende Brusthöhle mit Eis. Dieser Schritt minimiert die warme Ischämiezeit und verbessert die Lebensfähigkeit der isolierten Organellen.
  9. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Thymus und das Perikard stumpf zu zerlegen und das Herz vollständig freizulegen.
  10. Üben Sie mit einer Pinzette einen sanften Zug auf das Herz aus, um die Aorta freizulegen und zu identifizieren. Die Aorta ist das dickste große Gefäß, das sich von der Basis des Herzens verzweigt. Andere große Gefäße, wie zum Beispiel die Lungenvene, sind deutlich durchsichtiger als die Aorta.
  11. Schneiden Sie die Aorta etwa 4-6 mm oberhalb der Aortenwurzel, aber unterhalb der Verzweigungspunkte der Halsschlagadern ab.
  12. Die Aorta wird kanüliert und das Herz28,29 mit eiskalter Kardioplegielösung (CB) unter Verwendung eines schwerkraftabhängigen Druckkopfes perfundiert, bis die Koronararterien vom Blut befreit sind und das Organ blanchiert erscheint.
    HINWEIS: Für große Nagetiere eignet sich ein Kanülendurchmesser von 1,8-2,2 mm gut, während für kleinere Nagetiere ein Durchmesserbereich von 1,4-1,8 mm empfohlen wird. Die Retroperfusion sollte nicht länger als 15-30 s dauern, bis sich die Herzkranzgefäße vom Blut befreit haben.
  13. Isolieren Sie das ventrikuläre Myokard, indem Sie die Vorhöfe, das knorpelige Klappengewebe und das Fettgewebe präparieren.
  14. Legen Sie die Ventrikel in ein vorgekühltes 10-ml-Becherglas mit 0,1-0,2 mL eiskaltem IB.
  15. Schneiden Sie das Gewebe mit einer scharfen chirurgischen Schere bis zu einer Größe von ca. 1 mm3.

3. Mitochondriale Reinigung und Proteinquantifizierung

  1. Das zerkleinerte Gewebe wird in das vorgekühlte Zentrifugenröhrchen mit der Bezeichnung "Spins 1 und 2" überführt, das die Proteaselösung enthält.
  2. Fügen Sie eiskaltes IB zu einem Endvolumen von 25 mL hinzu.
  3. Dispergieren Sie das Gewebe mit einem motorisierten tragbaren Rotor-Stator-Homogenisator bei 18.000 U/min für 20-25 s auf Eis.
  4. Zentrifugieren Sie homogenisiertes Gewebe in einem Röhrchen mit der Bezeichnung "Spins 1 und 2" bei 8.000 x g für 10 min bei 4 °C.
  5. Entsorgen Sie den Überstand (der Protease enthält), indem Sie ihn in die Ballonflasche gießen, und spülen Sie das Pellet vorsichtig mit 5 ml IB aus, um die verbleibende Protease zu entfernen.
  6. Nachdem Sie die Spülung verworfen haben, resuspendieren Sie das Pellet mit frischem eiskaltem IB durch sanften Vortex auf ein Endvolumen von 25 mL.
  7. Zentrifugieren Sie bei 800 x g für 10 min bei 4 °C.
  8. Entfernen Sie den Überstand (enthält Mitochondrien), indem Sie ihn vorsichtig in ein vorgekühltes 50-ml-Röhrchen mit der Aufschrift "Spin 3" gießen. Achten Sie beim Gießen darauf, dass sich der lose obere Teil des Pellets nicht löst. Alternativ kann eine Transferpipette oder Stripette verwendet werden, um den Überstand aufzufangen.
  9. Der Überstand wird bei 8000 x g 10 min bei 4 °C zentrifugiert.
  10. Entsorgen Sie den entstandenen Überstand und behalten Sie das mitochondrienhaltige Pellet.
  11. Verwenden Sie ein fusselfreies Tuch, um überschüssigen Überstand von der Innenwand des Rohrs aufzusaugen, und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören. Bewahren Sie das Pellet so weit wie möglich bei 4 °C auf Eis auf.
  12. Um die Mitochondrien zu resuspendieren, geben Sie 80 μl eiskaltes IB auf den Boden des Röhrchens. Suspendieren Sie das Pellet vorsichtig, indem Sie wiederholt IB über das Pellet waschen.
  13. Um Blasenbildung zu vermeiden, stellen Sie eine Mikropipette so ein, dass sie aspiriert und zwischen 40 und 60 μl Volumen abgibt.
  14. Wenn sich das mitochondriale Pellet dispergiert, vergrößern Sie das Volumen der Mikropipette, um die pelletierten Mitochondrien effizient zu resuspendieren. Vermeiden Sie es, das Pellet mit der Pipettenspitze zu berühren und Blasen zu bilden.
  15. Nach der Resuspendierung werden die Mitochondrien in ein vorgekühltes Mikrozentrifugenröhrchen überführt und als Stammmitochondrien gekennzeichnet. Notieren Sie sich die Gesamtlautstärke der Aufwirbelung.
  16. Um die mitochondriale Proteinkonzentration in der Probe zu bestimmen, führen Sie einen Gesamtprotein-Assay unter Verwendung der bekannten BCA- oder Bradford-Protein-Assays durch, wie in den Anweisungen des Herstellers definiert.
    HINWEIS: Eine alternative oder ergänzende Strategie zur Beurteilung der Ausbeute besteht darin, die Citratsynthase-Aktivität zu bestimmen. Als Referenz kann der mitochondriale Gehalt quantifiziert werden, indem das in Vinnakota et al.30 beschriebene Protokoll befolgt wird.

