Betriebs- und Biocontainment-Verfahren einer Anlage für Labormäuse mit natürlichem Mikrobiom: Immunphänotypisierungsverfahren

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir den Aufbau und die Betriebsabläufe, einschließlich mikrobieller Eindämmungsmaßnahmen einer Anlage zur "Wilding von Mäusen" am Beispiel von Blutproben zur Immunphänotypisierung.

Zusammenfassung

Die Verwendung von Labormäusen mit natürlichem Mikrobiom, wie z.B. "Wildling-Mäusen", bietet aufgrund ihrer großen Ähnlichkeit mit dem menschlichen Superorganismus ein vielversprechendes Forschungswerkzeug sowohl für die Grundlagen- als auch für die angewandte Wissenschaft. Die Zucht und der Erhalt dieser Mäuse, die ein vielfältiges Mikrobiom aus Bakterien, Viren und Parasiten beherbergen, stellen die Tierhaltungseinrichtungen an Forschungseinrichtungen jedoch vor große Herausforderungen. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, wurde an der Charité - Universitätsmedizin Berlin ein spezielles Anlagenkonzept für die Unterbringung von "Wildling-Mäusen" entwickelt. Bei diesem Ansatz wurde eine Einrichtung mit spezifischen strukturellen Merkmalen und Betriebsprotokollen entworfen, um das natürliche Mikrobiom effektiv einzudämmen und so Bereiche mit höheren Hygienestandards zu schützen.

Es wird eine Methodik für die Blutentnahme sowohl von spezifizierten erregerfreien (SPF) als auch von "Wildling-Mäusen" für die Immunphänotypisierung demonstriert, wobei der Arbeitsablauf und die in der Einrichtung implementierten Biocontainment-Maßnahmen hervorgehoben werden. Bemerkenswerte Ergebnisse zeigen, dass "Wildling-Mäuse", die einem natürlichen Mikrobiom ausgesetzt sind, ausgeprägte Immunzellpopulationen entwickeln, die bei Mäusen, die gezüchtet und unter strengen Hygienebedingungen gehalten werden, deutlich reduziert sind.

Die Bedeutung dieser Studie liegt in ihrem Potenzial, Forschern Zugang zu Mäusen zu verschaffen, die ein natürliches Mikrobiom und ein ausgereiftes Immunsystem besitzen, das dem von erwachsenen Menschen ähnelt. Dieser Ansatz könnte die Übertragbarkeit präklinischer Erkenntnisse in die klinische Praxis verbessern und damit das Feld der biomedizinischen Forschung voranbringen.

Einleitung

Experimente an Mäusen sind in der Grundlagen- und angewandten Wissenschaft, wie z.B. in der präklinischen und toxikologischen Forschung, nach wie vor unverzichtbar. Die Standardisierung der Hygiene in Laborumgebungen, die darauf abzielt, biologisches Rauschen zu reduzieren und die Variabilität der Versuchsergebnisse zu minimieren, hat jedoch dazu geführt, dass die natürliche Mikrobiota weitgehend ausgeschlossen wurde. So unterscheiden sich die Bedingungen, unter denen hygienisch standardisierte, spezifizierte pathogenfreie (SPF) Labormäuse geboren und gehalten werden, von den realen Bedingungen, denen Mensch und Tier normalerweise ausgesetzt sind. Diese Diskrepanz zwischen Laborbedingungen und der natürlichen Umgebung, in der menschliche Krankheiten auftreten, führt zu dem "Standardisierungsirrtum": Die Annahme, dass die Minimierung der Variation der experimentellen Bedingungen die translationalen Ergebnisse verbessert. In der Realität schränkt sie jedoch die biologische Relevanz der Befunde ein ^1,2. So hat die Forschung beispielsweise gezeigt, dass das Fehlen einer mikrobiellen und umweltbedingten Vielfalt bei SPF-Mäusen zu einem unterentwickelten Immunsystem führen kann, was die Gültigkeit immunologischer und präklinischer Studien untergräbt³.

