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Methodenartikel

Bestimmung der Ziliarfunktion und Membranundurchlässigkeit des pseudostratifizierten Lungenepithels der Atemwege

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DOI:

10.3791/67094

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21. Februar 2025

 , 
1Department of Biomedical Sciences, School of Medicine and Health Sciences, University of North Dakota

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Grenzflächenkultur zwischen Luft und Flüssigkeit wird häufig verwendet, um pseudostratifiziertes Atemwegsepithel zu entwickeln, indem primäre normale menschliche Bronchialepithelzellen differenziert werden, die die apikale Seite der Lungenatemwege nachahmen. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll zur Bestimmung seiner Qualität durch Überwachung seiner biophysikalischen Eigenschaften, wie z. B. der Ziliarfunktion und der Membranintegrität.

Zusammenfassung

Die Differenzierung primärer Epithelzellen der Lungenatemwege in der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche (ALI) ist eine beliebte Technik zur Entwicklung eines mehrzelligen pseudostratifizierten Atemwegsepithels, das die apikale Seite der Lungenatemwege nachahmt. Während die Differenzierung der primären Atemwegszellen der Lunge erwartet wird, bietet die Bewertung biophysikalischer Eigenschaften wie Ziliarfunktion und Membranundurchlässigkeit eine Qualitätsbewertung des Atemwegsepithels und gewährleistet die Zuverlässigkeit des Experiments. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll für die Entwicklung von multizellulärem pseudostratifiziertem Atemwegsepithel in ALI-Kultur und bewerten zwei wichtige biophysikalische Eigenschaften: die Ziliarfunktion und die Membranundurchlässigkeit. Um die Ziliarfunktion zu bestimmen, erfassten wir die Ziliarbewegung eines 4-wöchigen differenzierten Atemwegsepithels mit einer Hochgeschwindigkeitskamera, die an einem inversen Mikroskop befestigt war, gefolgt von der Quantifizierung der Ziliarschlagfrequenz (CBF) mit dem Simon Amon Video Analysis (SAVA) System. Wir maßen auch den transepithelialen elektrischen Widerstand (TEER) mit einem Volt-Ohm-Meter, um die Integrität der Epithelbarriere des Atemwegsepithels zu bestimmen.

Einleitung

Chronische Atemwegserkrankungen wie Asthma, chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD) und Mukoviszidose gehören zu den größten Gesundheitsproblemen weltweit1. Die Prävalenz von Atemwegserkrankungen, die durch Viren wie das humane Influenza-A-Virus, das Respiratorische Synzytial-Virus (RSV) und das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) verursacht werden, führt ebenfalls zu einer Belastung für die Wirtschaft und die öffentliche Gesundheit2. Daher besteht ein immenser Bedarf, Behandlungsschemata für Atemwegserkrankungen zu entwickeln, die zu irreversiblen Schäden am Atemwegsgewebe führen. Das respiratorische Epithelgewebe selbst ist nicht nur an der Sauerstoffaufnahme beteiligt, sondern stellt auch eine Barriere dar, um den Körper vor eindringenden Krankheitserregern und gefährlichen Chemikalien zu schützen3. Das respiratorische Epithel hat eine komplexe zelluläre Organisation, die aus drei Hauptzelltypen besteht: Flimmerzellen, Becherzellen und Basalzellen. Kürzlich wurde über das Vorhandensein neuartiger, aber seltener Ionozytenzellen im Epithel der Atemwegeberichtet 4. Das komplexe Gewebe funktioniert koordiniert, um angeborene Immunantworten wie die Sekretion antimikrobieller Peptide, die Freisetzung von Zytokinen zur Aktivierung einer adaptiven Immunantwort und die mukoziliäre Clearancebereitzustellen 5. Das Fehlen eines geeigneten Atemwegsmodells ist eines der Hindernisse für die Erforschung von Atemwegsinfektionen und die Entwicklung von Behandlungen.

