Bestimmung der Ziliarfunktion und Membranundurchlässigkeit des pseudostratifizierten Lungenepithels der Atemwege

Summary

Die Grenzflächenkultur zwischen Luft und Flüssigkeit wird häufig verwendet, um pseudostratifiziertes Atemwegsepithel zu entwickeln, indem primäre normale menschliche Bronchialepithelzellen differenziert werden, die die apikale Seite der Lungenatemwege nachahmen. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll zur Bestimmung seiner Qualität durch Überwachung seiner biophysikalischen Eigenschaften, wie z. B. der Ziliarfunktion und der Membranintegrität.

Abstract

Die Differenzierung primärer Epithelzellen der Lungenatemwege in der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche (ALI) ist eine beliebte Technik zur Entwicklung eines mehrzelligen pseudostratifizierten Atemwegsepithels, das die apikale Seite der Lungenatemwege nachahmt. Während die Differenzierung der primären Atemwegszellen der Lunge erwartet wird, bietet die Bewertung biophysikalischer Eigenschaften wie Ziliarfunktion und Membranundurchlässigkeit eine Qualitätsbewertung des Atemwegsepithels und gewährleistet die Zuverlässigkeit des Experiments. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll für die Entwicklung von multizellulärem pseudostratifiziertem Atemwegsepithel in ALI-Kultur und bewerten zwei wichtige biophysikalische Eigenschaften: die Ziliarfunktion und die Membranundurchlässigkeit. Um die Ziliarfunktion zu bestimmen, erfassten wir die Ziliarbewegung eines 4-wöchigen differenzierten Atemwegsepithels mit einer Hochgeschwindigkeitskamera, die an einem inversen Mikroskop befestigt war, gefolgt von der Quantifizierung der Ziliarschlagfrequenz (CBF) mit dem Simon Amon Video Analysis (SAVA) System. Wir maßen auch den transepithelialen elektrischen Widerstand (TEER) mit einem Volt-Ohm-Meter, um die Integrität der Epithelbarriere des Atemwegsepithels zu bestimmen.

Introduction

Chronische Atemwegserkrankungen wie Asthma, chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD) und Mukoviszidose gehören zu den größten Gesundheitsproblemen weltweit¹. Die Prävalenz von Atemwegserkrankungen, die durch Viren wie das humane Influenza-A-Virus, das Respiratorische Synzytial-Virus (RSV) und das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) verursacht werden, führt ebenfalls zu einer Belastung für die Wirtschaft und die öffentliche Gesundheit². Daher besteht ein immenser Bedarf, Behandlungsschemata für Atemwegserkrankungen zu entwickeln, die zu irreversiblen Schä....

Protocol

Das Protokoll sollte in sterilem Zustand unter einer Laminar-Flow-Haube der Biosicherheitsstufe 2 (Biosicherheitswerkbank) durchgeführt werden. Das gesamte Medium und die Lösungen sollten vor der Verwendung bei 37 °C aufgetaut werden. Die Zentrifugation sollte bei 4 °C durchgeführt werden. Alle im Versuch verwendeten Materialien müssen steril sein. Die Primärzellen (deidentifizierter Spender) wurden in Zusammenarbeit mit Dr. Kristina Bailey am University of Nebraska Medical Center (UNMC), Omaha, NE, gewonnen. Die Primärzellen stammen von deidentifizierten Spendern, und die Zellen fallen nicht unter das NIH Human Subject. Die Zellen w....

Results

Wir untersuchten sowohl die Ziliarfunktion als auch die Membranundurchlässigkeit des Atemwegsepithels, die aus der Differenzierung primärer NHBE-Zellen von zwei unabhängigen deidentifizierten Spendern (zwei nichtrauchende, gesunde Erwachsene oder Erwachsene mit COPD, über 50-jährige Frauen) gewonnen wurden. Zur Bestimmung der Ziliarfunktion wurde die CBF des 28-Tage-differenzierten Atemwegsepithels bestimmt. Wir beobachteten, dass die CBF für beide Atemwegsepithele mindestens 3 Hz erreichte, was mit den zuvor veröffentli.......

Discussion

Das Epithel der primären Atemwege des Menschen (ALI-Kultur) wird zunehmend als In-vitro-Lungenmodell für biologische Bewertungen verwendet, um Funktionen und Mechanismen zu untersuchen und den Einsatz von Tieren zu reduzieren¹⁴. ALI hat mehrere Vorteile gegenüber jeder Monolayer-Unterwasserkultur. Zum Beispiel liefert es ein gewebeartiges pseudostratifiziertes Atemwegsepithel, das die apikale Seite der Lungenatemwege^nachahmt

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x DPBS	Thermo Fisher Scientific, USA	14190-144
Epithelzellwachstumsmedium für die Atemwege	PromoCell, Deutschland	C-21060
Amphotericin B	Thermo Fisher Scientific, USA	15290-026
EVOM2 Volt Ohmmeter	World Precision Instruments, USA	Nicht anwendbar
Heparinlösung	STEMCELL-Technologien, USA	07980
Hydrocortison Lager	STEMCELL Technologies, USA	07926
Mikroskop: Leica DMI8 (Leica Mikroskop) mit 120f/sec Hochgeschwindigkeitskamera (Basler) in Verbindung mit dem Mikroskop. Microsope auch mit Tischkammer-Inkubator i8 befestigt.	Leica, USA	Nicht zutreffend
Penicillin-Streptomycin	Corning, USA	30-002-CI
PneumaCult-ALI Basalmedium	STEMCELL technologies, USA	05002
PureCol	Advanced BioMatrix, USA	5005
Sisson-Ammons Videoanalysesystem (SAVA). Software V.2.1.15	Amson Engineering, USA	Nicht zutreffend