Es wurden mehrere Ansätze vorgeschlagen, um die biologische Variation in Mausmodellen zu berücksichtigen, jeder mit seinen eigenen Vorteilen und Einschränkungen, einschließlich der gemeinsamen Unterbringung mit verwilderten Mäusen und Mäusen aus dem Zoohandel ^3,4,5,6,7,8, der sequentiellen Exposition gegenüber Kommensalen⁹, der Haltung der Tiere in Außengehegen¹⁰ oder auf Einstreu von Großtieren¹¹ und Kottransplantationen von wilden Mäusen¹². Ein vielversprechendes neues Mausmodell für die präklinische und toxikologische Forschung ist das Modell "Wildling-Mäuse", das aus Standard-Labormausstämmen besteht, die ein natürliches Mikrobiom beherbergen¹³. Diese "Wildling-Mäuse" werden durch die Transplantation von Embryonen von Labormausstämmen in wild gefangene Mäuse erzeugt. Während der Geburt erwerben die Labormausstämme das natürliche Mikrobiom ihrer Leihmütter und ahmen die natürliche Impfung nach, die bei der Entbindung beim Menschen stattfindet¹³. "Wildling-Mäuse" können wie jeder andere Labormausstamm gezüchtet werden, wobei ihr natürliches Mikrobiom über Generationen hinweg erhalten bleibt.

"Wildling-Mäuse" beherbergen eine vielfältige Mikrobiota - darunter Bakterien, Viren und Parasiten -, die normalerweise von SPF-Mausanlagen ausgeschlossen sind. Folglich stellt die Aufrechterhaltung eines natürlichen Mikrobioms in Forschungseinrichtungen eine Herausforderung dar, da diese Mikroben eingedämmt werden müssen, ohne die allgemeinen SPF-Hygienestandards zu beeinträchtigen.

An der Charité - Universitätsmedizin Berlin wurde eine eigene Einrichtung für "Wildling-Mäuse" eingerichtet, die durch strenge Biocontainment-Maßnahmen von den SPF-Bereichen getrennt ist. Die Einrichtung umfasst Zucht- und Versuchsräume, die sicherstellen, dass das natürliche Mikrobiom der "Wildling-Mäuse" erhalten bleibt, während die SPF-Bereiche geschützt werden (Abbildung 1).

Die Gründerpaare der Charité-Kolonie wurden aus der Kolonie "Wilding mice" importiert, die an der Abteilung für Mikrobiomforschung des Universitätsklinikums Erlangen der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU) etabliert wurde. Sie werden vor dem Import der Koloniegründer mit einem Gesundheitszeugnis versehen und mit einem erweiterten Panel auf Zoonoseerreger überwacht. Sentinels werden eingesetzt, um das Mikrobiom im Laufe der Zeit zu überwachen. Sowohl SPF als auch "Wildling-Mäuse" werden unter den gleichen Bedingungen gehalten. Die Mäuse werden gezüchtet und bevorzugt in individuell beatmeten Käfigen (IVC) Typ II lange in Gruppen von fünf Mäusen gehalten. Die Temperatur in der Anlage beträgt 22 °C und der Hell-Dunkel-Zyklus 12 Stunden. Die Mäuse erhalten handelsübliches Getreide- und Leitungswasser. Eine Sterilisation von Einstreu und Anreicherungsgegenständen ist für "Wildling-Mäuse" nicht erforderlich. Das Autoklavieren dieser Gegenstände verhindert jedoch Materialverwechslungen in Bereichen, in denen SPF-Mäuse untergebracht sind.

In diesem Protokoll werden die Immunphänotypisierungsverfahren sowohl für SPF- als auch für "Wildling-Mäuse" demonstriert, wobei die strengen mikrobiellen Containment-Protokolle in der "Wildling-Maus"-Anlage hervorgehoben werden. Diese Maßnahmen gewährleisten die Integrität der SPF-Umgebung und bieten gleichzeitig die Vorteile der Arbeit mit Mäusen, die ein natürliches Mikrobiom tragen.

Abbildung 1: Layout der Anlage für Wildling-Mäuse. E1 = Zugang zur Anlage. Pfeile zeigen den Eingangsweg in die Anlage an. E2 = Zugang zur Laminar-Airflow-Kabine von außerhalb der Anlage. PA = Personenschleuse mit Luftdusche. AS = Luftdusche. R1, R2 = Räume für die Zucht von Wildlingmäusen. R3 = Platz für die Haltung von Wilding-Mäusen. R4 = Platz für die Haltung von SPF-Mäusen. PR1 = Behandlungsraum für SPF-Mäuse. PR2 = Behandlungsraum für Wildling-Mäuse. SB = sterile Arbeitsbank. EE = Notausgänge. CR = Umkleideraum vor der LAF-Kabine. LAF = laminare Luftstromkabine für Eingriffe unter schützender Luftströmung. A = Autoklav. ER = Technikraum. Grüne Pfeile stellen Routen dar, die bei der Arbeit mit SPF-Tieren zugänglich sind, und gelbe Pfeile zeigen Wege an, die für die Arbeit mit Wildling-Mäusen nach dem Luftduschen verfügbar sind. Blaue Pfeile zeigen den Zugang nur für das Haltungspersonal an. Die rote Linie markiert die Glaswand im Inneren der LAF-Kabine, die den Raum in zwei Bereiche unterteilt, die entweder von E1 über PR2 oder von E2 über CR zugänglich sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Protokoll