4. Qualitätskontrollen

  1. Verdünnen Sie den mitochondrialen Stamm in einem vorgekühlten Mikrozentrifugenröhrchen auf die gewünschte Arbeitskonzentration mit IB.
    HINWEIS: Mitochondriale Stämme werden auf 40 mg/ml verdünnt, um bei einer Endkonzentration von 0,1 mg/ml für Respirometrie-Assays zu arbeiten, wenn Isolate aus Herzgewebe verwendet werden.
  2. Spülen Sie Oxygraphenkammern, Stopfen und Mikroliterspritzen zehnmal mit destilliertem Wasser, um sie zu reinigen, bevor Sie sie in Respirometrie-Assays verwenden.
  3. Um die Lebensfähigkeit und Qualität von mitochondrialen Isolaten zu testen, laden Sie 2,3 ml Respirationspuffer (RB) in die Oxygraphenkammern und lassen Sie das Sauerstoffverbrauchssignal bei 37 °C für etwa 10 Minuten oder wenn die Rate nahe 0 liegt, äquilibrieren.
  4. Sobald das Signal ausgeglichen ist, drücken Sie die Stopper nach unten und saugen Sie den überschüssigen Puffer an, der aus der Kapillare des Stoppers austritt.
  5. Fügen Sie 1 mM EGTA mit einer Mikroliterspritze hinzu, um das restliche Calcium in den Puffern oder der mitochondrialen Probe zu chelatisieren.
  6. Um die Atmung anzukurbeln, fügen Sie 5 mM Natriumpyruvat und 1 mM L-Malat hinzu.
  7. Nach der Zugabe von Substraten fügen Sie einen Bolus aus verdünnten Mitochondrien hinzu, um eine Arbeitskonzentration zu erreichen, und lassen Sie die Atmung 5 Minuten lang erfolgen. Dieser Zeitraum wird als LEAK oder Beatmung des Zustands 2 bezeichnet.
  8. Fügen Sie bei der 5-Minuten-Marke einen Bolus von 500 μM ADP hinzu, um die Atmung des Zustands 3 zu initiieren, auch OXHPOS genannt, und lassen Sie die Mitochondrien bis zur Anoxie atmen.
  9. Berechnen Sie das Respiratory Control Ratio (RCR), indem Sie die maximale Rate des Sauerstoffverbrauchs während Zustand 3 durch die Rate des Sauerstoffverbrauchs kurz vor der Zugabe von ADP in Zustand 2 dividieren (siehe Abbildung 1).
    HINWEIS: Ein alternativer RCR-Ausdruck von 1 - 1/RCR kann auch als Qualitätsmetrik verwendet werden, die zwischen 0 und 1 begrenzt ist. Es ist jedoch schwierig, die Qualität anhand dieser Metrik zu unterscheiden, wenn die RCR 10 > (siehe Abbildung 2).
  10. Spülen Sie Kammern und Stopfen 10 Mal mit reinem Wasser, um den Oxygraphen für nachfolgende Assays zu reinigen. Wenn die Respirometrie abgeschlossen ist, füllen Sie die Kammern mit 70 % Ethanol und setzen Sie die Stopfen bis zur nächsten Verwendung in die Kammern.