Das Modell der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche (ALI) wird zu einem wichtigen Instrument für die Erforschung von Atemwegserkrankungen6. Es handelt sich um ein effektives In-vitro-Modell für die Lungenatemwege, da sich die primären Lungenatemwegszellen zu einem pseudostratifizierten Atemwegsepithel differenzieren, das aus mindestens drei Zelltypen besteht, die sich im Allgemeinen auf der apikalen Seite der Atemwege befinden. Erstens bedecken Flimmerzellen den größten Teil der apikalen Seite der Atemwege und tragen zur mukoziliären Clearance bei. Zweitens produzieren Becherzellen Schleim und sind die größten Zellen, die sich gemeinsam mit Ziliarzellen auf der apikalen Seite der Atemwege befinden. Drittens befinden sich Basalzellen in der Basalschicht der Atemwege und sind die Vorläuferzellen, die sich in verschiedene Epithelzellen differenzieren 5,7. Obwohl Ionozyten und Büschelzellen im Epithel der Atemwege selten sind, können sie auch eine Rolle bei der Ziliarfunktion und der Membranpermeabilität spielen4. Diese Technik unterscheidet sich von der traditionellen submersen Zellkultur, die die In-vivo-Lungenumgebung nicht nachahmt. Da ALI aus primären Epithelzellen hergestellt wird, die von gesunden Menschen, Patienten mit Asthma und COPD stammen, bietet es eine vielfältigere Plattform für die Untersuchung von Reaktionen auf Infektionen und die Pathophysiologie der Krankheit.

Die gesundheitliche Bewertung der von ALI entwickelten Kulturen ist ein wesentlicher Aspekt, der überwacht werden muss, um die Lebensfähigkeit, Funktionalität und physiologische Relevanz der kultivierten Zellen sicherzustellen. Es stärkt das Vertrauen in die Integrität, Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit von ALI-Kulturen. Wie bereits veröffentlicht, hat unsere Gruppe die Integrität der ALI-Kultur durch die Bewertung von zwei biophysikalischen Parametern bewertet: die Ziliarfunktion durch Quantifizierung der Ziliarschlagfrequenz (CBF) und die Integrität der Epithelbarriere durch die Bestimmung des transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER)6,7,8. Die mukoziliäre Clearance (MCC) ist eines der wichtigen Merkmale des Atemwegsepithels, das von Flimmerzellen getragen wird. Spezialisierte Organellen, sogenannte Zilien, auf der Oberfläche von Flimmerzellen schlagen in metachronen Wellen, um die Atemwege von Infektionen und eingeatmeten Partikeln zu befreien, die in der Schleimschicht des Atemwegsepithels stecken geblieben sind. Ein wirksames MCC hängt vollständig von der richtigen Ziliaraktivitätab 9. Eine gute CBF ist ein Hinweis auf ein gesundes, intaktes Epithel der Atemwege; Daher bietet die Überwachung des CBF für ALI-Kulturen wertvolle Einblicke in die Integrität des Epithels10. Obwohl es mehrere Möglichkeiten gibt, CBF zu quantifizieren, z. B. die Hochgeschwindigkeits-Videomikroskopie11 und die phasenaufgelöste optische Doppler-Kohärenztomographie12, erfordert jede Methode technisches Fachwissen und spezielle Ausrüstung. In diesem Protokoll bieten wir eine einfachere und weniger technische Methode zur Quantifizierung der CBF des differenzierten Atemwegsepithels. Wir haben auch eine Methode zur Quantifizierung der TEER desselben Epithels beschrieben, die die Integrität und Barrierefunktion des Epithelgewebes anzeigt13.