Die Anlage zur "Wildhaltung von Mäusen" und Verfahren mit lebenden Tieren wurden vom zuständigen Landesamt für Gesundheit und Soziales Berlin (LAGeSo) genehmigt. Die wichtigsten Schritte des Protokolls sind in Abbildung 2 zusammengefasst.

1. Zugang zur Anlage Wilding erhalten

1. Erhalten Sie eine persönliche Einführung in die Betriebs- und Bioabdichtungsabläufe der Anlage durch den zuständigen Tierschutzbeauftragten.
2. Holen Sie sich den Transponderschlüssel für den Zutritt zur Einrichtung für "Wildling-Mäuse" und buchen Sie die Eingriffsräume über das Online-Buchungssystem.

2. Betreten der Anlage für "Wildling-Mäuse"

1. Deponieren Sie die Kleidung in der Umkleidekabine.
2. Wechseln Sie in die Bereichskleidung: Hose, Kasak und Einweg-Überschuhe (Abbildung 3).

3. Blutentnahme von SPF-Mäusen im SPF-Bereich

1. Die SPF-Mäuse (männlich und weiblich, 8-20 Wochen) werden aus dem Raum, in dem sie gehalten werden (R4), in den Behandlungsraum für SPF-Tiere (PR1) in einen geschlossenen IVC-Käfig überführt.
2. Schalten Sie die Laminar-Flow-Bank ein und desinfizieren Sie die Arbeitsfläche mit 70% Vol.-Ethanol. Arbeiten Sie im Inneren der Bank.
3. Überprüfen Sie die Kapillarrohre auf gebrochene oder abgebrochene Abschnitte, um ein erhöhtes Risiko von Bruch oder Beschädigung zu vermeiden.
4. Unter kurzer Vollnarkose mit Isofluran (Induktion bei 5 % Isofluran in sauerstoffangereicherter medizinischer Luft, gefolgt von 1,5 %-2,0 % zur Erhaltung) nach Verlust des Pedalentzugsreflexes (wie durch Zehenkneifen angezeigt) die Halsvenen der Mäuse durch Greifen des Nackens komprimieren.
5. Befestigen Sie den Kopf des Tieres mit einer Hand mit Daumen und Zeigefinger. Führen Sie eine frische Kapillare in den medialen Canthus des Auges unter der Nickhaut im Winkel von 45° ein. Stellen Sie sicher, dass sich die Kapillare zwischen dem Augapfel und der knöchernen Augenhöhle befindet.
   HINWEIS: Um ein Trauma zu vermeiden, lassen Sie die Spitze des Kapillarrohrs nicht die Oberfläche des Auges berühren.
6. Führen Sie die Kapillare mit einer sanften axialen Drehbewegung durch die Sinusmembran ein. Drehen Sie den Schlauch an der Rückseite der Orbita weiter, bis das Blut fließt. Sammeln Sie mindestens 15 μl Blut in einem Blutentnahmeröhrchen, das Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthält (ca. 1 Tropfen).
7. Lösen Sie vor dem Entfernen der Kapillare den Griff am Nacken, um Blutungen in das Gewebe auf ein Minimum zu beschränken. Um eine gute Blutstillung zu gewährleisten, verwenden Sie ein sauberes Mullkissen oder einen Tupfer, um die Blutung zu stoppen.
8. Drehen Sie den Schlauch leicht, um Blut und EDTA zu mischen. Schütteln Sie die Tube nicht. Lagern Sie die Blutprobe auf Eis.
9. Desinfizieren Sie die Arbeitsfläche und schalten Sie die Laminar-Flow-Bank aus. Bringen Sie SPF-Mäuse in einer geschlossenen IVC in den SPF-Haltungsraum zurück (R4).

4. Betreten des Bereichs für "Wildling-Mäuse"

1. Ziehen Sie Schuhe und Socken im Vorraum der Luftdusche (PA) aus. Ziehen Sie Bereichssocken und persönliche Ganzkörperschutzausrüstung (PSA) an, die aus einem Tyvek-Overall, einem Haarnetz, falls erforderlich, Baumwollhandschuhen, Nitrilhandschuhen und Gesichtsmasken besteht (Abbildung 3).
2. Betreten Sie die Luftdusche in Socken über den selbstklebenden Bodenbelag. Hebe beim Luftduschen die Arme an und führe eine 360°-Drehung aus.
3. Verlassen Sie die Luftdusche und ziehen Sie auf der anderen Seite Bereichsschuhe an.