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Ergebnisse

Nach Abschluss der mitochondrialen Isolierung sollte die Qualität und Funktionalität der Isolate durch Quantifizierung des Sauerstoffverbrauchs (JO2) mittels hochauflösender Respirometrie getestet werden. Zu diesem Zweck wurden die mitochondrialen Stämme auf 40 mg/ml verdünnt, um Arbeitskonzentrationen von 0,1 mg/ml in 2 ml RB für alle Respirometrie-Assays mit isolierten kardialen Mitochondrien zu ermöglichen. Die Atmung wurde durch 5 mM Natriumpyruvat und 1 mM L-Malat in Gegenwart von 1 mM EGTA, eine...

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Diskussion

Die Einhaltung der in diesem Protokoll kurz beschriebenen Methoden wird die Isolierung gut gekoppelter Mitochondrien aus dem Herzgewebe kleiner Nagetiere sowie anderer Gewebetypen und -quellen gewährleisten. Insgesamt sollte der Prozess 3-3,5 Stunden dauern, während derer alle tierischen Gewebe, Proben und Isolate so weit wie möglich auf Eis bei 4 °C verbleiben sollten, um den Abbau zu begrenzen. Dieses Verfahren ist robust und kann auf verschiedene Weise geändert werden, um die experime...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass es nichts offenzulegen gibt.

Danksagungen

Wir möchten Daniel A. Beard und Kalyan C. Vinnakota für ihre grundlegenden Beiträge zu diesem Protokoll danken. Diese Arbeit wurde durch das NSF CAREER-Stipendium MCB-2237117 finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen
10 mL GlasbecherFür Organdissektion und Zerkleinerung
50 mL ZentrifugenröhrchenZentrifugation
Adenosin 5'-Diphosphat MonokaliumsalzDihydrat Sigma A5285Respirometrie-Assays
BSA-Protein-Assay-KitThermo ScentificPI23225Quantifizierung mitochondrialer Proteine
DextroseSigma DX0145Für Puffer (CB)
Ethylenglykol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-Tetraessigsäure Sigma E4378Für Puffer (CB und IB) und Respirometrie-Assays
GlaskanüleRadnotiMeerschweinchen- und Rattenherzperfusion
Heparin-Natrium-SchweineschleimhautSigma SRE0027-250KU IP-Injektionfür Tiere
Hochauflösendes RespirometerClark-Elektrode; Oxygraph mit 2 mL-Kammern
Induktionskammer
IsofluranSigma 792632Anästhetikum 
L-ApfelsäureSigma 02288-50GRespirometrie-Assays
Magnesiumchlorid-HexahydratSigma M9272Für Puffer (RB)
MannitolSigma MX0214Für Puffer (IB)
Mikroliter-SpritzenGrößen ab 5– 50 & Mikro; L
Mikroplatten-ReaderMuss in der Lage sein, bei 37 μg zu inkubieren; C 
MOPSSigma 475898Für alle Puffer
O2 Tank
OMNI THQ HomogenisatorOMNI International 12-500Ähnliche Rotor-Stator-Homogenisatoren funktionieren
mit PipettenVolumina von  2– 20 & Mikro; L; 20– 200 & Mikro; L; 200– 1000 &Mikro; L
KaliumchloridSigma P3911Für Puffer (RB und CB)
Kaliumphosphat zweibasischSigma 795496Für Puffer (IB und RB)
Protease aus Bacillus licheniformisSigma P5459
NatriumchloridSigma S9888Für Puffer (CB)
NatriumpyruvatFisher BioreagenzienBP356-100Respirometrie-Assays
SaccharoseSigma 8510-OPFür Puffer (IB)
Chirurgisches DissektionssetAbhängig von Tier- und Gewebequelle
TischzentrifugeMuss auf 4 & Grad abkühlen; C 