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Protokoll

Das Protokoll sollte in sterilem Zustand unter einer Laminar-Flow-Haube der Biosicherheitsstufe 2 (Biosicherheitswerkbank) durchgeführt werden. Das gesamte Medium und die Lösungen sollten vor der Verwendung bei 37 °C aufgetaut werden. Die Zentrifugation sollte bei 4 °C durchgeführt werden. Alle im Versuch verwendeten Materialien müssen steril sein. Die Primärzellen (deidentifizierter Spender) wurden in Zusammenarbeit mit Dr. Kristina Bailey am University of Nebraska Medical Center (UNMC), Omaha, NE, gewonnen. Die Primärzellen stammen von deidentifizierten Spendern, und die Zellen fallen nicht unter das NIH Human Subject. Die Zellen wurden im Rahmen eines genehmigten Material Transfer Agreement (MTA) zwischen der University of North Dakota, Grand Forks, ND, und UNMC, Omaha, NE, gewonnen. Hier haben wir passageierte 4 NHBE-Zellen verwendet. Obwohl gezeigt wurde, dass sich auch NHBE-Zellen mit höherer Passage (bis Passage 8) in das Epithel der Atemwege differenzieren, verwenden wir routinemäßig NHBE-Zellen der Passage vier, da es keinen offensichtlichen Unterschied in den Transkriptionsprofilen des gesamten Genoms zwischen den Passagen 1 bis 4gibt 6,14.

1. Primäre Zellkultur

HINWEIS: Ein sorgfältiger Umgang mit den Primärzellen ist entscheidend. Das gesamte Protokoll sollte eine harte Behandlung und übermäßiges Pipettieren der Primärzellen vermeiden.

  1. Geben Sie mit einer sterilen serologischen Pipette 5 ml Kollagen in eine 100-mm-Gewebekulturschale (TC), um die Schale vorzubeschichten. Inkubieren Sie die TC-Schale 20 Minuten lang mit Kollagen bei Raumtemperatur (RT).
  2. Aspirieren Sie mit einer sterilen serologischen Pipette das Kollagen aus der TC-Schale und ersetzen Sie es durch 8 ml voraufgetautes Medium für vollständige Atemwegsepithelzellen (AEC), das mit 2 % (v/v) Penicillin-Streptomycin und 1 % (v/v) Amphotericin B ergänzt wird (Tabelle 1).
  3. Tauen Sie eine Durchstechflasche (mit 5 x 105 Zellen) mit primären normalen humanen Bronchialepithelzellen (NHBE) in einem Wasserbad bei 37 °C auf.
  4. Geben Sie mit einer sterilen serologischen 5-ml-Pipette tropfenweise 1 ml voraufgetautes vollständiges AEC-Medium zu den Zellen, um die NHBE-Zellen zu akklimatisieren, und sammeln Sie alle Zellen in einem sterilen konischen 15-ml-Röhrchen.
  5. Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 212 x g für 5 min bei 4 °C pelletiert. Entsorgen Sie das Medium vorsichtig aus dem Röhrchen und resuspendieren Sie die Zellen in den übrig gebliebenen Mediumstropfen im Röhrchen durch sanftes Klopfen.
    HINWEIS: Übermäßiges und hartes Klopfen sollte vermieden werden.
  6. Geben Sie mit einer sterilen serologischen 5-ml-Pipette langsam 2 ml vollständiges AEC-Medium zu den resuspendierten Zellen und sammeln Sie alle Zellen.
  7. Geben Sie die Zellen in die Platte, die mit 8 mL vollständigem AEC-Medium zugesetzt ist. Bewegen Sie die TC-Schale seitwärts, um die Zellen in der Schale gleichmäßig zu verteilen.
  8. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem 85%-95% feuchten CO2 -Zellkultur-Inkubator. Beobachten Sie nach 24 Stunden die NHBE-Zellen unter dem Mikroskop bei 10x oder 20x auf ihre Anheftung an die TC-Schale und ihr Wachstum. Sind die Zellen im Medium suspendiert, zeigt dies abgestorbene Zellen.
  9. Nach 48 h wird das Altmedium mit einer sterilen serologischen Pipette aus der TC-Schale abgesaugt.
  10. Geben Sie mit einer sterilen serologischen Pipette 10 ml vorgewärmtes, vollständiges AEC-Medium in die Zellen. Fügen Sie das Medium langsam in eine Ecke ein; Vermeiden Sie direktes Gießen über die Oberseite der Zellen.
  11. Wechseln Sie das gesamte AEC-Medium alle 48 Stunden, bis die Zellen eine Konfluenz von 95 % bis 100 % erreichen.

2. Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkultur

  1. Mit einer P200-Pipette 100 μl Kollagen in einen vorbeschichteten 6,5 mm Transwell-Einsatz mit 0,4 μm-Poren-Polyestermembran (im Folgenden als Inserts bezeichnet) geben und 20 min bei RT inkubieren.
  2. Mit einer sterilen serologischen Pipette wird das Medium aus den konfluenten NHBE-Zellen abgesaugt.
  3. Geben Sie 5 mL 1x Dulbecco's Phosphatpuffer Kochsalzlösung (DPBS) mit einer sterilen serologischen Pipette in eine Ecke der TC-Schale.
  4. Schwenken Sie die Platte vorsichtig, um die Zellen zu waschen, und aspirieren Sie das 1x DPBS mit einer sterilen serologischen Pipette. Stellen Sie sicher, dass die Zellen während des Protokolls zu keinem Zeitpunkt austrocknen.
  5. Geben Sie mit einer serologischen Pipette 5 ml TrypsinLE in die Zellen und inkubieren Sie bei 37 °C in einem feuchten CO2 -Zellkultur-Inkubator, bis alle Zellen von der Unterseite der Platte dissoziiert sind.
  6. Sammeln Sie mit einer sterilen serologischen Pipette alle Zellen in einem konischen 15-ml-Röhrchen. Geben Sie mit einer sterilen serologischen Pipette 3 ml Trypsin in die TC-Schale und sammeln Sie alle Restzellen.
  7. Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 212 x g für 5 min bei 4 °C pelletiert. Entsorgen Sie das Medium und klopfen Sie vorsichtig auf das Röhrchen, um die Zellen in den übrig gebliebenen Trypsintropfen im Röhrchen wieder zu suspendieren.
  8. Geben Sie mit einer serologischen Pipette 2 ml vollständiges AEC-Medium zu den resuspendierten Zellen.
  9. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämazytometer oder einem automatisierten Zellzähler.
  10. Verdünnen Sie die Zellen mit vollständigen AEC-Medien, wobei jeder Einsatz 5 x 104 Zellen in einem Volumen von 200 μl erhält.
  11. Übertragen Sie die Einsätze mit einer sterilen Pinzette in eine leere Vertiefung in einer 24-Well-Kulturschale.
  12. Geben Sie mit einer P1000-Pipette 500 μl vollständiges AEC-Medium in die Basalvertiefung der Platte.
  13. Übertragen Sie die Einsätze mit einer sterilen Pinzette zurück in die Basalvertiefung und fügen Sie das vollständige AEC-Medium hinzu.
  14. Geben Sie mit einer P200-Pipette 5 x 104 resuspendierte NHBE-Zellen in 200 μl des vollständigen AEC-Mediums auf die apikale Seite des Einsatzes. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem 85 % - 95 % feuchten CO2 -Zellkultur-Inkubator.
  15. Beobachten Sie nach 24 h die Zellen unter dem Mikroskop, um zu sehen, ob sie in der Vertiefung eine konfluente Schicht gebildet haben.