5. Blutentnahme von "wilden Mäusen"

1. "Wildling-Mäuse" (männlich und weiblich, 8 - 20 Wochen) werden aus dem Raum, in dem sie in einem geschlossenen IVC-Käfig gehalten werden (R3), in den Eingriffsraum (PR2) überführt.
2. Schalten Sie die Laminar-Flow-Bank ein und desinfizieren Sie die Arbeitsfläche.
3. Befolgen Sie die für die Probenahme von SPF-Mäusen in Abschnitt 3, Schritte 2-8 beschriebenen Verfahren.
4. Wechseln Sie nach Abschluss der Blutentnahme die Handschuhe. Desinfizieren Sie alle Materialien und Oberflächen. Schalten Sie die Laminar-Flow-Bank aus.

6. Export von Blutproben aus dem Bereich "Wildling-Mäuse" über den Laminar-Airflow-Schrank (LAF)

HINWEIS: Der Operationssaal (PR2) enthält einen LAF-Schrank, der als Materialschleuse und steriler Interventionsraum dient. Die Proben werden über die LAF-Kabine abtransportiert. Der Innenraum ist sowohl von innen (über E1 und PR2) als auch von außen (über E2 und CR) über das Wildling-Areal zugänglich und wird in der Mitte durch eine Glaswand mit Schiebetür geteilt (Bild 1). Für den Export von Materialien sind zwei Personen erforderlich: Person 1 (innerhalb des Wildling-Bereichs [über PR2]) führt die Schritte 6.1 und 6.2 aus. Person 2 (außerhalb des Wildling-Bereichs [über E2]) führt die Schritte 6.3-6.5 aus.

1. Desinfizieren Sie Probenbehälter. Entnehmen Sie Probenbehälter über die Schiebetür in der Glaswand der LAF-Kabine.
2. Nachdem die Übergabe der Probenbehälter an Person 2 abgeschlossen ist, nehmen Sie Schutzkleidung von Person 2 (trägt Schutzkleidung im Kittelschloss der Kabine) auf der anderen Seite der LAF-Kabine entgegen und entsorgen Sie diese. Desinfizieren Sie alle Oberflächen.
3. Ziehen Sie Schutzkleidung im Zugangsbereich LAF vor der LAF-Kabine an (CR, Abbildung 1).
4. Nehmen Sie desinfizierte Probenbehälter aus dem Wildling-Bereich berührungslos durch die Schiebetür in der Glaswand der LAF-Kabine entgegen.
5. Entfernen Sie die Schutzkleidung und führen Sie sie durch die Schiebetür in den Innenbereich der LAF-Kabine zur Entsorgung.

7. Verlassen der Anlage für "Wildling-Mäuse"

1. Lassen Sie Einweg-Overalls und Bereichsschuhe im Bereich. Entsorgen Sie Haarnetz, Gummihandschuhe und Gesichtsmaske.
   HINWEIS: Schuhe und Overalls können wiederverwendet werden.
2. Betreten Sie die Luftdusche sofort in den Bereichssocken. Heben Sie die Arme und führen Sie eine 360°-Drehung aus, während Sie an der Luft duschen.
3. Lassen Sie die Luftdusche und legen Sie die Socken in den Wäscheauffangbehälter. Ziehen Sie die Socken und Schuhe sowie Einweg-Überschuhe an. Legen Sie die Kleidung im Bereich der Umkleidekabine im Wäschesammler ab. Anziehen in der Umkleidekabine