Referenzen

  1. Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. J Biol Chem. 172 (2), 619-635 (1948).
  2. Claude, A. Fractionation of mammalian liver cells by differential centrifugation: Ii. Experimental procedures and results. J Exp Med. 84 (1), 61-89 (1946).
  3. Ernster, L., Schatz, G. Mitochondria: A historical review. J Cell Biol. 91 (3 Pt 2), 227s-255s (1981).
  4. Martinez-Reyes, I., Chandel, N. S. Mitochondrial tca cycle metabolites control physiology and disease. Nat Commun. 11 (1), 102(2020).
  5. Vercellino, I., Sazanov, L. A. The assembly, regulation, and function of the mitochondrial respiratory chain. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 141-161 (2022).
  6. Fernie, A. R., Carrari, F., Sweetlove, L. J. Respiratory metabolism: Glycolysis, the TCA cycle and mitochondrial electron transport. Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 254-261 (2004).
  7. Kalpage, H. A., et al. Cytochrome C phosphorylation: Control of mitochondrial electron transport chain flux and apoptosis. Int J Biochem Cell Biol. 121, 105704(2020).
  8. Sousa, J. S., D'imprima, E., Vonck, J. Mitochondrial respiratory chain complexes. Subcell Biochem. 87, 167-227 (2018).
  9. Mitchell, P., Moyle, J. Chemiosmotic hypothesis of oxidative phosphorylation. Nature. 213 (5072), 137-139 (1967).
  10. Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. I. Kinetics of oxygen utilization. J Biol Chem. 217 (1), 383-393 (1955).
  11. Li, Z., Graham, B. H. Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode. Methods Mol Biol. 837, 63-72 (2012).
  12. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), e21746(2011).
  13. Bisaccia, G., Ricci, F., Gallina, S., Di Baldassarre, A., Ghinassi, B. Mitochondrial dysfunction and heart disease: Critical appraisal of an overlooked association. Int J Mol Sci. 22 (2), 614(2021).
  14. Zhou, B., Tian, R. Mitochondrial dysfunction in pathophysiology of heart failure. J Clin Invest. 128 (9), 3716-3726 (2018).
  15. Holzem, K. M., et al. Mitochondrial structure and function are not different between nonfailing donor and end-stage failing human hearts. FASEB J. 30 (8), 2698-2707 (2016).
  16. Cordero-Reyes, A. M., et al. Freshly isolated mitochondria from failing human hearts exhibit preserved respiratory function. J Mol Cell Cardiol. 68, 98-105 (2014).
  17. Norat, P., et al. Mitochondrial dysfunction in neurological disorders: Exploring mitochondrial transplantation. NPJ Regen Med. 5 (1), 22(2020).
  18. Diaz-Vegas, A., et al. Is mitochondrial dysfunction a common root of noncommunicable chronic diseases. Endocr Rev. 41 (3), bnaa005(2020).
  19. Lai, N., et al. Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity. Acta Physiol (Oxf). 225 (2), e13182(2019).
  20. Holmuhamedov, E. L., Oberlin, A., Short, K., Terzic, A., Jahangir, A. Cardiac subsarcolemmal and interfibrillar mitochondria display distinct responsiveness to protection by diazoxide. PLoS One. 7 (9), e44667(2012).
  21. Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: Functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2 (2), 287-295 (2007).
  22. Micakovic, T., et al. Isolation of pure mitochondria from rat kidneys and western blot of mitochondrial respiratory chain complexes. Bio Protoc. 9 (19), e3379(2019).
  23. Liao, P. C., Bergamini, C., Fato, R., Pon, L. A., Pallotti, F. Isolation of mitochondria from cells and tissues. Methods Cell Biol. 155, 3-31 (2020).
  24. Hubbard, W. B., et al. Fractionated mitochondrial magnetic separation for isolation of synaptic mitochondria from brain tissue. Sci Rep. 9 (1), 9656(2019).
  25. Zhou, D., et al. Protocol for mitochondrial isolation and sub-cellular localization assay for mitochondrial proteins. STAR Protoc. 4 (1), 102088(2023).