    HINWEIS: Wenn die Zellen keine konfluente Schicht bilden, wechseln Sie das basale AEC-Medium alle 48 h durch frisches, vollständiges AEC-Medium, bis die Zellen eine konfluente Monoschicht bilden. Beim Wechsel des Basalmediums werden die Einsätze mit einer sterilen Pinzette in die leere Vertiefung überführt. Aspirieren Sie das alte Medium mit einer P1000-Pipette, fügen Sie frisches Medium hinzu und setzen Sie die Einsätze wieder in frisches, vollständiges AEC-Medium ein.
  16. Sobald die Zellen zusammenfließen, übertragen Sie die Einsätze mit einer sterilen Pinzette in eine leere Vertiefung. Saugen Sie mit einer P1000-Pipette das gesamte basale AEC-Medium an.
  17. Geben Sie mit einer P1000-Pipette 500 μl frisches vollständiges Luft-Flüssig-Grenzflächendifferenzierungsmedium (ALI), ergänzt mit 2 % (v/v) Penicillin-Streptomycin und 1 % (v/v) Amphotericin B in die Basalvertiefung.
  18. Übertragen Sie die Einsätze mit einer sterilen Pinzette in die Basalvertiefung mit Zugabe des vollständigen ALI-Mediums. Saugen Sie mit einer P200-Pipette das apikale AEC-Medium vorsichtig aus der Vertiefung an.
    HINWEIS: Die apikale Seite sollte nicht mit dem vollständigen ALI-Medium hinzugefügt werden. Aspirieren Sie das AEC-Medium vorsichtig von der apikalen Seite, um eine Zellablösung zu vermeiden.
  19. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem feuchten CO2 -Zellkultur-Inkubator. Nach 48 h werden die Einsätze mit einer sterilen Pinzette in eine leere Vertiefung überführt.
  20. Aspirieren Sie mit einer P1000-Pipette das alte Medium und fügen Sie frische 500 μl vollständiges ALI-Medium hinzu.
  21. Setzen Sie die Einsätze mit einer sterilen Pinzette wieder in die Vertiefung mit frischem Medium ein. Wechseln Sie das komplette ALI-Medium alle 48 Stunden bis zum 28. Tag (vier Wochen).
  22. An Tag 28 mit einer P200-Pipette 100 μl 1x DPBS auf die apikale Seite der Einsätze geben und bei 37 °C in einem feuchten CO2 -Zellkultur-Inkubator für 30 min inkubieren. Aspirieren Sie das 1x DPBS mit einer P200-Pipette.
    HINWEIS: DPBS sollte hinzugefügt werden, indem auf die Wand gegossen wird, anstatt direkt auf die Zellen. Vermeiden Sie beim Aspirieren von DPBS das Berühren des Epithels und energisches Pipettieren, da jede Beschädigung des Epithels die Integrität des Epithels (gewebeähnlich) beeinträchtigen kann.
  23. Ab der 2. Woche der Differenzierung beurteilen Sie die Schleimproduktion, indem Sie eine möglicherweise dunklere Schicht aufgrund von Schleim auf dem Epithel unter dem Mikroskop beobachten. Der überschüssige Schleim kann durch DPBS-Waschen entfernt werden. Geben Sie kurz 200 μL 1x DPBS auf der apikalen Seite der Einsätze auf eine 24-Well-Platte und inkubieren Sie die Platte bei 37 °C in einem feuchten CO2 -Zellkultur-Inkubator für 30 min. Entfernen Sie DPBS und bewahren Sie die Platte bei 37 °C in einem feuchten CO2 -Zellkultur-Inkubator auf.