8. Aufbereitung und Analyse von Blutproben

1. Bringen Sie Blutproben ins Labor.
   1. Bereiten Sie einen Fluorophor-konjugierten Antikörper-Färbecocktail vor: Fügen Sie für jede Probe 0,25 μl Alexa Fluor 700 Anti-Maus-CD45, 0,25 μl Brilliant Violet 605 Anti-Maus-TCR-β-Kette, 0,25 μl APC Anti-Maus-CD4, 0,25 μl Brilliant Violet 785 Anti-Maus-CD8, 0,25 μl FITC Anti-Maus-CD44 und 0,25 μl PerCP/Cyanin5,5 Anti-Maus-CD62L-Antikörper zu 50 μl Durchflusszytometrie-Puffer (phosphatgepufferte Kochsalzlösung, 2 mM EDTA, 0,1 % Rinderserumalbumin, 4 °C). Im Dunkeln auf Eis bis Schritt 8.8 aufbewahren.
      HINWEIS: Die verwendeten Fluorophore können an die Konfiguration des Durchflusszytometers angepasst werden, das für die Probenentnahme verwendet wird.
2. Desinfizieren Sie die Blutentnahmeröhrchen. Geben Sie 2 ml eiskalten Durchflusszytometriepuffer in ein 5 ml-Polystyrolröhrchen mit rundem Boden. Lege das Rohr auf Eis.
3. Öffnen Sie das Blutentnahmeröhrchen. Geben Sie 10 μl Blut in das Röhrchen, das den Durchflusszytometriepuffer und den Pulswirbel enthält.
4. Bei 400 x g 5 min bei 4 °C runterschleudern.
5. Aspirieren Sie den Überstand. Fügen Sie 1 ml Lysepuffer für rote Blutkörperchen (RBC) hinzu, pulsieren Sie den Vortex und inkubieren Sie ihn 3 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT).
6. Fügen Sie 100 μl 10x PBS hinzu. Bei 400 x g 5 min bei 4 °C runterschleudern.
7. Wiederholen Sie die Schritte 8.5-8.6.
8. Aspirieren Sie den Überstand. 50 μl Antikörper-Färbecocktail hinzufügen, vortexen und 20 Minuten im Dunkeln auf Eis inkubieren.
9. Fügen Sie 1 ml Durchflusszytometrie-Puffer hinzu. Bei 400 x g 5 min bei 4 °C runterschleudern.
10. Aspirieren Sie den Überstand. Fügen Sie 180 μl Durchflusszytometrie-Puffer hinzu.
11. Fügen Sie 20 μl SYTOX Blue Dead Cell Stain (Endkonzentration 1:1000) für die Unterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen hinzu.
12. Erfassen Sie Proben auf einem Durchflusszytometer und analysieren Sie die Daten mit der Durchflusszytometer-Erfassungssoftware oder dem Datenanalyseprogramm für Durchflusszytometrie.

Ergebnisse

"Wilde Mäuse" beherbergen möglicherweise Mikroorganismen, die normalerweise von SPF-Anlagen ausgeschlossen sind, was eine Herausforderung für die Tierhaltung in Forschungseinrichtungen darstellt, die strenge Hygienestandards einhalten. In den letzten 4 Jahren haben Wissenschaftler und Tierärzte der Charité - Universitätsmedizin Berlin und des Deutschen Zentrums zum Schutz von Labortieren (Bf3R) eine Einrichtung für Mäuse mit einem natürlichen Mikrobiom entwickelt, die in Zusammenarbeit strenge Biocontainment-Maßnahmen umfasst (Abbildung 1). Um dieses Design zu realisieren, wurde eine bestehende Mausanlage umfassend umgebaut, einschließlich des Einbaus einer Luftdusche und einer Laminar-Airflow-Kabine. Die Bereiche, in denen "Wildling-Mäuse" und LSF-Mäuse gezüchtet und gehalten werden, sind durch die Luftdusche getrennt und beide Bereiche verfügen über ausgewiesene Eingriffsräume. Thermostabiles Material verlässt den Bereich für "Wildling-Mäuse" erst durch den Autoklaven, während thermolabile Materialien, wie z.B. Proben, über den LAF-Schrank zur Weiterverarbeitung in Laborbereichen exportiert werden können (Abbildung 2). Die strikte Einhaltung aller Biocontainment-Maßnahmen ist unerlässlich, um eine Kontamination von Bereichen zu verhindern, in denen SPF-Hygienebedingungen eingehalten werden (Abbildung 3). Die Design- und Biocontainment-Maßnahmen der Anlage für "Wilding mice" an der Charité - Universitätsmedizin Berlin bieten den Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftlern die Möglichkeit, mit Mäusen zu forschen, die ein natürliches Mikrobiom beherbergen, und gleichzeitig die Ausbreitung von Mikroorganismen in Bereiche der Tiereinrichtung mit höherem Hygieneniveau effektiv zu verhindern.