  26. Hernandez-Camacho, J. D., et al. Isolation of mitochondria from mouse skeletal muscle for respirometric assays. J Vis Exp. (180), e63336(2022).
  27. Farrugia, G. E., et al. A protocol for rapid and parallel isolation of myocytes and non-myocytes from multiple mouse hearts. STAR Protoc. 2 (4), 100866(2021).
  28. Wollenman, L. C., Vander Ploeg, M. R., Miller, M. L., Zhang, Y., Bazil, J. N. The effect of respiration buffer composition on mitochondrial metabolism and function. PLoS One. 12 (11), e0187523(2017).
  29. Vinnakota, K. C., et al. Open-loop control of oxidative phosphorylation in skeletal and cardiac muscle mitochondria by ca(2). Biophys J. 110 (4), 954-961 (2016).
  30. Vinnakota, K. C., Bazil, J. N., Van Den Bergh, F., Wiseman, R. W., Beard, D. A. Feedback regulation and time hierarchy of oxidative phosphorylation in cardiac mitochondria. Biophys J. 110 (4), 972-980 (2016).
  31. Warnock, L. B., Huang, D. Heparin. Statpearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2024).
  32. Sercel, A. J., et al. Generating stable isolated mitochondrial recipient clones in mammalian cells using mitopunch mitochondrial transfer. STAR Protoc. 2 (4), 100850(2021).
  33. Lampl, T., Crum, J. A., Davis, T. A., Milligan, C., Del Gaizo Moore, V. Isolation and functional analysis of mitochondria from cultured cells and mouse tissue. J Vis Exp. (97), e52076(2015).
  34. Sobolewski, P., Kandel, J., Eckmann, D. M. Air bubble contact with endothelial cells causes a calcium-independent loss in mitochondrial membrane potential. PLoS One. 7 (10), e47254(2012).
  35. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  36. Wei, P., Liu, Q., Xue, W., Wang, J. A colorimetric assay of citrate synthase activity in drosophila melanogaster. J Vis Exp. (155), e59454(2020).
  37. Tomar, N., et al. Substrate-dependent differential regulation of mitochondrial bioenergetics in the heart and kidney cortex and outer medulla. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1863 (2), 148518(2022).
  38. Ter Veld, F., Jeneson, J. A., Nicolay, K. Mitochondrial affinity for ADP is twofold lower in creatine kinase knock-out muscles. Possible role in rescuing cellular energy homeostasis. FEBS J. 272 (4), 956-965 (2005).
  39. Gouspillou, G., et al. Accurate determination of the oxidative phosphorylation affinity for ADP in isolated mitochondria. PLoS One. 6 (6), e20709(2011).
  40. Strubbe-Rivera, J. O., et al. The mitochondrial permeability transition phenomenon elucidated by cryo-em reveals the genuine impact of calcium overload on mitochondrial structure and function. Sci Rep. 11 (1), 1037(2021).
  41. Zhou, Z., et al. Diverse functions of cytochrome C in cell death and disease. Cell Death Differ. 31 (4), 387-404 (2024).
  42. Certo, M., et al. Mitochondria primed by death signals determine cellular addiction to antiapoptotic bcl-2 family members. Cancer Cell. 9 (5), 351-365 (2006).
  43. Bose, S., French, S., Evans, F. J., Joubert, F., Balaban, R. S. Metabolic network control of oxidative phosphorylation: Multiple roles of inorganic phosphate. J Biol Chem. 278 (40), 39155-39165 (2003).
  44. Motawe, Z. Y., Abdelmaboud, S. S., Breslin, J. W. Evaluation of glycolysis and mitochondrial function in endothelial cells using the seahorse analyzer. Methods Mol Biol. 2711, 241-256 (2024).
  45. Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes. Nat Protoc. 1 (6), 2563-2572 (2006).
  46. Huerta, B., et al. Sea lamprey cardiac mitochondrial bioenergetics after exposure to TFM and its metabolites. Aquat Toxicol. 219, 105380(2020).
  47. Malyala, S., Zhang, Y., Strubbe, J. O., Bazil, J. N. Calcium phosphate precipitation inhibits mitochondrial energy metabolism. PLoS Comput Biol. 15 (1), e1006719(2019).

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