3. Bestimmung der Ziliarschlagfrequenz

HINWEIS: Für die Bestimmung des CBF bei 37 °C (falls erforderlich) muss das Mikroskop über einen Klimakammer-Inkubator verfügen, der 5 % CO2 bei 37 °C und Luftfeuchtigkeit liefert.

  1. Schalten Sie das Mikroskop mit dem angeschlossenen Computer und der Umgebungskammer ein. Öffnen Sie die Tür der Kammer, um die Platte mit den Einsätzen auf den Mikroskoptisch zu legen.
  2. Sobald die Platte auf den Tisch gestellt ist, schließen Sie die Kammer. Bewegen Sie die Platte mit dem Bedienknopf des Mikroskoptisches, um die Einsätze sichtbar zu machen.
  3. Wählen Sie das Objektiv mit 20-facher Vergrößerung im Phasenkontrastmodus aus. Betrachten Sie die Platte durch das Okular des Mikroskops und fokussieren Sie die Zelle mit dem Abstimmknopf.
  4. Klicken Sie auf dem Computerbildschirm auf das SAVA-Systemsymbol . Das SAVA-Programm sollte auf dem Computer installiert sein, der mit dem Mikroskop verbunden ist.
  5. Klicken Sie auf der Softwareoberfläche auf Experiment konfigurieren. Klicken Sie auf der nächsten Registerkarte auf Experiment erstellen.
  6. Es wird eine neue Registerkarte angezeigt, auf der Sie unter Name des Experimentverzeichnisses und unter Experimentbeschreibung eingeben Details zu dem Verzeichnis angeben, in dem die Daten gespeichert werden, und dann auf OK klicken.
  7. Klicken Sie auf Das Experiment , das erstellt wurde und im Verzeichnis unter den Experimenten angezeigt wird.
  8. Klicken Sie auf Ändern und geben Sie die Beispieldetails in der Beispielbeschreibung an. Klicken Sie auf Hinzufügen und dann auf Beenden , um diese Registerkarte zu verlassen.
  9. Wählen Sie in der Hauptsoftwareoberfläche des Experimentslots das erstellte Experiment aus dem Dropdown-Menü auf der Hauptoberfläche aus.
  10. Klicken Sie auf Video aufnehmen und überwachen Sie die Ziliarschlagfrequenz (CBF) auf dem Computerbildschirm. Auf dem Bildschirm wird eine fokussierte Ziliarbewegung angezeigt.
  11. Zeichnen Sie für jede Einfügung 6 verschiedene Zufallsfelder für 2,1 s mit 120 Bildern pro Sekunde auf. Klicken Sie auf Video speichern , um die CBF-Daten zu überwachen.
  12. Um Daten zu analysieren, klicken Sie auf der Softwareoberfläche auf Video analysieren. Klicken Sie auf der nächsten Registerkarte auf OK.
  13. Klicken Sie auf der folgenden Registerkarte auf Alle analysieren. Laden Sie die für jedes Experiment generierte Tabelle in den SAVA-Datenerfassungsordner des Computers auf dem Computer herunter.
  14. Nehmen Sie die Gaußsche mittlere Häufigkeit für die Datendarstellung.

4. Quantifizierung des transepithelialen elektrischen Widerstands

HINWEIS: Für die TEER-Quantifizierung ist Flüssigkeit auf der apikalen Seite des Atemwegsepithels erforderlich. Um dieses Protokoll zu erstellen, fügen Sie 100 μl 1x DPBS an der apikalen Seite des Atemwegsepithels in die Inserts hinzu, die bereits das Basalmedium enthalten (experimentell) oder 500 μl 1x DPBS.