Die Durchflusszytometrie ist die Goldstandardmethode in der zellulären Immunologie und wird verwendet, um Immunzellpopulationen in Blut und Geweben als Reaktion auf veränderte Umweltbedingungen zu untersuchen. Zum Beispiel haben erwachsene Menschen eine beträchtliche Anzahl von Gedächtnis-T-Zellen im Blut zirkulieren, die sich entwickeln, wenn sie Mikroorganismen aus der Umwelt ausgesetzt sind³. Hier wurde mittels Durchflusszytometrie im Blut von Mäusen, die gezüchtet und unter SPF-Bedingungen gehalten wurden, und im Blut von "Wildling-Mäusen" nach Gedächtnis-T-Zellen gesucht (Abbildung 4). "Wildling-Mäuse", die mit einem natürlichen Mikrobiom besiedelt sind, stellen eine ausgeprägte Population von Gedächtnis-T-Zellen dar. Im Gegensatz dazu haben Mäuse, die unter SPF-Bedingungen gezüchtet und gehalten wurden, stark reduzierte Gedächtnis-T-Zellen im Blutkreislauf. Daher kann die Durchflusszytometrie den Einfluss verschiedener mikrobieller Umgebungen auf das Immunkompartiment charakterisieren. Die Datengranulation kann durch die Einbeziehung zusätzlicher Immunzellmarker erhöht werden. Neu entwickelte Ansätze in der Durchflusszytometrie, wie z.B. die Zytometrie durch Time-of-Flight (CyTOF) und die spektrale Durchflusszytometrie, ermöglichen die Erfassung von Informationen über eine Vielzahl von Parametern und damit die Erweiterung der Anzahl von Immunzell(-Sub-)Populationen, die in derselben Blut- und Gewebeprobe quantifiziert werden können. Darüber hinaus kann die zelluläre Zytokinproduktion auch durch Durchflusszytometrie beurteilt werden, was Einblicke in die Funktion von Zellen als Reaktion auf ein natürliches Mikrobiom gibt.

Abbildung 2: Arbeitsablauf im Werk Wildling. Die Blutentnahme und Probenaufbereitung sind Beispiele, können aber durch andere Verfahren ersetzt werden, wie z. B. chirurgische Eingriffe mit Gewebeentnahme und Histologie. Abkürzungen finden Sie in Abbildung 1 Legende. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Vergleich der Anforderungen an persönliche Schutzausrüstung (PSA) für SPF- und Wildling-Gebiete. Im SPF-Bereich (links) besteht die Standard-PSA aus einer einzigen Schicht Schutzkleidung. Im Wildling-Bereich (rechts) ist dagegen ein dreistufiger PSA-Prozess erforderlich, bevor man die Luftdusche betritt: Unter dem Overall wird ein Kasac (Schutzunterwäsche = Stufe 1) getragen (Schritt 2). Diese zusätzliche Schicht trägt zur Aufrechterhaltung der Hygiene bei und verhindert Kreuzkontaminationen zwischen den Bereichen. Nach der Luftdusche müssen ausgewiesene Schuhe für den Wildlingbereich getragen werden (Schritt 3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Immunphänotyp von "Wildling-Mäusen". Blutproben von männlichen SPF-Mäusen (n = 5 Mäuse) und "Wilding-Mäusen" (n = 5 Mäuse) im Alter von 14 Wochen wurden mit einem Cocktail aus Fluorophor-konjugierten Antikörpern gegen CD45, TCR-β-Kette, CD4, CD8, CD44 und CD62L gefärbt. Die Zahlen sind der Anteil des elterlichen Tores ± der Standardabweichung. Die Gating-Strategie wird für SPF-Mäuse gezeigt, mit Ausnahme der letzten beiden Blots von SPF und "Wildling-Mäusen". Bei "Wildling-Mäusen" sind die T-Zellen des Zentral- und Effektorgedächtnisses im Vergleich zu Mäusen, die unter SPF-Bedingungen gezüchtet und gehalten werden, erhöht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Mäuse mit einem natürlichen Mikrobiom sind aufgrund ihrer größeren Ähnlichkeit mit dem menschlichen Superorganismus ein vielversprechendes Forschungsinstrument für die Grundlagen- und angewandte Wissenschaft 3,9,10,11,12. Versuche, biologische Komplexität in Mausmodelle zu integrieren, haben zur Entwicklung verschiedener Ansätze geführt, von denen jeder seine eigenen Vorteile und Grenzen hat 3,7,8,9,10,11,12. "Wildling-Mäuse" vereinen die Vorteile einer kontrollierten Laborumgebung mit einem natürlichen Mikrobiom. Dieser Ansatz erhält die Stabilität unter experimentellen Bedingungen und bewahrt gleichzeitig die natürliche mikrobielle Vielfalt, die für die Untersuchung komplexer biologischer Wechselwirkungen erforderlich ist. Biomedizinische Therapien, die an "Wildling-Mäusen" entwickelt und getestet wurden, bergen daher ein großes Potenzial für eine erfolgreiche Translation in die klinische Anwendung.

Es muss jedoch noch festgestellt werden, in welchen präklinischen Krankheitsmodellen "Wildling-Mäuse" SPF-Mäusen überlegen sind. Darüber hinaus beherbergen Mäuse mit einem natürlichen Mikrobiom Mikroorganismen wie hochübertragbare Würmer, die in der Regel von institutionellen Einrichtungen ausgeschlossen sind. Die Zucht und Arbeit mit diesen Mäusen stellt daher eine Herausforderung für die Tierhaltung in Forschungseinrichtungen dar.

Bei der Einrichtung einer Einrichtung für "Wildling-Mäuse" haben Wissenschaftler, Tierärzte und institutionelle Beamte der Charité - Universitätsmedizin, des Deutschen Zentrums zum Schutz von Versuchstieren (Bf3R) und der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU) gemeinsam gearbeitet. Nach der Entwicklung des Anlagenkonzepts wurde eine bestehende Mausanlage umfassend umgebaut, um strenge Biocontainment-Maßnahmen zu integrieren. Die Anlage ist für den Betrieb der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) in Bezug auf die Forschung mit menschlichen Krankheitserregern zertifiziert.

Hier werden Operations- und Biocontainment-Abläufe in der Anlage für "Wildling-Mäuse" am Beispiel der Blutentnahme zur Immunphänotypisierung mittels Durchflusszytometrie beschrieben. Die strikte Einhaltung von Biocontainment-Maßnahmen während der Arbeit in der Anlage für "Wildling-Mäuse" ist zwingend erforderlich, um die Ausbreitung von Mikroorganismen auf andere Bereiche der Tierhaltung zu verhindern. Dazu gehört auch die Beschränkung des Zugangs zur Einrichtung auf so wenige Personen wie möglich, so die Forschungsgruppe. Darüber hinaus ist eine obligatorische Einführungsveranstaltung erforderlich, die vom Tierschutzbeauftragten der Einrichtung durchgeführt wird, bevor Sie zum ersten Mal Zugang zur Einrichtung erhalten. Allgemeine Informationen und Standard Operating Procedures (SOP) für die Arbeit im Wildling-Werk sind auch auf einer internen Website ("Wildling-Wiki")^14,15 verfügbar.

Bei der Arbeit in der Einrichtung muss PSA ordnungsgemäß getragen werden. So ist zum Beispiel unbedingt darauf zu achten, dass keine Haare außerhalb des Haarnetzes freigelegt werden, da sich die Eier von Parasiten daran festsetzen könnten. Handelt es sich bei dem Versuch sowohl um "Wildling-Mäuse" als auch um SPF-Mäuse, so müssen zuerst SPF-Mäuse behandelt werden. Die Bereiche für "Wildling-Mäuse" und SPF-Mäuse innerhalb der Anlage sind durch eine Luftdusche voneinander getrennt und jeder Bereich ist mit ausgewiesenen Operationsräumen ausgestattet. Diese Zimmer können über ein Online-Buchungssystem gebucht werden, um einen reibungslosen Arbeitsablauf und eine begrenzte Anzahl von Personen in der Einrichtung zu gewährleisten. In jeder Barriere dürfen maximal zwei Personen pro Bereich und Eingriffsraum (PR1, PR2, LAF) gleichzeitig arbeiten. Ausnahmen gelten für Experimente, die zusätzliches Personal erfordern, um eine ethische und kompetente Durchführung der Verfahren zu gewährleisten. Die Mäuse werden in geschlossenen IVC-Käfigen zwischen den Räumen innerhalb ihres jeweiligen Bereichs transportiert, die nur unter einer Laminar-Flow-Bank geöffnet werden können, um die mikrobielle Eindämmung und Arbeitssicherheit zu gewährleisten. Im Operationsraum im Bereich "Wilding mice" befindet sich auch eine Laminar Airflow (LAF)-Kabine. Diese LAF-Kabine muss für die Sektion und Operation von "Wildling-Mäusen" einschließlich des Embryotransfers verwendet werden. Der Embryotransfer ist ein kritisches Verfahren im Zusammenhang mit "Wilding-Mäusen", da er zur Generierung neuer "Wildling-Maus"-Modelle verwendet wird. Zum Beispiel wird der Transfer von Embryonen von gentechnisch veränderten (GVO) Mausstämmen in Wildtyp-"Wilding-Mäuse" verwendet, um Wildling-GVO-Stämme zu erzeugen. Die LAF-Kabine wird auch für den Export von Proben genutzt, was eine Abstimmung mit einer Person außerhalb des Bereichs "Wildling-Mäuse" erfordert. Die weitere Probenverarbeitung kann in angrenzenden Laborräumen durchgeführt werden, so dass die Forscher zeitkritische Materialien vor Ort handhaben können, während die Orte, an denen Proben von "Wildling-Mäusen" verarbeitet werden, begrenzt werden.