  1. Schalten Sie das EVOM2-Volt-Ohmmeter mit dem Netzschalter ein. Verbinden Sie den Prüfwiderstand mit dem EVOM2 am INPUT-Steckplatz.
  2. Überwachen Sie den Messwert auf dem EVOM2-Bildschirm. Wenn es über oder unter 1000 liegt, muss es kalibriert werden. Drehen Sie mit einer Pinzette den ADJ-Schalter am EVOM2-Volt-Ohmmeter, bis er einen einheitlichen Messwert von 1000 anzeigt.
  3. Nehmen Sie einen leeren Einsatz für die experimentelle Kontrolle. Mit einer P200-Pipette werden 100 μl 1x DPBS an der apikalen Seite des leeren Einsatzes zugegeben, während 500 μl 1x DPBS an der Basalseite mit einer P1000-Pipette zugegeben werden.
  4. Trennen Sie den Prüfwiderstand und schließen Sie die STX2-Elektrode an den INPUT-Steckplatz des EVOM2 an. Reinigen Sie die STX2-Elektrode vorsichtig mit 70 % Ethanol.
  5. Führen Sie die STX2-Elektrode mit 1x DPBS in den leeren Einsatz ein, wobei Sie den kürzeren Elektrodenschenkel auf dem apikalen Teil jedes Einsatzes und den längeren Elektrodenschenkel auf dem basalen Teil belassen.
  6. Zeichnen Sie den stabilen Messwert auf dem EVOM2-Bildschirm auf, da der Messwert aufgrund von Bewegungen oder anderen unbestimmten Gründen schwanken kann.
  7. Führen Sie die STX2-Elektrode in den Einsatz mit dem 28-Tage-differenzierten Epithel ein, wobei Sie den kürzeren Elektrodenschenkel auf dem apikalen Teil jedes Einsatzes und den längeren Elektrodenschenkel auf dem basalen Teil im Medium belassen.
  8. Zeichnen Sie den stabilen Messwert auf dem EVOM2-Bildschirm auf. Nehmen Sie mehrere unabhängige Messungen vor, um einen zuverlässigen Durchschnitt zu berechnen. Subtrahieren Sie den Hintergrund (leerer Einfügewert) vom experimentellen Einfügewert für die Berechnung.

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Ergebnisse

Wir untersuchten sowohl die Ziliarfunktion als auch die Membranundurchlässigkeit des Atemwegsepithels, die aus der Differenzierung primärer NHBE-Zellen von zwei unabhängigen deidentifizierten Spendern (zwei nichtrauchende, gesunde Erwachsene oder Erwachsene mit COPD, über 50-jährige Frauen) gewonnen wurden. Zur Bestimmung der Ziliarfunktion wurde die CBF des 28-Tage-differenzierten Atemwegsepithels bestimmt. Wir beobachteten, dass die CBF für beide Atemwegsepithele mindestens 3 Hz erreichte, was mit den zuvor veröffentli...

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Diskussion

Das Epithel der primären Atemwege des Menschen (ALI-Kultur) wird zunehmend als In-vitro-Lungenmodell für biologische Bewertungen verwendet, um Funktionen und Mechanismen zu untersuchen und den Einsatz von Tieren zu reduzieren14. ALI hat mehrere Vorteile gegenüber jeder Monolayer-Unterwasserkultur. Zum Beispiel liefert es ein gewebeartiges pseudostratifiziertes Atemwegsepithel, das die apikale Seite der Lungenatemwegenachahmt

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Offenlegungen

Autoren haben keinen Interessenkonflikt.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch das NIH P20GM113123 und das UND SMHS Pilot Grant finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1x DPBSThermo Fisher Scientific, USA14190-144
Epithelzellwachstumsmedium für die AtemwegePromoCell, DeutschlandC-21060
Amphotericin BThermo Fisher Scientific, USA15290-026
EVOM2 Volt OhmmeterWorld Precision Instruments, USANicht anwendbar
HeparinlösungSTEMCELL-Technologien, USA07980
Hydrocortison LagerSTEMCELL Technologies, USA07926
Mikroskop: Leica DMI8 (Leica Mikroskop) mit 120f/sec Hochgeschwindigkeitskamera (Basler) in Verbindung mit dem Mikroskop. Microsope auch mit Tischkammer-Inkubator i8 befestigt.Leica, USANicht zutreffend
Penicillin-StreptomycinCorning, USA30-002-CI
PneumaCult-ALI Basalmedium STEMCELL technologies, USA05002
PureColAdvanced BioMatrix, USA5005
Sisson-Ammons Videoanalysesystem (SAVA). Software V.2.1.15 Amson Engineering, USANicht zutreffend

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

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