Alle anderen Materialien müssen im Wildling-Werk verbleiben oder vor Verlassen des Werks autoklaviert werden. Nach der Arbeit werden alle Materialien und Oberflächen mit Desinfektionsmitteln desinfiziert, die für BSL2-Bedingungen geeignet sind. Personen, die die Anlage für "Wildling-Mäuse" betreten haben, ist es untersagt, am selben Tag eine andere Tierhaltung zu betreten.

Die Forschung in der Einrichtung wird im Rahmen des wissenschaftlichen Konsortiums "The Wildling Mouse Model in Health and Disease (Wildling HeaD)" durchgeführt, um die Kommunikation zwischen Wissenschaftlern, die mit "Wildling-Mäusen" arbeiten, sowie den Austausch von Methoden und Fachwissen zu erleichtern. Das Konsortium wird von Responsible PrecliniX am QUEST Center for Responsible Research des Berlin Institute of Health (BIH) unterstützt, das bei den Präregistrierungsverfahren für Tierversuche, dem robusten Versuchsdesign und dem Qualitätsmanagement (www.bihealth.org/en/quest/service/service/responsible-preclinix) hilft.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass eine hochmoderne Anlage geschaffen wurde, die mit strengen Biocontainment-Maßnahmen ausgestattet ist, um eine sichere und ethische präklinische Forschung zu unterstützen. Diese Einrichtung ermöglicht die Untersuchung von "Wildling-Mäusen", die ein natürliches Mikrobiom beherbergen und so die Lücke zwischen kontrollierten Laborbedingungen und realen mikrobiellen Umgebungen effektiv schließen. Für den Bau einer Anlage wie der beschriebenen ist es wichtig, der Teamwissenschaft und der interdisziplinären Zusammenarbeit Vorrang einzuräumen und das Fachwissen von Wissenschaftlern, Tierärzten und institutionellen Beamten einzubeziehen, um eine effektive Gestaltung und einen effektiven Betrieb von Umgebungen mit hohem Biocontainment zu gewährleisten. Darüber hinaus sind die Umsetzung strenger Bioabdichtungsmaßnahmen, umfassende Schulungen und die Entwicklung klarer Standard Operating Procedures (SOPs) von entscheidender Bedeutung. Die Etablierung einer effizienten Kommunikationsstruktur, wie z. B. eines internen Wikis, und die kontinuierliche Überwachung und Validierung der Versuchsbedingungen werden die Wirksamkeit und Sicherheit der Anlage bei der Verwaltung komplexer Modelle wie "Wildling-Mäuse" weiter erhöhen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Alexa Fluor 700 Anti-Maus CD45 Antikörper	BioLegend	103127	Klon 30F-11
Tierfutter	Altromin	1324
APC Anti-Maus CD4 Antikörper	BioLegend	100515	Klon RM4-5
Blutentnahmeröhrchen	Greiner	450475	MiniCollect K3E, K3EDTA
Rinderserum Albumin	Sigma-Aldrich	A9647-100G
Brilliant Violet 605 Anti-Maus-TCR-Beta-Ketten-Antikörper	BioLegend		109241 Klon H57-597
Brilliant Violet 785 Anti-Maus-CD8-Antikörper	BioLegend	100749	Clone 53-6.7
Kapillar-Hirschmann		9000210	Hirschmann-Minicaps, Na-Hep
EDTA	Corning	46-034-CI
FITC Anti-Maus-CD44-Antikörper	BioLegend	103021	Clone IM7
PerCP/Cyanin5.5 Anti-Maus-CD62L-Antikörper	BioLegend	104431	Clone MEL-14
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (10x)	Gibco	12579099
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1x)	Gibco	14190094
RBC-Lysingpuffer	BioLegend	420302
Polystyrolröhrchen mit rundem Boden	Sarstedt	55.476.005
SYTOX Blue Dead Cell Stain	Invitrogen	S34852
Tyvek overall (DuPont)	Fisher	Scientific 11371633